WO2013011734A1 - Ｈｌａ遺伝子のｄｎａタイピング方法及びキット - Google Patents

Ｈｌａ遺伝子のｄｎａタイピング方法及びキット Download PDF

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隆 椎名
進悟 鈴木
有紀 尾崎
滋樹 光永
猪子　英俊
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学校法人 東海大学
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for DNA typing of HLA genes using a massively parallel sequencer.
  • HLA Human leukocyte antigen
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA class I antigen is composed of ⁇ -chain showing high polymorphism and ⁇ 2-microglobulin with little polymorphism
  • HLA class II antigen is ⁇ -chain with high polymorphism and ⁇ -chain with little polymorphism.
  • Consists of. ⁇ chain of class I molecule is encoded by HLA-A, HLA-B and HLA-C genes
  • ⁇ chain of class II antigen is HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPB1
  • ⁇ chain is HLA-DRA1 , HLA-DQA1, and HLA-DPA1 gene.
  • exon 2 and exon 3 of the gene encoding the ⁇ chain show high polymorphism in the HLA class I antigen, and exon 2 of the gene encoding the ⁇ chain in the HLA class II antigen is advanced. Show polymorphism.
  • the gene region encoding HLA is located in human chromosome 6 short arm 6p21.3, class I region (HLA-A, HLA-C, HLA-B, etc.) from the telomere side toward the centromere side, Class III region, class II region (HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, etc.) are arranged in this order, and many genes are encoded at very high density. The relationship between blood transfusion and transplantation and various diseases has been reported. There is no HLA gene in the class III region, and genes such as complement components and tumor necrosis factor (TNF) are present.
  • TNF tumor necrosis factor
  • HLA-DRB gene region encoding the ⁇ chain of the HLA-DR antigen.
  • pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1.
  • HLA-DRB5 (DR51) gene and pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1.
  • DR3 DR52
  • HLA-DRB2 HLA-DRB9
  • DR4 DR7 and DR9 types
  • pseudogenes such as HLA-DRB4 (DR53) gene
  • HLA-DRB7, HLA-DRB8 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome.
  • DR8 type no HLA-DRB gene other than HLA-DRB1 is located on the same chromosome.
  • Each allele exon has a plurality of polymorphic regions, and the base sequence (amino acid sequence) of a polymorphic region is often common to a plurality of alleles. That is, each HLA allele is defined by a combination of multiple polymorphic regions. In the HLA class I antigen, exon 2 or exon 3 having the same base sequence as well as the polymorphic region in the exon may be common to a plurality of alleles.
  • HLA is known to have an extremely large number of alleles due to the presence of advanced polymorphisms, and their notation is also determined. That is, the first zone for discriminating serological HLA type (2 digit level), the second zone for discriminating alleles with amino acid substitution within the same serological HLA type (4 digit level), and no amino acid mutation The third zone (6 digit level) that discriminates alleles in which base substitution is recognized, and the fourth zone (8 digit level) that discriminates alleles with base substitution outside the gene region encoding the HLA molecule (intron). .
  • the conventional method is a DNA typing method using PCR centering on the exon region of each gene, it misses base substitution in the intron region and the promoter region, and as a result, the gene structure has other expression HLA. It was possible to miss the detection of a null allele that is not different from the gene but whose expression is suppressed.
  • An object of the present invention is to provide a highly accurate DNA typing method and kit that eliminates ambiguity derived from phase ambiguity.
  • the present invention provides an HLA DNA typing method including the following steps. (1) Specifically anneal to the upstream and downstream regions of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 and HLA-DPB1 in the human genome sequence Providing a primer set and a primer set that specifically anneals to the untranslated regions of exons 2 and 3 ′ of HLA-DRB1; (2) PCR amplification of the test sample (DNA) using the primer set; (3) step of determining the base sequence of the PCR amplified product; and (4) step of performing homology search with the database. .
  • the method of the present invention is the ultimate DNA typing method in which the phase ambiguity with unknown positional relationship between cis and trans is eliminated because the entire nucleotide sequence necessary for DNA typing of the HLA gene from one molecule can be obtained. .
  • high-accuracy HLA matching between the transplant candidate and the donor candidate at the time of transplantation is realized. Since the entire nucleotide sequence of the gene including peripheral regions such as the promoter region, exon region, and intron region of the HLA gene is determined, it becomes possible to detect null alleles or novel alleles that are not expressed at all or whose expression is suppressed. .
  • (A) It is a figure which shows the relationship between HLA class I gene structure and molecular structure.
  • (B) It is a figure which shows the structure of the promoter area
  • (A) It is a figure which shows the relationship between HLA class II gene structure and molecular structure.
  • (B) It is a figure which shows the structure of the promoter area
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the gene structure of HLA gene and the position which designed the PCR primer (The sequence number of the primer designed in the said area
  • FIG. 3 is a diagram showing an agarose gel electrophoresis image of each PCR product by three types of DNA extraction methods in Example 3.
