BR112014001258B1 - Método de tipagem de dna, e, conjuntos de iniciadores para tipagem de dna - Google Patents

Método de tipagem de dna, e, conjuntos de iniciadores para tipagem de dna Download PDF

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Abstract

método de tipagem de dna, e, conjuntos de iniciadores para tipa-gem de dna a finalidade da presente invenção é fornecer um método e um kit para tipagem de dna altamente precisa em que a ambiguidade derivada da ambiguidade da fase é eliminada. a presente invenção fornece um método para a tipagem de dna de hla, que é caracterizado por compreender: (1) uma etapa de preparação de um conjunto de iniciadores que pode respectivamente anelar com uma região à montante e uma região à jusante de cada um dos genes hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqa1, hla-dqb 1, hla-dpa1 e hla-dpb1 na sequência de nucleotídeos do genoma humano, e tam-bém preparar um conjunto de iniciadores que pode anelar respectivamente com o éxon 2 e uma região 3' lateral não traduzida em hla-drb1; (2) uma etapa de realizar a amplificação por pcr de uma amostra a ser testada (dna) usando os conjuntos de iniciadores; (3) uma etapa de determinação da sequência de nucleotídeos para um produto de pcr amplificado; e (4) uma etapa opcional de realizar a busca de homo-logia em um banco de dados.

Description

Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se a um método e um kit para tipagem de DNA de um gene HLA usando um sequenciador paralelo massivo.
Técnica Anterior
[0002] O antígeno leucocitário humano (HLA), que representa o complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC), apresenta peptídeos derivados de proteínas estrangeiras, tais como patógenos e peptídeos derivados de autoproteínas para células T. Desta forma, o HLA é profundamente envolvido na indução de respostas imunológicas. Como HLAs principais, seis tipos de antígenos são conhecidos, ou seja, as moléculas de classe I (HLA-A, HLA-B, HLA-C), que são expressas em quase todas as células, e as moléculas de classe II (HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP), que são expressas principalmente em células do sistema imunológico.
[0003] O antígeno HLA classe I consiste em uma cadeia α altamente polimórfica e uma microglobulina β2 substancialmente não polimórfica; enquanto que o antígeno HLA classe II consiste em uma cadeia β altamente polimórfica b e uma cadeia α menos polimórfica. As cadeias α das moléculas de classe I são codificadas pelos genes de HLA-A, HLA-B e HLA-C. As cadeias β dos antígenos de classe II são codificadas pelos genes de HLA- DRB1, HLA-DQB1 e HLA-DPB1, enquanto que as cadeias α são codificadas pelos genes de HLA-DRA1, HLA-DQA1 e HLA-DPA1. A nível genético, nos antígenos HLA classe I, o éxon 2 e o éxon 3 de um gene de codifica uma cadeia α são altamente polimórficos; enquanto que, nos antígenos HLA classe II, o éxon 2 de um gene que codifica uma cadeia β é altamente polimórfico.
[0004] Uma região do gene que codifica um HLA está localizada no braço curto do cromossomo humano 6 em 6p21.3. Uma região de classe I (HLA-A, HLA-C e HLA-B, etc.) uma região de classe III e uma região de classe II (HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, etc.) são organizadas nesta ordem do lado do telômero em direção ao lado do centrômero. Muitos genes são codificados em uma densidade extremamente alta densidade e a associação destes genes com transfusão, transplante e várias doenças foi relatada. Na região de classe III, nenhum gene HLA está presente e genes dos componentes do complemento e fatores de necrose tumoral (TNF), etc. estão presentes.
[0005] Em uma região do gene HLA-DRB que codifica uma cadeia β de um antígeno HLA-DR, foi confirmado que 5 tipos de polimorfismos estruturais estão presentes. No tipo DR1 e no tipo DR10, pseudogenes como HLA-DRB6 e HLA-DRB9, além de HLA-DRB1, estão localizados no mesmo cromossomo. No tipo DR2, um gene HLA-DRB5 (DR51) e pseudogenes como HLA-DRB6 e HLA-DRB9, além de HLA-DRB1, estão localizados no mesmo cromossomo. Nos tipos DR3, DR5 e DR6, um gene HLA-DRB3 (DR52) e pseudogenes como HLA-DRB2 e HLA-DRB9, além de HLA- DRB1, estão localizados no mesmo cromossomo. Nos tipos DR4, DR7 e DR9, um gene HLA-DRB4 (DR53) e pseudogenes como HLA-DRB7, HLA- DRB8 e HLA-DRB9, além de HLA-DRB1, estão localizados no mesmo cromossomo. Ao contrário destes, no tipo DR8, nenhum gene HLA-DRB, exceto HLA-DRB1, está localizado no mesmo cromossomo.
[0006] No éxon de cada alelo, várias regiões apresentando polimorfismo estão presentes. Em muitos casos, uma sequência de nucleotídeos (sequência de aminoácidos) presente em uma determinada região polimórfica está comumente presente em uma pluralidade de alelos. Em suma, cada alelo HLA é especificado por uma pluralidade de regiões polimórficas em combinação. Em um antígeno HLA classe I, não apenas uma região polimórfica no éxon, mas também o éxon 2 ou o éxon 3 tendo a mesma sequência de nucleotídeos está, às vezes, comumente presente em uma pluralidade de alelos.
