JPH11216000A - Ｈｌａ−ａ対立遺伝子型の判別方法 - Google Patents
Ｈｌａ−ａ対立遺伝子型の判別方法Info
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- JPH11216000A JPH11216000A JP10305892A JP30589298A JPH11216000A JP H11216000 A JPH11216000 A JP H11216000A JP 10305892 A JP10305892 A JP 10305892A JP 30589298 A JP30589298 A JP 30589298A JP H11216000 A JPH11216000 A JP H11216000A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法、およびキ
ット、試薬を提供する。 【解決手段】少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺
伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いて、およ
び特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１
つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特
異的な各グループに対応するプライマー対のセットを用
いてＰＣＲ法を行い、選択的増幅より得られた産物を電
気泳動により展開し検出する方法（Ａ'法）および各特
定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物
を、特異的な切断部位を与える制限酵素または全く切断
部位を与えない制限酵素により処理しそれを電気泳動に
より展開し検出する方法（Ｂ法）を組み合わせて行う。
ット、試薬を提供する。 【解決手段】少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺
伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いて、およ
び特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１
つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特
異的な各グループに対応するプライマー対のセットを用
いてＰＣＲ法を行い、選択的増幅より得られた産物を電
気泳動により展開し検出する方法（Ａ'法）および各特
定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物
を、特異的な切断部位を与える制限酵素または全く切断
部位を与えない制限酵素により処理しそれを電気泳動に
より展開し検出する方法（Ｂ法）を組み合わせて行う。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ヒトの主要組織適合抗原であるＨ
ＬＡ（Human Leukocyte Antigen）は、免疫担当細胞の
膜表面に発現し、抗原処理（antigen processing）され
た外因性および内因性抗原由来のぺプチドをＴリンパ球
に提示すると共に、自己・非自己の識別マーカーとして
機能している。本発明は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判
別方法、その試薬およびキットに関するものであり、特
に臨床医学領域の臓器移植の際のドナー・レシピエント
間の適合性の判定や各種疾病との相関性解析などにおい
て有用である。
ＬＡ（Human Leukocyte Antigen）は、免疫担当細胞の
膜表面に発現し、抗原処理（antigen processing）され
た外因性および内因性抗原由来のぺプチドをＴリンパ球
に提示すると共に、自己・非自己の識別マーカーとして
機能している。本発明は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判
別方法、その試薬およびキットに関するものであり、特
に臨床医学領域の臓器移植の際のドナー・レシピエント
間の適合性の判定や各種疾病との相関性解析などにおい
て有用である。
【０００２】
【従来の技術】ＨＬＡ抗原は、従来より、主にヒト同種
抗体を用いた血清学的方法により、型判別が行われてき
た。すなわち臍帯血や頻回輸血者の血清中に含まれる各
ＨＬＡ抗原型に対する特異抗体を用いて抗原抗体反応を
行い、補体依存性の細胞障害を惹起させることで、陽性
細胞は細胞膜の透過性に変化を来しエオジン色素などの
取り込みにより、顕微鏡下で着色され膨化した形態とし
て識別できる。この方法により、ＨＬＡクラスＩ抗原で
あるＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原および同クラスＩＩ抗原で
あるＤＲ，ＤＱ抗原の型を識別することが可能である
が、これらの方法は特異抗体の採取と品質維持、および
供給面に問題があった。また方法論的には細胞の生存を
指標として判定するため、被検試料の状態の悪化、例え
ば疾病や採血後の経時的影響に起因する細胞生存率の低
下などが検査成績の信頼性の低下の誘因になるという問
題があった。
抗体を用いた血清学的方法により、型判別が行われてき
た。すなわち臍帯血や頻回輸血者の血清中に含まれる各
ＨＬＡ抗原型に対する特異抗体を用いて抗原抗体反応を
行い、補体依存性の細胞障害を惹起させることで、陽性
細胞は細胞膜の透過性に変化を来しエオジン色素などの
取り込みにより、顕微鏡下で着色され膨化した形態とし
て識別できる。この方法により、ＨＬＡクラスＩ抗原で
あるＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原および同クラスＩＩ抗原で
あるＤＲ，ＤＱ抗原の型を識別することが可能である
が、これらの方法は特異抗体の採取と品質維持、および
供給面に問題があった。また方法論的には細胞の生存を
指標として判定するため、被検試料の状態の悪化、例え
ば疾病や採血後の経時的影響に起因する細胞生存率の低
下などが検査成績の信頼性の低下の誘因になるという問
題があった。
【０００３】近年分子生物学的技術の発展により、ＨＬ
Ａ抗原をコードする遺伝子領域の解析に伴い各種のＨＬ
Ａ抗原型と遺伝子の塩基配列の対応性について知られる
ようになった。すなわちＨＬＡ遺伝子の特定の遺伝子配
列を調べることで、被検試料のＨＬＡ抗原型を決定する
（遺伝子タイピング）ことが可能となった。特に微細な
塩基配列の変化を高感度に検出可能な技術であるＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction）法はＨＬＡクラスＩＩ
抗原遺伝子である、ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ遺伝子のタイピン
グに利用されている。これらのＰＣＲ法を基盤としたＨ
ＬＡクラスＩＩ遺伝子タイピングの技法として、ＰＣＲ
−ＳＳＯＰ（Sequence-Specific Oligonucleotide Prob
e）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Leng
th Polymorphism）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence-Spec
ific Primer）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand C
onformation Polymorphism）法などが開発されている。
これらの技法は何れも解析の対象となる遺伝子領域をＰ
ＣＲ法で増幅し、その増幅産物を必要に応じてさらに別
の技法を用いることにより、塩基配列の可変部位を解析
して、遺伝子型を判別するものである。このＨＬＡクラ
スＩＩ遺伝子タイピングでは、従来のヒト同種血清を用
いた血清学的方法による型分類に留まらず、遺伝子レベ
ルの型分類を可能にしている。すなわち、従来の血清学
的方法では同一と考えられていた抗原が、遺伝子配列の
違いによりさらに細分化され、本検査の臨床的意義の拡
大をもたらしている。
Ａ抗原をコードする遺伝子領域の解析に伴い各種のＨＬ
Ａ抗原型と遺伝子の塩基配列の対応性について知られる
ようになった。すなわちＨＬＡ遺伝子の特定の遺伝子配
列を調べることで、被検試料のＨＬＡ抗原型を決定する
（遺伝子タイピング）ことが可能となった。特に微細な
塩基配列の変化を高感度に検出可能な技術であるＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction）法はＨＬＡクラスＩＩ
抗原遺伝子である、ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ遺伝子のタイピン
グに利用されている。これらのＰＣＲ法を基盤としたＨ
ＬＡクラスＩＩ遺伝子タイピングの技法として、ＰＣＲ
−ＳＳＯＰ（Sequence-Specific Oligonucleotide Prob
e）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Leng
th Polymorphism）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence-Spec
ific Primer）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand C
onformation Polymorphism）法などが開発されている。
これらの技法は何れも解析の対象となる遺伝子領域をＰ
ＣＲ法で増幅し、その増幅産物を必要に応じてさらに別
の技法を用いることにより、塩基配列の可変部位を解析
して、遺伝子型を判別するものである。このＨＬＡクラ
スＩＩ遺伝子タイピングでは、従来のヒト同種血清を用
いた血清学的方法による型分類に留まらず、遺伝子レベ
ルの型分類を可能にしている。すなわち、従来の血清学
的方法では同一と考えられていた抗原が、遺伝子配列の
違いによりさらに細分化され、本検査の臨床的意義の拡
大をもたらしている。
【０００４】ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子タイピングに比
べ、ＰＣＲ法を利用したクラスＩ遺伝子タイピングの実
用化は著しく遅れている。これは、（１）クラスＩＩ遺
伝子では、抗原特異性を反映したものを含め遺伝子変異
（遺伝子置換）の多くが第２エクソン（ｅｘｏｎ）に集
中しているのに対し、クラスＩ遺伝子では第２〜３エク
ソン、また一部は第４エクソンに散在している、（２）
非古典的遺伝子（ＨＬＡ−Ｅ、Ｆ、Ｇ）および疑偽遺伝
子（ＨＬＡ−Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）を含めＨＬＡクラスＩ遺
伝子間の相同性が高い、などが理由である。
べ、ＰＣＲ法を利用したクラスＩ遺伝子タイピングの実
用化は著しく遅れている。これは、（１）クラスＩＩ遺
伝子では、抗原特異性を反映したものを含め遺伝子変異
（遺伝子置換）の多くが第２エクソン（ｅｘｏｎ）に集
中しているのに対し、クラスＩ遺伝子では第２〜３エク
ソン、また一部は第４エクソンに散在している、（２）
非古典的遺伝子（ＨＬＡ−Ｅ、Ｆ、Ｇ）および疑偽遺伝
子（ＨＬＡ−Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）を含めＨＬＡクラスＩ遺
伝子間の相同性が高い、などが理由である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の血清学的方法によるＨＬＡ−Ａローカス抗原タイピン
グの測定上の問題を解決し、従来法では識別分類が不可
能であったＡ抗原のサブタイプを遺伝子レベルで分類
（アリルタイピング）可能にする方法およびそれに用い
るキットや試薬を提供することである。
の血清学的方法によるＨＬＡ−Ａローカス抗原タイピン
グの測定上の問題を解決し、従来法では識別分類が不可
能であったＡ抗原のサブタイプを遺伝子レベルで分類
（アリルタイピング）可能にする方法およびそれに用い
るキットや試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
に鑑み、鋭意研究した結果、染色体ＤＮＡ中に存在する
少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配
列に特異的なＰＣＲ増幅用プライマー、または特定のＨ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定の
グループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グ
ループに対応するＰＣＲ増幅用プライマーを、創意工夫
して設定することができた。さらにＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子の特定グループ由来のＰＣＲ増幅産物に対しては、各
グループ毎に必要に応じた一連の制限酵素の処理により
得られるＤＮＡ断片サイズから、1種類の対立遺伝子を
判別することが可能であることを見出し、本発明を完成
するに至った。
に鑑み、鋭意研究した結果、染色体ＤＮＡ中に存在する
少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配
列に特異的なＰＣＲ増幅用プライマー、または特定のＨ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定の
グループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グ
ループに対応するＰＣＲ増幅用プライマーを、創意工夫
して設定することができた。さらにＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子の特定グループ由来のＰＣＲ増幅産物に対しては、各
グループ毎に必要に応じた一連の制限酵素の処理により
得られるＤＮＡ断片サイズから、1種類の対立遺伝子を
判別することが可能であることを見出し、本発明を完成
するに至った。
【０００７】すなわち本発明は以下のＡ法およびＢ法を
組み合わせて行うＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法を
主旨としたものである。 Ａ法： （１）特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくと
も１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列
に特異的な各グループに対応するプライマー対のセット
を用いてＰＣＲ法を行い、各特定のグループ内のＨＬＡ
−Ａ対立遺伝子群をグループとして選択的に増幅する、
（２）前記ＰＣＲ法により得られた増幅産物を電気泳動
により展開し、特定のサイズの増幅されたＤＮＡバンド
の存在の有無を確認することにより、各特定のグループ
内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型をグループとし
て判別する。 Ｂ法： ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型がグループ
として判別された場合に、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｐ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行う。
組み合わせて行うＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法を
主旨としたものである。 Ａ法： （１）特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくと
も１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列
に特異的な各グループに対応するプライマー対のセット
を用いてＰＣＲ法を行い、各特定のグループ内のＨＬＡ
−Ａ対立遺伝子群をグループとして選択的に増幅する、
（２）前記ＰＣＲ法により得られた増幅産物を電気泳動
により展開し、特定のサイズの増幅されたＤＮＡバンド
の存在の有無を確認することにより、各特定のグループ
内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型をグループとし
て判別する。 Ｂ法： ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型がグループ
として判別された場合に、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｐ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行う。
【０００８】ここで上記特定のグループは特定のＨＬＡ
−Ａ対立遺伝子群からなる。例えば本発明の１つの態様
として、以下の遺伝子群からなるA3-1グループ、A3-2グ
ループ、A3-3グループ、A3-4グループを例示することが
できる。すなわち、A3-2グループはA*0201〜A*0221、A*
6901の遺伝子群からなり、A3-3グループはA*0217、A*23
01、A*2402〜A*2408、A*2410、A*2413、A*2414の遺伝子
群からなり、A3-4グループはA*0202、A*0205、A*0208、
A*0214の遺伝子群からなり、A3-1グループはその他の遺
伝子群からなる。ここで各グループに対応するＰＣＲプ
ライマーは、これら複数のグループのうちの特定のグル
ープを増幅するために、該特定のグループに含まれる全
ての各遺伝子に共通な塩基配列に特異的であるように設
定する。例えば、A3-1グループではA3-12Aであり、A3-2
グループではA3-12Gであり、A3-3グループではA3-25Tで
あり、A3-4グループではA3-59Gである。該特定のグルー
プを選択的に増幅する場合、各グループに対応するプラ
イマー対としてセンス（Ｓｅｎｓｅ）、アンチセンス
（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の両方に必ずしもあるグループ
に特異的な前記で設定するプライマーを用いる必要はな
く、一方にあるグループに特異的なプライマーを用い、
もう一方に全てのグループに特異的なプライマー、例え
ばA3-273Tを用いてもよい。