  • Primer set preparation step In the DNA typing method of the present invention, first, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 and HLA-DPB1 in the human genome base sequence A primer set that specifically anneals to the upstream region and the downstream region of each gene and a primer set that specifically anneals to the untranslated regions on exons 2 and 3 ′ of HLA-DRB1 are prepared.
  • the genomic base sequence of human chromosome 6 (6p21.3) including the region where the HLA gene is present has already been elucidated, and the relationship between the gene structure and the structure of the expression product (HLA molecule) is also known (Fig. 1 and FIG. 2).
  • HLA-A, HLA-B and HLA-C which are called classical HLA class I molecules, contain 7 or 8 exons (FIG. 1 (a)).
  • HLA-A, HLA-B and HLA-C which are called classical HLA class I molecules, contain 7 or 8 exons (FIG. 1 (a)).
  • enhancers and promoter regions There are two types of enhancers and promoter regions, and expression is regulated (FIG. 1 (b)).
  • the conventional DNA typing method particularly performs PCR using primers prepared based on exons 2 and 3. As a result, the phase ambiguity problem has arisen as described above.
  • HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP which are said to be classical HLA class II molecules, are composed of an ⁇ chain and a ⁇ chain, and each gene contains 5 or 6 exons (FIG. 2).
  • A) the promoter region is located outside exon 1, and expression is regulated (FIG. 2 (b)).
  • PCR using a primer prepared based on exon 2 is performed. As mentioned above, there was a phase ambiguity problem.
  • the classical class I molecules HLA-A, HLA-B, HLA-C
  • all of the classical class II molecules HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 and HLA-DPB1 gene regions A primer set capable of PCR-amplifying not only exons but also introns, including 5 'and 3' untranslated regions and promoter regions
  • gene regions including HLA-DRB1 exons 2 to 3 'untranslated regions Since the PCR product prepared and PCR-amplified using it is subjected to the next generation sequencing described later, uncertainties such as phase ambiguity can be eliminated, and the presence or absence of null allyl can be detected accurately.
  • PCR primer sets listed in Tables 1 to 4 below are prepared.
  • SEQ ID NOs: 1 to 3 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-A gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-A gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 1 has a nucleotide sequence corresponding to the 29,909,487th position to the 29,909,514th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 2 has a nucleotide sequence corresponding to the 29,909,487th position to the 29,909,514th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 3 has a complementary nucleotide sequence to the nucleotide sequence corresponding to the 29,914,925th position to the 29,914,952nd position in the human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 5,500 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 4 to 5 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-B gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-B gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 4 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 31,325,796th position to the 31,325,820th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 5 has a nucleotide sequence corresponding to the 31,321,212th position to the 31,321,235th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is about 4,600 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 6 to 8 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-C gene that is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-C gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 6 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 31st, 240th, 868th position to the 31st, 240th, 892nd position in a human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 7 has a base sequence complementary to the base sequence corresponding to the 31st, 240th, 868th position to the 31st, 240th, 892nd position in a human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 8 has a nucleotide sequence corresponding to the 31st, 236th, and 991st positions to the 31st, 236th, and 114th positions in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 4,800 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 9 to 11 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR1 subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 9 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,131st position to the 32,552,156th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 10 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,131st position to the 32,552,156th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 11 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,609th position to the 32,546,629th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 5,200 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 31 and 32 in Table 2 are PCR primers that specifically amplify HLA-DR1, HLA-DR4, HLA-DR6 (DR13), and HLA-DR10 subtype genes of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain Is a set.
  • These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 31 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,558,110th position to the 32,558,133rd position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 32 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,551,974th position to the 32,551,999th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is about 6,100 bases (bp) for the HLA-DR1 subtype, about 9,100 bases (bp) for the HLA-DR4 subtype, and HLA- About 8,900 bases (bp) for the DR6 (DR13) subtype and about 8,900 bases (bp) for the HLA-DR10 subtype.
  • SEQ ID NOs: 11 and 12 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR2 subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 11 is as described above.
  • SEQ ID NO: 12 has a complementary nucleotide sequence to the nucleotide sequence corresponding to the 32,552,130th position to the 32,552,151st position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 5,500 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 31 and 33 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR2 (DR15) subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 31 is as described above.
  • SEQ ID NO: 33 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,551,974th position to the 32,551,999th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 6,100 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 13 and 14 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR3, HLA-DR5, HLA-DR6, and HLA-DR8 subtype genes of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. . These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 13 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,137th position to the 32,552,160th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 14 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,609th position to the 32,546,629th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 5,100 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 34 and 32 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR3 subtype gene of the HLA-DRB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 34 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,558,110th position to the 32,558,133rd position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 32 is as described above.
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 8,900 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 15 and 16 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR4 subtype gene of the HLA-DRB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 15 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,131st position to the 32,552,157th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 16 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,609th position to the 32,546,629th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 6,200 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 31 and 35 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR5 (DR11) subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 31 is as described above.
