KR101709826B1 - 신규 ｐｃｒ 서열화 방법 및 ｈｌａ 제노타이핑에서의 상기 방법의 사용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 하기 단계들을 포함하는 PCR 서열화 방법을 제공한다: 1) 샘플을 제공하는 단계; 2) 증폭 단계; 3) 혼합 단계; 4) 파괴 단계; 5) 서열화 단계; 및 6) 스플라이싱(splicing) 단계. 본 발명은 본 방법에서 사용된 프라이머 태그들, 및 제노타이핑, 특히 HLA 분석에서의 상기 방법의 이용도 제공한다. 본 발명은 HLA-A/B, HLA-C 및 HLA-DQB1에 대한 PCR 프라이머들도 제공한다.
Description
관련 출원들
본 특허출원은 2010.6.30일 출원된, 중국 특허출원 제 201010213717.6, 201010213719.5 및 201010213721.2호를 우선권으로 주장하며, 2010.12.24일 출원된, 국제출원 제 PCT/CN2010/002150 및 PCT/CN2010/002149호를 우선권으로 주장하며, 그 내용들은 전체로서 본 명세서에 참고로서 통합된다.
기술분야
본 발명은 핵산 서열화 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로 PCR 서열화 분야에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 DNA 바코딩(barcoding) 기술 및 DNA 불완전 전단(shearing) 전략에도 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히 제 2 세대 서열화 기술, 특히 제 2 세대 서열화 기술의 페어드-엔드(Paired-end) 서열화 기술에 적용가능하며, 또한 HLA 제노타이핑(genotyping)에 적용가능하다. 특히, 본 발명은 HLA 제노타이핑 방법, HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 HLA-DQB1 제노타이핑 방법을 제공하며, 본 방법에 사용된 PCR 증폭을 위한 프라이머 쌍들(pairs)도 제공한다.
PCR 서열화 방법은, 관심 대상의 유전자의 DNA 단편들(fragments)을 PCR 방법에 의하여 수득하고, 수득된 관심 대상의 유전자의 DNA 단편들을 DNA 서열화하여 관심 대상의 유전자의 DNA 서열 정보를 수득하는 기술을 말한다. PCR 서열화 방법들은 오랫동안 유전자 돌연변이의 검출 및 제노타이핑과 같은 분야에 광범위하게 적용되어 왔다.
DNA 서열화 기술은, 생어(Sanger) 서열화 방법에 의해 대표되는 제 1 세대 DNA 서열화 기술 및 Illumina GA, Roche 454, ABI Solid 등에 의해 대표되는 제 2 세대 DNA 서열화 기술로 주로 분류된다. 생어 DNA 서열화 기술은 간단한 실험 조작들, 시각적 결과들 및 정확한 결과들, 및 짧은 실험 기간에 의하여 특징되며, 이에따라 임상적 유전자 돌연변이 검출 및 제노타이핑과 같은 분야들에서 광범위하게 적용되며, 여기에서 빠른 소요 시간(turnaround time)은 검출 결과들에서와 같이 높게 요구된다. 그러나, 적은 처리량(throughput) 및 높은 비용과 같은 특징들로 인하여, 제노타이핑이 대규모로 수행되는 분야에서의 이의 적용은 제한된다.
제 1 세대 DNA 서열화 기술에 비하여, 제 2 세대 DNA 서열화 기술은 높은 서열화 처리량, 저비용, 높은 자동화 수준, 및 단일-분자 서열화와 같은 특징들을 갖는다. Illumina GA 단일-분자 서열화를 예로 들면, 일회 서열화 운전(run)으로 50G (약 500억) 염기들의 데이터, 평균 1일 당 50억 염기들 데이터를 생성하며, 하나의 염기에 대한 평균 서열화 비용은 생어 방법에서의 서열화 비용의 1/1000 미만이다. 나아가, 결과들의 분석은 컴퓨터에 의해 직접 실시될 수 있다. 따라서, 제 2 세대 DNA 서열화 기술은 대규모 서열화 프로젝트들에 상당히 적당한 기술이다. 그러나, 제 2 세대 DNA 서열화 기술에서는 연속 서열화 길이가 일반적으로 짧다. 현재, 최대 양방향성 서열화 길이는 Illumina GA의 경우, 200bp; Roche 454 GS-FLX의 경우 최대 서열화 길이는 약 500bp일 수 있지만, 서열화 비용이 높고 처리량이 낮다. PCR 암플리콘(amplicon)이 서열화기에서 최대 서열화 길이보다 큰 길이인 경우, 전체 암플리콘의 완전한 서열화는 서열화에 의해 직접 달성될 수 없고, 암플리콘의 전체 DNA 서열 정보가 수득될 수 없다. 짧은 최대 서열화 길이로 인하여, PCR 서열화 방법에 있어서 제 2 세대 서열화 기술의 적용은 제한된다. 보다 긴 최대 서열화 길이를 수득하기 위한 서열화 기술의 점진적인 개선에 추가하여, PCR 서열화 적용 분야에서 제 2 세대 DNA 서열화기의 현재 최대 서열화 길이의 부족을 극복하기 위한 새로운 기술을 개발하는 것이 시급히 요구된다.
인간 백혈구 항원(HLA: Human Leucocyte Angigen)은 이제까지 다형성이 가장 높은 것으로 알려진 유전자 계(system)들 중 하나이다. 이는 인간 신체에서의 특이적 면역 반응을 조정하고, 질병들에 대한 감수성(susceptibility)에서의 개인적인 차이들을 결정하기 위한 일차적인 유전자 계로, 동종이계(allogeneic) 기관 이식 거부반응과 밀접하게 관련된다. HLA-A, B, C, DRB1 및 DQB1과 같이, 유전자들의 매칭(matching) 정도 및 공여자와 수령자에서의 해상도(resolution)가 높을수록, 그 이식체는 더욱 오래 생존한다. 가능한 공여자와 수령자를, 조혈모세포 이식 전에 고해상도 HLA 제노타이핑하는 것은 이미 일반적인 시험 항목이다.
현재 국제 표준 HLA 고해상도 제노타이핑 기술은 생어 서열화 기술에 기초한 PCR 서열화 방법으로, 이는 대응 HLA 유전자 영역들을 PCR 증폭하고, 증폭 산물을 서열화하고, 그 서열화 결과를 전문적 제노타이핑 소프트웨어를 이용하여 제노타이핑하고, 최종적으로 그 샘플의 HLA 유전형 정보를 수득하는 것을 포함한다. 이는 시각적 결과들, 고해상도 및 새로운 대립유전형질(allele) 검출능에 의하여 특징된다. 그러나, 높은 비용 및 낮은 처리량과 같은, 생어 서열화의 특징으로 인하여, 대규모 HLA 제노타이핑 검출이 요구되는, 조혈모세포 지원자 등록 데이터베이스 (Bone Marrow Bank)와 같은 연구소들에서의 그의 적용은 제한된다.
Roche 454 GS-FLX에 기초한 PCR 서열화 방법이 HLA 제노타이핑에 사용되었음이 보고되었다. 그러나, 서열화 비용이 상대적으로 높기 때문에, 서열화 처리량 및 서열화 비용 면에서 생어 서열화에 기초한 HLA 제노타이핑 기술에 대하여 현저히 뛰어나지는 않았다. Roche 454 GS-FLX에 비하여, Illumina GA는 보다 짧은 서열화 길이를 갖지만, 서열화 처리량 및 서열화 비용 면에서 명백한 장점들을 갖는다. Illumina GA의 짧은 최대 서열화 길이의 결함이 극복된다면, HLA 제노타이핑에서의 그의 적용은 현재 HLA 제노타이핑 방법의 결점을 보충할 것이다.
제 2 세대 서열화 기술에 의하여, 다수의 샘플들에서 특이적 유전자와 관련된 서열들과 동시에 서열분석을 수행하는 경우, PCR 서열화 전략이 일반적으로 사용되며, 여기에서 프라이머 인덱스(index) 및 제 2 세대 서열화 기술의 조합이 직접적으로 사용된다. 서열화기의 최대 서열화 길이가 전체 PCR 생성물의 길이를 커버할 수 있는 경우, 상기 전략은 필요조건을 만족시킨다. 서열화기의 최대 서열화 길이가 전체 PCR 생성물의 길이를 커버할 수 없는 경우, Illumina GA는 보다 긴 최대 서열화 길이를 갖는 제 2 세대 서열화기로 대체될 필요가 있다 (예컨대 Roche 454 GS-FLX). 최대 서열화 길이가 필요조건에 여전히 만족되지 않는 경우, 비용과 처리량 면에서 손해를 보면서도 제 1 세대 서열화기가 사용되어야 한다.
실질적인 상황은 Illumina GA가 특별히 높은 서열화 처리량을 가지지만, 그의 최대 서열화 길이는 단지 200bp이며; Roche 454 GS-FLX의 최대 서열화 길이는 약 500bp에 달할 수 있지만, 서열화 비용이 비교적 높고, 처리량은 비교적 낮으며; 제 1 세대의 최대 서열화 길이는 1000bp 이상에 도달할 수 있지만, 그의 처리량 및 비용은 제 2 세대 서열분석기에 필적하지 않는다.
비용과 처리량을 손해보지 않으면서 서열분석기에 의해 철저하게 서열화될 수 있는 PCR 생성물들의 길이를 증진시킬 수 있는 기술이 있는가? 본 출원발명에서 프라이머 인덱스들, DNA 불완전 전단 전략 및 제 2 세대 서열화 기술의 조합은 서열분석기에 의해 서열분석될 수 있는 PCR 생성물들의 길이가 서열분석기의 최대 서열화 길이보다 더울 길도록 할 수 있는 한편, 고처리량 및 저비용과 같은 제 2 세대 서열화 기술의 특징들을 완전히 이용할 수 있도록 하여, 그에 따라 이의 적용가능한 범위를 크게 확장시킨다. 본 발명에서 사용된 제 2 세대 서열화 기술은, 제 2 세대 서열화 기술들 중, 페어드-엔드 서열화 기술, 및 PCR 주형에 대한 DNA 참조 서열을 갖는 PCR 서열화 기술을 포함한다.
본 발명은 PCR 서열화 방법을 제공하며, 이에 의하여 짧은 최대 서열화 길이로 인한 한계가 경감되며, PCR 서열화 적용 분야에서 제 2 세대 DNA 서열화 기술의 적용이 확장된다. 예로서, 제 2 세대 서열화 기술을 이용하여 서열화를 수행하는 경우, 5'말단에 첨가된 프라이머 인덱스를 갖는 인덱스 프라이머들이 사용되며, 증폭된 PCR 생성물들은 전단되며, 그 전단 생성물들은 최종적으로 복구되고, 그들의 3' 말단들에 결찰된 데옥시아데노신 (A)를 갖고, 그 후 상이한 PCR-자유 어댑터(PCR-free adapter)들에 결찰된다.
DNA 바코딩 기술 및 DNA 불완전 전단 전략에 기초한 PCR 서열화 방법은 프라이머 인덱스들의 수는 증가시키지 않으면서, 특이적으로 라벨된 샘플들의 수를 크게 증가시킬 수 있다 (도 5). 본 발명에서, PCR 생성물들의 실질적으로 서열화된 길이는, DNA 불완전 전단 전략의 사용 및 제 2 세대 서열화 기술의 적용을 조합하여, 프라이머 인덱스들을 순방향 및 역방향 PCR 프라이머들에 첨가하므로써, 서열분석기의 최대 서열화 길이를 초과한다.
증폭 프라이머의 전방 말단에의 인덱스 서열의 첨가는 다수의 샘플들의 동시 서열화를 실현화하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 말하면, 독특한 프라이머 인덱스를, 프라이머 인덱스를 PCR 프라이머의 5'말단에 첨가함에 의한 인덱스 프라이머의 합성과 조합하여 PCR-인덱스/바코드 기술을 이용하므로써 PCR 동안 각 샘플에 첨가한다. 그 자체로서, 제 2 세대 서열화 기술에 의한 서열화 동안, 샘플들은 PCR 단계에서만 하나씩 차례로 처리되어야만 하며, 나머지 실험 단계들에서는 함께 혼합되어 동시에 처리될 수 있으며, 각 샘플에 대한 최종 결과는 그의 독특한 프라이머 인덱스로 인하여 추적될 수 있다.
"어댑터(adapter)" 또는 "라이브러리 어댑터(library adapter)" 인덱스 기술은 상이한 라이브러리 어댑터들을 다중 서열화 라이브러리들에 첨가하는 것을 포함하는 라이브러리 인덱스화 기술을 의미하며(상이한 라이브러리 어댑터들은 상이한 서열들로 이루어지며, 서열들 중 상이한 부분은 어댑터 인덱스라고 명명된다), 인덱스화된 서열화 라이브러리들을 구축한 후, 풀(pool) 중에서 다수의 상이한 인덱스화 서열화 라이브러리들의 서열화를 달성하고, 여기에서 각 인덱스화된 서열화 라이브러리에 대한 최종 서열화 결과는 구분가능하다. "PCR-자유 라이브러리 어댑터"라는 용어는 염기들의 설계된 절편(segment)을 의미하며, 그의 주 역할은 서열화 칩 상에 DNA 분자의 보조적인 고정화 및 보편적 서열화 프라이머들에 결합 자리들의 제공에 있으며, 여기에서 PCR-자유 라이브러리 어댑터는 서열화 라이브러리 중 DNA 절편들의 2개의 말단에 직접 결찰될 수 있다. PCR은 어댑터의 도입을 포함하지 않기 때문에, 어댑터는 PCR-자유 라이브러리 어댑터로 명명된다. 예로서, 본 발명의 실시예들에 사용된 PCR-자유 라이브러리 어댑터들은 ILLUMIA로부터의 것들이다.
라이브러리 어댑터 인덱스 기술이 사용되는, PCR-자유 라이브러리의 구축 방법은 서열화 라이브러리의 DNA 단편의 2 개의 말단들에 라이브러리 어댑터의 직접 결찰을 의미한다. PCR은 라이브러리 어댑터의 도입을 포함하지 않기 때문에, 이는 PCR-자유 라이브러리 구축으로 명명된다. DNA 리가아제는 도입 과정에서 결찰에 사용될 수 있다. PCR은 라이브러리 구축 공정에 포함되지 않기 때문에, PCR 바이어스(bias)로부터 초래된 최종 결과들의 부정확성은, 높은 서열 유사성의 PCR 생성물들을 포함하는 라이브러리의 구축 동안 회피된다.