−Ａ対立遺伝子群からなる。例えば本発明の１つの態様
として、以下の遺伝子群からなるA3-1グループ、A3-2グ
ループ、A3-3グループ、A3-4グループを例示することが
できる。すなわち、A3-2グループはA*0201〜A*0221、A*
6901の遺伝子群からなり、A3-3グループはA*0217、A*23
01、A*2402〜A*2408、A*2410、A*2413、A*2414の遺伝子
群からなり、A3-4グループはA*0202、A*0205、A*0208、
A*0214の遺伝子群からなり、A3-1グループはその他の遺
伝子群からなる。ここで各グループに対応するＰＣＲプ
ライマーは、これら複数のグループのうちの特定のグル
ープを増幅するために、該特定のグループに含まれる全
ての各遺伝子に共通な塩基配列に特異的であるように設
定する。例えば、A3-1グループではA3-12Aであり、A3-2
グループではA3-12Gであり、A3-3グループではA3-25Tで
あり、A3-4グループではA3-59Gである。該特定のグルー
プを選択的に増幅する場合、各グループに対応するプラ
イマー対としてセンス（Ｓｅｎｓｅ）、アンチセンス
（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）の両方に必ずしもあるグループ
に特異的な前記で設定するプライマーを用いる必要はな
く、一方にあるグループに特異的なプライマーを用い、
もう一方に全てのグループに特異的なプライマー、例え
ばA3-273Tを用いてもよい。
【０００９】さらに本発明は以下のＡ'法およびＢ法を
組み合わせて行うＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法を
主旨としたものでもある。 Ａ'法： （１）少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の
塩基配列に特異的なプライマー対を用いて、および特定
のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特
定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な
各グループに対応するプライマー対のセットを用いてＰ
ＣＲ法を行い、各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子および各
特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群をグループ
として選択的に増幅する、（２）前記ＰＣＲ法により得
られた増幅産物を電気泳動により展開し、特定のサイズ
の増幅されたＤＮＡバンドの存在の有無を確認すること
により、対応する各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の型お
よび／または各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子群の特定の型をグループとして判別する。 Ｂ法： ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型がグループ
として判別された場合に、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｐ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行う。
組み合わせて行うＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法を
主旨としたものでもある。 Ａ'法： （１）少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の
塩基配列に特異的なプライマー対を用いて、および特定
のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特
定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な
各グループに対応するプライマー対のセットを用いてＰ
ＣＲ法を行い、各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子および各
特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群をグループ
として選択的に増幅する、（２）前記ＰＣＲ法により得
られた増幅産物を電気泳動により展開し、特定のサイズ
の増幅されたＤＮＡバンドの存在の有無を確認すること
により、対応する各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の型お
よび／または各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子群の特定の型をグループとして判別する。 Ｂ法： ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型がグループ
として判別された場合に、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｐ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行う。
【００１０】本発明の判別方法は、白血球等の被検試料
より得られる染色体（ゲノム）ＤＮＡに対して行う。本
発明の判別方法におけるＡ'法は２つに分類することが
でき、１つは少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺
伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲ
法を行い、各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を選択的に増
幅する工程、および他の１つは特定のＨＬＡ−Ａ対立遺
伝子群からなる少なくとも１つの特定のグループ内の各
遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グループに対応す
るプライマー対のセットを用いてＰＣＲ法を行い、各特
定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群をグループと
して選択的に増幅する工程である。前者の工程では以
後、増幅産物の電気泳動を行い、特定のＤＮＡバンドを
確認することで各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の型が判
別できる。後者の工程では同じく増幅産物の電気泳動を
行うが、ここでは各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立
遺伝子群の特定の型がグループとして判別されるのみで
あり、この段階では各グループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子それぞれの型は判別できない。従って後者の場合は、
本発明方法におけるＢ法を以後適用する。
より得られる染色体（ゲノム）ＤＮＡに対して行う。本
発明の判別方法におけるＡ'法は２つに分類することが
でき、１つは少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺
伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲ
法を行い、各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を選択的に増
幅する工程、および他の１つは特定のＨＬＡ−Ａ対立遺
伝子群からなる少なくとも１つの特定のグループ内の各
遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グループに対応す
るプライマー対のセットを用いてＰＣＲ法を行い、各特
定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群をグループと
して選択的に増幅する工程である。前者の工程では以
後、増幅産物の電気泳動を行い、特定のＤＮＡバンドを
確認することで各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の型が判
別できる。後者の工程では同じく増幅産物の電気泳動を
行うが、ここでは各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立
遺伝子群の特定の型がグループとして判別されるのみで
あり、この段階では各グループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子それぞれの型は判別できない。従って後者の場合は、
本発明方法におけるＢ法を以後適用する。
【００１１】上記Ａ法若しくはＡ'法におけるＤＮＡバ
ンドの確認は、例えばゲル電気泳動後の臭化エチジウム
染色の紫外線照射などにより行う。このＡ法若しくは
Ａ'法では１検体について、１または２のバンドが確認
されるが、それは各被検試料がＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の
特定の型をホモ接合体またはヘテロ接合体で保有するか
らである。
ンドの確認は、例えばゲル電気泳動後の臭化エチジウム
染色の紫外線照射などにより行う。このＡ法若しくは
Ａ'法では１検体について、１または２のバンドが確認
されるが、それは各被検試料がＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の
特定の型をホモ接合体またはヘテロ接合体で保有するか
らである。
【００１２】Ｂ法ではＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の
型がグループとして判別された場合に、ＲＦＬＰ法、Ｐ
ＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、
ＰＣＲ−ＳＳＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行
う。
型がグループとして判別された場合に、ＲＦＬＰ法、Ｐ
ＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、
ＰＣＲ−ＳＳＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行
う。
【００１３】本発明は１つの態様として、上記Ａ法若し
くはＡ'法を行った後に、以下のＢ法を適用する方法を
提供する。すなわちＲＦＬＰ法として、以下の（１）お
よび（２）の工程を行う。 （１）各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の
増幅産物を、特異的な切断部位を与える制限酵素または
全く切断部位を与えない制限酵素により処理する、
（２）前記制限酵素により処理した増幅産物を電気泳動
により展開し、制限酵素切断の存在の有無を反映するＤ
ＮＡ断片サイズを判読し、既知のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子
型のＤＮＡ断片サイズを記載した判定表に照らして該Ｈ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子群の各型を判別する。ここで前記判
定表は、あらかじめＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型が既知であ
る試料の増幅産物を前記制限酵素により処理し、得られ
たＤＮＡ断片サイズを整理・記載して作成する。当業者
ならば、このような判定表は容易に作成できる。
くはＡ'法を行った後に、以下のＢ法を適用する方法を
提供する。すなわちＲＦＬＰ法として、以下の（１）お
よび（２）の工程を行う。 （１）各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の
増幅産物を、特異的な切断部位を与える制限酵素または
全く切断部位を与えない制限酵素により処理する、
（２）前記制限酵素により処理した増幅産物を電気泳動
により展開し、制限酵素切断の存在の有無を反映するＤ
ＮＡ断片サイズを判読し、既知のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子
型のＤＮＡ断片サイズを記載した判定表に照らして該Ｈ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子群の各型を判別する。ここで前記判
定表は、あらかじめＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型が既知であ
る試料の増幅産物を前記制限酵素により処理し、得られ
たＤＮＡ断片サイズを整理・記載して作成する。当業者
ならば、このような判定表は容易に作成できる。
【００１４】ここに、判定表としては例えば図１〜３を
参考にすればよい。本明細書にて使用している制限酵素
以外の制限酵素を使用する場合には別の判定表を使用す
ればよい。該別の判定表は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型が
既知の試料の増幅産物を新たな制限酵素により処理し、
得られたＤＮＡ断片サイズから作成すればよい。当業者
ならば、このような判定表は作成できる。またこのＢ法
においても、各被検試料がＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の特定
の型をホモ接合体またはヘテロ接合体で保有することに
留意する。
参考にすればよい。本明細書にて使用している制限酵素
以外の制限酵素を使用する場合には別の判定表を使用す
ればよい。該別の判定表は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型が
既知の試料の増幅産物を新たな制限酵素により処理し、
得られたＤＮＡ断片サイズから作成すればよい。当業者
ならば、このような判定表は作成できる。またこのＢ法
においても、各被検試料がＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の特定
の型をホモ接合体またはヘテロ接合体で保有することに
留意する。
【００１５】なお上記Ａ法、Ａ'法およびＢ法におい
て、増幅産物は電気泳動により展開しているが、一般的
にはポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動、キャピラリー電気泳動などのゲル電気泳動の
技法が利用される。
て、増幅産物は電気泳動により展開しているが、一般的
にはポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動、キャピラリー電気泳動などのゲル電気泳動の
技法が利用される。
【００１６】上記以外にもＢ法として、各特定のグルー
プ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物をナイロンや
ニトロセルロースなどの膜にブロッティングし、ＨＬＡ
−Ａ対立遺伝子の多型性を示す領域に相補的なオリゴヌ
クレオチドプローブを該膜に対してハイブリダイズさせ
ることにより該ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の各型を判別す
るＳＳＯＰ法が挙げられる。なお前記ＳＳＯＰ法はその
変法である逆ドットブロット（reverse dot blot）法も
含むものである。またＢ法として、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子群の特定の型がグループとして判別された後に被検試
料より得られる染色体ＤＮＡ若しくは前記増幅産物に対
してさらにＰＣＲ法を行い、その増幅産物を必要に応じ
てさらに別の技法を用いて解析するＰＣＲ−ＲＦＬＰ
法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法またはＰＣ
Ｒ−ＳＳＣＰ法なども挙げることができる。これらの方
法は多くの成書に記載されているので、それらに従って
行うことができる。
プ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物をナイロンや
ニトロセルロースなどの膜にブロッティングし、ＨＬＡ
−Ａ対立遺伝子の多型性を示す領域に相補的なオリゴヌ
クレオチドプローブを該膜に対してハイブリダイズさせ
ることにより該ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の各型を判別す
るＳＳＯＰ法が挙げられる。なお前記ＳＳＯＰ法はその
変法である逆ドットブロット（reverse dot blot）法も
含むものである。またＢ法として、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子群の特定の型がグループとして判別された後に被検試
料より得られる染色体ＤＮＡ若しくは前記増幅産物に対
してさらにＰＣＲ法を行い、その増幅産物を必要に応じ
てさらに別の技法を用いて解析するＰＣＲ−ＲＦＬＰ
法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法またはＰＣ
Ｒ−ＳＳＣＰ法なども挙げることができる。これらの方
法は多くの成書に記載されているので、それらに従って
行うことができる。
【００１７】本発明は前記方法に、さらにＲＦＬＰ法、
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ
法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法から選
ばれる１または２の方法を行うことによって、ＨＬＡ−
Ａ対立遺伝子を判別することも含む。例えばＰＣＲ−Ｓ
ＳＰ法として、少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立
遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いてＰＣ
Ｒ法を行い、各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を選択的に
増幅する。
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ
法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法から選
ばれる１または２の方法を行うことによって、ＨＬＡ−