  • SEQ ID NO: 35 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,551,974th position to the 32,551,999th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 8,900 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 31 and 36 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR5 (DR12) subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 31 is as described above.
  • SEQ ID NO: 36 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,551,974th position to the 32,551,999th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 8,900 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 31 and 37 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR6 (DR14) subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 31 is as described above.
  • SEQ ID NO: 37 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,551,974th position to the 32,551,999th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 8,900 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 17 and 18 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR7 subtype gene of the HLA-DRB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 17 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,137th position to the 32,552,160th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 18 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,606th position to the 32,546,629th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 5,100 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 38 and 36 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR7 and HLA-DR9 subtype genes of the HLA-DRB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 38 has a complementary nucleotide sequence corresponding to the 32,558,110th position to the 32,558,133rd position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 36 is as described above.
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 11,400 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 31 and 39 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR8 subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene.
  • SEQ ID NO: 31 is as described above.
  • SEQ ID NO: 39 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,551,974th position to the 32,551,999th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 8,900 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 19 and 20 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR9 subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 19 has a complementary nucleotide sequence to the nucleotide sequence corresponding to the 32,552,137th position to the 32,552,160th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 20 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,609th position to the 32,546,629th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 5,100 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 21 and 22 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR10 subtype gene of the HLA-DRB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 21 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,137th position to the 32,552,159th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 22 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,403rd position to the 32,546,435th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 5,400 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 23 and 24 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPA1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DPA1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 23 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,041,478th position to the 33,041,502th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 24 has a nucleotide sequence corresponding to the 33,031,888th position to the 33,031,911th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 9,600 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 40 and 41 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPA1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DPA1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 40 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,041,573th position to the 33,041,596th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 41 has a nucleotide sequence corresponding to the 33,031,888th position to the 33,031,912th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 9,600 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 25 and 26 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DPB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 25 has a nucleotide sequence corresponding to the 33,043,056th position to the 33,043,079th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 26 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,055,476th position to the 33,055,499th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 12,400 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 42 and 43 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present in the human genome base sequence (reference sequence: hg19) at a position sandwiching exon 2 from the upstream and downstream sides from the 5 'untranslated region of the HLA-DPB1 gene.
  • SEQ ID NO: 42 has a nucleotide sequence corresponding to the 33,043,168th position to the 33,043,191st position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 43 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,049,084th position to the 33,049,107th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 5,900 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 44 and 45 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DPB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 44 has a nucleotide sequence corresponding to the 33,048,182nd position to the 33,048,207th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 45 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,055,428th position to the 33,055,453th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 7,200 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 27 and 28 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQA1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQA1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 27 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,604,318th position to the 32,604,338th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 28 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,611,681st position to the 32,611,701th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 7,400 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 46 and 47 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQA1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQA1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 46 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,604,469th position to the 32,604,488th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 47 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,611,936th position to the 32,611,956th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 7,400 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 29 and 30 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 29 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,626,545th position to the 32,626,568th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 30 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,635,612th position to the 32,635,637th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 9,100 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 29, 30, and 48 to 50 in Table 4 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQB1 gene that is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NOs: 29 and 48 have base sequences corresponding to the 32,626,545th position to the 32,626,568th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NOs: 30, 49, and 50 have complementary base sequences corresponding to positions 32, 635, 612 to 32, 635, 637 in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 9,100 bases (bp).
  • primers can be prepared by a technique usually used in this field.
  • the primer sets described in Table 1 and Table 2 show the most preferable examples, and in the method of the present invention, a forward that can anneal to the positions sandwiching the entire HLA gene region from the upstream side and the downstream side.
  • a set of (Forward) primer and reverse (Reverse) primer can be used similarly.
  • the test sample (DNA) is PCR amplified using the primer set prepared in step (1).
  • the PCR amplification reaction is performed according to a normal protocol. Specifically, it is as follows. 1. DNA is extracted from the sample according to the form of the test sample. 2. The extracted DNA is quantified, and a primer solution is appropriately set to prepare a reaction solution. 3. Set the reaction conditions and perform the PCR reaction.
  • the temperature of the annealing step is preferably about 60 ° C. By annealing at about 60 ° C., alleles can be generated in equal proportions (uniformly).
  • the temperature of the annealing step is preferably about 70 ° C. By annealing at about 70 ° C., only the target DR subtype can be specifically generated. 4).
  • the obtained PCR product is purified and subjected to the next nucleotide sequencing step.
  • step (3) A base sequence determination step. Next, the base sequence of the PCR product (amplified DNA) generated in step (2) is determined. This step is preferably performed by using a so-called next-generation sequence (or ultra-high speed sequence). For the next-generation sequence, see, for example, “Experimental Medicine” Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodosha).
  • Described herein is a method for sequencing based on the Pyrosequence employed in the Roche Genome Sequencer FLX system.
  • the PCR product obtained in step (2) is fragmented to about 500 bases using a nebulizer.