[0007] Uma vez que uma região altamente polimórfica está presente em um HLA, o número dos tipos de alelos é conhecido por ser extremamente grande e a notação deles foi definida: ou seja, um primeiro campo (nível de dois dígitos) é para discriminação dos tipos de HLA sorológicos, um segundo campo (nível de 4 dígitos) é para discriminação dos alelos com uma substituição de aminoácido no mesmo tipo de HLA sorológico, um terceiro campo (nível de 6 dígitos) é para discriminação de alelos com uma substituição de base não acompanhando uma mutação de aminoácido e um quarto campo (nível de 8 dígitos) é para discriminação de alelos com uma substituição de base em um íntron, que está fora da região genética que codifica uma molécula HLA.
[0008] No transplante da medula óssea, diz-se que se o tipo de HLA de um paciente que pretende receber um transplante coincidir completamente com o tipo de HLA de um doador no nível de 4 dígitos, a taxa de sucesso do transplante melhora e a frequência de GVHD severa diminui. Por outro lado, se os tipos HLA não coincidirem no nível de 4 dígitos, o risco de causar falha, como uma resposta de rejeição, aumenta. Portanto, a tipagem de HLA exata e altamente precisa é extremamente importante também sob um ponto de vista clínico.
[0009] Como método de tipagem de DNA em um gene HLA, um método SBT (tipagem baseada em sequência) e um método SSO (oligonucleotídeo específico de sequência) - Luminex baseado em uma reação em cadeia da polimerase (PCR) são de tendência predominante.
[00010] Estes métodos de tipagem de DNA convencionais têm uma vantagem, que consiste na rápida realização de tipagem de muitas amostras; no entanto, às vezes falham em determinar com precisão uma região polimórfica e uma relação posicional cis/trans de éxons em um cromossomo no caso de um gene classe I. Devido a isso, ocorre ambiguidade de fase, e a tipagem de HLA altamente precisa às vezes não foi facilmente realizada.
[00011] Uma vez que os métodos convencionais são métodos de tipagem de DNA usando PCR baseado principalmente nas regiões de éxon de cada gene, substituições de base em uma região de íntron e uma região promotora são negligenciadas, com o resultado de que havia um risco de falha para detecção de um alelo nulo, que tem a mesma estrutura genética que outros genes que expressam HLA, mas cuja expressão é suprimida.
Técnica Relacionada Documento Patente
[00012] Documento Patente 1: JP H11-216000 A
Documento Não Patente
[00013] Documento Não Patente 1: Lind C., et al., Human Immunology, Vol. 71, páginas 1033-1042 (2010)
Sumário da Invenção Problema Técnico
[00014] Um objeto da presente invenção é fornecer um método e um kit para tipagem de DNA altamente precisa em que a ambiguidade derivada da ambiguidade da fase é eliminada.
Solução para o Problema
[00015] Os presentes inventores conceberam ultimamente uma ideia de projetar recentemente um iniciador de PCR capaz de amplificar especificamente genes dos HLAs, como moléculas de HLA classe I, incluindo HLA-A, HLA-B e HLA-C e, e moléculas de HLA classe II, incluindo HLA- DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 e HLA-DPB1, a definição de condições adequadas de PCR e aplicação de uma técnica de sequenciamento paralelo massivo. Com base nestas novas ideias, eles estudaram repetidamente com o objetivo de atingir o objeto acima. Como resultado, a presente invenção foi realizada.
[00016] Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para a tipagem de DNA do HLA, incluindo as seguintes etapas: (1) uma etapa de preparação de um conjunto de iniciadores que respectivamente anela especificamente com uma região à montante e uma região à jusante de cada um dos genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 e HLA-DPB1 na sequência do genoma humano, e um conjunto de iniciadores que respectivamente anela especificamente com a região do éxon 2 e uma região não traduzida do éxon 3' de HLA-DRB1; (2) uma etapa de amplificação de uma amostra de teste (DNA) por um PCR usando os conjuntos de iniciadores; (3) uma etapa de determinação das sequências nucleotídicas dos produtos amplificados por PCR; e (4) uma etapa de realização de uma busca de homologia em um banco de dados.
Efeitos Vantajosos da Invenção
[00017] Uma vez que o método da presente invenção fornece todas as sequências nucleotídicas necessárias para a tipagem de DNA de um gene HLA de uma única molécula, é um método de tipagem de DNA moderno em que a ambiguidade de fase devido à relação posicional cis/trans não evidente é eliminada. Devido a isto, a correspondência altamente precisa do HLAs entre um paciente que procura receber um transplante e um candidato doador após o transplante é realizada.
[00018] Uma vez que todas as sequências nucleotídicas de um gene HLA, incluindo as regiões periféricas como uma região promotora, regiões de éxon e regiões de íntron são determinadas, um alelo nulo, que não é expresso ou tem a expressão suprimida, e um novo alelo podem ser detectados. Breve Descrição dos Desenhos [Figura 1] (a) Um diagrama mostrando a relação entre a estrutura de um gene de HLA classe I e a estrutura da molécula de HLA classe I; e (b) Um diagrama mostrando a estrutura de uma região promotora de um gene de HLA classe I citada de "Transplantation/transfusion Examination", supervisionado por Hidetoshi Inoko, Takehiko Sasazuki e Takeo Juuji, Kodan-sha Scientific, 2004, página 35. [Figura 2] (a) Um diagrama mostrando a relação entre a estrutura de um gene de HLA classe II e a estrutura da molécula de HLA classe II; e (b) Um diagrama mostrando a estrutura de uma região promotora de um gene de HLA classe II citada de "Transplantation/transfusion Examination", supervisionado por Hidetoshi Inoko, Takehiko Sasazuki e Takeo Juuji, Kodan-sha Scientific, 2004, páginas 46 e 47. [Figura 3] Um diagrama mostrando uma região do gene HLA- DR, citada de "Transplantation/transfusion Examination", supervisionado por Hidetoshi Inoko, Takehiko Sasazuki e Takeo Juuji, Kodan-sha Scientific, 2004, página 48. [Figura 4] Um padrão eletroforético do gel de agarose mostrando estados de amplificação dos produtos de PCR amplificados no Exemplo 1. [Figura 5] Um diagrama mostrando esquematicamente a estrutura de um gene HLA e a posição a que um iniciador de PCR é projetado para se ligar (SEQ ID No. do iniciador designado na região indicada é indicada entre parênteses). [Figura 6] Um padrão eletroforético do gel de agarose mostrando os estados de amplificação dos produtos de PCR amplificados de um gene HLA no Exemplo 2. [Figura 7] Um padrão eletroforético do gel de agarose dos produtos de PCR amplificados obtidos por três tipos de métodos de extração de DNA no Exemplo 3.