Ａ対立遺伝子を判別することも含む。例えばＰＣＲ−Ｓ
ＳＰ法として、少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立
遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いてＰＣ
Ｒ法を行い、各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を選択的に
増幅する。
【００１８】本発明のＡ法若しくはＡ'法における、少
なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配列
に特異的なプライマー対としては、A1-67A（配列番号１
３）とA2-234C（配列番号４）、A1-67T（配列番号１
４）とA2-234C（配列番号４）、A2-87G（配列番号１
５）とA2-234C（配列番号４）、A2-87A（配列番号１
６）とA2-234C（配列番号４）、A2-226A（配列番号１
７）とA3-68G（配列番号２３）、A2-226C（配列番号１
８）とA3-68G（配列番号２３）、A2-5T（配列番号２）
とA2-197A（配列番号１９）、A2-5T（配列番号２）とA2
-197T（配列番号２０）、A3-25A（配列番号２１）とA3-
273T（配列番号１０）、A3-25G（配列番号２２）とA3-2
73T（配列番号１０）、A3-159A（配列番号２４）とA3-2
73T（配列番号１０）、A3-159C（配列番号２５）とA3-2
73T（配列番号１０）、A4-8C（配列番号１１）とA4-224
G（配列番号２６）、A4-8C（配列番号１１）とA4-224T
（配列番号２７）、A2-29A（配列番号２８）とA2-197A
（配列番号１９）、A2-29A（配列番号２８）とA2-197T
（配列番号２０）、A2-29T（配列番号２９）とA2-234C
（配列番号４）、A2-81C（配列番号３）とA2-229C（配
列番号３０）、A3-71G（配列番号３１）とA3-240G（配
列番号３２）から選ぶことができ、また特定のＨＬＡ−
Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定のグルー
プ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グループ
に対応するプライマー対としては、A2-5C（配列番号
１）とA2-234C（配列番号４）、A2-5T（配列番号２）と
A2-234C（配列番号４）、A2-81C（配列番号３）とA2-23
8A（配列番号５）、A3-12A（配列番号６）とA3-273T
（配列番号１０）、A3-12G（配列番号７）とA3-273T
（配列番号１０）、A3-25T（配列番号８）とA3-273T
（配列番号１０）、A3-59G（配列番号９）とA3-273T
（配列番号１０）、A4-8C（配列番号１１）とA4-254G
（配列番号１２）から選ぶことができる。これらのプラ
イマー対およびそのＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ断片サイズ
を記載した表は図４に示す。なお本発明は、上記ＨＬＡ
−Ａ遺伝子タイピングに使用するための、少なくとも１
つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配列に特異的な
プライマー、または特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群から
なる少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共
通の塩基配列に特異的な各グループに対応するプライマ
ー（配列番号１〜配列番号３２）自身も含むものであ
る。
なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配列
に特異的なプライマー対としては、A1-67A（配列番号１
３）とA2-234C（配列番号４）、A1-67T（配列番号１
４）とA2-234C（配列番号４）、A2-87G（配列番号１
５）とA2-234C（配列番号４）、A2-87A（配列番号１
６）とA2-234C（配列番号４）、A2-226A（配列番号１
７）とA3-68G（配列番号２３）、A2-226C（配列番号１
８）とA3-68G（配列番号２３）、A2-5T（配列番号２）
とA2-197A（配列番号１９）、A2-5T（配列番号２）とA2
-197T（配列番号２０）、A3-25A（配列番号２１）とA3-
273T（配列番号１０）、A3-25G（配列番号２２）とA3-2
73T（配列番号１０）、A3-159A（配列番号２４）とA3-2
73T（配列番号１０）、A3-159C（配列番号２５）とA3-2
73T（配列番号１０）、A4-8C（配列番号１１）とA4-224
G（配列番号２６）、A4-8C（配列番号１１）とA4-224T
（配列番号２７）、A2-29A（配列番号２８）とA2-197A
（配列番号１９）、A2-29A（配列番号２８）とA2-197T
（配列番号２０）、A2-29T（配列番号２９）とA2-234C
（配列番号４）、A2-81C（配列番号３）とA2-229C（配
列番号３０）、A3-71G（配列番号３１）とA3-240G（配
列番号３２）から選ぶことができ、また特定のＨＬＡ−
Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定のグルー
プ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グループ
に対応するプライマー対としては、A2-5C（配列番号
１）とA2-234C（配列番号４）、A2-5T（配列番号２）と
A2-234C（配列番号４）、A2-81C（配列番号３）とA2-23
8A（配列番号５）、A3-12A（配列番号６）とA3-273T
（配列番号１０）、A3-12G（配列番号７）とA3-273T
（配列番号１０）、A3-25T（配列番号８）とA3-273T
（配列番号１０）、A3-59G（配列番号９）とA3-273T
（配列番号１０）、A4-8C（配列番号１１）とA4-254G
（配列番号１２）から選ぶことができる。これらのプラ
イマー対およびそのＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ断片サイズ
を記載した表は図４に示す。なお本発明は、上記ＨＬＡ
−Ａ遺伝子タイピングに使用するための、少なくとも１
つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配列に特異的な
プライマー、または特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群から
なる少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共
通の塩基配列に特異的な各グループに対応するプライマ
ー（配列番号１〜配列番号３２）自身も含むものであ
る。
【００１９】またＢ法における、各特定のグループ内の
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物に特異的な切断部位
を与える制限酵素または全く切断部位を与えない制限酵
素は、Fok I、Bsr I、Hinf I、Msp I、Sac II、Bst N
I、Mnl I、Hae III、Hga I、Bsp1286 I、Fnu4H I、TspR
I、Nla III、Nla IV、Ava II、BsaJ I、BsaH I、PmaC
I、MspA1 Iから選ぶことができる。
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物に特異的な切断部位
を与える制限酵素または全く切断部位を与えない制限酵
素は、Fok I、Bsr I、Hinf I、Msp I、Sac II、Bst N
I、Mnl I、Hae III、Hga I、Bsp1286 I、Fnu4H I、TspR
I、Nla III、Nla IV、Ava II、BsaJ I、BsaH I、PmaC
I、MspA1 Iから選ぶことができる。
【００２０】ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子は新規なものが次々
と発見され、ＷＨＯ（世界保健機構）のＨＬＡ命名委員
会の報告書では１９９７月３月時点で８２種類の対立遺
伝子の存在が知られている。本発明はこれらの全ての対
立遺伝子を識別することが可能であるが、今後さらに発
見・登録される対立遺伝子の識別についても本発明で示
した方法若しくはそれに対する上記以外のプライマーや
制限酵素の追加などの容易な改変により、対応すること
は可能である。
と発見され、ＷＨＯ（世界保健機構）のＨＬＡ命名委員
会の報告書では１９９７月３月時点で８２種類の対立遺
伝子の存在が知られている。本発明はこれらの全ての対
立遺伝子を識別することが可能であるが、今後さらに発
見・登録される対立遺伝子の識別についても本発明で示
した方法若しくはそれに対する上記以外のプライマーや
制限酵素の追加などの容易な改変により、対応すること
は可能である。
【００２１】また本発明は、本明細書記載のＨＬＡ−Ａ
対立遺伝子型の判別方法に使用するためのキット、試薬
も提供することが可能である。さらに本発明は、本明細
書記載のプライマーを含むキット、試薬も提供すること
が可能である。該キットは、例えば本発明で開示されて
いるプライマー（配列番号１〜配列番号３２）を含む溶
液、ＰＣＲ緩衝液（濃縮溶液でもよい）、耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼおよび該キットの説明書（上記判定表を含
む）により構成される。前記プライマーは、プライマー
対若しくはプライマーセットの形で構成されていてもよ
く、該プライマーを含む溶液は凍結乾燥状態でもよい。
Ｂ法にＲＦＬＰ法を適用する場合、必要に応じて本発明
で開示されている制限酵素およびその制限酵素切断用緩
衝液を構成に加えてもよい。またＢ法にＳＳＯＰ法を適
用する場合、適当なオリゴヌクレオチドプローブ（標識
していても標識していなくてもよい）、変性液、ハイブ
リダイゼーション緩衝液、洗浄液および発色試薬（非標
識の場合）などを構成に加えてもよい。さらにゲノムＤ
ＮＡを単離するためのグアニジンチオシアネートバッフ
ァーなど、キットの構成は本発明の実施を促進する程度
で任意に追加することができる。
対立遺伝子型の判別方法に使用するためのキット、試薬
も提供することが可能である。さらに本発明は、本明細
書記載のプライマーを含むキット、試薬も提供すること
が可能である。該キットは、例えば本発明で開示されて
いるプライマー（配列番号１〜配列番号３２）を含む溶
液、ＰＣＲ緩衝液（濃縮溶液でもよい）、耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼおよび該キットの説明書（上記判定表を含
む）により構成される。前記プライマーは、プライマー
対若しくはプライマーセットの形で構成されていてもよ
く、該プライマーを含む溶液は凍結乾燥状態でもよい。
Ｂ法にＲＦＬＰ法を適用する場合、必要に応じて本発明
で開示されている制限酵素およびその制限酵素切断用緩
衝液を構成に加えてもよい。またＢ法にＳＳＯＰ法を適
用する場合、適当なオリゴヌクレオチドプローブ（標識
していても標識していなくてもよい）、変性液、ハイブ
リダイゼーション緩衝液、洗浄液および発色試薬（非標
識の場合）などを構成に加えてもよい。さらにゲノムＤ
ＮＡを単離するためのグアニジンチオシアネートバッフ
ァーなど、キットの構成は本発明の実施を促進する程度
で任意に追加することができる。
【００２２】本発明の実用法の手順の１つとしては、表
１に示したプライマー群の内、第２エクソンについては
A2-5CとA2-234C（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2
-2グループ）、A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組
のプライマー対のセット、第３エクソンについてはA3-1
2AとA3-273T（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2
グループ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59
GとA3-273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセ
ット、第４エクソンについてはA4-8CとA4-254G（A4-1グ
ループ）のプライマー対を用いて、被検ＤＮＡ試料より
ＰＣＲ増幅を行い、増幅したグループを特定する。この
とき１反応チューブに１プライマー対を用いて増幅を行
えばよい。次にそのグループ内の対立遺伝子を区別可能
な一連の制限酵素による処理を行い、ＤＮＡ断片サイズ
を判読し、判定表のサイズを参考にして、Ａ対立遺伝子
を特定する。なお、以上の操作で、１つの被検試料から
２種類以下のＡ対立遺伝子が特定できない場合には、必
要に応じて特定のＡ対立遺伝子またはＡ対立遺伝子群の
特定のグループに特異的なプライマー対によりＰＣＲ法
を施行し、増幅の有無を元にして特定する。
１に示したプライマー群の内、第２エクソンについては
A2-5CとA2-234C（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2
-2グループ）、A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組
のプライマー対のセット、第３エクソンについてはA3-1
2AとA3-273T（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2
グループ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59
GとA3-273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセ
ット、第４エクソンについてはA4-8CとA4-254G（A4-1グ
ループ）のプライマー対を用いて、被検ＤＮＡ試料より
ＰＣＲ増幅を行い、増幅したグループを特定する。この
とき１反応チューブに１プライマー対を用いて増幅を行
えばよい。次にそのグループ内の対立遺伝子を区別可能
な一連の制限酵素による処理を行い、ＤＮＡ断片サイズ
を判読し、判定表のサイズを参考にして、Ａ対立遺伝子
を特定する。なお、以上の操作で、１つの被検試料から
２種類以下のＡ対立遺伝子が特定できない場合には、必
要に応じて特定のＡ対立遺伝子またはＡ対立遺伝子群の
特定のグループに特異的なプライマー対によりＰＣＲ法
を施行し、増幅の有無を元にして特定する。
【００２３】
【表１】
【００２４】次に、前記本発明の実用法の手順の１つを
さらに詳細に説明する。
さらに詳細に説明する。
【００２５】以下にゲノムＤＮＡの調製方法の一例を説
明する。採取した血液より常法に従い白血球を分離し、
これにグアニジンチオシアネートバッファーなどを加え
て溶解させた後、フェノール抽出によりタンパク質を除
去する。これに酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し攪拌
後、冷エタノールを添加してゲノムＤＮＡを得る。この
ＤＮＡを用いて、以下のようにしてＨＬＡ−Ａ遺伝子の
型判定を行う。
明する。採取した血液より常法に従い白血球を分離し、
これにグアニジンチオシアネートバッファーなどを加え
て溶解させた後、フェノール抽出によりタンパク質を除
去する。これに酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し攪拌
後、冷エタノールを添加してゲノムＤＮＡを得る。この
ＤＮＡを用いて、以下のようにしてＨＬＡ−Ａ遺伝子の
型判定を行う。
【００２６】先ず、前記ＤＮＡを用いて上記表１に示し
たようなプライマーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ
遺伝子の第２、３、４エクソン領域の増幅を行う。
たようなプライマーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ
遺伝子の第２、３、４エクソン領域の増幅を行う。
【００２７】例えば、第２エクソンについてはA2-5CとA
2-234C（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グルー
プ）、A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライ
マー対のセットを用いる。増幅反応に用いる試薬は市販
のものを使用することができ、添付の説明書の指示に従
って行えばよいが、必要に応じ反応温度、時間、サイク
ル数などの条件を変えてもよい。増幅産物は常法に従
い、10％程度のポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、
エチジウムブロマイド染色してグループ特異的に増幅し
たバンドを検出することができる。また、ゲルはアガロ
ースなども用いることができ、ゲル濃度は必要に応じ変
えてもよい。
2-234C（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グルー
プ）、A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライ
マー対のセットを用いる。増幅反応に用いる試薬は市販
のものを使用することができ、添付の説明書の指示に従
って行えばよいが、必要に応じ反応温度、時間、サイク
ル数などの条件を変えてもよい。増幅産物は常法に従
い、10％程度のポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、
エチジウムブロマイド染色してグループ特異的に増幅し
たバンドを検出することができる。また、ゲルはアガロ
ースなども用いることができ、ゲル濃度は必要に応じ変
えてもよい。
【００２８】例えば、第３エクソンについてはA3-12Aと
A3-273T（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2グル
ープ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59GとA
3-273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセット
を用いる。以下第２エクソンと同様の工程で、ＰＣＲ法
によるＤＮＡ増幅を行い、電気泳動により増幅産物（グ