  • a DNA adapter is added to the end of the fragmented DNA fragment.
  • the DNA fragment to which the DNA adapter is added is converted into a single-stranded DNA fragment, and then the beads are bound to the beads via the adapter.
  • the obtained beads are encapsulated in a water-in-oil emulsion (microbeads in which one DNA fragment is bound to one bead).
  • a reactor environment is formed).
  • nucleic acids Four types of nucleic acids (A, C, G, T) are added in a certain order, a chemiluminescence pattern corresponding to the added nucleic acid is recorded, and a base sequence is determined by a combination of the signal intensity and position information.
  • step (3) by comparing the base sequence obtained in step (3) with the data of the base sequence database of known HLA alleles, the allele type of the DNA contained in the test sample (Up to 8 digits) is determined.
  • the method of the present invention uses the primer sets described in Table 1 as representative examples. Primers were set at positions sandwiching the entire HLA class II gene excluding HLA class I and HLA-DRB1 and the exon 2 to 3 'untranslated region of HLA-DRB1, and DNA amplified over almost the entire region It can also be characterized by sequencing, thereby eliminating phase ambiguity and obtaining information about null alleles.
  • Example 1 [experimental method] 1. A PCR reaction was carried out using the already extracted genomic DNA as a template and using each HLA class I gene-specific primer set (see Table 1: SEQ ID NOs: 1 to 8). The specific procedure is as follows. (1) For PCR amplification, Prime STAR GXL polymerase (TaKaRa) was used. That is, 4 ⁇ L of 5 ⁇ Prime STAR GXL buffer solution, 1.6 ⁇ L of dNTP solution, 4 ⁇ L (1 pmol / ⁇ L) of each PCR primer, and 0.8 ⁇ L of Prime STAR GXL polymerase were added to 50 ng of genomic DNA solution. Was adjusted to 20 ⁇ L with sterilized water. (2) After keeping the temperature at 94 ° C.
  • Prime STAR GXL polymerase TaKaRa
  • the base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows. (1) The PCR product was purified according to the standard protocol of QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). (2) The concentration was measured according to the standard protocol of PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen). (3) The purified PCR product was adjusted to a concentration of 500 ng / 100 ⁇ L, and a rapid library was prepared, emulsion PCR, and sequencing were performed according to the standard protocol of Genome Sequencer (GS) Junior (Roche). A base sequence of 10,000 reads was obtained. (4) These sequences were combined and edited with GS de novo Assembler (Roche), and then the allele of the HLA gene was identified by homology search with a known base sequence on the DNA database.
  • PCR primers were designed to specifically amplify 5.5 kb, 4.6 kb and 4.8 kb in HLA-A, HLA-B and HLA-C, respectively. From the examination of PCR conditions and agarose gel electrophoresis of the PCR products, a single amplification product was obtained at the position of the target molecular weight for each PCR product in each HLA class I gene (FIG. 4). Further, as a result of determining the base sequence of the PCR product by the Sanger method, HLA allele consistent with the previous report was obtained, and thus it was confirmed that this PCR system can be used for HLA typing.
  • HLA-B * 40 02 heterozygote containing 3 homozygous specimens and an allele combination (B * 40 and B * 55) that shows phase ambiguity in the conventional DNA typing method
  • HLA-B * 40: 02: 01: 01 was detected from all specimens, and 15 kinds of 17 heterozygous specimens were detected.
  • two new alleles were detected.
  • HLA-B * 40: 02: 01: 01 and HLA-B * 55: 02: 01: I was able to type in 01. Therefore, this method enables 8-digit level HLA typing without phase ambiguity, and is excellent for efficiently detecting base substitutions, insertions and deletions in promoters and introns that cause null alleles. Tool.
  • Example 2 [experimental method] 1. PCR using genomic DNA already extracted as a template and gene-specific primer sets of HLA class I and HLA class II (see Tables 1 to 4: SEQ ID NOs: 1 to 8, 9 to 22, and 31 to 50) Reaction was performed. The specific procedure is as follows. (1) For PCR amplification, Prime STAR GXL polymerase (TaKaRa) was used. That is, 4 ⁇ L of 5 ⁇ Prime STAR GXL buffer, 1.6 ⁇ L of dNTP solution, 1 to 7 ⁇ L (4 pmol / ⁇ L) PCR primer, 0.8 ⁇ L of Prime STAR GXL polymerase were added to 50 ng of genomic DNA solution.
  • Prime STAR GXL polymerase (TaKaRa) was used. That is, 4 ⁇ L of 5 ⁇ Prime STAR GXL buffer, 1.6 ⁇ L of dNTP solution, 1 to 7 ⁇ L (4 pmol / ⁇ L) PCR primer, 0.8
  • the total amount of the reaction solution was adjusted to 20 ⁇ L with sterilized water.
  • GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used. After PCR, the amplification status of the PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis. The electrophoretic image is shown in FIG.
