CN114540486A - 一种hla-dpa1基因全长扩增引物组、分型试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HLA‑DPA1基因全长扩增引物组、分型试剂盒,其上下游引物分别为HLA‑DPA1‑1F和HLA‑DPA1‑1R。本发明可以有效提高扩增效率和基因分型的准确率;同时降低检测成本,简化操作步骤。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体为一种HLA-DPA1基因全长扩增引物组、分型试剂盒。
背景技术
人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)是编码人类的主要组织相容性复合体(MHC)。编码HLA的基因位于6号染色体的短臂上(6p21.31),包括一系列紧密连锁的基因座,由360万个碱基对组成,是目前已知的人类染色体中基因密度最高,也是多态性最为丰富的区域。HLA与人类的免疫系统功能密切相关,其中部分基因编码细胞表面抗原,是免疫系统区分自身和异体物质的基础。HLA基因高度多态化,存在许多不同的等位基因,从而细致调控后天免疫系统。在进行移植手术时人类白细胞抗原决定组织相容性,供体和受体的人类白细胞抗原越相似,排异反应就越小。此外许多疾病与一定的人类白细胞抗原相关联,因此它们对于一定疾病的可能性有关。特定形式的HLA蛋白已经被证实和特定疾病高度相关,或者是确定会诱导该疾病发生;许多HLA相关的自体免疫疾病都和东亚汉人有强烈相关性。
HLA基因分型为器官和造血干细胞移植的供受者的选择提供有效的检测手段,还可以应用于法医学DNA分型和亲子鉴定。另外,HLA基因还与多种药物的药效和毒副作用相关,HLA分型可以让医生根据基因型选择治疗药物,提高药物的有效性,避免不良反应的发生。因此,HLA分型不仅为了解人种来源和民族的迁徙提供重要的科学资料,而且在医学实践中有重要意义。
传统的的HLA基因分型方法如血清学分型和细胞学分型方法操作繁琐且准确率较低。新兴的DNA测序方法,如限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)、序列特异性引物(PCR-SSP)等虽然灵敏性较高,但仍存在分辨率有限、无法检出新等位基因型等方面的不足。直接测序分型(PCR-SBT)方法分辨率高,精确度高,并且能直接发现新的等位基因,但易出现模棱两可的结果,而PCR方案结合高通量测序技术可解决此类问题。
HLA-DPA1属于HLA-Ⅱ类分子α链,这个II类分子是由α(DPA)和β(DPB)链组成的杂二聚体,两者都锚定在膜上,它通过提呈细胞外蛋白衍生的肽在免疫系统中发挥着核心作用。HLA-DPA1基因具有高度多态性,IPD-IMGT/HLA数据库目前(截止2022年01月)收录的HLA-DPA1等位基因有373个。HLA-DP基因中的一些单核苷酸多态性(rs3077、rs9277535和rs9277534等)已被发现与亚洲人群乙型肝炎病毒(HBV)的易感性和持续性有关。HLA-DPA1的rs1431403多态性被证实可能是中国人群胚胎妊娠的危险因素。HLA-DPA1多态性与中国汉族特发性扩张型心肌病遗传易感性的关系也已经被证实。
因此,HLA-DPA1基因的分型检测可为一些疾病的确诊和治疗方向提供一定的指导意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题,提供一种HLA-DPA1基因全长扩增引物组、分型试剂盒。为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种HLA-DPA1基因全长扩增引物组,囊括了HLA-DPA1基因的全部外显子及内含子区域,其上下游引物分别为HLA-DPA1-1F和HLA-DPA1-1R,引物扩增长度5515bp,其具体序列为:
HLA-DPA1-1F:5’-TTTCTGGATTGGAAGSTAGCCCTAC-3’;
HLA-DPA1-1R:5’-CGCTGGTACYTAAAATTCTCCCATC-3’;
其中,引物序列中S和Y为考虑人群基因组多态性而设置的简并碱基,分别代表G/C碱基和C/T碱基,通过设置包含多态性位点的简并碱基可以使引物组具有更好的人群适应性和更高的扩增效率。
一种HLA-DPA1基因全长扩增引物组分型试剂盒,包括权利要求1所述的引物组。
一种基于HLA-DPA1基因全长扩增引物组的二代测序及分型方法,包括如下步骤:
S1.提取样本DNA
使用核酸提取试剂盒对样本进行核酸提取,然后使用Nanodrop2000进行浓度及纯度的测定,DNA浓度应在40~200ng/μL,OD260/280比值应在1.7~2.0之间,然后将DNA浓度稀释至40ng/μL;
S2.配置反应体系及PCR扩增
配置HLA-DPA1基因PCR扩增反应体系,然后在PCR仪器上进行PCR扩增;
S3.HLA-DPA1基因扩增产物纯化
S4.HLA-DPA1基因纯化后产物打断
纯化后产物使用超声打断仪打断,使DNA均匀片段化,打断后产物使用Qubit 4.0进行浓度测定,使用Agilent 2100生物分析仪进行片段长度测定,保证片段长度主要分布在150~300bp之间,主峰在150-250bp之间;
S5.文库构建
对片段化后的DNA进行末端修饰、接头连接和文库扩增反应,扩增反应程序为:98℃变性45s;98℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s,进行6个循环;72℃延伸1min;4℃,∞;制备完成的DNA文库使用Qubit 4.0进行浓度测定,使用Agilent 2100生物分析仪进行片段长度测定,保证片段长度主要分布在200~500bp之间,主峰在300bp左右;
S6.二代测序及数据分析
将质控合格的文库进行上机测序,测序下机后的原始数据通过fastp进行数据过滤,将过滤后的clean data通过HLAscan软件与IMGT/HLA数据库进行比对,得到HLA-DPA1的基因分型信息。
本发明的优点在于:
本发明可以有效提高扩增效率和基因分型的准确率;同时降低检测成本,简化操作步骤,是检测HLA-DPA1基因分型的特异性引物和分型方法上的创新。
附图说明