ループ特異的に増幅したバンド）を検出する。
A3-273T（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2グル
ープ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59GとA
3-273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセット
を用いる。以下第２エクソンと同様の工程で、ＰＣＲ法
によるＤＮＡ増幅を行い、電気泳動により増幅産物（グ
ループ特異的に増幅したバンド）を検出する。
【００２９】例えば、第４エクソンについてはA4-8CとA
4-254G（A4-1グループ）のプライマー対（セット）を用
いる。以下第２、３エクソンの検出と同様の工程で、Ｄ
ＮＡ増幅、増幅産物（グループ特異的に増幅したバン
ド）の検出を行う。
4-254G（A4-1グループ）のプライマー対（セット）を用
いる。以下第２、３エクソンの検出と同様の工程で、Ｄ
ＮＡ増幅、増幅産物（グループ特異的に増幅したバン
ド）の検出を行う。
【００３０】次に、グループとして判別された遺伝子群
に対してはＰＣＲ増幅産物をそれぞれのグループに特異
的な制限酵素を用いて切断する。例えば、あるグループ
はFok I、Bsr I、Hinf I、Msp I、Sac II、Bst N I、あ
るグループはFok I、 Hinf I、Msp I、あるグループはB
sr I、Bst N I、Mnl I、あるグループはFok I、Msp I、
Mnl I、Hae III、Hga I、あるグループはFok I、Bsr
I、Bsp1286 I、Fnu4H I、あるグループはBsp1286 I、Fn
u4H I、あるグループはTspR I、あるグループはPst Iあ
るいはBst N Iで切断する。また、必要に応じてNla II
I、Nla IV、Ava II、BsaJ I、Mnl I、BsaH I、PmaC I、
MspA1 I、TspR I、Bsp1286 I、Bsr Iのうちから制限酵
素を選択し、補助的な切断を行う。切断した増幅産物は
常法に従い、10％程度のポリアクリルアミドゲルで電気
泳動後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出
し、そのＲＦＬＰバンドパターンから判定表などに従っ
てＨＬＡ−Ａ遺伝子型を判定することができる。また前
記同様、ゲルはアガロースなども用いることができ、ゲ
ル濃度は必要に応じ変えてもよい。なお、制限酵素は市
販のものを使用することができ、添付の説明書の指示に
従って切断反応を行えばよい。
に対してはＰＣＲ増幅産物をそれぞれのグループに特異
的な制限酵素を用いて切断する。例えば、あるグループ
はFok I、Bsr I、Hinf I、Msp I、Sac II、Bst N I、あ
るグループはFok I、 Hinf I、Msp I、あるグループはB
sr I、Bst N I、Mnl I、あるグループはFok I、Msp I、
Mnl I、Hae III、Hga I、あるグループはFok I、Bsr
I、Bsp1286 I、Fnu4H I、あるグループはBsp1286 I、Fn
u4H I、あるグループはTspR I、あるグループはPst Iあ
るいはBst N Iで切断する。また、必要に応じてNla II
I、Nla IV、Ava II、BsaJ I、Mnl I、BsaH I、PmaC I、
MspA1 I、TspR I、Bsp1286 I、Bsr Iのうちから制限酵
素を選択し、補助的な切断を行う。切断した増幅産物は
常法に従い、10％程度のポリアクリルアミドゲルで電気
泳動後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出
し、そのＲＦＬＰバンドパターンから判定表などに従っ
てＨＬＡ−Ａ遺伝子型を判定することができる。また前
記同様、ゲルはアガロースなども用いることができ、ゲ
ル濃度は必要に応じ変えてもよい。なお、制限酵素は市
販のものを使用することができ、添付の説明書の指示に
従って切断反応を行えばよい。
【００３１】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によって判別できない
アリルの組み合わせ、例えば、A*0201=0207=0215N=022
0、A*0205=0208、A*0206=0221、A*0207=0215N、A*2402=
2405、A*2601=2605、A*7401=7402については、表１に示
したシークエンス特異的プライマーの対、A3-25AとA3-2
73T（A*0201特異的）、A3-25GとA-273T（A*0207特異
的）、A2-5TとA2-197T（A0201、A0205特異的）、A2-5T
とA2-197A（A*0208、A*0220特異的）、A2-87GとA2-234C
（A*0206特異的）、A2-87AとA2-234C（A*0221特異
的）、A4-8CとA4-224G（A*0207特異的）、A4-8CとA4-22
4T（A*0215N特異的）、A3-159AとA3-273T（A*2402特異
的）、A3-159CとA3-273T（A*2405特異的）、A2-226CとA
3-68G（A*2601特異的）、A2-226AとA3-68G（A*2605特異
的）、A1-67AとA2-234C（A*7401特異的）、A1-67TとA2-
234C（A*7402特異的）を用いてＰＣＲ−ＳＳＰ解析を行
い判別する。これらは、ＰＣＲ増幅の有無によってＨＬ
Ａ−Ａ遺伝子型を判定する。このとき１反応チューブに
１プライマー対を用いて増幅を行うが、該反応チューブ
に複数のプライマー対を入れて増幅させてもよい。実際
の検査・キットでは、例えばA*02アリル関連の３種類の
ＰＣＲ−ＳＳＰ解析、すなわちA*0201=0207、A*0201=02
20、A*0207=0215N用のＰＣＲ−ＳＳＰ反応を１チューブ
で行い、操作タスクや経費の削減を実現することができ
る。
アリルの組み合わせ、例えば、A*0201=0207=0215N=022
0、A*0205=0208、A*0206=0221、A*0207=0215N、A*2402=
2405、A*2601=2605、A*7401=7402については、表１に示
したシークエンス特異的プライマーの対、A3-25AとA3-2
73T（A*0201特異的）、A3-25GとA-273T（A*0207特異
的）、A2-5TとA2-197T（A0201、A0205特異的）、A2-5T
とA2-197A（A*0208、A*0220特異的）、A2-87GとA2-234C
（A*0206特異的）、A2-87AとA2-234C（A*0221特異
的）、A4-8CとA4-224G（A*0207特異的）、A4-8CとA4-22
4T（A*0215N特異的）、A3-159AとA3-273T（A*2402特異
的）、A3-159CとA3-273T（A*2405特異的）、A2-226CとA
3-68G（A*2601特異的）、A2-226AとA3-68G（A*2605特異
的）、A1-67AとA2-234C（A*7401特異的）、A1-67TとA2-
234C（A*7402特異的）を用いてＰＣＲ−ＳＳＰ解析を行
い判別する。これらは、ＰＣＲ増幅の有無によってＨＬ
Ａ−Ａ遺伝子型を判定する。このとき１反応チューブに
１プライマー対を用いて増幅を行うが、該反応チューブ
に複数のプライマー対を入れて増幅させてもよい。実際
の検査・キットでは、例えばA*02アリル関連の３種類の
ＰＣＲ−ＳＳＰ解析、すなわちA*0201=0207、A*0201=02
20、A*0207=0215N用のＰＣＲ−ＳＳＰ反応を１チューブ
で行い、操作タスクや経費の削減を実現することができ
る。
【００３２】また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰとＰＣＲ−ＳＳＰ
解析によって判別できないヘテロ接合体の組み合わせ、
例えば、A*0201/0208=0205/0220、A*0201/0205=0202/02
06、A*2402/2502=2407/2501、A*6602/6803＝6603/68012
については、表１に示したプライマーの対、A2-29AとA2
-197A（A*0220特異的）、A2-29AとA2-197T（A*0201、A*
0202特異的）、A2-81CとA2-229C（A*2501、A*2502特異
的）、A2-29TとA2-234C（A*68012、A*6803特異的）を用
いてＤＮＡ増幅を行う。増幅産物は常法に従い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動またはアガロース電気泳動
後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出するこ
とができる。
解析によって判別できないヘテロ接合体の組み合わせ、
例えば、A*0201/0208=0205/0220、A*0201/0205=0202/02
06、A*2402/2502=2407/2501、A*6602/6803＝6603/68012
については、表１に示したプライマーの対、A2-29AとA2
-197A（A*0220特異的）、A2-29AとA2-197T（A*0201、A*
0202特異的）、A2-81CとA2-229C（A*2501、A*2502特異
的）、A2-29TとA2-234C（A*68012、A*6803特異的）を用
いてＤＮＡ増幅を行う。増幅産物は常法に従い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動またはアガロース電気泳動
後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出するこ
とができる。
【００３３】そしてＰＣＲ増幅産物は制限酵素、例え
ば、Msp IあるいはBsr Iで切断し、前記同様ゲル電気泳
動などによりバンドを検出する。そして、そのＲＦＬＰ
バンドパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子型を判定する。
ば、Msp IあるいはBsr Iで切断し、前記同様ゲル電気泳
動などによりバンドを検出する。そして、そのＲＦＬＰ
バンドパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子型を判定する。
【００３４】
【実施例】次に、実際の既知試料を用いた実施例によっ
て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこ
れらのみに限定されるものではない。
て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこ
れらのみに限定されるものではない。
【００３５】実施例１１．ゲノムＤＮＡの単離 正常人より採取した血液（約10ml）より常法に従い分離
した白血球（試料１〜７）あるいはホモ接合体の培養細
胞株（試料８〜10）に500μlのグアニジンチオシアネー
トバッファー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMク
エン酸ナトリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサ
ルコシルナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加
えて溶解させた後、2回のフェノール抽出によりタンパ
ク質を除去した。これに３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）
を添加し攪拌後、2倍量の冷エタノールを添加してゲノ
ムＤＮＡを得た。このＤＮＡを用いて、以下のようにし
てＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行った。
した白血球（試料１〜７）あるいはホモ接合体の培養細
胞株（試料８〜10）に500μlのグアニジンチオシアネー
トバッファー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMク
エン酸ナトリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサ
ルコシルナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加
えて溶解させた後、2回のフェノール抽出によりタンパ
ク質を除去した。これに３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）
を添加し攪拌後、2倍量の冷エタノールを添加してゲノ
ムＤＮＡを得た。このＤＮＡを用いて、以下のようにし
てＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行った。
【００３６】２．ＰＣＲ法による選択的増幅 上記ＤＮＡを用いて、表１に示したアリルグループ特異
的プライマーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ遺伝子
の第２および第３エクソン領域の増幅を行った。
的プライマーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ遺伝子
の第２および第３エクソン領域の増幅を行った。
【００３７】第２エクソンについてはA2-5CとA2-234C
（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グループ）、
A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライマー対
のセットを用いた。反応溶液はゲノムＤＮＡを100ng、
あらかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反
応させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最
終濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2
は1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライ
マー対は0.2或いは2μMになるように添加した組成液
で、全量を50μlとして反応を行った。ＰＣＲ増幅装置
はGeneAmp PCR system9600を用いた。ＤＮＡ増幅は変性
（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング（62
或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33
サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物は常法に
従い、10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチジ
ウムブロマイド染色してグループ特異的に増幅したバン
ドを検出した。
（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グループ）、
A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライマー対
のセットを用いた。反応溶液はゲノムＤＮＡを100ng、
あらかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反
応させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最
終濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2
は1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライ
マー対は0.2或いは2μMになるように添加した組成液
で、全量を50μlとして反応を行った。ＰＣＲ増幅装置
はGeneAmp PCR system9600を用いた。ＤＮＡ増幅は変性
（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング（62
或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33
サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物は常法に
従い、10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチジ
ウムブロマイド染色してグループ特異的に増幅したバン
ドを検出した。
【００３８】図５に示したように試料６、８、９ではA2
-1グループ特異的な増幅が認められ、試料１、２、10で
はA2-2グループ特異的な増幅が認められた。また、試料
３、４、５、７、９、10ではA2-3グループ特異的な増幅
が認められた。
-1グループ特異的な増幅が認められ、試料１、２、10で
はA2-2グループ特異的な増幅が認められた。また、試料
３、４、５、７、９、10ではA2-3グループ特異的な増幅
が認められた。
【００３９】第３エクソンについてはA3-12AとA3-273T
（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2グルー
プ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59GとA3-
273T（Ａ３−４グループ）の４組のプライマー対のセッ
トを用いた。反応溶液は、ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、
あらかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反
応させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最
終濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2
は1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライ
マー対は0.2μMになるように添加した組成液で、全量を
50μlとして反応を行った。以下第２エクソンと同様
に、ＰＣＲ増幅装置はGeneAmp PCR system 9600を用
い、ＤＮＡ増幅は変性（94℃）を２分行った後、変性30
秒、アニーリング（62或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長