  • the base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows. (1) The PCR product was purified according to the standard protocol of QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). (2) The concentration was measured according to the standard protocol of PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen). (3) The purified PCR product was adjusted to a concentration of 100 ng, and fragment library preparation, emulsion PCR, and sequencing were performed according to the standard protocol of Ion Personal Genome Machine (Ion PGM) (Life Technologies). A base sequence of 300,000 reads was obtained. (4) The sequences were combined and edited with GS De Novo Assembler (Roche), and then the allele of the HLA gene was identified by homology search with a known base sequence on the DNA database.
  • HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 5 'untranslated region to exon 2, HLA-DRB1 exon 2 to 3' untranslated region, HLA-DQB1, HLA-DPB1 5 'untranslated PCR primers that specifically amplify 4 kb to 12 kb in the exon 2 from the region and the exon 2 to 3 ′ untranslated region of HLA-DPB1 were designed. From the examination of PCR conditions and agarose gel electrophoresis of these PCR products, a single amplification product was obtained at the position of the target molecular weight for both the PCR products of the HLA class I and HLA class II genes (FIG. 6). Further, as a result of determining the base sequence of the PCR product by the Sanger method, HLA allele consistent with the previous report was obtained, and thus it was confirmed again that this PCR system can be used for HLA typing.
  • HLA-DPB1 For HLA-DPB1, it was possible to type only the exon part. Furthermore, novel alleles were detected in the HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, and HLA-DQB1 genes. Therefore, this method enables 8-digit level HLA typing without phase ambiguity, and is excellent for efficiently detecting base substitutions, insertions and deletions in promoters and introns that cause null alleles. Tool.
  • Genomic DNA was extracted using Buccal Cell DNA Extraction Kit, BuccalQuick (TRIMGEN). 2. Genomic DNA extracted using Buccal Cell DNA Extraction Kit, BuccalQuick (TRIMGEN) was further purified with isopropanol and ethanol. 3. Genomic DNA was extracted using QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). 4). Using 3 samples each of genomic DNA extracted in items 1 to 3, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 specific primer set (by the same experimental method as in Example 1 and Example 2) See Tables 1 and 4: PCR reactions were performed using SEQ ID NOs: 1-8, 29, 30, 48-50). After PCR, the amplification status of the PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis. The electrophoretic image is shown in FIG.
  • Lanes 1 to 3 in FIG. 7 are extracted by the experiment method 1
  • lanes 4 to 6 are extracted by the experiment method 2
  • lanes 7 to 9 are the amplification states of the PCR products when the method is extracted by the experiment method 3.
  • experimental method 3 involves blood collection, since experimental method 1 can collect cells from the oral mucosa, it was proved that using the method of the present invention, HLA typing is sufficiently possible even when blood collection is impossible. .

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Abstract

フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを目的とする。本発明は、（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２及び３'側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。

Description

ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法及びキット
　本発明は、大量並列シークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法及びキットに関する。
　ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっているが、主なものとして６種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ）である。
　ＨＬＡクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２－ミクログロブリンからなり、ＨＬＡクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスＩ分子のα鎖はＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、α鎖はＨＬＡ－ＤＲＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、ＨＬＡクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。
　ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
　ＨＬＡ－ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１以外のＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子は位置しない。
　各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が、複数のアリルに共通であることもある。
　ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、及びＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である。
　骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのＨＬＡタイプが４桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度のＧＶＨＤ頻度が低下すると言われている。逆に、ＨＬＡ型が４桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、ＨＬＡタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
　ＨＬＡ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ｔｙｐｉｎｇ）法やＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）－Ｌｕｍｉｎｅｘ法が主流となっている。
　これら従来のＤＮＡタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスＩ遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ　ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＨＬＡタイピングが難しい場合があった。
　また、従来の方法は、各遺伝子のエクソン領域を中心とするＰＣＲを用いたＤＮＡタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出を見逃す可能性があった。
特開平１１－２１６０００号公報
Ｌｉｎｄ　Ｃ．等、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７１巻、１０３３－１０４２頁（２０１０年）
　本発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを課題とする。
　本発明者らは、クラスＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＣならびにクラスＩＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１について、それらのＨＬＡ遺伝子を特異的に増幅しうるＰＣＲプライマーを新たに設計し、好適なＰＣＲ条件を設定して、大量並列シークエンシング技術を駆使するという新しい着想に基づき、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち本発明は、以下のステップを含むＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
　本発明の方法は１分子からのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係が不明なフェーズ・アンビギュイティが排除された究極のＤＮＡタイピング法である。これにより、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なＨＬＡの一致が実現される。
　ＨＬＡ遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、全く発現していない、あるいは発現が抑制されているｎｕｌｌアリルや新規アリルの検出が可能となる。
（ａ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。 （ａ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁～第４７頁から引用した。 ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子領域を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４８頁から引用した。 実施例１で増幅したＰＣＲ産物の増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 ＨＬＡ遺伝子の遺伝子構造とＰＣＲプライマーを設計した位置を示す模式図である（括弧内には、当該領域で設計したプライマーの配列番号を記した）。 実施例２で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 実施例３における３種類のＤＮＡ抽出法による各ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
　以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