Modos para Realizar a Invenção
[00019] Agora, o método de tipagem de DNA da presente invenção será descrito mais especificamente em etapas.
(1) Etapa de preparação de um conjunto iniciador
[00020] No método de tipagem de DNA da presente invenção, em primeiro lugar, um conjunto de iniciadores que respectivamente anela especificamente com uma região à montante e uma região à jusante de cada um dos genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA- DPA1 e HLA-DPB1 na sequência do genoma humano, e um conjunto de iniciadores que respectivamente anela especificamente com a região do éxon 2 e uma região não traduzida do éxon 3' de HLA-DRB1 são preparados.
[00021] A sequência do genoma do cromossomo humano 6 (6p21.3), em que um gene HLA está presente, já foi elucidada e a associação da estrutura do gene e da estrutura de um produto de expressão (molécula de HLA) foi revelada (consulte a Figura 1 e a Figura 2).
[00022] Mais especificamente, cada um dos genes de HLA-A, HLA-B e HLA-C, que são chamadas moléculas de HLA classe I clássicas, contém 7 ou 8 éxons (Figura 1(a)). Fora do éxon 1, dois tipos de intensificadores e uma região promotora estão presentes para c controlar a expressão (Figura 1(b)).
[00023] Sabe-se ainda que muitas regiões polimórficas estão presentes no éxon 2, 3 e 4. Assim, o PCR foi realizado pelo uso de iniciadores preparados especialmente com base nos éxons 2 e 3 em métodos de tipagem de DNA convencionais. Por conseguinte, um problema de ambiguidade de fase ocorreu, como mencionado acima.
[00024] Entretanto, os genes de HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP, que são chamados de moléculas de HLA classe II clássicas, consistem em cadeias α e cadeias β, em que cada um dos genes contém de 5 a 6 éxons (Figura 2 (a)). Fora do éxon 1, uma região promotora está presente para controlar a expressão (Figura 2(b)).
[00025] Sabe-se ainda que muitas regiões polimórficas estão presentes no éxon 2 e no éxon 3. Assim, o PCR foi realizado pelo uso de iniciadores preparados especialmente com base no éxon 2 em métodos de tipagem de DNA convencionais. Nesse sentido, ocorreu um problema de ambiguidade de fase, como mencionado acima.
[00026] Na presente invenção, um conjunto de iniciadores que pode amplificar (por PCR) todas as regiões de um gene (incluindo não apenas os éxons, mas também os íntrons, regiões 5' e 3'não traduzidas e uma região promotora) em cada uma das moléculas de classe I clássicas (HLA-A, HLA- B, HLA-C) e moléculas de classe II clássicas (HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 e HLA-DPB1); e um conjunto de iniciadores que pode amplificar (por PCR) as regiões do gene de HLA-DRB1 incluindo o éxon 2 a uma região 3’ não traduzida são preparados, e os produtos de PCR obtido por amplificação por PCR usando os conjuntos de iniciadores são submetidos ao sequenciamento da próxima geração (descrito mais adiante). Portanto, incertezas, como ambiguidade de fases, podem ser eliminadas e a presença ou ausência de um alelo nulo pode ser detectada com precisão.
[00027] Especificamente, os conjuntos de iniciadores de PCR listados na Tabela 1 até a Tabela 4 abaixo são preparados.
[00028] Na Tabela 1, as SEQ ID Nos. 1 a 3 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA-A, que é uma cadeia α do MHC classe I. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-A (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00029] A SEQ ID No. 1 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 29.909.487 até a posição 29.909.514 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00030] A SEQ ID No. 2 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 29.909.487 até a posição 29.909.514 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00031] A SEQ ID No. 3 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 29.914.925 até a posição 29.914.952 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00032] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.500 bases (pb).
[00033] Na Tabela 1, as SEQ ID Nos. 4 e 5 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA-B, que é uma cadeia α do MHC classe I. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-B (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00034] A SEQ ID No. 4 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 31.325.796 até a posição 31.325.820 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00035] A SEQ ID No. 5 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 31.321.212 até a posição 31.321.235 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00036] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 4.600 bases (pb).
[00037] Na Tabela 1, as SEQ ID Nos. 6 a 8 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA-C, que é uma cadeia α do MHC classe I. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-C (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00038] A SEQ ID No. 6 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 31.240.868 até a posição 31.240.892 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00039] A SEQ ID No. 7 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 31.240.868 até a posição 31.240.892 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00040] A SEQ ID No. 8 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 31.236.991 até a posição 31.236.114 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00041] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 4.800 bases (pb). [Tabela 1]
Figure img0001
[00042] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 9 a 11 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR1 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β do MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DRB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00043] A SEQ ID No. 9 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.552.131 até a posição 32.552.156 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00044] A SEQ ID No. 10 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.552.131 até a posição 32.552.156 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00045] A SEQ ID No. 11 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.546.609 até a posição 32.546.629 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00046] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.200 bases (pb).