본 발명에서 포함된 것과 같은 DNA 증폭 방법들, DNA 추출 방법들, DNA 정제 방법들 및 DNA 서열 배열 방법들은 당 기술 분야에서 이용가능한 임의의 방법들일 수 있다. 상기 방법들은 실질적인 상황들에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. DNA 서열화 방법들의 경우, 당업자는 통상의 방법들에 따르거나, 또는 서열분석기의 설명에 따라 그를 실시할 수 있다.
프라이머 인덱스들의 설계는 적용된 실험 플랫폼(platform)에 따라 달라진다. Illumina GA 서열화 플랫폼의 특징들 면에서, 본 발명에서 프라이머 인덱스들을 설계할 때 하기 인자들이 우선적으로 고려된다: 1: 3개 이상의 염기를 포함하는 모노뉴클레오티드 반복 서열은 프라이머 인덱스 서열들에서 회피된다, 2: 모든 프라이머 인덱스들의 동일한 자리에서 염기 A 및 염기 C의 총 량은 모든 염기들의 양의 30%~70%로 계산된다, 3: 프라이머 인덱스 서열 그 자체의 GC 함량은 40% 내지 60%이다, 4: 프라이머 인덱스들은 적어도 4개의 염기들까지 서로 상이하다, 5: Illumina GA 서열화 프라이머들에 대해 높은 서열 유사성을 갖는 서열들은 프라이머 인덱스 서열들에서 회피된다, 그리고, 6: PCR 프라이머들에 프라이머 인덱스 서열들의 첨가가 심각한 헤어핀(hairpin) 및 2량체를 생성하는 결과를 내는 경우가 감소된다
본 발명에서는, 2 개의 프라이머 인덱스들(동일 또는 상이함)이 PCR생성물의 두 말단에 각각 첨가되어, 그 PCR 생성물의 어느 한 말단에서 프라이머 지수가 PCR 생성물의 샘플 정보를 특이적으로 표지할 수 있도록 한다. 결과의 PCR 생성물은 불완전 전단된다. 소위 "불완전 전단(incomplete shearing)"이라 함은, 생성물이 온전하게 전단되지 않은 PCR 생성물들 및 부분적으로 전단된 PCR 생성물들을 포함하는 경우를 의미한다. 전단 방법들은, 이에 제한되지는 않지만, 화학 전단 방법들 (예컨대 효소 분해) 및 물리적 전단 방법들을 포함한다. 물리적 전단 방법들은 초음파 전단 방법들 또는 기계적 전단 방법들을 포함한다. 전단된 DNA는 2% 아가로오스 전기영동에 투입되고, 서열분석기의 최대 서열화 길이와 최대 적용가능한 DNA 길이간의 모든 DNA 밴드들은 겔을 슬라이스하여 정제 및 회수된다 (Illumina GA 서열분석기에 적용가능한 가장 긴 DNA는 700bp이고, 그 길이는 원래 DNA 길이를 의미하며, 이는 라이브러리 어댑터 서열의 길이를 포함하지 않는다). 정제 및 회수 방법은, 이에 제한되지는 않지만, 전기영동 및 겔 슬라이싱에 의한 회수, 및 자석 비즈(beads)에 의한 회수를 포함한다. 회수된 DNA 단편들은 제 2 세대 서열분석기에 대한 서열화 라이브러리들의 구축 절차들에 따라 서열화 라이브러리들의 구축에 투입되며, 그 후 서열화된다. 바람직하게는, 서열화 라이브러리들은 서열화 라이브러리들을 구조화하기 위한 PCR-자유 절차들에 따라 구축되며, 페어드-엔드 방법은 서열화 방법으로서 사용된다. 서열화 라이브러리들의 PCR-자유 구축은 당업자에 의해 알려진 방법들에 따라 실시된다. 수득된 서열화 데이타에서, 모든 시험 샘플들에 대한 서열 정보는 프라이머 인덱스 서열들로 인하여 수득될 수 있다. 서열 판독값들(reads)은 BMA에 의하여 PCR 생성물들의 대응 DNA 참조 서열들로 배열되며, 서열 판독값들간의 중복(overlapping) 및 연결 관계에 의하여 완전한 서열이 어셈블리된다 (도 1). 본 명세서에서 연결은 페어드-엔드 서열화 특징들로 인한 페어드-엔드 연결 관계를 의미한다.
Illumina GA 서열화(Illumina Inc.사로부터의 게놈 분석기 서열분석기(Genome Analyzer Sequencer), 간략하게 Illumina GA로서 언급됨)에서, DNA 서열 분석은 합성에 의한 서열화 원칙에 기초하여 실시된다. 상 단상형(haplotype)에 적용될 수 있으며, 최종적으로 수득된 데이터는 일련의 염기 서열들을 의미하며, HLA 데이터베이스에서 참조 서열들과의 배열에 직접 적용될 수 있다. 이는 전통적인 타입화(typing) 소프트웨어에 존재하는 피크들의 그릇된 판단의 결점을 갖지 않기 때문에, 소프트웨어 타입화 자동화에 유리하다. Illumina GA는 높은 서열 처리량을 갖는다. 현재, 1회의 단일한 서열분석 가동은 50G(500억) 염기 데이터, 평균 일 당 50억 염기 데이터를 생성한다. 높은 데이터 처리량으로 인하여, 높은 서열분석 깊이는 각 서열에 대하여 수득될 수 있으며, 이에 따라 서열분석 결과들의 신뢰성이 보장된다.
Illumina GA의 HLA 타입화 분야에의 적용에 대한 연구들은 아직 없다. 본 발명은 Illumina GA를 HLA 타입화 분야에 최초로 적용하며, DNA 바코딩 기술, DNA 불완전 전단 및 PCR-자유 라이브러리 제조에 기초한, PCR 서열화 기술을 이용하여, 저비용, 고처리량, 높은 정확성 및 높은 해상도로 HLA 타입화를 달성한다
본 발명에서, DNA 바코딩 기술, DNA 불완전 전단 및 PCR-자유 라이브러리 제조에 기초한, PCR 서열화 기술을 이용하므로써 분석되는 샘플들은 그룹화된다: 각 군의 샘플들을, 양방향성 프라이머 인덱스들에 의해 표지된 프라이머들을 이용하여 관심 대상의 HLA 유전자들의 단편을 증폭시킨다(PCR 생성물들의 최대 길이는 서열분석기에 적용될 수 있는 DNA의 최대 길이에 따라 달라지며; 현 Illumina GA에서 최대 적용가능한 DNA 길이는 700bp이고, 이 길이는 원래 DNA 길이로, 라이브러리 어댑터 서열의 길이를 포함하지 않는다); 이 PCR 생성물들을 동일한 양으로 함께 풀화되며(pooled), 그 후 불완전 전단 및 인덱스화된 PCR-자유 DNA 서열화 라이브러리 제조에 투입된다. 샘플들의 다양한 군들로부터 수득되는 것과 같은, 상이한 인덱스화된 서열화 라이브러리들은 균등 몰로 혼합되며, 서열분석기의 최대 서열화 길이보다 더욱 긴 길이의 모든 DNA 단편들은 Illumina GA에 의하여 선택적으로 회수 및 서열화된다. 각 샘플에 대한 DNA 서열 판독값들은 총 서열화 데이터에서 어댑터 지수들, 프라이머 인덱스들 및 PCR 프라이머들의 서열 정보를 스크리닝하므로써 수득될 수 있다. 어셈블리 후 결과의 DNA 서열들은 IMGT HLA 전문 데이터베이스에서 대응 데이터에 따라 배열되며, 그에 따라 최종적으로 샘플의 HLA 유전자형을 결정한다.
상기 설명된 방법들에서, DNA를 전단 후, 상이한 군들의 샘플들로부터의 DNA는 인덱스화된 PCR-자유 라이브러리 제조 동안 상이한 라이브러리 어댑터에 결찰되며, 따라서 다음의 타입화 단계들에서, 결과의 서열화 데이터는 각 샘플에서 사용된 프라이머 인덱스들 및 어댑터 인덱스들에 기초하여 하나씩 샘플들에 대하여 추적될 수 있다. 각 샘플의 서열들은 소프트웨어에 의하여 PCR 생성물에 대응하는 알려진 DNA 참조 서열에 대하여 배열된다. 서열 중복 및 연결 관계에 기초하여, PCR 생성물에 대한 온전한 서열은 전단된 DNA의 서열들로부터 어셈블리된다.
본 발명은 Illumina GA 서열화 기술에 기초한 고해상도 HLA 제노타이핑 방법들을 제공하며, 이에 따라 단상형 서열화 및 소프트웨어 타입화 자동화를 달성하며, HLA 제노타이핑 처리량을 증진시키고, 비용을 감소시킨다.
현재의 서열화 기술들에서 DNA 주형의 길이 및 현재 서열화 기술들에서의 짧은 판독값 길이에 대한 필요로 인하여, HLA-SBT 방법들에 대한 본래의(original) PCR 프라이머들은 새로운 서열화 기술에 근거한 고해상도 HLA 타입화 방법들에 더이상 적용가능하지 않다. 본 발명은 양호한 특이성 및 보존성을 갖는 신규 PCR 프라이머들을 설계하며, 이는 HLA-A, B 유전자의 엑손들(Exons) 2, 3, 4를 독립적으로 증폭시키며, 그의 PCR 생성물들은 700bp가 넘지 않는 길이를 갖고, 특히 Illumina GA에 적용가능하다(현재 Illumina GA에 적용가능한 최대 DNA 길이는 700bp이다). 본 발명에서 제공되는 것과 같은 PCR 프라이머들의 세트는 대상(특히 인간)에 대한 HLA 제노타이핑에, 큰 규모, 고처리량 및 저비용으로 적용가능하다.
본 발명에서 사용된 기술적 해결책들에서, 모든 최신의 HLA-A/B 유전자 서열들은 IMGT/HLA 인터넷 웹사이트 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)로부터 다운로드되며, 그 후 HLA-A 데이터 세트로서 개인 디스크에 저장되고, HLA-A 서열들 외의 모든 최신 HLA-I 유전자 서열들은 비교 데이터 세트로서 다운로드된다. 상기 2개의 데이터 세트들은 2개의 말단 및 엑손들 2, 3,4의 내부 부분에서의 각 유전자 자리에 대하여 보존적이고 특이적인 서열들을 찾기 위하여 비교되며, 설계된 PCR 프라이머 서열은 상동성에 대하여 인간 게놈 서열에 비교된다. HLA-A/B 유전자는 서열 면에서 HLA-I 분자들에 속하는 다른 유전자들에 매우 유사하기 때문에, PCR 프라이머들을 설계할 때, 프라이머의 3' 말단은 그 프라이머들을 이용한 HLA-A/B 유전자의 증폭의 특이성을 보장하기 위하여 가능한 한 특이적이어야만 한다. 한편, PCR 생성물들의 길이는 700bp 미만이고, 순방향 및 역방향 프라이머들의 어닐링 온도는 실질적으로 동일하다.
설계 필요사항들에 맞는 후보 HLA-A/B 프라이머들의 다수 쌍들은 일반적인 HLA-A/B 혈청형들(serotypes)의 주형 DNA들을 증폭시키는데 사용된다. 그들 중, 엑손 2, 3 및 4 각각의 증폭에 대하여, 최선의 보존성 및 특이성을 갖는 HLA-A/B의 PCR 프라이머들의 2개 세트들 (각 세트에 대하여 6 쌍들)을 가려내었다.
상기 2개 세트들의 PCR 프라이머들 (각 세트에 대하여 6 쌍들)을 기본 프라이머들로서 이용하고, 그에 기초하여, HLA-A/B의 일반적인 혈청형들의 95 및 950 DNA 주형들 (이들 주형들의 혈청형들은 HLA-A/B의 일반적인 혈청형들 모두를 포함한다) 각각의 증폭에 사용되는, 95세트의 인덱스 프라이머들이 설계된다. 모든 PCR 생성물들은, 균등량으로 혼합 후 Illumina GA 페어-엔드 100를 이용하여 서열화되며, PCR 프라이머들의 보존성 및 특이성을 확인하기 위하여, 어셈블리 후 그 서열화 결과들을 본래의 타입화 결과들에 비교한다.
본 발명에서 설계되는 것과 같은 HLA-A, B 프라이머들, 즉 엑손 2, 3 및 4의 증폭을 위한 HLA-A/B 의 PCR 프라이머들의 두 세트들(각 세트에 대하여 6 쌍들) 각각을 표 1 및 표 2에 나타내었다:
| 서열번호: | 프라이머 번호 | 프라이머 서열 | 프라이머의 용도 | 생성물들의 길이 |
| 1 | A-F2 | CCTCTGYGGGGAGAAGCAA | HLA-A 유전자의 엑손 2 증폭 | 480bp |
| 2 | A-R2 | ATCTCGGACCCGGAGACTG | ||
| 3 | A-F3 | CGGGGCCAGGTTCTCACAC | HLA-A 유전자의 엑손 3의 증폭 | 410bp |
| 4 | A-R3 | GGYGATATTCTAGTGTTGGTCCCAA | ||
| 5 | A-F4 | GTGTCCCATGACAGATGCAAAA | HLA-A 유전자의 엑손4의 증폭 | 430bp |
| 6 | A-R4 | GGCCCTGACCCTGCTAAAGG | ||
| 7 | B-F2 | AGGAGCGAGGGGACCGCA | HLA-B 유전자의 엑손 2의 증폭 | 400bp |
| 8 | B-R2 | CGGGCCGGGGTCACTCAC | ||
| 9 | B-F3 | CGGGGCCAGGGTCTCACA | HLA-B 유전자의 엑손 3의 증폭 | 370bp |
| 10 | B-R3 | GAGGCCATCCCCGGCGAC | ||
| 11 | B-F4 | GCTGGTCACATGGGTGGTCCTA | HLA-B 유전자의 엑손 4의 증폭 | 380bp |
| 12 | B-R4 | CTCCTTACCCCATCTCAGGGTG |
| 서열번호: | 프라이머 번호 | 프라이머 서열 | 프라이머의 용도 | 생성물들의 길이 |
| 13 | A-F2s | CCTCTGYGGGGAGAAGCAA | HLA-A 유전자의 엑손 2의 증폭 | 481bp |
| 14 | A-R2s | GGATCTCGGACCCGGAGACTGT | ||
| 15 | A-F3s | TGGGCTGACCGYGGGGTC | HLA-A 유전자의 엑손 3의 증폭 | 403bp |
| 16 | A-R3s | GGYGATATTCTAGTGTTGGTCCCAA | ||
| 17 | A-F4s | GTGTCCCATKACAGATGCAAAA | HLA-A 유전자의 엑손 4의 증폭 | 405bp |
| 18 | A-R4s | GGCCCTGACCCTGCTAAAGG | ||
| 19 | B-F2s | AGGAGCGAGGGGACCGCA | HLA-B 유전자의 엑손 2의 증폭 | 400bp |
| 20 | B-R2s | CGGGCCGGGGTCACTCAC | ||
| 21 | B-F3s | CCAAAATCCCCGCGGGTT | HLA-B 유전자의 엑손 3의 증폭 | 405bp |
| 22 | B-R3s | GAGGCCATCCCCGGCGAC | ||
| 23 | B-F4s | GCTGGTCACATGGGTGGTCCTA | HLA-B 유전자의 엑손 4의 증폭 | 374bp |
| 24 | B-R4s | TGACCCCTCATCCCCCTCCT |
퇴화성(degenerate) 프라이머들은 하나의 아미노산을 암호화하는 모든 상이한 염기들을 나타내는 모든 가능한 상이한 서열들의 혼합물을 의미한다. 특이성을 증가시키기 위하여, 퇴화는 코돈 표를 참조하여 상이한 생물들에서의 염기 이용의 바이어스에 따라 감소될 수 있으며, 여기에서 R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/T, H=A/C/T, B=C/G/T, V=A/C/G, D=A/G/T, N=A/C/G/T이다.