（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り返すことにより行
った。増幅産物は10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
後、エチジウムブロマイド染色してグループ特異的に増
幅したバンドを検出した。
（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2グルー
プ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59GとA3-
273T（Ａ３−４グループ）の４組のプライマー対のセッ
トを用いた。反応溶液は、ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、
あらかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反
応させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最
終濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2
は1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライ
マー対は0.2μMになるように添加した組成液で、全量を
50μlとして反応を行った。以下第２エクソンと同様
に、ＰＣＲ増幅装置はGeneAmp PCR system 9600を用
い、ＤＮＡ増幅は変性（94℃）を２分行った後、変性30
秒、アニーリング（62或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長
（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り返すことにより行
った。増幅産物は10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
後、エチジウムブロマイド染色してグループ特異的に増
幅したバンドを検出した。
【００４０】図６に示したように試料５、６、７、８、
９ではA3-1グループ特異的な増幅が認められ、試料１、
２ではA3-2グループ特異的な増幅が認められた。また、
試料３、４、９、10ではA3-3グループ特異的な増幅が認
められ、試料10ではA3-4グループ特異的な増幅が認めら
れた。
９ではA3-1グループ特異的な増幅が認められ、試料１、
２ではA3-2グループ特異的な増幅が認められた。また、
試料３、４、９、10ではA3-3グループ特異的な増幅が認
められ、試料10ではA3-4グループ特異的な増幅が認めら
れた。
【００４１】３．増幅産物の制限酵素処理 第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増幅産物はそれ
ぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて切断した。
すなわち、A2-1グループはFok I、Bsr I、HinfI、Msp
I、Sac II、Bst N I、A2-2グループはFok I、 Hinf I、
Msp I、A2-3グループはBsr I、Bst N I、Mnl I、A3-1グ
ループはFok I、Msp I、Mnl I、Hae III、Hga I、A3-2
グループはFok I、Bsr I、Bsp1286 I、Fnu4H I、A3-3グ
ループはBsp1286 I、Fnu4H I、A3-4グループはTspR Iで
切断した。また、必要に応じてNla III、Nla IV、Ava I
I、BsaJ I、Mnl I、BsaH I、PmaC I、MspA1 I、TspR
I、Bsp1286 I、Bsr Iのうちから制限酵素を選択し、補
助的な切断を行った。
ぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて切断した。
すなわち、A2-1グループはFok I、Bsr I、HinfI、Msp
I、Sac II、Bst N I、A2-2グループはFok I、 Hinf I、
Msp I、A2-3グループはBsr I、Bst N I、Mnl I、A3-1グ
ループはFok I、Msp I、Mnl I、Hae III、Hga I、A3-2
グループはFok I、Bsr I、Bsp1286 I、Fnu4H I、A3-3グ
ループはBsp1286 I、Fnu4H I、A3-4グループはTspR Iで
切断した。また、必要に応じてNla III、Nla IV、Ava I
I、BsaJ I、Mnl I、BsaH I、PmaC I、MspA1 I、TspR
I、Bsp1286 I、Bsr Iのうちから制限酵素を選択し、補
助的な切断を行った。
【００４２】図７〜１０に試料２、３、６、８の実際の
ＲＦＬＰパターンを示した。試料２ではA2-2とA3-2グル
ープのＲＦＬＰ解析を行い、試料３ではA2-3とA3-3グル
ープのＲＦＬＰ解析を行った。また、試料６、８ではA2
-1とA3-1グループのＲＦＬＰ解析を行った。判定表（図
１〜図３）を用いて、それぞれのＲＦＬＰパターンから
ＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行った。同様にして他の試
料についても判定表を用いてＲＦＬＰパターンからＨＬ
Ａ−Ａ遺伝子の型判定を行った。
ＲＦＬＰパターンを示した。試料２ではA2-2とA3-2グル
ープのＲＦＬＰ解析を行い、試料３ではA2-3とA3-3グル
ープのＲＦＬＰ解析を行った。また、試料６、８ではA2
-1とA3-1グループのＲＦＬＰ解析を行った。判定表（図
１〜図３）を用いて、それぞれのＲＦＬＰパターンから
ＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行った。同様にして他の試
料についても判定表を用いてＲＦＬＰパターンからＨＬ
Ａ−Ａ遺伝子の型判定を行った。
【００４３】さらに、試料１については第４エキソンの
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析、すなわち第４エキソンに対する
PCR増幅産物はPst IあるいはBst N Iで切断した。
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析、すなわち第４エキソンに対する
PCR増幅産物はPst IあるいはBst N Iで切断した。
【００４４】４．ＰＣＲ−ＳＳＰによる解析 試料１、４、９、10については必要に応じたＰＣＲ−Ｓ
ＳＰ解析を行った。すなわち、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によ
って判別できないアリルの組み合わせ、A*0201=0207=02
15N=0220、A*0205=0208、A*0206=0221、A*0207=0215N、
A*2402=2405、A*2601=2605、A*7401=7402については、
表１に示したシークエンス特異的プライマーの対、A3-2
5AとA3-273T（A*0201特異的）、A3-25GとA-273T（A*020
7特異的）、A2-5TとA2-197T（A0201、A0205特異的）、A
2-5TとA2-197A（A*0208、A*0220特異的）、A2-87GとA2-
234C（A*0206特異的）、A2-87AとA2-234C（A*0221特異
的）、A4-8CとA4-224G（A*0207特異的）、A4-8CとA4-22
4T（A*0215N特異的）、A3-159AとA3-273T（A*2402特異
的）、A3-159CとA3-273T（A*2405特異的）、A2-226CとA
3-68G（A*2601特異的）、A2-226AとA3-68G（A*2605特異
的）、A1-67AとA2-234C（A*7401特異的）、A1-67TとA2-
234C（A*7402特異的）を用いたＰＣＲ−ＳＳＰ解析によ
り判別を行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あ
らかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応
させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1unit、そして最終
濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は
1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマ
ー対は0.2或いは0.4μMになるように添加した組成液
で、全量を50μlとして反応を行った。ＤＮＡ増幅はGen
eAmpPCR system 9600などのＰＣＲ増幅装置を用い、変
性（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング
（62或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応
を33サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物は常
法に従い、10％程度のポリアクリルアミドゲルで電気泳
動後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出し
た。
ＳＰ解析を行った。すなわち、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によ
って判別できないアリルの組み合わせ、A*0201=0207=02
15N=0220、A*0205=0208、A*0206=0221、A*0207=0215N、
A*2402=2405、A*2601=2605、A*7401=7402については、
表１に示したシークエンス特異的プライマーの対、A3-2
5AとA3-273T（A*0201特異的）、A3-25GとA-273T（A*020
7特異的）、A2-5TとA2-197T（A0201、A0205特異的）、A
2-5TとA2-197A（A*0208、A*0220特異的）、A2-87GとA2-
234C（A*0206特異的）、A2-87AとA2-234C（A*0221特異
的）、A4-8CとA4-224G（A*0207特異的）、A4-8CとA4-22
4T（A*0215N特異的）、A3-159AとA3-273T（A*2402特異
的）、A3-159CとA3-273T（A*2405特異的）、A2-226CとA
3-68G（A*2601特異的）、A2-226AとA3-68G（A*2605特異
的）、A1-67AとA2-234C（A*7401特異的）、A1-67TとA2-
234C（A*7402特異的）を用いたＰＣＲ−ＳＳＰ解析によ
り判別を行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あ
らかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応
させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1unit、そして最終
濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は
1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマ
ー対は0.2或いは0.4μMになるように添加した組成液
で、全量を50μlとして反応を行った。ＤＮＡ増幅はGen
eAmpPCR system 9600などのＰＣＲ増幅装置を用い、変
性（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング
（62或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応
を33サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物は常
法に従い、10％程度のポリアクリルアミドゲルで電気泳
動後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出し
た。
【００４５】５．ヘテロ接合体の組み合わせの解析 また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰとＰＣＲ−ＳＳＰ解析によって
判別できないヘテロ接合体の組み合わせ、A*0201/0208=
0205/0220、A*0201/0205=0202/0206、A*2402/2502=2407
/2501、A*6602/6803＝6603/68012については、表１に示
したプライマーの対、A2-29AとA2-197A（A*0220特異
的）、A2-29AとA2-197T（A*0201、A*0202特異的）、A2-
81CとA2-229C（A*2501、A*2502特異的）、A2-29TとA2-2
34C（A*68012、A*6803特異的）を用いてＤＮＡ増幅を行
った。反応液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あらかじめ等
量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応させた耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終濃度がTris
-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は1.5mM、Trit
onX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマー対は0.2或
いは0.4μMになるように添加した組成液で、全量を50μ
lとして反応を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR syste
m 9600などのＰＣＲ増幅装置を用い、変性（94℃）を２
分行った後、変性30秒、アニーリング（59或いは62℃）
45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り
返すことにより行った。増幅産物は常法に従い、10％程
度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブ
ロマイド染色してバンドを検出した。
判別できないヘテロ接合体の組み合わせ、A*0201/0208=
0205/0220、A*0201/0205=0202/0206、A*2402/2502=2407
/2501、A*6602/6803＝6603/68012については、表１に示
したプライマーの対、A2-29AとA2-197A（A*0220特異
的）、A2-29AとA2-197T（A*0201、A*0202特異的）、A2-
81CとA2-229C（A*2501、A*2502特異的）、A2-29TとA2-2
34C（A*68012、A*6803特異的）を用いてＤＮＡ増幅を行
った。反応液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あらかじめ等
量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応させた耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終濃度がTris
-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は1.5mM、Trit
onX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマー対は0.2或
いは0.4μMになるように添加した組成液で、全量を50μ
lとして反応を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR syste
m 9600などのＰＣＲ増幅装置を用い、変性（94℃）を２
分行った後、変性30秒、アニーリング（59或いは62℃）
45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り
返すことにより行った。増幅産物は常法に従い、10％程
度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブ
ロマイド染色してバンドを検出した。
【００４６】そしてＰＣＲ増幅産物は制限酵素Msp Iあ
るいはBsr Iで切断した。切断した増幅産物は前記と同
様、常法に従い、10％程度のポリアクリルアミドゲル電
気泳動後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出
し、そのＲＦＬＰバンドパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子
型を判定した。
るいはBsr Iで切断した。切断した増幅産物は前記と同
様、常法に従い、10％程度のポリアクリルアミドゲル電
気泳動後、エチジウムブロマイド染色してバンドを検出
し、そのＲＦＬＰバンドパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子
型を判定した。
【００４７】このようにして判定されたＨＬＡ−Ａ遺伝
子型を表２に示す。
子型を表２に示す。
【表２】
【００４８】実施例２ 正常人より採取した血液（約10ml）より常法に従い分離
した白血球に500μlのグアニジンチオシアネートバッフ
ァー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMクエン酸ナ
トリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサルコシル
ナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加えて溶解
させた後、2回のフェノール抽出によりタンパク質を除
去した。これに３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し
攪拌後、2倍量の冷エタノールを添加してゲノムＤＮＡ
を得た。
した白血球に500μlのグアニジンチオシアネートバッフ
ァー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMクエン酸ナ
トリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサルコシル
ナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加えて溶解
させた後、2回のフェノール抽出によりタンパク質を除