[00047] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 31 e 32 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente HLA-DR1, HLA-DR4, HLA-DR6 (DR13) e um gene do subtipo HLA-DR10 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00048] A SEQ ID No. 31 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.558.110 até a posição 32.558.133 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00049] A SEQ ID No. 32 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.551.974 até a posição 32.551.999 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00050] Os comprimentos dos produtos de PCR obtidos usando estes conjuntos de iniciadores são estimados como de cerca de 6.100 bases (pb) no caso de um subtipo HLA-DR1, de cerca de 9.100 bases (pb) no caso de um subtipo HLA-DR4, de cerca de 8.900 bases (pb) no caso de um subtipo HLA- DR6 (DR13) e de cerca de 8.900 bases (pb) no caso de um subtipo HLA- DR10.
[00051] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 11 e 12 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR2 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DRB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00052] A SEQ ID No. 11 é como definida acima.
[00053] A SEQ ID No. 12 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos correspondendo da posição 32.552.130 até a posição 32.552.151 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00054] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.500 bases (pb).
[00055] Na Tabela 3, as SEQ ID Nos. 31 e 33 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene do subtipo HLA-DR2 (DR15) de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00056] A SEQ ID No. 31 é como definida acima.
[00057] A SEQ ID No. 33 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.551.974 até a posição 32.551.999 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00058] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 6.100 bases (pb).
[00059] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 13 e 14 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR3, HLA-DR5, HLA-DR6 e HLA-DR8 do gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DRB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00060] A SEQ ID No. 13 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.552.137 até a posição 32.552.160 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00061] A SEQ ID No. 14 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.546.609 até a posição 32.546.629 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00062] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.100 bases (pb).
[00063] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 34 e 32 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR3 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00064] A SEQ ID No. 34 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.558.110 até a posição 32.558.133 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00065] A SEQ ID No. 32 é como definida acima.
[00066] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 8.900 bases (pb).
[00067] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 15 e 16 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR4 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DRB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00068] A SEQ ID No. 15 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.552.131 até a posição 32.552.157 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00069] A SEQ ID No. 16 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.546.609 até a posição 32.546.629 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00070] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 6.200 bases (pb).
[00071] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 31 e 35 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR5 (DR11) de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00072] A SEQ ID No. 31 é como definida acima.
[00073] A SEQ ID No. 35 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.551.974 até a posição 32.551.999 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00074] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 8.900 bases (pb).
[00075] Na Tabela 2, as SEQ ID Nos. 31 e 36 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR5 (DR12) de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00076] A SEQ ID No. 31 é como definida acima.
[00077] A SEQ ID No. 36 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.551.974 até a posição 32.551.999 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00078] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 8.900 bases (pb). Tabela 2]
Figure img0002
Figure img0003
[00079] Na Tabela 3, as SEQ ID Nos. 31 e 37 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR6 (DR14) de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00080] A SEQ ID No. 31 é como definida acima.
[00081] A SEQ ID No. 37 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.551.974 até a posição 32.551.999 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00082] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 8.900 bases (pb).
[00083] Na Tabela 3, as SEQ ID Nos. 17 e 18 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente o gene de subtipo HLA-DR7 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DRB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00084] A SEQ ID No. 17 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.552.137 até a posição 32.552.160 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00085] A SEQ ID No. 18 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.546.606 até a posição 32.546.629 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00086] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.100 bases (pb).
[00087] Na Tabela 3, as SEQ ID Nos. 38 e 36 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR7 e HLA-DR9 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00088] A SEQ ID No. 38 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.558.110 até a posição 32.558.133 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00089] A SEQ ID No. 36 é como definida acima.
[00090] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 11.400 bases (pb).
[00091] Na Tabela 3, as SEQ ID Nos. 31 e 39 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR8 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00092] A SEQ ID No. 31 é como definida acima.
[00093] A SEQ ID No. 39 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.551.974 até a posição 32.551.999 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00094] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 8.900 bases (pb).
[00095] Na Tabela 3, as SEQ ID Nos. 19 e 20 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR9 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DRB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00096] A SEQ ID No. 19 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.552.137 até a posição 32.552.160 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00097] A SEQ ID No. 20 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.546.609 até a posição 32.546.629 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[00098] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.100 bases (pb).
[00099] Na Tabela 3, as SEQ ID Nos. 21 e 22 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene de subtipo HLA-DR10 de um gene HLA-DRB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DRB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000100] A SEQ ID No. 21 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.552.137 até a posição 32.552.159 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000101] A SEQ ID No. 22 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.546403 até a posição 32.546.435 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000102] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.400 bases (pb). Tabela 3]
Figure img0004
Figure img0005
[000103] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 23 e 24 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DPA1, que é uma cadeia α do MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-DPA1 (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000104] A SEQ ID No. 23 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.041.478 até a posição 33.041.502 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000105] A SEQ ID No. 24 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.031.888 até a posição 33.031.911 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000106] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 9.600 bases (pb).
[000107] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 40 e 41 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DPA1, que é uma cadeia α de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-DPA1 (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000108] A SEQ ID No. 40 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.041.573 até a posição 33.041.596 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000109] A SEQ ID No. 41 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.031.888 até a posição 33.031.912 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000110] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 9.600 bases (pb).