图1为实施例1中HLA-DPA1基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图;
图2为HLA-DPA1基因打断后质控图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍,以使更好的理解本发明,但是下述实施例并不限定本发明的保护范围。
实施例1HLA-DPA1基因的扩增和打断
具体操作步骤如下:
S1.提取样本DNA
随机挑选6例临床血液样本,进行DNA提取,然后使用Nanodrop2000进行浓度及纯度的测定,DNA浓度应在40~200ng/μL,OD260/280比值应在1.7~2.0之间,将DNA浓度稀释至40ng/μL。
S2.配置反应体系及PCR扩增
用特异性引物组(HLA-DPA1-1F/HLA-DPA1-1R)及其他相关试剂,按照配制表1所示的反应体系进行配制,配置好反应体系后按照表2所示的PCR扩增程序对DNA目标区域进行PCR扩增。
表1.PCR扩增反应体系
表2.PCR扩增程序
PCR扩增反应结束后,取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳确认所扩增的目的片段,如图1所示,片段大小正确,目的条带清晰。
S3.HLA-DPA1基因扩增产物纯化
根据DNA产物纯化试剂盒操作说明书对扩增得到的目标基因片段进行纯化,使用Nanodrop2000对纯化后产物进行浓度及纯度测定,OD260/280比值应为1.7-1.9。
S4.HLA-DPA1基因纯化后产物打断
纯化后产物使用超声打断仪打断,使DNA均匀片段化,打断后产物使用Qubit 4.0进行浓度测定,使用Agilent 2100生物分析仪进行片段长度测定,保证片段长度主要分布在150~300bp之间,主峰在200bp左右,如图2所示。
实施例2HLA-DPA1基因分型检测
具体操作步骤如下:
S1.提取样本DNA
使用核酸提取试剂盒对10例临床样本进行核酸提取,然后使用Nanodrop2000进行浓度及纯度的测定,DNA浓度应在40~200ng/μL,OD260/280比值应在1.7~2.0之间,将DNA浓度稀释至40ng/μL。
S2.配置反应体系及PCR扩增
按照表1中的内容配置HLA-DPA1基因PCR扩增反应体系,反应体系配置好后在PCR仪上按照表2中的反应程序进行PCR扩增。
S3.HLA-DPA1基因扩增产物纯化
根据DNA产物纯化试剂盒操作说明书对扩增得到的目标基因片段进行纯化。
S4.HLA-DPA1基因纯化后产物打断
纯化后产物使用超声打断仪打断,使DNA均匀片段化,打断后产物使用Qubit 4.0进行浓度测定,使用Agilent 2100生物分析仪进行片段长度测定,保证片段长度主要分布在150~300bp之间,主峰在200bp左右。
S5.文库构建
根据建库试剂盒操作说明书对片段化后的DNA进行末端修饰、接头连接和文库扩增反应,扩增反应程序为:98℃变性45s;98℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s,进行6个循环;72℃延伸1min;4℃,∞。制备完成的DNA文库使用Qubit 4.0进行浓度测定,使用Agilent2100生物分析仪进行片段长度测定,保证片段长度主要分布在200~500bp之间,主峰在300bp左右。
S6.二代测序及数据分析
将质控合格的文库进行上机测序,使用Illumina公司的HiSeq 4000测序仪进行测序,采用双端150bp的测序模式,测序深度为1000×。测序下机后的原始数据通过fastp进行数据过滤,将过滤后的clean data通过HLAscan软件与IMGT/HLA数据库(版本3.43)进行比对,得到HLA-DPA1的基因分型信息,如表3中全长扩增子测序结果所示,同时将该分型结果与全外显子测序(WES)分型结果(样本1-8)或全基因组测序(WGS)分型结果(样本9-10)进行比对,在6位分辨率上分型结果一致率100%,进一步说明了本发明分型方法的准确性。
表3. 10例临床样本HLA-DPA1基因分型结果与WES/WGS结果对比
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不等同于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,不脱离本发明的精神和范围下所做的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (5)
1.一种HLA-DPA1基因全长扩增引物组,其特征在于,其上下游引物分别为HLA-DPA1-1F和HLA-DPA1-1R,其具体序列为:
HLA-DPA1-1F:5’-TTTCTGGATTGGAAGSTAGCCCTAC-3’;
HLA-DPA1-1R:5’-CGCTGGTACYTAAAATTCTCCCATC-3’;
其中,引物序列中S和Y为简并碱基,分别代表G/C碱基和C/T碱基,引物扩增长度5515bp。
2.一种HLA-DPA1基因全长扩增引物组分型试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物组。
3.一种基于HLA-DPA1基因全长扩增引物组的二代测序及分型方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.提取样本DNA
使用核酸提取试剂盒对样本进行核酸提取,然后使用Nanodrop2000进行浓度及纯度的测定,DNA浓度应在40~200ng/μL,OD260/280比值应在1.7~2.0之间,然后将DNA浓度稀释至40ng/μL;
S2.配置反应体系及PCR扩增
配置HLA-DPA1基因PCR扩增反应体系,然后在PCR仪器上进行PCR扩增;
S3.HLA-DPA1基因扩增产物纯化
S4.HLA-DPA1基因纯化后产物打断
纯化后产物使用超声打断仪打断,使DNA均匀片段化,打断后产物使用Qubit 4.0进行浓度测定,使用Agilent 2100生物分析仪进行片段长度测定,保证片段长度主要分布在150~300bp之间,主峰在150-250bp之间;
S5.文库构建
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