去した。これに３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し
攪拌後、2倍量の冷エタノールを添加してゲノムＤＮＡ
を得た。
【００４９】上記ＤＮＡを用いて、表１に示したアリル
グループ特異的プライマーを用いたＰＣＲ法によりＨＬ
Ａ−Ａ遺伝子の第２および第３エクソン領域の増幅を行
った。
グループ特異的プライマーを用いたＰＣＲ法によりＨＬ
Ａ−Ａ遺伝子の第２および第３エクソン領域の増幅を行
った。
【００５０】第２エクソンについてはA2-5CとA2-234C
（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グループ）、
A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライマー対
のセットを用いた。反応溶液はゲノムＤＮＡを100ng、
あらかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反
応させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最
終濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2
は1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライ
マー対は0.2或いは2μMになるように添加した組成液
で、全量を50μlとして反応を行った。ＰＣＲ増幅装置
はGeneAmp PCR system9600を用いた。ＤＮＡ増幅は変性
（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング（62
或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33
サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物を常法に
従い、10％程度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、
エチジウムブロマイド染色した結果、A2-1及びA2-2グル
ープ特異的に増幅したバンドを検出した。
（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グループ）、
A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライマー対
のセットを用いた。反応溶液はゲノムＤＮＡを100ng、
あらかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反
応させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最
終濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2
は1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライ
マー対は0.2或いは2μMになるように添加した組成液
で、全量を50μlとして反応を行った。ＰＣＲ増幅装置
はGeneAmp PCR system9600を用いた。ＤＮＡ増幅は変性
（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング（62
或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33
サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物を常法に
従い、10％程度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、
エチジウムブロマイド染色した結果、A2-1及びA2-2グル
ープ特異的に増幅したバンドを検出した。
【００５１】第３エクソンについてはA3-12AとA3-273T
（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2グルー
プ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59GとA3-
273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセットを
用いた。反応溶液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あらかじ
め等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応させた
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終濃度が
Tris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は1.5mM、
TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマー対は
0.2μMになるように添加した組成液で、全量を50μlと
して反応を行った。以下第２エクソンと同様に、ＰＣＲ
増幅装置はGeneAmp PCR system 9600を用い、ＤＮＡ増
幅は変性（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリ
ング（62或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の
反応を33サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物
を10％程度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチ
ジウムブロマイド染色した結果、A3-1及びA3-2グループ
特異的に増幅したバンドを検出した。
（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2グルー
プ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59GとA3-
273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセットを
用いた。反応溶液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あらかじ
め等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応させた
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終濃度が
Tris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は1.5mM、
TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマー対は
0.2μMになるように添加した組成液で、全量を50μlと
して反応を行った。以下第２エクソンと同様に、ＰＣＲ
増幅装置はGeneAmp PCR system 9600を用い、ＤＮＡ増
幅は変性（94℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリ
ング（62或いは67℃）45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の
反応を33サイクル繰り返すことにより行った。増幅産物
を10％程度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチ
ジウムブロマイド染色した結果、A3-1及びA3-2グループ
特異的に増幅したバンドを検出した。
【００５２】第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増
幅産物はそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した。すなわち、A2-1グループはFok I、Bsr I、
HinfI、Msp I、Sac II、Bst N I、A2-2グループはFok
I、 Hinf I、Msp I、A3-1グループはFok I、Msp I、Mnl
I、Hae III、Hga I、A3-2グループはFok I、Bsr I、Bs
p1286 I、Fnu4H Iで切断した。切断したＰＣＲ増幅産物
は10%程度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチ
ジウムブロマイド染色した。
幅産物はそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した。すなわち、A2-1グループはFok I、Bsr I、
HinfI、Msp I、Sac II、Bst N I、A2-2グループはFok
I、 Hinf I、Msp I、A3-1グループはFok I、Msp I、Mnl
I、Hae III、Hga I、A3-2グループはFok I、Bsr I、Bs
p1286 I、Fnu4H Iで切断した。切断したＰＣＲ増幅産物
は10%程度のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチ
ジウムブロマイド染色した。
【００５３】A2-1、A2-2、A3-1、A3-2グループのＲＦＬ
Ｐ解析後、判定表（図１〜図３）を用いて、それぞれの
ＲＦＬＰパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行っ
た。A2-1グループのＲＦＬＰ解析からはA*1101=1102=11
03-1104と判定された。A2-2グループのＲＦＬＰ解析か
らはA*0201=0203=0204=0207=0209=0212=0213=0215N=021
6=0217=0218=0219=0220と判定された。A3-1グループの
ＲＦＬＰ解析からはA*1101=1102=1103と判定された。A3-
2グループのＲＦＬＰ解析からはA*0201=0206=0207=0209
=0211=0215N=0220=0221=6901と判定された。さらに、A2-
1グループはNlaIVによって補助的に切断することによっ
てA*1101=1103=1104、A3-1グループはNla IIIで補助的
に切断することによってA*1101=1102と判定された。こ
れら第２および第３エキソンの判定結果を合せることに
よって、ＨＬＡ−Ａ遺伝子型はA*1101とA*0201=0207=02
09=0215N=0220と判定された。
Ｐ解析後、判定表（図１〜図３）を用いて、それぞれの
ＲＦＬＰパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行っ
た。A2-1グループのＲＦＬＰ解析からはA*1101=1102=11
03-1104と判定された。A2-2グループのＲＦＬＰ解析か
らはA*0201=0203=0204=0207=0209=0212=0213=0215N=021
6=0217=0218=0219=0220と判定された。A3-1グループの
ＲＦＬＰ解析からはA*1101=1102=1103と判定された。A3-
2グループのＲＦＬＰ解析からはA*0201=0206=0207=0209
=0211=0215N=0220=0221=6901と判定された。さらに、A2-
1グループはNlaIVによって補助的に切断することによっ
てA*1101=1103=1104、A3-1グループはNla IIIで補助的
に切断することによってA*1101=1102と判定された。こ
れら第２および第３エキソンの判定結果を合せることに
よって、ＨＬＡ−Ａ遺伝子型はA*1101とA*0201=0207=02
09=0215N=0220と判定された。
【００５４】さらに、第２および第３エキソンのＲＦＬ
Ｐ解析によって判別できないアリルの組み合せ、A*0201
=0207=0209=0215N=0220については第４エキソンのＰＣ
Ｒ−ＲＦＬＰ解析、すなわち第４エキソンに対するPCR
増幅産物をPst Iで切断することによって、A*0201=0207
=0215N=0220と判定された。
Ｐ解析によって判別できないアリルの組み合せ、A*0201
=0207=0209=0215N=0220については第４エキソンのＰＣ
Ｒ−ＲＦＬＰ解析、すなわち第４エキソンに対するPCR
増幅産物をPst Iで切断することによって、A*0201=0207
=0215N=0220と判定された。
【００５５】上記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によっても判別で
きないアリルの組み合わせ、A*0201=0207=0215N=0220に
ついては、表１に示したシークエンス特異的プライマー
の対、A3-25AとA3-273T（A*0201特異的）、A3-25GとA-2
73T（A*0207特異的）、A2-5TとA2-197T（A0201、A0205
特異的）、A2-5TとA2-197A（A*0208、A*0220特異的）、
A4-8CとA4-224G（A*0207特異的）、A4-8CとA4-224T（A*
0215N特異的）を用いたＰＣＲ−ＳＳＰ解析により判別
を行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あらかじ
め等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応させた
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終濃度が
Tris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は1.5mM、
TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマー対は
0.2或いは0.4μMになるように添加した組成液で、全量
を50μlとして反応を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR
system 9600などのＰＣＲ増幅装置を用い、変性（94
℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング（62℃）
45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り
返すことにより行った。増幅産物は常法に従い、10％程
度のポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、エチジウム
ブロマイド染色してバンドを検出した。こうしたＰＣＲ
−ＳＳＰ解析によってA*0201=0207=0215N=0220はA*0201
と判別された。
きないアリルの組み合わせ、A*0201=0207=0215N=0220に
ついては、表１に示したシークエンス特異的プライマー
の対、A3-25AとA3-273T（A*0201特異的）、A3-25GとA-2
73T（A*0207特異的）、A2-5TとA2-197T（A0201、A0205
特異的）、A2-5TとA2-197A（A*0208、A*0220特異的）、
A4-8CとA4-224G（A*0207特異的）、A4-8CとA4-224T（A*
0215N特異的）を用いたＰＣＲ−ＳＳＰ解析により判別
を行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あらかじ
め等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応させた
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終濃度が
Tris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は1.5mM、
TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマー対は
0.2或いは0.4μMになるように添加した組成液で、全量
を50μlとして反応を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR
system 9600などのＰＣＲ増幅装置を用い、変性（94
℃）を２分行った後、変性30秒、アニーリング（62℃）
45秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り
返すことにより行った。増幅産物は常法に従い、10％程
度のポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、エチジウム
ブロマイド染色してバンドを検出した。こうしたＰＣＲ
−ＳＳＰ解析によってA*0201=0207=0215N=0220はA*0201
と判別された。
【００５６】このようにしてＨＬＡ−Ａ遺伝子型はA*02
01／1101と判別された。
01／1101と判別された。
【００５７】実施例３ 正常人より採取した血液（約10ml）より常法に従い分離
した白血球に500μlのグアニジンチオシアネートバッフ
ァー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMクエン酸ナ
トリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサルコシル
ナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加えて溶解
させた後、2回のフェノール抽出によりタンパク質を除
去した。これに３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し
攪拌後、2倍量の冷エタノールを添加してゲノムＤＮＡ
（試料11、12）を得た。
した白血球に500μlのグアニジンチオシアネートバッフ
ァー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMクエン酸ナ
トリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサルコシル
ナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加えて溶解
させた後、2回のフェノール抽出によりタンパク質を除
去した。これに３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し