[000111] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 25 e 26 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DPB1, que é uma cadeia β do MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-DPB1 (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000112] A SEQ ID No. 25 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.043.056 até a posição 33.043.079 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000113] A SEQ ID No. 26 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.055.476 até a posição 33.055.499 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000114] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 12.400 bases (pb).
[000115] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 42 e 43 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DPB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de um gene HLA-DRB1 e imprensam a região 5'não traduzida até o éxon 2 na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000116] A SEQ ID No. 42 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.043.168 até a posição 33.043.191 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000117] A SEQ ID No. 43 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.049.084 até a posição 33.049.107 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000118] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 5.900 bases (bp).
[000119] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 44 e 45 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DPB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas nas posições que correspondem à montante e à jusante do éxon 2 até uma região 3’ não traduzida de um gene HLA-DPB1 e que imprensam o éxon 2 até uma região 3'não traduzida na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000120] A SEQ ID No. 44 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.048.182 até a posição 33.048.207 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000121] A SEQ ID No. 45 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 33.055.428 até a posição 33.055.453 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000122] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 7.200 bases (pb).
[000123] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 27 e 28 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DQA1, que é uma cadeia α de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-DQA1 (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000124] A SEQ ID No. 27 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.604.318 até a posição 32.604.338 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000125] A SEQ ID No. 28 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.611.681 até a posição 32.611.701 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000126] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 7.400 bases (pb).
[000127] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 46 e 47 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DQA1, que é uma cadeia α de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-DQA1 (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000128] A SEQ ID No. 46 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.604.469 até a posição 32.604.488 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000129] A SEQ ID No. 47 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.611.936 até a posição 32.611.956 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000130] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 7.400 bases (pb).
[000131] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 29 e 30 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DQB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-DQB1 (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000132] A SEQ ID No. 29 tem uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.626.545 até a posição 32.626.568 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000133] A SEQ ID No. 30 tem uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.635.612 até a posição 32.635.637 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000134] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 9.100 bases (bp).
[000135] Na Tabela 4, as SEQ ID Nos. 29, 30 e 48 a 50 representam um conjunto de iniciadores de PCR amplificando especificamente um gene HLA- DQB1, que é uma cadeia β de MHC classe II. Estes iniciadores do conjunto são sequências nucleotídicas localizadas em posições que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de um gene HLA-DQB1 (incluindo o promotor, éxons e íntrons) e que imprensam todas as regiões na sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000136] As SEQ ID Nos. 29 e 48 têm uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.626.545 até a posição 32.626.568 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000137] As SEQ ID Nos. 30, 49 e 50 têm uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência de nucleotídeos que corresponde da posição 32.635.612 até a posição 32.635.637 em uma sequência do genoma humano (sequência de referência: hg19).
[000138] O comprimento de um produto de PCR obtido usando esses conjuntos de iniciador é estimado em cerca de 9.100 bases (bp). Tabela 4]
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[000139] Estes iniciadores podem ser preparados por um método rotineiramente usado neste campo. Além disso, os conjuntos de iniciadores descritos na Tabela 1 e na Tabela 2 são os exemplos mais preferíveis. No método da presente invenção, qualquer conjunto de iniciadores que pode ser usado como o conjunto de iniciadores é um conjunto de um iniciador normal e um iniciador reverso capaz de anelar para as posições, que correspondem à montante e à jusante de todas as regiões de cada gene HLA e imprensar todas as regiões.
(2) Etapa de amplificação por PCR
[000140] No método da presente invenção, uma amostra de teste (DNA) é amplificada por PCR usando os conjuntos de iniciadores preparados na etapa acima (1).
[000141] A reação de amplificação por PCR é realizada de acordo com um protocolo geral e, mais especificamente, da seguinte maneira. 1. O DNA é extraído de uma amostra de teste, dependendo da forma da amostra. 2. O DNA extraído é quantificado e as concentrações de iniciadores são adequadamente definidas para preparar a solução reacional. 3. As condições reacionais são definidas e uma PCR é realizada.
[000142] Por exemplo:
[000143] Etapa de desnaturação térmica (geralmente de 92 a 97°C)
[000144] Etapa de anelamento (geralmente de 55 a 72°C)
[000145] Etapa de extensão (geralmente de 65 a 80 °C)
[000146] No método da presente invenção, no caso de um gene HLA (exceto HLA-DRB1), a temperatura de anelamento é preferencialmente definida em cerca de 60°C. Devido ao anelamento a cerca de 60°C, os alelos podem ser produzidos na razão equivalente (uniformemente). No caso de um HLA-DRB1, a temperatura da etapa de anelamento é preferencialmente definida em cerca de 70°C. Devido ao anelamento a cerca de 70°C, um subtipo de DR desejado só pode ser produzido especificamente. 4. O produto de PCR obtido é purificado e submetido à etapa de sequenciamento do nucleotídeo a seguir.
(3) Etapa de sequenciamento do nucleotídeo
[000147] Em seguida, a sequência de nucleotídeos do produto de PCR (DNA amplificado) produzido na etapa acima (2) é determinada. A etapa é preferencialmente realizada por uma técnica chamada de sequenciamento de próxima geração (ou sequenciamento ultra-alto). Em relação ao sequenciamento de próxima geração, consulte, por exemplo, “Experimental Medicine", Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodo-sha).