　本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備する。
　ＨＬＡ遺伝子が存在する領域を含むヒト第６染色体（６ｐ２１．３）のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＨＬＡ分子）の構造との関連も知られている（図１と図２参照）。
　即ち、古典的ＨＬＡクラスＩ分子と言われるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの遺伝子は７個又は８個のエクソンを含んでおり（図１（ａ））、エクソン１の外側には２種類のエンハンサーやプロモーター領域があって発現が調節されている（図１（ｂ））。
　さらに、エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２及び３に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
　また、古典的ＨＬＡクラスＩＩ分子と言われるＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含んでおり（図２（ａ））、エクソン１の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている（図２（ｂ））。
　さらに、エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
　本発明では、古典的クラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ）ならびに古典的クラスＩＩ分子のＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の遺伝子領域の全て（エクソンのみならず、イントロン、５’側と３’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２から３’側の非翻訳領域を含む遺伝子領域をＰＣＲ増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を後述する次世代シークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、ｎｕｌｌアリルの有無も正確に検知することができる。
　具体的には、下記表１～表４に掲げるＰＣＲプライマーセットを調製する。
　表１における配列番号１～３は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ａ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９０９，４８７番目から第２９，９０９，５１４番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９０９，４８７番目から第２９，９０９，５１４番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９１４，９２５番目から第２９，９１４，９５２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，５００塩基（ｂｐ）である。
　表１における配列番号４～５は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２５，７９６番目から第３１，３２５，８２０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２１，２１２番目から第３１，３２１，２３５番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，６００塩基（ｂｐ）である。
　表１における配列番号６～８は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ｃ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２４０，８６８番目から第３１，２４０，８９２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２４０，８６８番目から第３１，２４０，８９２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２３６，９９１番目から第３１，２３６，１１４番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，８００塩基（ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表２における配列番号９～１１は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ１サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３１番目から第３２，５５２，１５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３１番目から第３２，５５２，１５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，２００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号３１、３２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ６（ＤＲ１３）、ＨＬＡ－ＤＲ１０サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５８，１１０番目から第３２，５５８，１３３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号３２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さはＨＬＡ－ＤＲ１サブタイプで約６，１００塩基（ｂｐ）、ＨＬＡ－ＤＲ４サブタイプで約９，１００塩基（ｂｐ）、ＨＬＡ－ＤＲ６（ＤＲ１３）サブタイプで約８，９００塩基（ｂｐ）、ＨＬＡ－ＤＲ１０サブタイプで約８，９００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号１１と１２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ２サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１１は上記の通りである。
配列番号１２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３０番目から第３２，５５２，１５１番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，５００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号３１と３３は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ２（ＤＲ１５）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３１は上記の通りである。
　配列番号３３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約６，１００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号１３と１４は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ５、ＨＬＡ－ＤＲ６、ＨＬＡ－ＤＲ８サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，１００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号３４と３２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ３サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５８，１１０番目から第３２，５５８，１３３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号３２は上記の通りである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号１５と１６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ４サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３１番目から第３２，５５２，１５７番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約６，２００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号３１と３５は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ５（ＤＲ１１）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３１は上記の通りである。
　配列番号３５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号３１と３６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ５（ＤＲ１２）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３１は上記の通りである。
　配列番号３６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表３における配列番号３１と３７は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ６（ＤＲ１４）サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３１は上記の通りである。
　配列番号３７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号１７と１８は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ７サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０６番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，１００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号３８と３６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ９サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５８，１１０番目から第３２，５５８，１３３番目に相当する相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号３６は上記の通りである。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１１，４００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号３１と３９は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ８サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３１は上記の通りである。
　配列番号３９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５１，９７４番目から第３２，５５１，９９９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，９００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号１９と２０は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ９サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号２０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，１００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号２１と２２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ１０サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１５９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号２２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，４０３番目から第３２，５４６，４３５番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，４００塩基（ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表４における配列番号２３と２４は、はＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，４７８番目から第３３，０４１，５０２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号２４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０３１，８８８番目から第３３，０３１，９１１番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，６００塩基（ｂｐ）である。
　表４における配列番号４０と４１は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号４０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，５７３番目から第３３，０４１，５９６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号４１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０３１，８８８番目から第３３，０３１，９１２番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，６００塩基（ｂｐ）である。