攪拌後、2倍量の冷エタノールを添加してゲノムＤＮＡ
（試料11、12）を得た。
【００５８】上記ＤＮＡ試料11、12を用いて、表１に示
したＨＬＡ−Ａ対立遺伝子A*3301の塩基配列に特異的プ
ライマー（シークエンス特異的プライマー）、およびア
リルグループ特異的プライマーを用いてＰＣＲ法を行
い、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子A*3301およびＨＬＡ−Ａ遺伝
子の第２および第３エクソン領域の増幅を行った。
したＨＬＡ−Ａ対立遺伝子A*3301の塩基配列に特異的プ
ライマー（シークエンス特異的プライマー）、およびア
リルグループ特異的プライマーを用いてＰＣＲ法を行
い、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子A*3301およびＨＬＡ−Ａ遺伝
子の第２および第３エクソン領域の増幅を行った。
【００５９】ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子A*3301塩基配列特異
的ＰＣＲ増幅についてはA3-71GとA3-240Gの１組のプラ
イマー対を用いた。第２エクソンについてはA2-5CとA2-
234C（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グルー
プ）、A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライ
マー対のセットを用いた。第３エクソンについてはA3-1
2AとA3-273T（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2
グループ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59
GとA3-273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセ
ットを用いた。反応溶液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あ
らかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応
させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終
濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は
1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマ
ー対は0.2μMになるように添加した組成液で、全量を50
μlとして反応を行った。ＰＣＲ増幅装置はGeneAmp PCR
system 9600を用い、ＤＮＡ増幅は変性（94℃）を２分
行った後、変性30秒、アニーリング（62或いは67℃）45
秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り返
すことにより行った。増幅産物を10％程度のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し
た結果、図１１に示したように試料11ではA*3301、A2-1
およびA3-1グループ特異的な増幅が認められ、試料11の
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の一方はA*3301と判別された。試
料12ではA2-1およびA3-1グループ特異的な増幅が認めら
れた。しかし、A*3301特異的な増幅が認められなかった
ので試料12はA*3301を持たないことが分かった。
的ＰＣＲ増幅についてはA3-71GとA3-240Gの１組のプラ
イマー対を用いた。第２エクソンについてはA2-5CとA2-
234C（A2-1グループ）、A2-5TとA2-234C（A2-2グルー
プ）、A2-81CとA2-238A（A2-3グループ）の3組のプライ
マー対のセットを用いた。第３エクソンについてはA3-1
2AとA3-273T（A3-1グループ）、A3-12GとA3-273T（A3-2
グループ）、A3-25TとA2-273T（A3-3グループ）、A3-59
GとA3-273T（A3-4グループ）の４組のプライマー対のセ
ットを用いた。反応溶液は、ゲノムＤＮＡを100ng、あ
らかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応
させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを1 unit、そして最終
濃度がTris-HCl（pH8.3）は10mM、KClは50mM、MgCl2は
1.5mM、TritonX-100は0.1％、dNTPsは200μM、プライマ
ー対は0.2μMになるように添加した組成液で、全量を50
μlとして反応を行った。ＰＣＲ増幅装置はGeneAmp PCR
system 9600を用い、ＤＮＡ増幅は変性（94℃）を２分
行った後、変性30秒、アニーリング（62或いは67℃）45
秒、ＤＮＡ伸長（72℃）30秒の反応を33サイクル繰り返
すことにより行った。増幅産物を10％程度のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し
た結果、図１１に示したように試料11ではA*3301、A2-1
およびA3-1グループ特異的な増幅が認められ、試料11の
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の一方はA*3301と判別された。試
料12ではA2-1およびA3-1グループ特異的な増幅が認めら
れた。しかし、A*3301特異的な増幅が認められなかった
ので試料12はA*3301を持たないことが分かった。
【００６０】第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増
幅産物はそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した。すなわち、A2-1グループはFok I、Bsr I、
HinfI、Msp I、Sac II、Bst N I、A3-1グループはFok
I、Msp I、Mnl I、Hae III、Hga Iで切断した。また、
試料11のA3-1グループについてはPmaC Iで補助的な切断
を行った。切断したＰＣＲ増幅産物は10%程度のポリア
クリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染
色した。
幅産物はそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した。すなわち、A2-1グループはFok I、Bsr I、
HinfI、Msp I、Sac II、Bst N I、A3-1グループはFok
I、Msp I、Mnl I、Hae III、Hga Iで切断した。また、
試料11のA3-1グループについてはPmaC Iで補助的な切断
を行った。切断したＰＣＲ増幅産物は10%程度のポリア
クリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染
色した。
【００６１】図１２、１３に試料11、12の実際のＲＦＬ
Ｐパターンを示した。A2-1、A3-1、グループのＲＦＬＰ
解析後、判定表（図１〜図３）を用いて、それぞれのＲ
ＦＬＰパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行っ
た。試料11については、A2-1グループのＲＦＬＰ解析か
らA*3301=3303／3401=3402=6601=6602=68011=6901=6801
2=6802と判定された。またA3-1グループのＲＦＬＰ解析
からA*31012=3301=3303／6602=6603と判定された。これ
ら第２および第３エキソンの判定結果を合せることによ
ってA*3301=3303／6602と判定された。すでにA*3301塩
基配列に特異的な増幅が認められているので、試料11の
ＨＬＡ−Ａ遺伝子型はA*3301とA*6602と判定された。試
料12についてはA2-1グループのＲＦＬＰ解析からA*3301
=3303／31012と判定された。A3-1グループのＲＦＬＰ解
析からA*31012=3301=3303／A*31012=3301=3303と判定さ
れた。これら第２および第３エキソンの判定結果を合せ
ることによって、A*31012／3301=3303と判定された。す
でにA*3301塩基配列特異的な増幅が認められていないの
で、試料12のＨＬＡ−Ａ遺伝子型はA*31012とA*3303と
判定された。
Ｐパターンを示した。A2-1、A3-1、グループのＲＦＬＰ
解析後、判定表（図１〜図３）を用いて、それぞれのＲ
ＦＬＰパターンからＨＬＡ−Ａ遺伝子の型判定を行っ
た。試料11については、A2-1グループのＲＦＬＰ解析か
らA*3301=3303／3401=3402=6601=6602=68011=6901=6801
2=6802と判定された。またA3-1グループのＲＦＬＰ解析
からA*31012=3301=3303／6602=6603と判定された。これ
ら第２および第３エキソンの判定結果を合せることによ
ってA*3301=3303／6602と判定された。すでにA*3301塩
基配列に特異的な増幅が認められているので、試料11の
ＨＬＡ−Ａ遺伝子型はA*3301とA*6602と判定された。試
料12についてはA2-1グループのＲＦＬＰ解析からA*3301
=3303／31012と判定された。A3-1グループのＲＦＬＰ解
析からA*31012=3301=3303／A*31012=3301=3303と判定さ
れた。これら第２および第３エキソンの判定結果を合せ
ることによって、A*31012／3301=3303と判定された。す
でにA*3301塩基配列特異的な増幅が認められていないの
で、試料12のＨＬＡ−Ａ遺伝子型はA*31012とA*3303と
判定された。
【００６２】
【００６３】本発明によれば、少なくとも１つの特定の
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー
対、および特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少な
くとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基
配列に特異的な各グループに対応するプライマー対のセ
ットによるＰＣＲ増幅と、さらに各特定のグループ内の
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物の特異的な制限酵素
処理（ＲＦＬＰ法）等により、1種類の対立遺伝子を判
別することができるので、従来の血清学的方法によるＨ
ＬＡ−Ａローカス抗原タイピングの測定上の問題を解決
し、従来法では識別分類が不可能であったＡ抗原のサブ
タイプを遺伝子レベルで分類（アリルタイピング）する
ことが可能になる。そして本発明はその方法およびそれ
に用いるキット、試薬を提供するものであり、これらは
臨床医学領域の臓器移植の際のドナー・レシピエント間
の適合性の判定や各種疾病との相関性解析などにおいて
有用となる。
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー
対、および特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少な
くとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基
配列に特異的な各グループに対応するプライマー対のセ
ットによるＰＣＲ増幅と、さらに各特定のグループ内の
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の増幅産物の特異的な制限酵素
処理（ＲＦＬＰ法）等により、1種類の対立遺伝子を判
別することができるので、従来の血清学的方法によるＨ
ＬＡ−Ａローカス抗原タイピングの測定上の問題を解決
し、従来法では識別分類が不可能であったＡ抗原のサブ
タイプを遺伝子レベルで分類（アリルタイピング）する
ことが可能になる。そして本発明はその方法およびそれ
に用いるキット、試薬を提供するものであり、これらは
臨床医学領域の臓器移植の際のドナー・レシピエント間
の適合性の判定や各種疾病との相関性解析などにおいて
有用となる。
【配列表】<110> Shionogi & Co.,LTD. <120> Methods for HLA-A DNA typing <130> A005941 <150> JP 297145/1997 <151> 1997-10-29 <160> 32 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-5C <400> 1 SCTCGTCCCC AGGCTCC 17 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-5T <400> 2 TCCTCGTCCC CAGGCTCT 18 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-81C <400> 3 AGCCCCGCTT CATCGCC 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-234C <400> 4 TAGCCGCGCA GGGTCCC 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-238A <400> 5 TTGTAGTAGC GGAGCGCGA 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-12A <400> 6 GGCCAGGTTC TCACACCA 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-12G <400> 7 GGCCAGGTTC TCACACCG 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-25T <400> 8 CACACCCTCC AGATGATGTT 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-59G <400> 9 TCGGACTGGC GCTTCCTG 18 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-273T <400> 10 TGGCCCCTGG TACCCGT 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A4-8C <400> 11 TCCYGWCAGA CSCCCCC 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A4-254G <400> 12 CTCAGGGTGA GGGGCTTG 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A1-67A <400> 13 GGCCCTGACC CAGACCA 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A1-67T <400> 14 GGCCCTGACC CAGACCT 17 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-87G <400> 15 CAGTGGGCTA CGTGGACG 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-87A <400> 16 CAGTGGGCTA CGTGGACA 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-226A <400> 17 ACTCACAGAC TGACCGAGA 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-226C <400> 18 ACTCACAGAC TGACCGAGC 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-197A <400> 19 CTGTGASTGG GCCTTCACA 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-197T <400> 20 CTGTGASTGG GCCTTCACT 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-25A <400> 21 ACACCGTCCA GAGGATGTA 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-25G <400> 22 ACACCGTCCA GAGGATGTG 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-68G <400> 23 TCGTAAGCGT CCTGCTGG 18 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> PCR primer A3-159A <400> 24 ATGGCGGCTC AGATCACCA 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-159C <400> 25 TGGCGGCTCA GATCACCC 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A4-224G <400> 26 ATGCTGCACA TGGCAGGTG 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A4-224T <400> 27 ATGCTGCACA TGGCAGGTT 19 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-29A <400> 28 TCCATGAGGT ATTTCTACAC A 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-29T <400> 29 TCCATGAGGT ATTTCTACAC T 21 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A2-229C <400> 30 GAGCGCGATC CGCAGGC 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-71G <400> 31 TCCTCCGCGG GTACCAG 17 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer A3-240G <400> 32 CTTCCCGTTC TCCAGGTG 18