[000148] A sequência da presente invenção é determinada por um método baseado no pirossequenciamento, que é empregado em um sistema sequenciador de genoma FLX da Roche. O método de sequenciamento será descrito abaixo. 1. O produto de PCR obtido na etapa acima (2) é rompido por um nebulizador em fragmentos de cerca de 500 bases. 2. A uma extremidade de cada um dos fragmentos de DNA, um adaptador de DNA é fixado. 3. Os fragmentos de DNA ligados com um adaptador de DNA são dissociados em fragmentos de DNA de fita simples, que são ligados às microesferas por meio do adaptador. As microesferas obtidas são englobadas e colocadas em uma emulsão água em óleo (um ambiente de microrreator contendo um único fragmento de DNA ligado a uma única microesfera é formado). 4. A PCR na emulsão é realizada para formar cópias de cada fragmento de DNA em uma microesfera (cada fragmento de DNA é clonalmente amplificado em cada microrreator. Desta forma, muitos fragmentos podem ser simultaneamente e paralelamente amplificados sem competição com outras sequências). Posteriormente, a emulsão é destruída e as microesferas com fragmentos de DNA amplificados são coletadas. 5. As microesferas são concentradas e carregadas em uma placa picotituladora (um único poço tem um tamanho suficiente para colocar uma única microesfera). 6. O ácido pirofosfórico produzido por uma polimerase durante uma reação enzimática é detectado em relação a cada microesfera por uma reação fluorescente da luciferase. Com base na intensidade e no padrão de fluorescência assim emitido, a sequência de nucleotídeos do DNA é determinada. Quatro tipos de ácidos nucleicos (A, C, G, T) são adicionados em uma ordem predeterminada. O padrão de quimiluminescência de acordo com o ácido nucleico adicionado é registrado. Com base na intensidade de sinal e nos dados posicionais em combinação, a sequência de nucleotídeos é determinada.
(4) Etapa de tipagem de DNA
[000149] Posteriormente, a sequência de nucleotídeos obtida na etapa (3) é comparada com dados de alelos de HLA conhecidos no banco de dados de sequenciamento de nucleotídeos. Desta forma, o tipo de alelo (até 8 dígitos) contido na amostra de teste é determinado.
[000150] No método da presente invenção, conjuntos de iniciadores típicos estão listados na Tabela 1 (descrita acima). O método da presente invenção é caracterizado pelo fato de que os iniciadores são projetados a fim de corresponder a todas as regiões de cada um dos genes de HLA classe I e HLA classe II, exceto HLA-DRB1, e as posições que imprensam a região entre o éxon 2 e a 3'não traduzida de HLA-DRB1, e a sequência de DNA amplificada de modo a corresponder a quase todas as regiões é determinada. Desta forma, a ambiguidade de fases (incerteza) é eliminada e informações sobre um alelo nulo podem ser obtidas.
Exemplos
[000151] A presente invenção será mais especificamente descrita por meio dos exemplos abaixo; no entanto, a presente invenção não se limita a estes exemplos. (Exemplo 1) [Método experimental] 1. Usando o DNA genômico já extraído como um molde e os conjuntos de iniciadores específicos para os genes de HLA classe I individuais (consulte a Tabela 1: SEQ ID Nos. 1 a 8), uma PCR foi realizada. O procedimento é mais especificamente como a seguir. (1) A amplificação por PCR foi realizada pelo uso do iniciador STAR GXL polimerase (TaKaRa). Mais especificamente, a 50 ng de uma solução de DNA genômico, 4 mL de 5 x tampão PrimeSTAR GXL, 1,6 μL de uma solução de dNTP, iniciadores de PCR (4 μL (1 pmol/μL) cada) e 0,8 μL do iniciador STAR GXL polimerase foram adicionados. A quantidade total da solução reacional foi ajustada para 20 μL com água esterilizada. (2) Após manter a 94°C durante 2 minutos, a solução reacional foi submetida a uma etapa consistindo em uma reação a 98°C durante 10 segundos, uma reação a 60°C durante 20 segundos e uma reação a 68°C durante 5 minutos. Essa etapa foi repetida 30 vezes. Observe que, para a amplificação por PCR, utilizou-se o sistema Gene Amp PCR 9700 (Applied Biosystems). Após a PCR, os estados de amplificação dos produtos de PCR foram verificados por eletroforese em gel de agarose. Os padrões eletroforéticos foram mostrados na Figura 4. 2. As sequências nucleotídicas dos produtos da PCR foram determinadas especificamente como a seguir. (1) Um produto da PCR foi purificado pelo kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN) de acordo com o protocolo padrão. (2) A concentração do produto da PCR purificado foi medida pelo kit de quantificação de dsDNA PicoGreen (Invitrogen) de acordo com o protocolo padrão. (3) Uma solução do produto da PCR purificado, uma concentração do qual foi ajustada para ser 500 ng/100 mL, foi submetida à construção de uma biblioteca rápida e, em seguida, a PCR em emulsão e o sequenciamento pelo Sequenciador Genômico (GS) Junior (Roche) foram realizados de acordo com o protocolo padrão para obter as sequências nucleotídicas de 10.000 leituras por amostra. (4) Estas sequências foram conectadas e editadas pelo compilador GS de novo (Roche). Posteriormente, realizou-se uma busca por homologia com sequências nucleotídicas conhecidas em um banco de dados de DNA para identificar os alelos no gene HLA.