본 발명은 HLA-A/B 유전자의 엑손들 2, 3 및 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들을 설계하는 방법을 이용하므로써 HLA-C의 엑손들 2, 3 및 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들의 2세트를 설계한다(각 세트에 대해 3개의 쌍들).
하기 실시예들에서, 알려진 HLA 유전형들을 갖는 95 및 950 혈액 샘플들은, 선택된 2세트의 PCR 프라이머들 (각 세트에 대해 3개의 쌍들)을 각각 이용하여 HLA-C에 대한 PCR 증폭된다. 증폭된 생성물들은 생어 방법 및 제 2 세대 서열화 방법에 의하여 서열화된다. 서열화 결과들은 HLA-C 타입화에 적용되고, 그 PCR 프라이머들의 보존성 및 특이성을 확인하기 위하여 본래의 타입화 결과들에 비교된다.
본 발명은 HLA-C 유전자의 엑손들 2, 3 및 4의 증폭을 위한 2세트의 PCR 프라이머들 (각 세트에 대하여 3개 쌍들)을 제공하며, 이들은 표 3에 나타낸 것과 같은, 서열번호: 25와 26, 서열번호: 27과 28, 및 서열번호: 29와 30, 및 표 4에 나타낸 것과 같은, 서열번호: 31과 32, 서열번호: 33과 34, 및 서열번호: 35와 36이다. 상기 6개 쌍의 PCR 프라이머들은 양호한 보존성 및 특이성을 가지며, HLA-C의 엑손 2, 3 및 4의 전장 서열들을 커버할 수 있고, 여기에서 모든 PCR 생성물들의 길이는 700bp 미만이고, 이는 일반 Illumina Solexa 서열화의 필요조건들을 충족시킨다. 추가적으로, 본 발명의 프라이머들은 생어 서열화에도 적용가능하다.
| 서열번호: | No. | 프라이머 서열 | HLA-C 엑손들 | 생성물 길이 |
| 25 | C-F2 | GACCCGGGGAGCCGCGCA | 2 | 455bp |
| 26 | C-R2 | TCGAGGGTCTGGGCGGGTT | ||
| 27 | C-F3 | CCTTTACCCGGTTTCATTTTCRGTTT | 3 | 417bp |
| 28 | C-R3 | CTACGGGAGATGGGGAAGGCT | ||
| 29 | C-F4 | GTGTCGCAAGAGAGATRCAAAGTGT | 4 | 451bp |
| 30 | C-R4 | GCTCTGGGAAAGGAGGRGAAGG |
| 서열번호: | No. | 프라이머 서열 | HLA-C 엑손들 | 생성물 길이 |
| 31 | C-F2s | GACCCGGGGAGCCGCGCA | 2 | 455bp |
| 32 | C-R2s | TCGAGGGTCTGGGCGGGTT | ||
| 33 | C-F3s | GCCCAGACCCTCGRCCGGA | 3 | 443bp |
| 34 | C-R3s | AGATRGGGAAGGCTCCCCACT | ||
| 35 | C-F4s | TCTCAGGATRGTCACATGGGC | 4 | 481bp |
| 36 | C-R4s | GCTCTGGGAAARGAGGRGAAGG |
상기 설명된 것과 같은 방법들에 따라, 제 2 세대 서열화 기술을 HLA-DQB1 제노타이핑에 적용하기 위하여, 본 발명은 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3의 증폭을 위한 PCR 프라이머들을 제공하며, 이들은 표 5에 나타낸 것과 같은 서열번호들: 37~40이다. 이 PCR 프라이머들은 양호한 보존성 및 특이성을 가지며, HLA-DQB1의 엑손들 2, 3의 전장 서열들을 커버할 수 있고, 여기에서 모든 PCR 생성물들의 길이는 700bp 미만이며, 이는 일반 Illumina Solexa 서열화의 필요조건을 충족시킨다. 추가적으로, 본 발명의 프라이머들은 생어 서열화에도 적용가능하다.
| 서열번호: | 프라이머 번호 | 프라이머 서열 | 증폭 타겟 | 증폭된 생성물들의 길이 |
| 37 | Q-F2 | GATTCCYCGCAGAGGATTTCG | HLA-DQB1의 엑손 2 |
311bp |
| 38 | Q-R2 | AGGGGCRACSACGCTCACCTC | ||
| 39 | Q-F3 | CCTGTCTGTTACTGCCCTCAGT | HLA-DQB1의 엑손 3 | 339bp |
| 40 | Q-R3 | GGCCCATAGTAACAGAAACTCAATA |
제노타이핑은 증폭용 프라이머 쌍들을 이용하여 본 발명에서 제공된 것과 같은 제노타이핑 방법들에 의하여, HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3의 증폭에 기초하여 실시될 수 있다. 선행기술에 비하여, 제노타이핑 방법들은 Illumina Solexa 서열화 기술을 이용하고, 이는 고처리량 및 저비용으로 고해상도 HLA 타입화 결과들을 수득능에 의해 특징화된다.
본 발명의 실시를 위한 구체적 방법
핵산 서열화 방법
한 측면에서, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는, 샘플에서 목적하는 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정 방법을 제공한다:
1) n 개의 샘플들을 제공하는 단계, 여기에서 n은 1이상(≥1)의 정수이며, 샘플들은 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터의 것이고, 특히 인간 혈액 샘플이며; 선택적으로, 분석될 n개의 샘플들은 m개의 군으로 나누어지며, m은 정수이고, n≥m≥1이다;
2) 증폭 단계: 하나의 쌍 또는 다수의 쌍들의 인덱스 프라이머들을 각 샘플에 대하여 사용하고, 샘플로부터의 주형들이 있는 경우, PCR 증폭은 목적의 핵산을 증폭하기에 적당한 조건 하에서 수행되고, 여기에서 인덱스 프라이머들의 각 쌍은, 프라이머 인덱스들을 포함하는, 순방향 인덱스 프라이머 및 역방향 인덱스 프라이머(이들 모두 퇴화성 프라이머들일 수 있음)로 이루어지고, 순방향 인덱스 프라이머 및 역방향 인덱스 프라이머에 포함된 프라이머 인덱스들은 동일하거나 상이할 수 있고; 상이한 샘플들에 대하여 사용된 인덱스 프라이머의 쌍들에서 프라이머 인덱스들은 상이하다;
3) 풀화 단계(pooling): n>1인 경우, 각 샘플들로부터의 PCR 생성물들을 함께 풀화한다;
4) 전단 단계: 증폭된 생성물들을 불완전 전단에 투입하고, 정제 및 회수한다;
5) 서열화 단계: 제 2 세대 서열화 기술, 바람직하게는 페어드-엔드 기술 (예로서, Illumina GA, Illumina Hiseq 2000)을 이용하므로써 회수된 DNA 혼합물을 서열화에 투입하여, 전단된 DNA의 서열들을 수득한다; 및
6) 어셈블리 단계: 수득된 서열화 데이터를, 각 샘플에 대한 독특한 프라이머 인덱스에 기초하여 샘플들에 하나씩 대응시켜, 각 서열 판독값을, 배열 프로그램(예컨대, Blast, BWA 프로그램)을 이용하여 PCR 생성물들에 대응하여 DNA 참조 서열에 대하여 배열시키고, 서열 중복 및 연결 관계에 의하여, 전단된 DNA의 서열들로부터 관심대상의 핵산의 완전한 서열을 어셈블리한다.
본 발명의 한 측면에서, 프라이머 인덱스들의 각 쌍 및 PCR 프라이머들의 쌍은 인덱스 프라이머들의 쌍을 형성하며, 순방향 및 역방향 PCR 프라이머들은 5' 말단에서 각각 순방향 프라이머 인덱스 및 역방향 프라이머 인덱스를 갖는다(또는 선택적으로 링커 서열들에 의해 연결된다).
본 발명의 한 측면에서, 상기 PCR 프라이머들은 HLA 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 특히 HLA-A/B 유전자 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 HLA-A/B의 엑손들 2, 3 및 4와 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 표 1 또는 표 2에서 나타낸 것과 같은 HLA-A/B의 엑손 2, 3 및 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들 또는 바람직하게는 표 7에 나타낸 것과 같은 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이다.
본 발명의 한 측면에서, 상기 PCR 프라이머들은 HLA 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 특히 HLA-C 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 HLA-C의 엑손 2, 3 및/또는 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고; 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들을 표 3 또는 표 4에 나타내었다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 PCR 프라이머들은 HLA 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 HLA-DQB1 유전자의 Exon 2 및/또는 3의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고; 바람직하게는, 상기 PCR 프라이머들을 표 5에 나타내었다.
본 발명의 한 측면은, 상기 프라이머 인덱스들은 PCR 프라이머들, 바람직하게는 HLA의 특이적 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 보다 바람직하게는 HLA-A/B의 엑손 2, 3 및 4와 HLA-DRB1에 대한 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들에 대하여 설계되고, 특히 표 1, 표 2 또는 표 7에 나타낸 것과 같은 PCR 프라이머들에 대하여 설계되고; 상기 프라이머 인덱스들은 특히, 표 6에 나타낸 것과 같은 프라이머 인덱스들의 95 쌍 중 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90 또는 95 쌍(또는 표 6에 나타낸 것과 같은 95 쌍의 프라이머 인덱스들 중 10~95 쌍들로 이루어지는 프라이머 인덱스들의 세트 (예로서, 10~95 쌍, 20~95 쌍, 30~95 쌍, 40~95 쌍, 50~95 쌍, 60~95 쌍, 70~95 쌍, 80~95 쌍, 90~95 쌍, 또는 95 쌍))을 포함한다; 그리고
상기 인덱스 프라이머들의 세트는 바람직하게는, 표 6에 나타낸 것과 같은 프라이머 인덱스들의 95 쌍 중, 적어도 PI-1 내지 PI-10, 또는 PI-11 내지 PI-20, 또는 PI-21 내지 PI-30, 또는 PI-31 내지 PI-40, 또는 PI-41 내지 PI-50, 또는 PI-51 내지 PI-60, 또는 PI-61 내지 PI-70, 또는 PI-71 내지 PI-80, 또는 PI-81 내지 PI-90, 또는 PI-91 내지 PI-95, 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 조합들을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 DNA 전단은 화학적 전단 방법들 및 물리적 전단 방법들을 포함하며, 여기에서 화학적 전단 방법들은 효소 분해를 포함하고, 물리적 전단 방법들은 초음파 전단 방법들 또는 기계적 전단 방법들을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 DNA 전단 후, 서열분석기의 최대 판독값 길이와 서열분석기의 적용가능한 최대 DNA 길이 사이의 모든 DNA 밴드들은 정제 및 회수되며, 여기에서 상기 정제 및 회수 방법은 이에 제한되지는 않지만, 전기영동 및 겔 슬라이싱에 의한 회수, 및 자석 비즈에 의한 회수를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 시험 샘플 중 목적하는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 서열화하기 위한 방법은 청구항 1의 1) 내지 4)의 단계들 및 하기 단계들을 포함한다:
5) 라이브러리 구축 단계: 전단된 PCR 생성물들의 라이브러리를 사용하므로써 PCR-자유 서열화 라이브러리를 구축하며, 여기에서 상이한 라이브러리 어댑터들이, 상이한 PCR-자유 서열화 라이브러리들을 구별하도록 첨가될 수 있으며, 서열분석기의 최대 판독값 길이와 서열분석기의 적용가능한 최대 DNA 길이간의 모든 DNA 밴드들, 바람직하게는 450bp 내지 750bp의 DNA 단편들이 정제 및 회수된다;
6) 서열화 단계: 회수된 DNA 혼합물을 제 2 세대 서열화 기술, 바람직하게는 페어드-엔드 기술 (예로서, Illumina GA, Illumina Hiseq 2000)을 이용하므로써 서열화에 투입하여 전단된 DNA들의 서열들을 수득한다;
7) 어셈블리 단계: 수득된 서열화 데이터를 라이브러리들의 상이한 라이브러리 어댑터 서열들 및 각 샘플에 대한 독특한 프라이머 인덱스에 기초하여 하나씩 대응시키고, 각 서열 판독값을 배열 프로그램(예컨대 Blast, BWA 프로그램)을 이용하여 PCR 생성물들에 대응하는 DNA 참조 서열에 대하여 배열하고, 서열 중복 및 연결 관계에 기초하여 전단된 DNA의 서열들로부터 목적하는 핵산의 완전한 서열을 어셈블리한다.
한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 것에 의하여 특징되는, HLA 타입화에서 상기 언급된 방법의 사용을 더욱 제공한다: 상기 방법에 의하여 환자로부터의 샘플(특히 혈액 샘플)을 서열화하고, HLA 데이터베이스(예컨대 IMGT HLA 전문 데이터베이스)에서 HLA의 엑손들, 바람직하게는 HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4, HLA-C의 엑손 2, 3 및/또는 4 , HLA-DQB1 유전자의 엑손 2 및/또는 3, 및/또는 HLA-DRB1의 엑손 2 의 서열 데이터와 함께 서열화 결과들을 배열하고; 여기에서 서열 배열 결과가 100% 맞으면, 대응 샘플의 HLA 유전형이 결정된다.