　表４における配列番号２５と２６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４３，０５６番目から第３３，０４３，０７９番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号２６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０５５，４７６番目から第３３，０５５，４９９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１２，４００塩基（ｂｐ）である。
　表４における配列番号４２と４３は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号４２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４３，１６８番目から第３３，０４３，１９１番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号４３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４９，０８４番目から第３３，０４９，１０７番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，９００塩基（ｂｐ）である。
表４における配列番号４４と４５は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号４４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４８，１８２番目から第３３，０４８，２０７番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号４５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０５５，４２８番目から第３３，０５５，４５３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，２００塩基（ｂｐ）である。
　表４における配列番号２７と２８は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６０４，３１８番目から第３２，６０４，３３８番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号２８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６１１，６８１番目から第３２，６１１，７０１番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，４００塩基（ｂｐ）である。
　表４における配列番号４６と４７は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号４６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６０４，４６９番目から第３２，６０４，４８８番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号４７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６１１，９３６番目から第３２，６１１，９５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，４００塩基（ｂｐ）である。
　表４における配列番号２９と３０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６２６，５４５番目から第３２，６２６，５６８番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号３０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６３７番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，１００塩基（ｂｐ）である。
　表４における配列番号２９、３０、４８～５０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２９と４８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６２６，５４５番目から第３２，６２６，５６８番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号３０、４９、５０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６３７番目に相当する相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，１００塩基（ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１及び表２に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、ＨＬＡの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニール可能なフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーとリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。
（２）ＰＣＲ増幅ステップ
　本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーセットを用い、被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅する。
　ＰＣＲ増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
　１．被検試料の形態に応じて、当該試料からＤＮＡを抽出する。
　２．抽出したＤＮＡを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
　３．反応条件を設定してＰＣＲ反応を実施する。
　　例：熱変性ステップ（通常は９２～９７℃）
　　　　アニーリングステップ（通常は５５～７２℃）
　　　　伸長ステップ（通常は６５～８０℃）
　本発明の方法では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１を除くＨＬＡ遺伝子の場合、前記アニーリングステップの温度を約６０℃とするのが好ましい。約６０℃でアニーリングさせることにより、対立遺伝子を等比率で（均一に）生成させることができる。また、ＨＬＡ－ＤＲＢ１では前記アニーリングステップの温度を約７０℃とするのが好ましい。約７０℃でアニーリングさせることにより、目的のＤＲサブタイプのみを特異的に生成させることができる。
　４．得られたＰＣＲ産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
（３）塩基配列決定ステップ。
　次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆる次世代シークエンス（あるいは超高速シークエンス）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照されたい。
　本明細書では、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）のゲノムシークエンサーＦＬＸシステムで採用されているパイロシークエンスに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。
　１．前記ステップ（２）で得られたＰＣＲ産物をネブライザーにより約５００塩基ほどに断片化する。
　２．その断片化されたＤＮＡ断片の末端にＤＮＡアダプターを付加する。
　３．ＤＮＡアダプターを付加したＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む（１ビーズに１つのＤＮＡ断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される）。
　４．エマルジョンＰＣＲ反応を実施し、各ビーズ上に各ＤＮＡ断片のコピーを形成させる（各ＤＮＡ断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる）。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたＤＮＡ断片を有するビーズを回収する。
　５．ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする（１ウェルに１個のビーズが入るサイズである）。
　６．各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからＤＮＡの塩基配列を決定する。４種類の核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
（４）ＤＮＡタイピングステップ
　次いで、前記ステップ（３）で得られた塩基配列を、既知のＨＬＡ対立遺伝子の塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたＤＮＡのアリル型（８桁まで）が決定される。
　本発明の方法は、前記表１に記載したプライマーセットを代表例とする。ＨＬＡクラスＩやＨＬＡ－ＤＲＢ１を除くＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子全領域、ならびにＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２から3’非翻訳領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってフェーズ・アンビギュイティ（不確実さ）を排除し、ｎｕｌｌアリルに関する情報を得ることもできる。
　以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
（実施例１）
［実験方法］
１．既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、各ＨＬＡクラスＩ遺伝子特異的プライマーセット（表１参照：配列番号１～８）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲ増幅はＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いた。すなわち、５０　ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４　μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ緩衝液、１．６　μＬのｄＮＴＰ溶液、４μＬ（１ｐｍｏｌ／μＬ）ずつのＰＣＲプライマー、０．８μＬのＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、６０度で２０秒間、６８度で５分間の３ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図４に示した。
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、ｒａｐｉｄライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり１万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＧＳ　ｄｅ　ｎｏｖｏ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）にて結合・編集させ、その後ＤＮＡデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、ＨＬＡ遺伝子のアリルを同定した。
［考察］
　ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃにおいて、それぞれ５．５ｋｂ、４．６ｋｂおよび４．８ｋｂを特異的に増幅するＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、各ＨＬＡクラスＩ遺伝子におけるＰＣＲ産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図４）。またＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないＨＬＡアリルが得られたことから、本ＰＣＲ系はＨＬＡタイピングに使用しうることが確認された。
　ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２ホモ接合３検体ならびに従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせ（Ｂ＊４０とＢ＊５５）を含むＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２ヘテロ接合１７検体を用いてＨＬＡ－Ｂ遺伝子由来のＰＣＲ産物をＧＳ　ＪｕｎｉｏｒによりＨＬＡタイピングをおこなった結果、全ての検体からＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２：０１：０１を検出し、ヘテロ接合１７検体では１５種類の既知アリルに加え、２種類の新規アリルを検出した。特に、フェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせ（Ｂ＊４０とＢ＊５５）の１検体については、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２：０１：０１とＨＬＡ－Ｂ＊５５：０２：０１：０１にタイピングすることができた。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ｎｕｌｌアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールである。