[Discussão]
[000152] Nos iniciadores de PCR HLA-A, HLA-B e HLA-C, que amplificam especificamente 5,5 Kb, 4,6 Kb e 4,8 Kb, foram projetados. As condições de PCR foram estudadas e a eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR resultantes foi realizada. Como resultado, verificou-se que todos os genes de HLA classe I fornecem um único produto de PCR amplificado em uma posição correspondente a um peso molecular desejado (Figura 4). Além disso, as sequências nucleotídicas dos produtos de PCR foram determinadas pelo método de Sanger. Como resultado, os alelos de HLA foram obtidos de modo consistente com os documentos conhecidos. A partir disso, confirmou-se que o sistema de PCR da invenção pode ser usado para a tipagem de HLA.
[000153] Usando três amostras de HLA-B*40:02 homozigoto e 17 amostras de um HLA-B*40:02 heterozigoto, incluindo combinações de alelos (B*40 e B*55), em cuja fase ambiguidade foi observada em método de tipagem de DNA convencional, uma PCR foi realizada. Como resultado da tipagem de HLA dos produtos de PCR derivados do gene HLA-B por GS Junior, HLA-B*40:02:01:01 foi detectado de todas as amostras. Nas 17 amostras heterozigotas, 2 tipos de novos alelos foram detectados além dos 15 alelos já conhecidos. Em particular, em relação a uma amostra com uma combinação de alelos (B*40 e B*55), em que ambiguidade de fase foi observada, HLA-B*40:02:01:01 e HLA-B*55:02:01:01 foram identificados por tipagem. A partir disso, foi demonstrado que o método da invenção permite a tipagem de HLA no nível de 8 dígitos, sem ambiguidade de fase; e que o método da invenção é uma excelente ferramenta para detectar eficientemente uma substituição, uma inserção e uma deleção de bases em um promotor e íntrons, que são causas de um alelo nulo. (Exemplo 2) [Método experimental] 1. Usando um DNA genômico já extraído como um molde e os conjuntos de iniciadores específicos para os genes de HLA classe I e HLA classe II individuais (consulte as Tabelas 1 a 4: SEQ ID Nos. 1 a 8, 9 a 22, 31 a 50), uma PCR foi realizada. O procedimento é mais especificamente como a seguir. (1) A amplificação por PCR foi realizada pelo uso do iniciador STAR GXL polimerase (TaKaRa). Mais especificamente, a 50 ng de uma solução de DNA genômico, 4 μL de 5 x tampão PrimeSTAR GXL, 1,6 μL de uma solução de dNTP, iniciadores de PCR (1 a 7 μL (4 pmol/μL)) e 0,8 μL do iniciador STAR GXL polimerase foram adicionados. A quantidade total da solução reacional foi ajustada para 20 μL com água esterilizada. (2) Após manter a 94°C durante 2 minutos, a solução reacional foi submetida a uma etapa consistindo em uma reação a 98°C durante 10 segundos e a uma reação a 70°C durante 5 minutos. Essa etapa foi repetida 30 vezes. Observe que, para a amplificação por PCR, utilizou-se o sistema Gene Amp PCR 9700 (Applied Biosystems). Após a PCR, os estados de amplificação dos produtos de PCR foram verificados por eletroforese em gel de agarose. Os padrões eletroforéticos foram mostrados na Figura 6. As sequências nucleotídicas dos produtos da PCR foram determinadas especificamente como a seguir. (1) Um produto da PCR foi purificado pelo kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN) de acordo com o protocolo padrão. (2) A concentração do produto da PCR purificado foi medida pelo kit de quantificação de dsDNA PicoGreen (Invitrogen) de acordo com o protocolo padrão. (3) O produto de PCR purificado, a concentração do qual foi ajustada para ser 100 ng, foi submetida à construção de uma biblioteca de fragmentos, e em seguida, a PCR em emulsão e o sequenciamento pela máquina pessoal de genoma Ion (Ion PGM) (Life Technologies) foram realizados de acordo com o protocolo padrão para obter sequências nucleotídicas de 300.000 leituras por amostra. (4) Estas sequências foram conectadas e editadas pelo compilador GS de novo (Roche). Posteriormente, realizou-se uma busca por homologia com sequências nucleotídicas conhecidas em um banco de dados de DNA para identificar os alelos no gene HLA. [Resultados e discussão] 1. Iniciadores de PCR, que amplificam especificamente 4 Kb a 12 Kb na região de uma região 5’ não traduzida até o éxon 2 de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DRB1, a região do éxon 2 até uma região 3'não traduzida do HLA-DRB1, a região de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 de HLA-DQB1 e HLA-DPB1 e a região do éxon 2 até uma região 3'não traduzida de HLA-DPB1 foram projetados. As condições de PCR foram estudadas e a eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR resultantes foi realizada. Como resultado, verificou-se que todos os genes HLA classe I e HLA classe II fornecem um único produto amplificado em uma posição correspondente a um peso molecular desejado (Figura 6). Além disso, as sequências nucleotídicas dos produtos de PCR foram determinadas pelo método de Sanger. Como resultado, os alelos de HLA foram obtidos de modo consistente com os documentos conhecidos. Confirmou-se novamente na presente invenção que o sistema de PCR da invenção pode ser usado para a tipagem de HLA. 2. Usando quatro amostras contendo uma combinação de alelos, em que a ambiguidade de fase é observada em um método de tipagem de DNA convencional, uma PCR foi realizada. Produtos de PCR derivados das regiões de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 dos genes HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DRB1, a região do éxon 2 até uma região não traduzida 3' de um gene HLA-DRB1, a região de uma região 5'não traduzida até o éxon 2 dos genes HLA-DQB1 e HLA-DPB1 e a região do éxon 2 até uma região 3'não traduzida de um gene HLA-DPB1 foram submetidos à tipagem de HLA por Ion PGM. Como resultado, a tipagem de regiões de gene inteiras de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 e HLA-DQB1 foi feita com êxito. Em relação ao HLA-DPB1, a tipagem de apenas um éxon foi feita com êxito. Além disso, em cada um dos genes HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 e HLA-DQB1, um novo alelo foi detectado. A partir disso, foi demonstrado que o método da invenção permite a tipagem de HLA no nível de 8 dígitos, sem ambiguidade de fase; e que o método da invenção é uma excelente ferramenta para detectar eficientemente uma substituição, uma inserção e uma deleção de bases em um promotor e íntrons, que são causas de um alelo nulo. (Exemplo 3) [Método experimental] 1. DNA genômico foi extraído usando o kit de extração de DNA celular Buccal, BuccalQuick (TRIMGEN). 2. O DNA genômico extraído pelo uso do kit de extração de DNA celular Buccal BuccalQuick (TRIMGEN) foi adicionalmente purificado com isopropanol e etanol. 3. Usando um minikit para DNA de sangue QIAamp (QIAGEN), o DNA genômico foi extraído. 4. Três de cada uma das amostras de DNA genômico extraídas no itens 1 a 3 acima foram submetidas à PCR usando conjuntos de iniciadores específicos para HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DQB1 realizados no mesmo método experimental como no Exemplo 1 e no Exemplo 2 (consulte a Tabela 1 e a Tabela 4: SEQ ID Nos. 1 a 8, 29, 30, 48 e 50). Após a PCR, os estados de amplificação dos produtos de PCR foram verificados por eletroforese em gel de agarose. Os padrões eletroforéticos foram mostrados na Figura 7.