프라이머 인덱스들의 세트
또다른 측면에서, 본 발명은 프라이머 인덱스들의 세트를 제공하며, 이는 표 6에 나타낸 것과 같은 프라이머 인덱스들의 95 쌍들 중, 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90, 또는 95 쌍들 (또는 표 6에 나타낸 것과 같은 95 쌍들 중 10~95 쌍들로 이루어지는 프라이머 인덱스들의 세트 (예로서, 10~95 쌍, 20~95 쌍, 30~95 쌍, 40~95 쌍, 50~95 쌍, 60~95 쌍, 70~95 쌍, 80~95 쌍, 90~95 쌍, 또는 95 쌍))을 포함하고, 그리고
인덱스 프라이머들의 상기 세트는 바람직하게는, 표 6에 나타낸 것과 같은 프라이머 인덱스들의 95 쌍들 중, 적어도 PI-1 내지 PI-10, 또는 PI-11 내지 PI-20, 또는 PI-21 내지 PI-30, 또는 PI-31 내지 PI-40, 또는 PI-41 내지 PI-50, 또는 PI-51 내지 PI-60, 또는 PI-61 내지 PI-70, 또는 PI-71 내지 PI-80, 또는 PI-81 내지 PI-90, 또는 PI-91 내지 PI-95, 또는 이들 중 임의의 2개 이상의 조합들을 포함한다.
본 발명은 또한 프라이머 인덱스들의 상기 세트의 PCR 서열화 방법들에서의 이용을 제공하며, 여기에서 특히 프라이머 인덱스들의 각 쌍 및 시험되는 관심대상의 서열의 증폭에 대한 PCR 프라이머들의 쌍은 인덱스 프라이머들의 쌍을 형성하고, 여기에서 순방향 및 역방향 PCR 프라이머들은 5' 말단에서 순방향 프라이머 인덱스 및 역방향 프라이머 인덱스를 각각 갖는다(또는 링커 서열에 의하여 선택적으로 연결된다).
본 발명의 한 측면에서, 상기 PCR 프라이머들은 HLA의 특이적 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머들로, 바람직하게는 HLA-A/B 유전자의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 나타낸 바와 같은 HLA-A/B의 엑손 2, 3 및 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 또는 바람직하게는 표 7에 나타낸 것과 같은 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들; 또는 HLA-C의 엑손 2, 3 및/또는 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 3 또는 표 4에 나타내었다: 또는 바람직하게는 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 5에 나타내었다.
또다른 측면에서, 본 발명은 프라이머 인덱스들의 상기 세트 및 시험되는 관심 대상의 서열의 증폭을 위한 PCR 프라이머들의 쌍을 포함하는 인덱스 프라이머들의 세트를 제공하며, 여기에서 인덱스 프라이머들의 쌍은 프라이머 인덱스의 쌍 및 PCR 프라이머들의 쌍을 포함하고, 순방향 및 역방향 PCR 프라이머는 5' 말단에서 순방향 및 역방향 프라이머 인덱스를 각각 갖는다(또는 링커 서열에 의하여 선택적으로 연결된다).
본 발명의 하나의 구체예에서, HLA의 특이적 유전자의 증폭을 위한 상기 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 HLA-A/B 유전자의 엑손 2, 3, 4, 및 HLA-DRB1의 엑손 2 의 증폭을 위한 PCR 프라이머들로, 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 나타낸 것과 같은 HLA-A/B의 엑손 2, 3 및 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 또는 바람직하게는 표 7에 나타낸 것과 같은 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이다; 바람직하게는 HLA-C의 엑손 2, 3 및/또는 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 3 또는 표 4에 나타내었으며; 또는 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3의 증폭을 위한 PCR 프라이머들로, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 5에 나타내었다.
또다른 측면에서, 본 발명은 PCR 서열화 방법들에서 상기 인덱스 프라이머들의 이용을 더욱 제공한다.
HLA 타입화 방법
한 측면에서, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 HLA 타입화 방법을 제공한다:
1) n개의 샘플들을 제공하는 단계, 여기에서 n은 1 이상(≥1)의 정수이고, 상기 샘플은 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간, 특히 인간 혈액 샘플이다;
2) 분석될 n개의 샘플들을 m개의 군으로 나누는 단계, 여기에서 m은 n≥m≥1의 정수이다;
3) 증폭 단계: 인덱스 프라이머들의 쌍을 각 샘플에 대하여 사용하고, 샘플로부터의 주형들이 있는 경우, PCR 증폭은 목적의 핵산을 증폭하기에 적당한 조건 하에서 수행되고, 여기에서 인덱스 프라이머들의 각 쌍은, 프라이머 인덱스들을 포함하는, 순방향 인덱스 프라이머 및 역방향 인덱스 프라이머(이들 모두 퇴화성 프라이머들일 수 있음)로 이루어지고, 순방향 인덱스 프라이머 및 역방향 인덱스 프라이머에 포함된 프라이머 인덱스들은 동일하거나 상이할 수 있고; 상이한 샘플들에 대하여 사용된 인덱스 프라이머의 쌍들에서 프라이머 인덱스들은 상이하다;
4) 풀화 단계: 각 샘플들로부터의 PCR 증폭 생성물들을 함께 풀화하여 PCR 생성물 라이브러러리를 수득한다;
5) 전단 단계: 결과의 PCR 생성물 라이브러리들을 불완전 전단에 투입한다;
6) 라이브러리 구축 단계: 라이브러리 어댑터 인덱스 기술을 이용하여 전단된 PCR 생성물들의 라이브러리로부터 PCR-자유 서열화 라이브러리들을 구축하는 단계로, 여기에서 상이한 라이브러리 어댑터들을 첨가하여 상이한 PCR-자유 서열화 라이브러리들을 구분할 수 있으며, 서열분석기의 최대 판독값 길이와 서열분석기의 적용가능한 최대 DNA 길이간의 모든 DNA 밴드들, 특히 450bp 내지 750bp의 DNA 단편들이 회수된다;
7) 서열화 단계: 제 2 세대 서열화 기술, 바람직하게는 페어드-엔드 기술 (예로서, Illumina GA, Illumina Hiseq 2000)을 이용하므로써 회수된 DNA 혼합물을 서열화에 투입하여, 전단된 DNA의 서열들을 수득한다; 및
8) 어셈블리 단계: 수득된 서열화 결과들을, 라이브러리들의 상이한 라이브러리 어댑터 서열들 및 각 샘플에 대한 독특한 프라이머 인덱스에 기초하여 샘플들에 하나씩 대응시켜, 각 서열 판독값을, 배열 프로그램(예컨대, Blast, BWA 프로그램)을 이용하여 PCR 생성물들에 대응하는 DNA 참조 서열에 대하여 배열시키고, 서열 중복 및 연결 관계에 기초하여, 전단된 DNA의 서열들로부터 목적의 핵산의 완전한 서열을 어셈블리한다.
9) 타입화 단계: HLA 데이터베이스에서 HLA의 엑손의 서열 데이터, 바람직하게는 HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4, HLA-C의 엑손 2, 3 및/또는 4, HLA-DQB1 유전자의 엑손 2 및/또는 3, 및/또는 HLA-DRB1의 엑손 2 (예컨대 IMGT HLA 전문 데이터베이스)를 이용하여 서열화 결과들을 배열하고, 여기에서 서열 배열 결과가 100% 일치를 나타내면, 대응 샘플의 HLA 유전형이 결정된다.
본 발명의 HLA 타입화 방법에서, 인덱스 프라이머들의 쌍은 프라이머 인덱스들의 쌍 및 PCR 프라이머들의 쌍을 포함하고, 순방향 및 역방향 PCR 프라이머는 5' 말단에서 순방향 및 역방향 프라이머 인덱스를 각각 갖는다 (또는 링커 서열에 의하여 선택적으로 연결됨).
본 발명의 한 구체예에서, 상기 PCR 프라이머들은 HLA의 특정 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 HLA-A/B 유전자의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 나타낸 것과 같은 HLA-A/B의 엑손 2, 3 및 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 또는 바람직하게는 표 7에 나타낸 것과 같은 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고; 바람직하게는 HLA-C의 엑손 2, 3 및/또는 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 3 또는 표 4에 나타낸 바와 같다; 또는 바람직하게는 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 5에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 프라이머 인덱스들은 상기 설명된 것과 같은 프라이머 인덱스들의 세트이다.
본 발명의 HLA 타입화 방법의 한 구체예에서, 상기 DNA 전단은 화학적 전단 방법 및 물리적 전단 방법들을 포함하며, 여기에서 화학적 전단 방법들은 효소 분해를 포함하고, 물리적 전단 방법들은 초음파 전단 방법들 또는 기계적 전단 방법들을 포함한다.
본 발명의 HLA 타입화 방법의 한 구체예에서, 상기 정제 및 회수 방법들은 이에 제한되지는 않지만, 전기영동 및 겔 슬라이싱에 의한 회수 및 자석 비즈에 의한 회수를 포함한다.
본 발명의 HLA 타입화 방법의 한 구체예에서, 라이브러리 어댑터 인덱스화 기술을 이용한 전단된 PCR 생성물들의 라이브러리들로부터 PCR-자유 서열화 라이브러리들의 구축은, m개의 라이브러리 어댑터들을 2)에서 수득된 m개의 PCR 생성물 라이브러리들에 첨가하고, 여기에서 각 PCR 생성물 라이브러리는 상이한 라이브러리 어댑터를 이용하고, 이에 의하여 m개의 어댑터 인덱스화 서열분석 라이브러리들을 구축하고; m개의 어댑터 인덱스화 서열화 라이브러리들은 균등 몰로 함께 풀화되어 어댑터 인덱스화 서열분석 라이브러리들의 혼합물을 구축하고, 여기에서 라이브러리 어댑터들의 연결 방법은 PCR 절차 없이 DNA 리가아제를 이용하여 직접 연결하는 것을 의미한다.
HLA 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들
한 측면에서, 본 발명은 HLA 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들을 제공하며, 이는 다음에 의하여 특징된다: 상기 PCR 프라이머들은 HLA-A/B 유전자의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 나타낸 것과 같은 HLA-A/B의 엑손 2, 3 및 4의 증폭의 PCR 프라이머들, 또는 바람직하게는 표 7에 나타낸 것과 같은 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고; 바람직하게는 HLA-C의 엑손 2, 3 및/또는 4의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 3 또는 표 4에 나타내었으며; 또는 바람직하게는 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3의 증폭을 위한 PCR 프라이머들이고, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머들은 표 5에 나타낸 것과 같다.
본 발명은 다음 단계들을 포함하는 상기 PCR 프라이머들을 이용한 서열화 방법을 더욱 제공한다:
샘플, 특히 혈액 샘플을 제공하는 단계로, 상기 혈액 샘플은 바람직하게는 포유동물, 특히 인간으로부터의 것이다;
증폭 단계: PCR 프라이머들을 이용하여 혈액 샘플로부터의 DNA를 증폭하여 PCR 생성물들을 수득하고, 그 PCR 생성물들을 정제한다;
서열화 단계: 상기 PCR 생성물들을 서열화하며, 상기 서열화 방법은 생어 서열화 방법, 또는 제 2 세대 서열화 방법일 수 있다 (예컨대, Hiseq 2000, Illumina GA 및 Roche454).
또다른 측면에서, 본 발명은 HLA 제노타이핑에서 상기 PCR 프라이머들의 이용을 제공하며, 이는 상기 PCR 프라이머들을 이용하고, 상기 서열화 방법에 의하여 수득된 결과들에 대한 어셈블리 및 배열 분석을 실시하고, 그 서열화 결과들을 데이타베이스에서의 표준 서열들과 비교하여 HLA 제노타이핑 결과들을 수득한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HLA 제노타이핑을 위한 키트를 더욱 제공하며, 상기 PCR 프라이머들을 포함한다.
HLA-A, B 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들
한 측면에서, 본 발명은 HLA-A,B 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들의 세트를 제공하며, 이는 상기 PCR 프라이머들이 표 1 또는 표 2에 나타낸 것과 같다는 것을 특징으로 한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 HLA-A,B 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들을 이용하는 서열화 방법을 제공한다:
샘플, 특히 혈액 샘플을 제공하는 단계로, 상기 혈액 샘플은 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다;
증폭 단계: 혈액 샘플로부터의 DNA를 PCR 프라이머들을 이용하여 증폭해서 PCR 생성물들을 수득하고, PCR 생성물들을 정제한다;
서열화 단계: PCR 생성물들을 서열화하고, 상기 서열화 방법은 생어 서열화 방법, 또는 제 2 세대 서열화 방법 (예컨대 Hiseq 2000, Illumina GA 및 Roche454)일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 PCR 프라이머들의 HLA 제노타이핑에서의 이용을 더욱 제공하며, 이는 상기 프라이머들을 이용하고, 상기 서열화 방법에 의하여 수득된 결과들에 대하여 어셈블리 및 배열 분석을 실시하고, 서열화 결과들을 데이터베이스 중 표준 서열들과 비교하여 HLA 제노타이핑 결과들을 수득하는 것에 의하여 특징된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HLA 제노타이핑을 위한 키트를 더욱 제공하며, 이는 본 발명의 HLA-A,B 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들을 포함한다.
HLA-C 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들
본 발명은 HLA-C 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 증폭하는 신규 방법을 더욱 제공하며, 본 발명의 증폭 프라이머 쌍들을 이용하여 PCR 증폭을 실시하고, 상기 증폭 프라이머 쌍들의 서열들은 표 3 또는 표 4에 나타낸 것과 같다는 것을 특징으로 한다.
HLA-C의 엑손 2, 3 및 4는 PCR 반응에 의하여 증폭될 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 특히 HLA-C 제노타이핑에 적당하다. 이전의 HLA-C 제노타이핑 방법들에 비교시, 본 발명의 방법을 이용하므로써 수득된 생성물들 및 본 발명의 증폭 프라이머들은 700bp 내로 제어되기 때문에, Illumina Solexa 서열화 기술에 기초한 HLA-SBT가 추가의 제노타이핑 동안 사용될 수 있다.
본 발명은 샘플들 중 HLA-C 유전자의 엑손 2, 3 및 4의 서열화 방법을 더욱 제공하며, 이는 다음 단계들을 포함한다:
1) 샘플을 제공하고, 샘플의 DNA를 추출하는 단계;
2) 본 발명의 HLA-C 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 상기 DNA를 증폭하여 PCR 생성물들을 수득하고, 바람직하게는 PCR 생성물들을 정제하는 단계로, 상기 PCR 프라이머 쌍은 바람직하게는 하기 프라이머 쌍들로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 서열번호: 25와 서열번호: 26, 서열번호: 27과 서열번호: 28, 서열번호: 29와 서열번호: 30, 또는 서열번호: 31과 서열번호: 32, 서열번호: 33과 서열번호: 34, 서열번호: 35와 서열번호: 36;
3) 바람직하게는 제 2 세대 서열화 방법, 예컨대 Illumina Solexa 또는 Roche454에 의하여 PCR 생성물들을 서열화하는 단계.