【図１】 既知のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型（ＨＬＡ−Ａ
アリルの第２エクソン）のＤＮＡ断片サイズ（ＲＦＬＰ
バンドパターン）を記載した判定表を示す図である。
アリルの第２エクソン）のＤＮＡ断片サイズ（ＲＦＬＰ
バンドパターン）を記載した判定表を示す図である。
【図２】 既知のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型（ＨＬＡ−Ａ
アリルの第３エクソン）のＤＮＡ断片サイズ（ＲＦＬＰ
バンドパターン）を記載した判定表を示す図である。
アリルの第３エクソン）のＤＮＡ断片サイズ（ＲＦＬＰ
バンドパターン）を記載した判定表を示す図である。
【図３】 既知のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型（ＨＬＡ−Ａ
アリルの第３，４エクソン）のＤＮＡ断片サイズ（ＲＦ
ＬＰバンドパターン）を記載した判定表を示す図であ
る。
アリルの第３，４エクソン）のＤＮＡ断片サイズ（ＲＦ
ＬＰバンドパターン）を記載した判定表を示す図であ
る。
【図４】 少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子の塩基配列に特異的なプライマー対、または特定のＨ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定の
グループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グ
ループに対応するプライマー対、およびそのＰＣＲ増幅
産物のＤＮＡ断片サイズ記載した表を示す図である。
子の塩基配列に特異的なプライマー対、または特定のＨ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定の
グループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な各グ
ループに対応するプライマー対、およびそのＰＣＲ増幅
産物のＤＮＡ断片サイズ記載した表を示す図である。
【図５】 表１に示したアリルグループ特異的プライマ
ーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ遺伝子の第２エク
ソン領域の増幅を行った結果を示す。
ーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ遺伝子の第２エク
ソン領域の増幅を行った結果を示す。
【図６】 表１に示したアリルグループ特異的プライマ
ーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ遺伝子の第３エク
ソン領域の増幅を行った結果を示す。なお、試料ナンバ
ーは図５に記載のものと同じである。
ーを用いたＰＣＲ法によりＨＬＡ−Ａ遺伝子の第３エク
ソン領域の増幅を行った結果を示す。なお、試料ナンバ
ーは図５に記載のものと同じである。
【図７】 第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増幅
産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて
切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料２）。
産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて
切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料２）。
【図８】 第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増幅
産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて
切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料６）。
産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて
切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料６）。
【図９】 第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増幅
産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて
切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料３）。
産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用いて
切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料３）。
【図１０】 第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増
幅産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料８）。
幅産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料８）。
【図１１】 試料11および12に対し、表１に示したアリ
ルグループあるいはシークエンス特異的プライマーを用
いたＰＣＲ法により、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のA*3301塩
基配列特異的増幅、第２および第3エクソン領域の増幅
を行った結果を示す。
ルグループあるいはシークエンス特異的プライマーを用
いたＰＣＲ法により、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のA*3301塩
基配列特異的増幅、第２および第3エクソン領域の増幅
を行った結果を示す。
【図１２】 第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増
幅産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料11）。
幅産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料11）。
【図１３】 第２および第３エクソンに対するＰＣＲ増
幅産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料12）。
幅産物をそれぞれのグループに特異的な制限酵素を用い
て切断した結果のＲＦＬＰパターンを示す（試料12）。
Claims (11)
- 【請求項１】 以下のＡ法およびＢ法を組み合わせて行
う、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法： Ａ法： （１）特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくと
も１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列
に特異的な各グループに対応するプライマー対のセット
を用いてＰＣＲ法を行い、各特定のグループ内のＨＬＡ
−Ａ対立遺伝子群をグループとして選択的に増幅する、
（２）前記ＰＣＲ法により得られた増幅産物を電気泳動
により展開し、特定のサイズの増幅されたＤＮＡバンド
の存在の有無を確認することにより、各特定のグループ
内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型をグループとし
て判別する。 Ｂ法： ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型がグループ
として判別された場合に、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｐ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行う。 - 【請求項２】 以下のＡ'法およびＢ法を組み合わせて
行う、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法： Ａ'法： （１）少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の
塩基配列に特異的なプライマー対を用いて、および特定
のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特
定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的な
各グループに対応するプライマー対のセットを用いてＰ
ＣＲ法を行い、各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子および各
特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群をグループ
として選択的に増幅する、（２）前記ＰＣＲ法により得
られた増幅産物を電気泳動により展開し、特定のサイズ
の増幅されたＤＮＡバンドの存在の有無を確認すること
により、対応する各特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の型お
よび／または各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝
子群の特定の型をグループとして判別する。 Ｂ法： ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の特定の型がグループ
として判別された場合に、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬ
Ｐ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳ
Ｐ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行う。 - 【請求項３】 請求項１または２におけるＢ法として、
以下の（１）および（２）の工程を行う、請求項１また
は２に記載の方法： （１）各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群の
増幅産物を、特異的な切断部位を与える制限酵素または
全く切断部位を与えない制限酵素により処理する、
（２）前記制限酵素により処理した増幅産物を電気泳動
により展開し、制限酵素切断の存在の有無を反映するＤ
ＮＡ断片サイズを判読し、既知のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子
型のＤＮＡ断片サイズを記載した判定表に照らして該Ｈ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子群の各型を判別する。 - 【請求項４】 さらにＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ
法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ
法およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ法から選ばれる１または２の
方法を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 少なくとも１つの特定のＨＬＡ−Ａ対立
遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー対が、A1-67A
（配列番号１３）とA2-234C（配列番号４）、A1-67T
（配列番号１４）とA2-234C（配列番号４）、A2-87G
（配列番号１５）とA2-234C（配列番号４）、A2-87A
（配列番号１６）とA2-234C（配列番号４）、A2-226A
（配列番号１７）とA3-68G（配列番号２３）、A2-226C
（配列番号１８）とA3-68G（配列番号２３）、A2-5T
（配列番号２）とA2-197A（配列番号１９）、A2-5T（配
列番号２）とA2-197T（配列番号２０）、A3-25A（配列
番号２１）とA3-273T（配列番号１０）、A3-25G（配列
番号２２）とA3-273T（配列番号１０）、A3-159A（配列
番号２４）とA3-273T（配列番号１０）、A3-159C（配列
番号２５）とA3-273T（配列番号１０）、A4-8C（配列番
号１１）とA4-224G（配列番号２６）、A4-8C（配列番号
１１）とA4-224T（配列番号２７）、A2-29A（配列番号
２８）とA2-197A（配列番号１９）、A2-29A（配列番号
２８）とA2-197T（配列番号２０）、A2-29T（配列番号
２９）とA2-234C（配列番号４）、A2-81C（配列番号
３）とA2-229C（配列番号３０）、A3-71G（配列番号３
１）とA3-240G（配列番号３２）から選ばれるものであ
り、また特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子群からなる少なく
とも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配
列に特異的な各グループに対応するプライマー対が、A2
-5C（配列番号１）とA2-234C（配列番号４）、A2-5T
（配列番号２）とA2-234C（配列番号４）、A2-81C（配
列番号３）とA2-238A（配列番号５）、A3-12A（配列番
号６）とA3-273T（配列番号１０）、A3-12G（配列番号
７）とA3-273T（配列番号１０）、A3-25T（配列番号
８）とA3-273T（配列番号１０）、A3-59G（配列番号
９）とA3-273T（配列番号１０）、A4-8C（配列番号１
１）とA4-254G（配列番号１２）から選ばれるものであ
る、請求項１から４のいずれかに記載のＨＬＡ−Ａ対立
遺伝子型の判別方法。 - 【請求項６】 各特定のグループ内のＨＬＡ−Ａ対立遺
伝子群の増幅産物に特異的な切断部位を与える制限酵素
または全く切断部位を与えない制限酵素が、Fok I、Bsr
I、Hinf I、Msp I、Sac II、Bst N I、Mnl I、Hae II
I、Hga I、Bsp1286 I、Fnu4H I、TspR I、Nla III、Nla
IV、Ava II、BsaJ I、BsaH I、PmaC I、MspA1 Iから選
ばれるものである、請求項３から５のいずれかに記載の
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別方法。 - 【請求項７】 A2-5C（配列番号１）、A2-5T（配列番号
２）、A2-81C（配列番号３）、A2-234C（配列番号
４）、A2-238A（配列番号５）、A3-12A（配列番号
６）、A3-12G（配列番号７）、A3-25T（配列番号８）、
A3-59G（配列番号９）、A3-273T（配列番号１０）、A4-
8C（配列番号１１）、A4-254G（配列番号１２）、A1-67
A（配列番号１３）、A1-67T（配列番号１４）、A2-87G
（配列番号１５）、A2-87A（配列番号１６）、A2-226A
（配列番号１７）、A2-226C（配列番号１８） 、A2-197
A（配列番号１９）、A2-197T（配列番号２０）、A3-25A
（配列番号２１） 、A3-25G（配列番号２２）、A3-68G
（配列番号２３）、A3-159A（配列番号２４）、A3-159C
（配列番号２５）、A4-224G（配列番号２６）、A4-224T
（配列番号２７）、A2-29A（配列番号２８）、A2-29T
（配列番号２９）、A2-229C（配列番号３０）、A3-71G
（配列番号３１）、A3-240G（配列番号３２）から選ば
れる、ＨＬＡ−Ａ遺伝子タイピングに使用するためのプ
ライマー。 - 【請求項８】 請求項１から６のいずれかに記載の方法
に使用するための、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別のた
めのキット。 - 【請求項９】 請求項１から６のいずれかに記載の方法
に使用するための、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別のた
めの試薬。 - 【請求項１０】 請求項７記載のプライマーを含む、Ｈ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別のためのキット。 - 【請求項１１】 請求項７記載のプライマーを含む、Ｈ
ＬＡ−Ａ対立遺伝子型の判別のための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10305892A JPH11216000A (ja) | 1997-10-29 | 1998-10-27 | Ｈｌａ−ａ対立遺伝子型の判別方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-297145 | 1997-10-29 | ||
| JP29714597 | 1997-10-29 | ||
| JP10305892A JPH11216000A (ja) | 1997-10-29 | 1998-10-27 | Ｈｌａ−ａ対立遺伝子型の判別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11216000A true JPH11216000A (ja) | 1999-08-10 |
Family
ID=26561021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10305892A Pending JPH11216000A (ja) | 1997-10-29 | 1998-10-27 | Ｈｌａ−ａ対立遺伝子型の判別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11216000A (ja) |
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