[Resultados experimentais e discussão]
[000154] Na Figura 7, as raias 1 a 3 mostram os estados de amplificação dos produtos de PCR no caso onde a extração foi feita pelo método experimental 1, as raias 4 a 6 mostram os estados de amplificação dos produtos de PCR no caso onde a extração foi feita pelo método experimental 2 e as raias 7 a 9 mostram o estado de amplificação dos produtos de PCR no caso onde a extração foi feita pelo método experimental 3. A amplificação por PCR no caso onde o DNA genômico extraído pelo método Experimental 1 foi usado como um molde em qualquer gene é equivalente à amplificação por PCR no caso onde o DNA genômico extraído pelo método experimental 3 foi usado, e um produto de PCR desejado foi obtido. No método experimental 3, sangue deve ser aliquotado; no entanto, no método experimental 1, as células podem ser tomadas da membrana da mucosa oral. Portanto, demonstrou-se que se o método da presente invenção for utilizado, a tipagem de HLA pode ser suficientemente realizada mesmo se o sangue não puder ser amostrado.

Claims (2)

1. Método de tipagem de DNA de HLA em até um nível de 8 dígitos sem ambiguidade de fase, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (1) uma etapa de preparação de um conjunto de iniciadores que respectivamente anela especificamente com uma região à montante e uma região à jusante de cada um dos genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLADQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 e HLA-DPB1 na sequência do genoma humano, em que o conjunto de iniciadores para o gene HLA-A compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 1, 2 e 3; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-B compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 4 e 5; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-C compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 6, 7 e 8; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DPA1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 23, 24, 40 e 41; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DPB1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 25, 26, 42, 43, 44 e 45; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DQA1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 27, 28, 46 e 47; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DQB1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 29, 30, 48, 49 e 50; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DRB1 compreendem um conjunto de iniciadores selecionado do grupo consistindo em: (i) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 9, 10, 11, 31 e 32; (ii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 11, 12, 31 e 33; (iii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 32 e 34; (iv) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 15, 16, 31 e 32; (v) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 31, 35 e 36; (vi) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 31, 32 e 37; (vii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 17, 18, 36 e 38; (viii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 31 e 39; (ix) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 19, 20, 36 e 38; (x) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 21, 22, 31 e 32; (2) uma etapa de amplificação de uma amostra de teste (DNA) por um PCR usando os conjuntos de iniciadores; (3) uma etapa de determinação das sequências nucleotídicas dos produtos amplificados por PCR; e (4) uma etapa de realizar, opcionalmente, uma busca de homologia em um banco de dados.
2. Conjunto de iniciadores para tipagem de DNA de um gene HLA em até um nível de 8 dígitos sem ambiguidade de fase, caracterizado pelo fato de que compreende um conjunto de iniciadores para pelo menos um gene HLA selecionado a partir de genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLADQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1 e HLA-DRB1 em uma sequência do genoma humano, em que o conjunto de iniciadores para o gene HLA-A compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 1, 2 e 3; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-B compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 4 e 5; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-C compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 6, 7 e 8; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DPA1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 23, 24, 40 e 41; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DPB1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 25, 26, 42, 43, 44 e 45; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DQA1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 27, 28, 46 e 47; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DQB1 compreendem um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 29, 30, 48, 49 e 50; o conjunto de iniciadores para o gene HLA-DRB1 compreendem um conjunto de iniciadores selecionado do grupo consistindo em: (i) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 9, 10, 11, 31 e 32; (ii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 11, 12, 31 e 33; (iii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 32 e 34; (iv) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 15, 16, 31 e 32; (v) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 31, 35 e 36; (vi) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 31, 32 e 37; (vii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 17, 18, 36 e 38; (viii) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 13, 14, 31 e 39; (ix) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 19, 20, 36 e 38; (x) um conjunto de iniciadores consistindo em um iniciador normal e um iniciador reverso iniciadores selecionados a partir de oligonucleotídeos com sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID Nos. 21, 22, 31 e 32.
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