본 발명은 다음을 포함하는 HLA-C 제노타이핑 방법을 더욱 제공한다:
1) 시험될 샘플의 HLA-C 유전자의 엑손 2, 3 및/또는 4를, 본 발명의 HLA-C 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭시키고, 상기 PCR 프라이머 쌍은 바람직하게는 다음 프라이머 쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 서열번호: 25와 서열번호: 26, 서열번호: 27과 서열번호: 28, 서열번호: 29와 서열번호: 30, 또는 서열번호: 31과 서열번호: 32, 서열번호: 33과 서열번호: 34, 서열번호: 35와 서열번호: 36;
2) 증폭된 엑손을 서열화하고, 제노타이핑 결과들을 결정하기 위하여 서열화 결과들을 데이터베이스 중의 표준 서열들과 비교하며, 여기에서 서열화는 생어 서열화 방법 또는 Illumina Solexa 또는 Roche454와 같은 제 2 세대 서열화 방법에 의하여 실시된다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 HLA-C 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머 쌍을 포함하는, HLA-C 제노타이핑의 키트를 더욱 제공하며, 바람직하게는 상기 PCR 프라이머쌍은 다음 프라이머 쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 서열번호: 25와 서열번호: 26, 서열번호: 27과 서열번호: 28, 서열번호: 29와 서열번호: 30, 또는 서열번호: 31과 서열번호: 32, 서열번호: 33과 서열번호: 34, 서열번호: 35와 서열번호: 36. 한 구체예에서, 상기 키트는 추가적인 약제들, 예로서 DNA 증폭제, DNA 정제, 및/또는 DNA 서열화를 위한 추가 약제들을 더 포함한다.
제노타이핑은 HLA-C의 엑손 2, 3 및 4의 증폭을 기초로 하여, 증폭 프라이머 쌍 및 본 발명에서 제공되는 것과 같은 제노타이핑 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 선행기술에 비하여, 상기 제노타이핑은 Illumina Solexa 서열화 기술을 이용하고, 처리량을 증진시키고, 절차를 간단화하면서도 시간과 비용을 절약한다.
HLA-DQB1 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머들
본 발명은 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3을 증폭시키기 위한 새로운 방법을 더욱 제공하며, 이는 본 발명의 증폭 프라이머 쌍들을 이용하여 PCR 증폭을 실시하는 것으로 특징되며, 상기 증폭 프라이머 쌍들은 표 5에 나타낸 것과 같다.
HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3은 PCR 반응에 의하여 증폭될 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 HLA-DQB1 제노타이핑에 특히 적당하다. 선행 기술의 HLA-DQB1 제노타이핑 방법들에 비하여, 본 발명의 방법 및 증폭 프라이머를 이용하여 수득된 생성물들은 300~400bp 내로 제어되기 때문에, Illumina Solexa 서열화 기술에 근거한 HLA-SBT는 추가의 타입화 동안 사용될 수 있다.
본 발명은 샘플들 중 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3을 서열화하는 방법을 더 제공하며, 이는 다음 단계들을 포함한다:
1) 샘플을 제공하고, 그 샘플의 DNA를 추출하는 단계;
2) 본 발명의 HLA-DQB1 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머 쌍, 바람직하게는 표 5에 나타낸 PCR 프라이머 쌍들을 이용하여 상기 DNA를 증폭시켜 PCR 생성물들을 수득하고, 바람직하게는 상기 PCR 생성물들을 정제하는 단계;
3) 상기 PCR 생성물들을, 바람직하게는 Illumina Solexa 또는 Roche454와 같은 제 2 세대 서열화방법으로 서열화하는 단계.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 HLA-DQB1 제노타이핑의 개선된 방법을 제공한다:
1) 시험될 HLA-DQB1의 엑손 2 및/또는 3을 본 발명의 HLA-DQB1 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머 쌍, 바람직하게는 표 5에 나타낸 것과 같은 PCR 프라이머 쌍들을 이용하여 증폭시키는 단계;
2) 증폭된 엑손을 서열화하고, 제노타이핑 결과들을 결정하기 위하여 서열화 결과들을 데이터베이스 중 표준 서열들과 비교하는 단계로, 여기에서 상기 서열화 방법은 생어 서열화 방법 또는 제 2 세대 서열화 방법, 예컨대 Illumina Solexa 또는 Roche454일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HLA-DQB1 제노타이핑을 위한 키트를 더욱 제공하며, 이는 본 발명의 HLA- DQB1 제노타이핑을 위한 PCR 프라이머 쌍, 바람직하게는 표 5에 나타낸 것과 같은 PCR 증폭 프라이머 쌍들을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 키트는 추가적인 약제들, 예로서, DNA 증폭, DNA 정제 및/또는 DNA 서열화를 위한 약제들을 더 포함한다.
도 1: 프라이머 인덱스들로 표지, DNA 전단 및 DNA 서열화 후 서열 어셈블리를 나타내는 도면. 순방향 및 역방향 프라이머 인덱스 서열들 Index-N-F/R (1)을 샘플 번호 N의 PCR 생성물들의 2개의 말단으로 도입하였다. 물리적 전단 방법에 의한 전단 후 PCR 생성물들은, 한 말단에서는 프라이머 인덱스 서열들을 운반하는 생성물들, 2 말단들에서는 프라이머 인덱스 서열이 없는 생성물들, 및 완전히 전단되지 않은 생성물들을 포함한다. 서열분석기의 최대 판독값 길이와 서열분석기의 적용가능한 최대 DNA 길이 간의 모든 DNA 밴드들은 겔 슬라이싱에 의하여 정제 및 회수되며, 서열화 (2)에 사용된다. 샘플 번호 N에 속하는 PCR 생성물들의 서열화 데이터는 Index-N-F/R을 이용하여 추적된다. PCR 생성물들의 알려진 참조 서열들은 서열 판독값들의 상대적인 위치들을 위치시키는데(localize) 사용되며, 완전한 PCR 생성물들의 서열화 결과들은 서열 판독값들 간의 중복 및 연결 관계에 근거하여 어셈블리된다 (3, 4).
도 2: 실시예 2의 샘플 번호 1에서 HLA-A/B/DRB1의 대응 엑손의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내는 도면. PCR 생성물들이 300bp~500bp의 일련의 단일 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 여기에서 래인(Lane) M은 분자량 마커 (DL 2000, Takara Co.)이고, 래인 1~7은 샘플 번호 1의 HLA-A/B/DRB1의 엑손 (A2, A3, A4, B2, B3, B4, DRB1-2)의 PCR 생성물들이고, 음성 대조구 (N)에서는 증폭밴드가 없음. 다른 샘플들의 결과들은 유사하다.
도 3: 실시예 4에서 전단 HLA-Mix 후의 DNA 전기영동 결과를 나타내는 도면 (겔 슬라이싱 전후)으로, 상기 겔-슬라이싱 영역은 450~750bp의 영역이다. 래인 M은 분자량 마커(NEB-50bp DNA Ladder)이고, 래인 1은 겔 슬라이싱 전의 HLA-Mix의 전기영동 결과이고, 래인 2는 슬라이싱 후 HLA-Mix의 전기영동 결과이다.
도 4: 실시예 6에서 샘플 번호 1의 컨센서스(consensus) 서열 구축용 프로그램의 스크린-캡쳐(screen-capture)로, 이는 프라이머 인덱스들 및 DNA 단편들 간의 중복 관계에 기초하여 PCR 생성물들의 완전한 서열을 어셈블리하는 것을 예시한다. HLA 유전형들의 명명법에 대해서는, http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html 참조. 결과 출력 컬럼 왼쪽에서 A*02:03:01 A*11:01:01의 모든 코딩 서열 결과들을 찾을 수 있으며, 여기에서 엑손 2의 서열은 주형 1의 알려진 본래 결과와 동일하다.
도 5: 프라이머 인덱스들 및 어댑터 인덱스로 표지한 후의 PCR 생성물을 나타내는 도면. 실험 동안, 프라이머 인덱스들은 PCR에 의하여 각 샘플의 PCR 생성물의 2개의 말단으로 동시에 도입되고; 상이한 프라이머 인덱스들을 갖는 다중 PCR 생성물들은 함께 풀화되어 서열화 라이브러리를 구축한다. 서열 라이브러리들의 구축 동안, 다수의 서열화 라이브러리들이 구축되어야만 하고, 서열화 라이브러리들은 상이한 어댑터 인덱스들을 갖는 라이브러리 어댑터들로 표지될 수 있다. 라이브러리들의 구축 종료 후, 상이한 어댑터 인덱스들로 표지된 다수의 서열화 라이브러리들은 함께 풀화되고, Illumina GA에 의하여 동시에 서열화된다 (프라이머 인덱스들은 상이한 인덱스들로 표지된 서열화 라이브러리들 중에서 동일할 수 있다). 서열화 결과들을 얻은 후, 각 샘플에 대한 DNA 서열 정보는 서열화 결과들에서 어댑터 인덱스들 및 프라이머 인덱스들의 서열 정보를 검색하므로써 수득될 수 있다.
도 6: 실시예 8에서 일부 샘플들의 HLA-C의 엑손 2, 3, 4의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내는 도면. PCR 생성물들이 400bp~500bp의 일련의 단일 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 여기에서 래인 M은 표준 DNA 분자량에 대한 참조이다 (DL 2000, Takara Co.).
도 7: 실시예 8에서 전단 HLA-Mix 후 DNA 전기영동 겔 슬라이싱의 결과를 나타내는 도면으로, 여기에서 상기 겔-슬라이싱 영역은 450~750bp의 영역이다. 래인 M은 분자량의 마커이고(NEB-50bp DNA Ladder), 래인 1은 슬라이싱 전 HLA-Mix의 겔을 나타내는 도면이고, 래인 2는 슬라이싱 후 HLA-Mix의 겔을 나타내는 도면이다.
도 8: 실시예 8에서 샘플 번호 2의 HLA-C 자리의 엑손 2의 컨센서스 서열의 구축 프로그램의 스크린-캡쳐. 먼저, 샘플의 C 자리의 서열 판독값들은 BWA 소프트웨어에 의하여 참조 서열을 이용하여 배열되고, 이에 의하여 샘플의 C 자리의 엑손 2, 3, 4의 컨센서스 서열들을 구축한다; 나아가, C 자리의 각 엑손의 단상형 서열은 SNPs들 간의 연결 관계에 기초하여 결정되며; 최종적으로 샘플의 유형은 엑손들의 단상형 서열들의 공통부분들(intersection)에 의하여 결정된다. 도면에 나타낸 것과 같이, 2개의 이형접합성(heterozygous) SNP는 샘플 번호 2의 C 유전자 서열의 695~764 영역에 포함되며, 이는 SNP의 연결 관계가 A-C, G-A인 read1 및 read2로부터 결정될 수 있다 (도면에서 "..."는 참조 서열 염기들에 동일한 염기들을 나타낸다). 상기 서열들은 C*010201 및 C*07020101 유형들 각각의 서열들 중 음영표시된 부분들에 대응한다. 다른 영역들의 연결 관계의 판단은 유사하다.
도 9: 실시예 9에서 26개 샘플들의 HLA-C 자리의 엑손 2, 3 및 4의 PCR 생성물들의 전기영동 결과들을 나타내는 도면. 도면에 나타낸 바와 같이, 모든 PCR 생성물들은 500bp 미만의 길이이다; 전기영동 밴드는 단일하며; 명확한 비특이적 밴드는 없고; 프라이머들의 동일한 쌍의 증폭 효율은 각종 샘플들에서 동일하다.
도 10: 실시예 9에서 uType 소프트웨어를 이용하므로써 주형 1의 PCR 증폭 생성물들의 서열화 데이터의 분석 결과를 나타내는 도면. 결과 출력 컬럼 왼쪽은, 주형 1의 알려진 본래의 유형과 동일한, C*08:01:01 C*15:05:01 결과를 나타낸다.
도 11: 실시예 10의 94개 샘플들 중 HLA-DQB1의 엑손 2+3의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내는 도면. PCR 생성물들이 250bp~500bp의 일련의 단일한 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 여기에서 래인 M은 표준 DNA 분자량들에 대한 참조이고 (DL 2000, Takara Co.), 래인들 PI-1 내지 PI-94는 94개 샘플들 중 HLA-DQB1의 엑손 2+3의 PCR 증폭 생성물들이고, 음성 대조구 (N)에서는 증폭 밴드가 없다.
도 12는 실시예 10에서, 전단 HLA-Q-Mix 후, DNA 전기영동 겔 슬라이싱의 결과들을 나타내며, 여기에서 겔-슬라이싱 영역은 350~550bp의 영역이다. 래인 M은 표준 DNA 분자량들의 마커(NEB-50bp DNA Ladder)이고, 래인 1은 슬라이싱 전 HLA-Q-Mix의 겔을 나타내는 도면이고, 래인 2는 슬라이싱 후 HLA-Q-Mix의 겔을 나타내는 도면이다.
도 13은 실시예 10에서 샘플 번호 7의 컨센서스 서열의 구축 프로그램의 스크린-캡쳐를 나타내며, 데이터 분석의 주요 절차를 나타낸다. 먼저, 샘플의 DQB1 자리의 서열 판독값들은 BWA 소프트웨어에 의한 참조 서열을 이용하여 배열되고, 이에 따라 샘플의 DQB1의 엑손 2, 3의 컨센서스 서열들이 구축되고, DQB1의 엑손 2, 3의 단상형 서열들은 SNPs 간의 연결 관계에 기초하여 결정된다. 도면에 나타낸 바와 같이, 6개의 이형접합성 SNPs는 샘플 번호 7의 DQB1 유전자 서열의 2322~2412 영역에 포함되며, 이는 SNP1-SNP5의 연결 관계가 T-G-T-C-C인 read1로부터 결정될 수 있고; 또다른 SNP1-SNP5의 연결 관계가 C-C-A-G-T인 read2로부터 결정될 수 있고; SNP3-SNP6의 연결 관계가 A-G-T-G인 read3으로부터 결정될 수 있다; 또다른 SNP3-SNP6의 연결 관계가 T-C-C-A인 read4로부터 결정될 수 있고; 이는 read1이 read4에 연결되고, read2가 read3에 연결되고, 이 영역에서 완전한 SNP 조합이 T-G-T-C-C-A 및 C-C-A-G-T-G이고, 서열들이 DQB1*0303 및 DQB1*0602 유형의 서열들의 음영표시된 부분들에 대응하는, 상기 SNP들의 상기 연결 관계들로부터 결정될 수 있다. 다른 영역들의 연결 관계의 판단은 유사하다.