（実施例２）
［実験方法］
１．既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１～４参照：配列番号１～８、９～２２、３１～５０）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲ増幅はＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いた。すなわち、５０　ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４　μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ緩衝液、１．６　μＬのｄＮＴＰ溶液、１から７　μＬ（４　ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．８　μＬのＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０　μＬに調整した。
（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、７０度で５分間の２ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図６に示した。
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を１００　ｎｇの濃度に調整し、Ｉｏｎ　Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｉｏｎ　ＰＧＭ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の標準プロトコールにしたがって、フラグメントライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり３０万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＧＳ　Ｄｅ　Ｎｏｖｏ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）にて結合・編集させ、その後ＤＮＡデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、ＨＬＡ遺伝子のアリルを同定した。
［結果及び考察］
１．ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２及びＨＬＡ－ＤＰＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域において、それぞれ４ｋｂから１２ｋｂを特異的に増幅するＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図６）。またＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないＨＬＡアリルが得られたことから、本ＰＣＲ系はＨＬＡタイピングに使用しうることが改めて確認された。
２．従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体を用いてＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２及びＨＬＡ－ＤＰＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域の各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＩｏｎ　ＰＧＭによりＨＬＡタイピングをおこなった。その結果、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１については、遺伝子領域全体のタイピングが可能であった。ＨＬＡ－ＤＰＢ１については、エクソン部分のみのタイピングが可能であった。さらに、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１の各遺伝子では、新規アリルを検出した。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ｎｕｌｌアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールである。
（実施例３）
［実験方法］
１．Ｂｕｃｃａｌ　Ｃｅｌｌ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴＲＩＭＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
２．Ｂｕｃｃａｌ　Ｃｅｌｌ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴＲＩＭＧＥＮ）を用いて抽出したゲノムＤＮＡをさらにイソプロパノールならびにエタノールにて精製した。
３．ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
４．項目１～３にて抽出したゲノムＤＮＡそれぞれ３検体を用いて、実施例１及び実施例２と同様の実験方法によりＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－ＤＱＢ１特異的プライマーセット（表１及び表４参照：配列番号１～８、２９、３０、４８～５０）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図７に示した。
［実験結果と考察］
　図７のレーン１～３は実験方法１にて抽出した場合、レーン４～６は実験方法２にて抽出した場合、レーン７～９は実験方法３にて抽出した場合のＰＣＲ産物の増幅状況を示す。実験方法１にて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅はいずれの遺伝子とも実験方法３にて抽出したものと遜色なく目的のＰＣＲ産物が得られた。実験方法３では採血を伴うが、実験方法１では口腔粘膜から細胞を採取できることから、本発明の方法を用いれば、採血が不可能な場合でもＨＬＡタイピングが十分に可能であることが証明された。

Claims (35)

  1. （１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；
    （２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；
    （３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
    （４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。
  2. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ａ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：１、２及び３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ｂ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：４及び５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ｃ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：６、７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１型であり、前記プライマーセットが配列番号：９、１０、１１、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２型であり、前記プライマーセットが配列番号：１１、１２、３１及び３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３２及び３４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ４型であり、前記プライマーセットが配列番号：１５、１６、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ５型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３１、３５及び３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ６型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３１、３２及び３７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ７型であり、前記プライマーセットが配列番号：１７、１８、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ８型であり、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４、３１及び３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ９型であり、前記プライマーセットが配列番号：１９、２０、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  14. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１０型であり、前記プライマーセットが配列番号：２１、２２、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  15. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２３、２４、４０及び４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  16. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２５、２６、４２、４３、４４及び４５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２７、２８、４６及び４７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  18. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：２９、３０、４８、４９及び５０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載の方法。
  19. 配列番号：１、２及び３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－Ａ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  20. 配列番号：４及び５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  21. 配列番号：６、７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  22. 配列番号：９、１０、１１、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  23. 配列番号：１１、１２、３１及び３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  24. 配列番号：１３、１４、３２及び３４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  25. 配列番号：１５、１６、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ４型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  26. 配列番号：１３、１４、３１、３５及び３６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ５型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  27. 配列番号：１３、１４、３１、３２及び３７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ６型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  28. 配列番号：１７、１８、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ７型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  29. 配列番号：１３、１４、３１及び３９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ８型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  30. 配列番号：１９、２０、３６及び３８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ９型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  31. 配列番号：２１、２２、３１及び３２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ１０型のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  32. 配列番号：２３、２４、４０及び４１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  33. 配列番号：２５、２６、４２、４３、４４及び４５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  34. 配列番号：２７、２８、４６及び４７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  35. 配列番号：２９、３０、４８、４９及び５０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
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