도 14는 HLA-DQB1 자리의 엑손 2 및 3 각각의 증폭 및 2개 쌍의 PCR 프라이머들을 갖는 엑손 2 및 3의 증폭의 각각으로부터의 결과인, 실시예 11에서 생성물들의 전기이동도를 나타낸다. 상기 전기이동도는 7개의 DNA 주형들로부터의 PCR 생성물들의 3개 세트들을 나타내며, 모든 PCR 생성물들은 500bp 미만의 길이를 갖고; 전기영동 밴드들은 단일하며; 명확하게 비특이적인 밴드는 없다. 음성 대조구 (N)에서는 증폭 밴드가 없으며, 래인 M은 표준 DNA 분자량들에 대한 참조이다 (DL 2000, Takara Co.).
도 15는, 실시예 11에서 uType 소프트웨어를 이용하여, 주형 7의 HLA-DQB1의 엑손 2 및 3의 증폭으로부터 초래한 PCR 생성물들의 서열화 데이타의 분석 결과들을 설명한다. 결과 출력 컬럼 왼편에 DQB1*03:03 DQB1*06:02 결과를 나타내었으며, 이는 Template 7의 알려진 본래의 결과와 동일하다.
도 16은 실시예 12의 샘플 번호 1에서 HLA-A/B/C/DQB1의 대응 엑손으로부터 PCR 생성물들의 전기영동 결과들을 나타낸다. PCR 생성물들은 300bp~500bp의 일련의 단일 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 래인 M은 분자량 마커 (DL 2000, Takara Co.)이고; 래인들 1~10은 샘플 번호 1의 HLA-A/B/C/DQB1의 엑손(A2, A3, A4, B2, B3, B4, C2, C3, C4, DQB1)의 PCR 증폭 생성물들이다; 음성 대조구 (N)에서는 증폭 밴드가 존재하지 않는다. 다른 샘플들의 결과들은 유사하다.
도 17은 실시예 12에서 균등 몰의 HLA-1-Mix, HLA-2-Mix, HLA-3-Mix, HLA-4-Mix, HLA-5-Mix, HLA-6-Mix, HLA-7-Mix, HLA-8-Mix, HLA-9-Mix 및 HLA-10-Mix를 풀화한 후 아가로오스 겔로부터의 회수 결과를 나타낸다. 래인 M은 분자량들의 마커이고, 래인 1은 풀의 전기영동 결과이며, 래인 2는 450bp 내지 750bpd 범위의 길이의 DNA 단편들을 포함하는 겔 슬라이싱 후의 전기이동도이다.
도 18은 실시예 12에서 샘플 번호 1의 HLA-C 자리의 엑손 2의 컨센서스 서열의 구축 프로그램의 스크린-캡쳐를 나타낸다. 먼저, 샘플의 C 자리의 서열 판독값들은 BWA 소프트웨어에 의한 참조 서열을 이용하여 배열되고, 이에 의하여 샘플의 C 자리의 엑손 2, 3, 4의 컨센서스 서열들을 구축하고; 나아가 C 자리의 엑손의 단상형 서열들이 SNPs 사이의 연결 관계에 기초하여 결정되며; 최종적으로 샘플의 유형은 엑손들의 단상형 서열들의 공통부분에 의하여 결정된다. 도면에 나타낸 바와 같이, 2 개의 이형접합성 SNPs는 샘플 번호 1의 C 유전자 서열의 695~764 영역에 포함되며, 이는 SNPs의 연결 관계가 A-C, G-A인 read1 및 read2로부터 결정될 수 있다 (도면에서 "…"는 참조 서열의 염기들과 동일한 염기들을 나타낸다). 서열들은 C*010201 및 C*07020101 유형의 서열들의 음영표시된 부분들에 각각 대응한다. 다른 영역들의 연결 관계의 판단은 유사하다.
도 2: 실시예 2의 샘플 번호 1에서 HLA-A/B/DRB1의 대응 엑손의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내는 도면. PCR 생성물들이 300bp~500bp의 일련의 단일 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 여기에서 래인(Lane) M은 분자량 마커 (DL 2000, Takara Co.)이고, 래인 1~7은 샘플 번호 1의 HLA-A/B/DRB1의 엑손 (A2, A3, A4, B2, B3, B4, DRB1-2)의 PCR 생성물들이고, 음성 대조구 (N)에서는 증폭밴드가 없음. 다른 샘플들의 결과들은 유사하다.
도 3: 실시예 4에서 전단 HLA-Mix 후의 DNA 전기영동 결과를 나타내는 도면 (겔 슬라이싱 전후)으로, 상기 겔-슬라이싱 영역은 450~750bp의 영역이다. 래인 M은 분자량 마커(NEB-50bp DNA Ladder)이고, 래인 1은 겔 슬라이싱 전의 HLA-Mix의 전기영동 결과이고, 래인 2는 슬라이싱 후 HLA-Mix의 전기영동 결과이다.
도 4: 실시예 6에서 샘플 번호 1의 컨센서스(consensus) 서열 구축용 프로그램의 스크린-캡쳐(screen-capture)로, 이는 프라이머 인덱스들 및 DNA 단편들 간의 중복 관계에 기초하여 PCR 생성물들의 완전한 서열을 어셈블리하는 것을 예시한다. HLA 유전형들의 명명법에 대해서는, http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html 참조. 결과 출력 컬럼 왼쪽에서 A*02:03:01 A*11:01:01의 모든 코딩 서열 결과들을 찾을 수 있으며, 여기에서 엑손 2의 서열은 주형 1의 알려진 본래 결과와 동일하다.
도 5: 프라이머 인덱스들 및 어댑터 인덱스로 표지한 후의 PCR 생성물을 나타내는 도면. 실험 동안, 프라이머 인덱스들은 PCR에 의하여 각 샘플의 PCR 생성물의 2개의 말단으로 동시에 도입되고; 상이한 프라이머 인덱스들을 갖는 다중 PCR 생성물들은 함께 풀화되어 서열화 라이브러리를 구축한다. 서열 라이브러리들의 구축 동안, 다수의 서열화 라이브러리들이 구축되어야만 하고, 서열화 라이브러리들은 상이한 어댑터 인덱스들을 갖는 라이브러리 어댑터들로 표지될 수 있다. 라이브러리들의 구축 종료 후, 상이한 어댑터 인덱스들로 표지된 다수의 서열화 라이브러리들은 함께 풀화되고, Illumina GA에 의하여 동시에 서열화된다 (프라이머 인덱스들은 상이한 인덱스들로 표지된 서열화 라이브러리들 중에서 동일할 수 있다). 서열화 결과들을 얻은 후, 각 샘플에 대한 DNA 서열 정보는 서열화 결과들에서 어댑터 인덱스들 및 프라이머 인덱스들의 서열 정보를 검색하므로써 수득될 수 있다.
도 6: 실시예 8에서 일부 샘플들의 HLA-C의 엑손 2, 3, 4의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내는 도면. PCR 생성물들이 400bp~500bp의 일련의 단일 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 여기에서 래인 M은 표준 DNA 분자량에 대한 참조이다 (DL 2000, Takara Co.).
도 7: 실시예 8에서 전단 HLA-Mix 후 DNA 전기영동 겔 슬라이싱의 결과를 나타내는 도면으로, 여기에서 상기 겔-슬라이싱 영역은 450~750bp의 영역이다. 래인 M은 분자량의 마커이고(NEB-50bp DNA Ladder), 래인 1은 슬라이싱 전 HLA-Mix의 겔을 나타내는 도면이고, 래인 2는 슬라이싱 후 HLA-Mix의 겔을 나타내는 도면이다.
도 8: 실시예 8에서 샘플 번호 2의 HLA-C 자리의 엑손 2의 컨센서스 서열의 구축 프로그램의 스크린-캡쳐. 먼저, 샘플의 C 자리의 서열 판독값들은 BWA 소프트웨어에 의하여 참조 서열을 이용하여 배열되고, 이에 의하여 샘플의 C 자리의 엑손 2, 3, 4의 컨센서스 서열들을 구축한다; 나아가, C 자리의 각 엑손의 단상형 서열은 SNPs들 간의 연결 관계에 기초하여 결정되며; 최종적으로 샘플의 유형은 엑손들의 단상형 서열들의 공통부분들(intersection)에 의하여 결정된다. 도면에 나타낸 것과 같이, 2개의 이형접합성(heterozygous) SNP는 샘플 번호 2의 C 유전자 서열의 695~764 영역에 포함되며, 이는 SNP의 연결 관계가 A-C, G-A인 read1 및 read2로부터 결정될 수 있다 (도면에서 "..."는 참조 서열 염기들에 동일한 염기들을 나타낸다). 상기 서열들은 C*010201 및 C*07020101 유형들 각각의 서열들 중 음영표시된 부분들에 대응한다. 다른 영역들의 연결 관계의 판단은 유사하다.
도 9: 실시예 9에서 26개 샘플들의 HLA-C 자리의 엑손 2, 3 및 4의 PCR 생성물들의 전기영동 결과들을 나타내는 도면. 도면에 나타낸 바와 같이, 모든 PCR 생성물들은 500bp 미만의 길이이다; 전기영동 밴드는 단일하며; 명확한 비특이적 밴드는 없고; 프라이머들의 동일한 쌍의 증폭 효율은 각종 샘플들에서 동일하다.
도 10: 실시예 9에서 uType 소프트웨어를 이용하므로써 주형 1의 PCR 증폭 생성물들의 서열화 데이터의 분석 결과를 나타내는 도면. 결과 출력 컬럼 왼쪽은, 주형 1의 알려진 본래의 유형과 동일한, C*08:01:01 C*15:05:01 결과를 나타낸다.
도 11: 실시예 10의 94개 샘플들 중 HLA-DQB1의 엑손 2+3의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내는 도면. PCR 생성물들이 250bp~500bp의 일련의 단일한 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 여기에서 래인 M은 표준 DNA 분자량들에 대한 참조이고 (DL 2000, Takara Co.), 래인들 PI-1 내지 PI-94는 94개 샘플들 중 HLA-DQB1의 엑손 2+3의 PCR 증폭 생성물들이고, 음성 대조구 (N)에서는 증폭 밴드가 없다.
도 12는 실시예 10에서, 전단 HLA-Q-Mix 후, DNA 전기영동 겔 슬라이싱의 결과들을 나타내며, 여기에서 겔-슬라이싱 영역은 350~550bp의 영역이다. 래인 M은 표준 DNA 분자량들의 마커(NEB-50bp DNA Ladder)이고, 래인 1은 슬라이싱 전 HLA-Q-Mix의 겔을 나타내는 도면이고, 래인 2는 슬라이싱 후 HLA-Q-Mix의 겔을 나타내는 도면이다.
도 13은 실시예 10에서 샘플 번호 7의 컨센서스 서열의 구축 프로그램의 스크린-캡쳐를 나타내며, 데이터 분석의 주요 절차를 나타낸다. 먼저, 샘플의 DQB1 자리의 서열 판독값들은 BWA 소프트웨어에 의한 참조 서열을 이용하여 배열되고, 이에 따라 샘플의 DQB1의 엑손 2, 3의 컨센서스 서열들이 구축되고, DQB1의 엑손 2, 3의 단상형 서열들은 SNPs 간의 연결 관계에 기초하여 결정된다. 도면에 나타낸 바와 같이, 6개의 이형접합성 SNPs는 샘플 번호 7의 DQB1 유전자 서열의 2322~2412 영역에 포함되며, 이는 SNP1-SNP5의 연결 관계가 T-G-T-C-C인 read1로부터 결정될 수 있고; 또다른 SNP1-SNP5의 연결 관계가 C-C-A-G-T인 read2로부터 결정될 수 있고; SNP3-SNP6의 연결 관계가 A-G-T-G인 read3으로부터 결정될 수 있다; 또다른 SNP3-SNP6의 연결 관계가 T-C-C-A인 read4로부터 결정될 수 있고; 이는 read1이 read4에 연결되고, read2가 read3에 연결되고, 이 영역에서 완전한 SNP 조합이 T-G-T-C-C-A 및 C-C-A-G-T-G이고, 서열들이 DQB1*0303 및 DQB1*0602 유형의 서열들의 음영표시된 부분들에 대응하는, 상기 SNP들의 상기 연결 관계들로부터 결정될 수 있다. 다른 영역들의 연결 관계의 판단은 유사하다.
도 14는 HLA-DQB1 자리의 엑손 2 및 3 각각의 증폭 및 2개 쌍의 PCR 프라이머들을 갖는 엑손 2 및 3의 증폭의 각각으로부터의 결과인, 실시예 11에서 생성물들의 전기이동도를 나타낸다. 상기 전기이동도는 7개의 DNA 주형들로부터의 PCR 생성물들의 3개 세트들을 나타내며, 모든 PCR 생성물들은 500bp 미만의 길이를 갖고; 전기영동 밴드들은 단일하며; 명확하게 비특이적인 밴드는 없다. 음성 대조구 (N)에서는 증폭 밴드가 없으며, 래인 M은 표준 DNA 분자량들에 대한 참조이다 (DL 2000, Takara Co.).
도 15는, 실시예 11에서 uType 소프트웨어를 이용하여, 주형 7의 HLA-DQB1의 엑손 2 및 3의 증폭으로부터 초래한 PCR 생성물들의 서열화 데이타의 분석 결과들을 설명한다. 결과 출력 컬럼 왼편에 DQB1*03:03 DQB1*06:02 결과를 나타내었으며, 이는 Template 7의 알려진 본래의 결과와 동일하다.
도 16은 실시예 12의 샘플 번호 1에서 HLA-A/B/C/DQB1의 대응 엑손으로부터 PCR 생성물들의 전기영동 결과들을 나타낸다. PCR 생성물들은 300bp~500bp의 일련의 단일 밴드들이라는 것을 전기이동도로부터 알 수 있으며, 래인 M은 분자량 마커 (DL 2000, Takara Co.)이고; 래인들 1~10은 샘플 번호 1의 HLA-A/B/C/DQB1의 엑손(A2, A3, A4, B2, B3, B4, C2, C3, C4, DQB1)의 PCR 증폭 생성물들이다; 음성 대조구 (N)에서는 증폭 밴드가 존재하지 않는다. 다른 샘플들의 결과들은 유사하다.
도 17은 실시예 12에서 균등 몰의 HLA-1-Mix, HLA-2-Mix, HLA-3-Mix, HLA-4-Mix, HLA-5-Mix, HLA-6-Mix, HLA-7-Mix, HLA-8-Mix, HLA-9-Mix 및 HLA-10-Mix를 풀화한 후 아가로오스 겔로부터의 회수 결과를 나타낸다. 래인 M은 분자량들의 마커이고, 래인 1은 풀의 전기영동 결과이며, 래인 2는 450bp 내지 750bpd 범위의 길이의 DNA 단편들을 포함하는 겔 슬라이싱 후의 전기이동도이다.
도 18은 실시예 12에서 샘플 번호 1의 HLA-C 자리의 엑손 2의 컨센서스 서열의 구축 프로그램의 스크린-캡쳐를 나타낸다. 먼저, 샘플의 C 자리의 서열 판독값들은 BWA 소프트웨어에 의한 참조 서열을 이용하여 배열되고, 이에 의하여 샘플의 C 자리의 엑손 2, 3, 4의 컨센서스 서열들을 구축하고; 나아가 C 자리의 엑손의 단상형 서열들이 SNPs 사이의 연결 관계에 기초하여 결정되며; 최종적으로 샘플의 유형은 엑손들의 단상형 서열들의 공통부분에 의하여 결정된다. 도면에 나타낸 바와 같이, 2 개의 이형접합성 SNPs는 샘플 번호 1의 C 유전자 서열의 695~764 영역에 포함되며, 이는 SNPs의 연결 관계가 A-C, G-A인 read1 및 read2로부터 결정될 수 있다 (도면에서 "…"는 참조 서열의 염기들과 동일한 염기들을 나타낸다). 서열들은 C*010201 및 C*07020101 유형의 서열들의 음영표시된 부분들에 각각 대응한다. 다른 영역들의 연결 관계의 판단은 유사하다.
실시예
본 발명의 구체예들은 하기 실시예들에서 상세하게 설명된다. 그러나, 당업자는, 하기 실시예들이 본 발명의 범주를 제한하기보다는 본 발명을 설명하기 위하여 설명된다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 실시예들 1~6에서, 95개 샘플들에서 HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DRB1의 엑손 2를, 프라이머 인덱스들 + DNA 불완전 전단 전략 + Illumia GA 서열분석기 페어드-엔드 100 서열화 기술의 조합을 이용하므로써 제노타이핑하며 (PCR 생성물들은 290bp 내지 500bp 범위의 길이를 갖는다), 이는 본 발명의 방법이, 고처리량 및 저비용과 같은 제 2 세대 서열분석기의 특징들을 충분하게 이용하면서, 서열분석기의 최대 판독값 길이를 초과하는 길이의 유전자 단편들의 타입화를 달성할 수 있다는 것을 증명한다.
원리: 분석될 샘플들에 대하여, PCR 생성물들의 샘플 정보를 특이적으로 표지하기 위하여, 프라이머 인덱스들을 PCR 반응에 의하여 HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DRB1의 엑손 2의 PCR 생성물들의 2 개의 말단에 도입한다. 각 군의 샘플들에서 3 개의 자리들(HLA-A/B/DRB1)의 PCR 증폭 생성물들을 함께 풀화하여 PCR 생성물들의 라이브러리를 수득하였다; PCR 생성물들의 라이브러리의 불완전한 초음파 전단 후, PCR-자유 서열화 라이브러리를 구축하였다. 서열화 라이브러리를 2% 저용융점 아가로오스 겔 전기영동에 투입하고, 450bp 내지 750bp 범위의 길이의 모든 DNA 밴드들을 겔 슬라이싱에 의하여 정제 및 회수하였다 (PCR-자유 서열화 라이브러리의 구축 동안, 라이브러리 어댑터들을 DNA 단편들의 2 개의 말단들에 첨가하였기 때문에, 전기이동도에 나타낸 것과 같이 DNA 밴드의 길이는 DNA 단편들의 실제 길이보다 약 250bp 더 길었으며; 따라서 여기에서 회수된 것과 같은 450bp 내지 700bp 범위의 길이의 단편들은 실제로 200bp 내지 500bp 범위의 본래 길이의 DNA 단편들에 대응한다). 회수된 DNA를 Illumina GA PE-100에 의하여 서열화하였다. 시험된 모든 샘플들의 서열 정보는 프라이머 인덱스 서열들에 의하여 추적될 수 있으며, 전체 PCR 생성물의 서열은 알려진 참조 서열들, DNA 단편들의 서열들 간의 중복 및 연결 관계에 기초하여 어셈블리될 수 있다. 본래의 PCR 생성물의 완전한 서열은 HLA-A/B/DRB1의 대응 엑손의 표준 데이터베이스를 이용하여 어셈블리하여 HLA-A/B/DRB1 제노타이핑을 달성할 수 있다.
실시예 1
샘플 추출
알려진 HLA-SBT 타입화 결과들로, 킹피셔 자동 추출기(KingFisher Automatic Extraction Instrument) (US Thermo Co.)를 이용하여 95개의 혈액 샘플들로부터 DNAs를 추출하였다 (중국 골수 공여자 프로그램(China Marrow Donor Program), 이하 (CMDP)로 명명). 주요 단계들은 다음과 같았다: 안내서에 설명된 바에 따라, 소정량의 일체완비형(sefl-contained) 약제를, 킹피셔 자동추출기에 의해 장착되는 6개의 깊은 웰 플레이트와 하나의 얕은 웰 플레이트에 첨가하고, 약제들이 첨가된, 모든 플레이트들을 요구되는 바에 따라 대응 위치에 배치하였다. "Bioeasy_200ul Blood DNA_KF.msz" 프로그램을 선택하고, "star" 키를 눌러서 핵산 추출을 실시하였다. 프로그램 종료 후, 약 100μl의 용리된 생성물들(즉, 추출된 DNA)을 플레이트 용리(Elution)로부터 채집하였다.
실시예 2
PCR 증폭
5' 말단에서 상이한 프라이머 인덱스들을 갖는 PCR 프라이머들을 합성하므로써 상이한 PCR 인덱스 프라이머들을 제조하였으며, 이러한 상이한 PCR 인덱스 프라이머들은 HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DRB1의 엑손 2에 대한 PCR 프라이머들이었다. 그 후, 프라이머 인덱스들을 PCR 반응에 의하여 PCR 생성물들의 2개의 말단에 도입하고, 이에 의하여 상이한 샘플들로부터 PCR 생성물들을 특이적으로 표지하였다.
95 세트의 PCR 인덱스 프라이머들을 사용하여 95개의 DNA 샘플들을 각각 증폭하였으며, 여기에서 PCR 인덱스 프라이머들의 각 세트는 양방향성 프라이머 인덱스들의 페어 (표 6) 및 HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4 (표 1) 및 HLA-DRB1의 엑손 2 (표 7)의 증폭을 위한 PCR 프라이머들로 이루어지고, 각 순방향 PCR 프라이머는 5' 말단에 연결된 프라이머 인덱스들의 페어에서 순방향 프라이머 인덱스를 갖고, 역방향 PCR 프라이머는 5' 말단에 연결된 프라이머 인덱스들의 페어에서 역방향 프라이머 인덱스를 갖는다. 프라이머들의 합성 동안, 프라이머 인덱스들을 PCR 프라이머들의 5' 말단에 직접 첨가하였다.
실시예 1의 샘플 추출 단계로부터 수득된 95 DNAs를 번호 1~95로 명명하였다. PCR 반응은 96웰 플레이트들, 총 7개의 플레이트들에서 일어났으며, 이들은 HLA-P-A2, HLA-P-A3, HLA-P-A4, HLA-P-B2, HLA-P-B3, HLA-P-B4 및 HLA-P-DRB1-2 (A2/A3/A4, B2/B3/B4, DRB1-2는 증폭된 자리들을 나타낸다)로 명명되며, 여기에서 어떤 주형의 첨가도 없는 음성 대조구를 각 플레이트에 설정하였으며, 음성 대조구에 사용된 프라이머들은 주형 1에 대한 것들과 동일한 것들이다. 실험 동안, 프라이머 인덱스들의 각 쌍에 대응하는 샘플들의 번호매김(numbering) 정보를 기록하였다.
D2-F1, D2-F2, D2-F3, D2-F4, D2-F5, D2-F6, D2-F7은 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 선방향 프라이머들이고, D2-R은 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 역방향 프라이머이다.
HLA-A/B/DRB1의 PCR 절차는 다음과 같았다:
96℃ 2분
95℃ 30초→60℃ 30초→72℃ 20초 (32 사이클들)
15℃ ∞
HLA-A/B용 PCR 반응 시스템은 다음과 같았으며, 여기에서 모든 약제들은 Promega (Beijing) Bio-Tech Co.로부터 구입하였다.
HLA-DRB1를 위한 PCR 반응 계는 다음과 같았다:
여기에서 PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7는 5' 말단에서 순방향 프라이머 인덱스 서열 번호 n (표 6)을 갖는 HLA-A/B/DRB1의 F 프라이머를 나타내고, PInr-A/B/D2-R2/3/4는 5' 말단에서 역방향 프라이머 인덱스 서열 번호 n을 갖는 HLA-A/B/DRB1의 R 프라이머를 나타내며(여기에서 n≤95), 나머지는 유사하게 유추될 수 있다. 나아가, 각 샘플은 PCR 프라이머들 (PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7, PInr-A/B/D2-R2/3/4)의 특이적 세트에 대응된다.
PCR 반응은 Bio-Rad Co.로부터의 PTC-200 PCR 장치에서 실시되었다. PCR 반응 후, 2ul PCR 생성물들을 1% 아가로오스 겔 전기영동시켰다. 도 2는 샘플 번호 1의 HLA-A/B/DRB1 의 대응 엑손의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내었으며, DNA 분자량용 마커는 DL 2000 (Takara Co.)이었다. 전기이동도에서 300bp 내지 500bp 범위의 길이의 일련의 단일 밴드들이 존재하며, 이는 샘플 번호 1의 HLA-A/B/DRB1의 엑손 (A2, A3, A4, B2, B3, B4, DRB1-2)의 성공적인 PCR 증폭을 나타낸다. 음성 대조구 (N)에서 증폭 밴드는 없었다. 다른 샘플들의 결과들은 유사하였다.
실시예 3
PCR 생성물들의 풀화 및 정제
나머지 PCR 생성물들 20μl를 96-웰 플레이트 HLA-P-A2의 각 웰로부터 취하였으며 (음성 대조구 제외), 3ml EP 튜브 중에서 진탕 하에 균질하게 혼합시켰다 (HLA-A2-Mix로 명명). 동일한 조작을 다른 6개의 96-웰 플레이트들에 적용하였으며, 이들은 HLA-A3-Mix, HLA-A4-Mix, HLA-B2-Mix, HLA-B3-Mix, HLA-B4-Mix 및 HLA-D2-Mix로서 명명되었다. 각 HLA-A2-Mix, HLA-A3-Mix, HLA-A4-Mix, HLA-B2-Mix, HLA-B3-Mix, HLA-B4-Mix 및 HLA-D2-Mix로부터 200ul를 취하고, 3ml EP 튜브 중에서 혼합하고, 이를 HLA-Mix로 명명하였다. HLA-Mix로부터의 500ul DNA 혼합물을 Qiagen DNA 정제 키트 (QIAGEN Co.)를 이용하여 컬럼 정제시켰다 (구체적인 정제 단계들은, 제조자 지시사항 참조). 정제에 의하여 수득된 200ul DNA가 48ng/ul의 HLA-Mix DNA 농도를 갖는다는 것을 Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific Co.)에 의하여 결정하였다.
실시예 4
PCR 생성물들의 전단, 및 Illumina GA PCR-자유(free) 서열화 라이브러리들의 구축
1. DNA 전단
정제된 HLA-Mix로부터 취한, 총 량 5ug DNA를, AFA 섬유 및 Snap-Cap이 있는 Covaris 마이크로튜브에 담고, 이를 Covaris S2DNA 전단기 (Covaris Co.) 중에서 전단시켰다. 전단 조건은 다음과 같았다:
주파수 스위핑(Frequency sweeping)
| 사용율(Duty Cycle) | 10% |
| 강도 | 5 |
| 사이클들/버스트(Burst) | 200 |
| 시간(초) | 300 |
2. 전단 후 정제
HLA-Mix의 모든 전단된 생성물들을 QIAquick PCR 정제 키트에 의하여 회수하고, 37.5ul EB (QIAGEN Elution Buffer)에 각각 용해시켰다.
3. 말단 복구 반응
전단 후 정제된 HLA-Mix를 DNA 말단 복구 반응시켰으며, 이 반응 시스템은 아래와 같았다 (모든 약제들은 Enzymatics Co.로부터 구매하였다):
| DNA | 37.5μL |
| H2O | 37.5μL |
| 10x 폴리뉴클레오티드 키나아제 버퍼 (B904) | 10μL |
| dNTP 혼합물 (용액 세트 (각 10mM)) | 4μL |
| T4 DNA 폴리머라아제 | 5μL |
| 클레나우(Klenow) 단편 | 1μL |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 | 5μL |
| 총 부피 | 100μL |
반응 조건: Thermomixer (Thermomixer, Eppendorf Co.) 중 20℃에서 30분 동안 인큐베이션.
반응 생성물들을 QIAquick PCR 정제 키트에 의하여 회수 및 정제하고, 34㎕ EB (QIAGEN Elution Buffer) 중에 용해시켰다.
4. 3' 말단에서 A의 첨가
이전 단계에서 회수된 DNA의 3' 말단에 A를 첨가하였으며, 반응 시스템은 다음과 같았다 (모든 약제들은 Enzymatics Co.로부터 구매하였다):
| 이전 단계에서 수득된 DNA | 32μL |
| 10x 청색 버퍼 | 5μL |
| dATP (1mM, GE Co.) | 10μL |
| 클레나우 (3'-5' exo-) | 3μL |
| 총 부피 | 50μL |
반응 조건: Thermomixer (Thermomixer, Eppendorf Co.) 중, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션.
반응 생성물들을 MiniElute PCR 정제 키트(QIAGEN Co.)에 의하여 회수 및 정제하고, 13㎕ EB (QIAGEN 용리 버퍼(Elution buffer))) 중에 용해시켰다.
5. Illumina GA PCR-자유 라이브러리 어댑터의 결찰
"PCR-자유 라이브러리 어댑터"라는 용어는, 그의 주요 역할이 서열화 칩 상에서의 DNA 분자의 보조적인 고정화에 있고, 보편성 서열화 프라이머들에 대한 결합 자리를 제공하는데 있는, 설계된 염기들의 절편을 의미하며, 여기에서 PCR-자유 라이브러리 어댑터는 서열화 라이브러리 중 DNA단편들의 2 개의 말단들에 직접 결찰될 수 있다; PCR은 라이브러리 어댑터의 도입에 관련되기 때문에, 라이브러리 어댑터는 PCR-자유 라이브러리 어댑터라고 명명되었다.
첨가된 A를 갖는 생성물들을 Illumina GA PCR-자유 라이브러리 어댑터들에 결찰되었으며, 반응 시스템은 다음과 같았다 (모든 약제들은 Illumina Co.로부터 구매하였다):
| 이전 단계에서 수득된 DNA | 11μL |
| 2x 신속(Rapid) 결찰 버퍼 | 15μL |
| PCR-자유 어댑터 올리고 혼합물 (30mM) | 1μL |
| T4 DNA 리가아제 (신속, L603-HC-L) | 3μL |
| 총 부피 | 30μL |
반응 조건들: Thermomixer (Thermomixer, Eppendorf Co.) 중 20℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
반응 생성물들을 Ampure Beads (Beckman Coulter Genomics)에 의하여 정제하고, 50ul 탈이온수에 용해시켰으며, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의해 결정된 DNA 농도는 다음과 같았다:
| qPCR에 의해 결정된 결과 (nM) | |
| HLA-Mix | 78.90 |
6. 겔 슬라이싱에 의한 회수
30μL HLA-Mix를 2% 저용융점 아가로오스 겔로 전기영동시켰다. 전기영동 조건은 100V, 100분이었다. DNA 마커는 NEB Co.로부터의 50bp DNA 마커였다. 450 내지 750bp의 범위의 DNA 단편들을 포함하는 겔을 슬라이스하였다 (도 3). 슬라이스된 겔 중 생성물들을 QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN Co.)에 의하여 회수 및 정제하고, 정제 후 부피는 32ul였으며, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의하여 측정된 DNA 농도는 10.16nM였다.
실시예 5
Illumina GA 서열화
QPCR 결과들에 따라, 10pmol DNA를 취하여 Illumina GA PE-100 프로그램에 의해 서열화시켰다. 구체적인 작동 절차는, Illumina GA 작동 설명서 참조(Illumina GA IIx).
실시예 6
결과 분석
Illumina GA로부터의 서열화 결과들은 일련의 DNA 서열들이었으며, 서열화 결과들 중에서 순방향 및 역방향 프라이머 인덱스 서열들 및 프라이머 서열들을 조사하므로써, 개별적인 프라이머 인덱스에 대응하는 각 샘플에 대한 HLA-A/B/DRB1의 각종 엑손의 PCR 생성물들의 서열화 결과들을 포함하는 데이터베이스들을 구축하였다. 각 엑손의 서열화 결과들을 BWA (Burrows-Wheeler Aligner)에 의하여 대응 엑손의 참조 서열에 대하여 배열하고 (참조 서열들은 http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/참조), 한편 각 데이터베이스의 컨센서스 서열들을 구축하고, 데이터베이스의 DNA 서열들을 선택 및 수정하였다. 수정된 DNA 서열들을, 서열 중복 및 연결 (페어드-엔드 연결) 관계에 근거하여 HLA-A/B/DRB1의 엑손의 대응 서열들로 어셈블리하였다. 결과의 DNA 서열을, IMGT HLA 전문 데이터베이스 중 HLA-A/B/DRB1의 대응 엑손의 서열 데이터베이스를 이용하여 배열하였다. 서열 배열의 결과가 100% 일치하는 경우, 대응 샘플의 HLA-A/B/DRB1 유전형이 결정되었다. 도 4에 예시된 것과 같이, 샘플 번호 1의 HLA-A 자리의 엑손 2의 컨센서스 서열의 구축을 위한 프로그램의 스크린-캡쳐 참조.
모든 95 개 샘플들에 대하여, 상기 방법에 의하여 수득된 타입화 결과들은 알려진 타입화 결과들에 완전히 일치하였으며, 여기에서 샘플 번호 1~32의 결과들은 다음과 같았다:
주: HLA-DRB1 유형들 중, DRB1*1201은 DRB1*1206/1210/1217일 가능성이 배제되지 않으며, DRB1*1454는 DRB1*1401일 가능성이 배제되지 않는데, 상기 대립유전자들은 HLA-DRB1의 엑손 2의 서열에서 완전히 동일하기 때문이다.
실시예 7
제 2 세대 서열화 기술 (Illumina GA)에 의한 HLA-A,B 및 DRB1 제노타이핑
샘플 추출
KingFisher 자동 추출기(US Thermo Co.)를 이용하여, 알려진 HLA-SBT 타입화 결과들 (중국 골수 공여자 프로그램, 이하 (CMDP)로 언급됨)을 갖는 950개 혈액 샘플들로부터 DNA들을 추출하였다. 방법은 실시예 1에 설명된 바와 같다.
PCR 증폭
샘플 추출 단계로부터 수득된 950개 DNA들을 번호 1~950으로 명명하고, 이를 10개의 군들로 나누고(각각에 대하여 95DNAs), 이들을 HLA-1, HLA-2, HLA-3, HLA-4, HLA-5, HLA-6, HLA-7, HLA-8, HLA-9, HLA-10로 명명하였다. 샘플들의 각 군에 대하여, 95개 DNA 샘플들은, HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4의 증폭을 위한 양방향성 프라이머 인덱스들 (표 6)을 갖는 95 세트들의 PCR 프라이머들 (표 1) 및 HLA-DRB1의 엑손 2의 증폭을 위한 양방향성 프라이머 인덱스들 (표 6)을 갖는 PCR 프라이머들 (표 7)에 의하여 증폭되었다. PCR 반응은 96-웰 플레이트들에서, 총 70개의 플레이트들을 이용하여 수행되었으며, HLA-X-P-A2, HLA-X-P-A3, HLA-X-P-A4, HLA-X-P-B2, HLA-X-P-B3, HLA-X-P-B4 및 HLA-X-P-DRB1-2 ("X"는 그룹 번호 정보 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10를 나타내고, "A2/3/4", "B2/3/4", "DRB1-2"는 증폭 자리들을 나타낸다)로 명명하였고, 여기에서 어떤 주형의 첨가도 없는 음성 대조구가 각 플레이트 내에 세팅되었으며, 음성 대조구에 대하여 사용된 프라이머들은 PI-1에 의해 표지된 프라이머들이다 (표 6). 실험 동안, 그룹 번호 및 프라이머 인덱스들에 대한 각 샘플의 정보를 기록하였다. 방법은 실시예 2에 설명된 바와 같았다.
PCR 생성물들의 풀화 및 정제
X 군("X"는 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10이다)의 샘플들의 경우, 20㎕의 나머지 PCR 생성물들을 96-웰 플레이트 HLA-X-P-A2의 각 웰로부터 취해졌으며 (음성 대조구 제외), 3ml EP 튜브 내에서 진탕 하에 균질하에 혼합되었다 (HLA-X-A2-Mix로 명명됨). 동일한 조작을 X 군의 샘플들의 다른 6개의 96-웰 플레이트들에 적용하였으며, 이를 HLA-X-A3-Mix, HLA-X-A4-Mix, HLA-X-B2-Mix, HLA-X-B3-Mix, HLA-X-B4-Mix 및 HLA-X-D2-Mix로서 명명하였다. HLA-X-A2-Mix, HLA-X-A3-Mix, HLA-X-A4-Mix, HLA-X-B2-Mix, HLA-X-B3-Mix, HLA-X-B4-Mix 및 HLA-X-D2-Mix 각각으로부터 200ul를 취하고, 3ml EP 튜브 중에서 혼합하였으며, 이를 HLA-X-Mix로서 명명하였다. HLA-X-Mix로부터의 500ul DNA 혼합물을 Qiagen DNA 정제 키트 (QIAGEN Co.)를 이용하여 컬럼 정제하여 (구체적인 정제 단계들은, 제조자 설명서 참조) 200ul DNA를 수득하고, 그의 DNA 농도를 Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific Co.)을 이용하여 결정하였다. 동일한 조작은 다른 군들에도 적용되었다. 최종적으로 결정된 DNA 농도는 다음과 같았다.
| HLA-1-Mix | HLA-2-Mix | HLA-3-Mix | HLA-4-Mix | HLA-5-Mix | HLA-6-Mix | HLA-7-Mix | HLA-8-Mix | HLA-9-Mix | HLA-10-Mix | |
| 농도 (ng/ul) | 48.0 | 52.1 | 49.3 | 50.2 | 47.6 | 48.5 | 49.1 | 48.6 | 51.3 | 50.8 |
방법은 실시예 3에 설명된 바와 같다.
Illumina GA 서열화 라이브러리들의 구축을, 실시예 4의 방법에 의하여 수행하였다. 샘플 군들 간의 대응 관계들 및 라이브러리 어댑터들은 다음과 같았다.
| 샘플 군 | HLA-1 | HLA-2 | HLA-3 | HLA-4 | HLA-5 | HLA-6 | HLA-7 | HLA-8 | HLA-9 | HLA-10 |
| 라이브러리 어댑터 번호 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
반응 생성물들을 Ampure Beads (Beckman Coulter Genomics)에 의하여 정제하였으며, 50ul 탈이온수 중에 용해시키고, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의해 결정된 DNA 몰 농도는 다음과 같았다:
| HLA-1-Mix | HLA-2-Mix | HLA-3-Mix | HLA-4-Mix | HLA-5-Mix | HLA-6-Mix | HLA-7-Mix | HLA-8-Mix | HLA-9-Mix | HLA-10-Mix | |
| 농도 (nM) |
78.90 | 72.13 | 79.33 | 80.21 | 77.68 | 78.50 | 89.12 | 78.60 | 81.32 | 80.82 |
겔
슬라이싱에
의한 회수
HLA-1-Mix, HLA-2-Mix, HLA-3-Mix, HLA-4-Mix, HLA-5-Mix, HLA-6-Mix, HLA-7-Mix, HLA-8-Mix, HLA-9-Mix 및 HLA-10-Mix을 균등 몰로 혼합하였으며 (최종 농도는 72.13nM/ul 이었다), 이는 HLA-Mix-10로서 명명하였다. 30μL HLA-Mix-10를 2% 낮은 용융점 아가로오스 겔 전기영동에 적용시켰다. 전기영동 조건은 100V, 100분이었다. DNA 마커는 NEB Co.으로부터의 50bp DNA 마커였다. 450bp 내지 750bp 범위의 DNA 단편들을 포함하는 겔을 슬라이스하였다. 슬라이스된 겔 중 생성물들을 QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN Co.)에 의하여 회수 및 정제하고, 정제 후 부피는 32ul였으며, 형광 정량 PCR (QPCR)에 측정된 DNA 농도는 9.96nM였다.
서열화 및 결과 분석은 실시예 5 및 6에 설명된 것과 같이 수행되었다. 모든 950개의 샘플들에 대하여, 상기 방법에 의하여 수득된 타입화 결과들은 알려진 타입화 결과들에 완전히 일치하였다.
실시예 8
제 2 세대 서열화 기술 (Illumina GA)을 이용함에 의한 HLA-C 제노타이핑
1．DNA 샘플 추출
단계들은 실시예 1에 설명된 바와 같았다.
2．PCR 증폭
단계들은, 사용된 PCR 프라이머들이 표 3에 나타낸 것과 같은 HLA-C의 엑손 2, 3 및 4에 대한 PCR 프라이머들이라는 것을 제외하고는 실시예 2에 설명된 바와 같다.
95 세트들의 PCR 인덱스 프라이머들을 95개 DNA 샘플들을 이용하여 각각 증폭시켰으며, 각 PCR 인덱스 프라이머들은 HLA-C의 엑손 2, 3, 4 증폭을 위한 PCR 프라이머들 및 양방향성 프라이머 인덱스들의 쌍으로 이루어졌으며 (아래 설명되는 바와 같음), 각 순방향 PCR 프라이머는 5' 말단에서 연결된 프라이머 인덱스들의 쌍의 순방향 프라이머 인덱스를 갖고, 역방향 PCR 프라이머는 5' 말단에서 연결된 프라이머 인덱스들의 쌍의 역방향 프라이머 인덱스를 갖는다. 프라이머들의 합성 동안, 프라이머 인덱스들을 PCR 프라이머들의 5' 말단에 직접 첨가하였다.
샘플 추출 단계로부터 수득된 95 DNAs들은 1~95번으로 명명하였다. PCR 반응은 96-웰 플레이트에서, 총 3개의 플레이트들에서 수행되었으며, 이들은 HLA-P-C2, HLA-P-C3, HLA-P-A4 (C2/3/4는 증폭 자리를 나타낸다)로 명명되었고, 여기에서 어떤 주형도 첨가하지 않은 음성 대조구를 각 플레이트에 설정하고, 음성 대조구에 사용된 프라이머들은 프라이머 PI-96과 동일하였다. 실험 동안, 프라이머 인덱스들의 각 쌍에 대응하는 샘플의 번호 정보를 기록하였다.
사용된 프라이머 인덱스들은, 표 6에 열거된 것과 같은 프라이머 인덱스들 PI-1 내지 PI-95, 및 하기 음성 대조구 프라이머 인덱스 PI-96 (표 19)이었다.
단계 1에서의 킹피셔 자동 추출기를 이용하여 추출된 DNA들을 주형으로 사용하였으며, HLA-C의 엑손에 대한 프라이머들을 사용하여 단일 튜브들 중 PCR 증폭을 실시하였으며, 여기에서 프라이머들은 5'말단에서 인덱스를 가졌다. PCR 절차는 다음과 같았다:
C2: 96℃ 2분
95℃ 30초→62℃ 30초→72℃ 20초 (35 싸이클)
15℃ ∞
C3: 96℃ 2분
95℃ 30초→56℃ 30초→72℃ 20초 (35 싸이클)
15℃ ∞
C4: 96℃ 2분
95℃ 30초→60℃ 30초→72℃ 20초 (35 싸이클)
15℃ ∞
HLA-C의 PCR 반응계는 다음과 같았다:
| Promega 5×버퍼 I (Mg2+ 추가) | 5.0μL |
| dNTP 혼합물 (각 2.5mM) | 2.0μL |
| PInr-C-F2/3/4 (50ng/ul) | 1.5μL |
| PInf-C-R2/3/4 (50ng/ul) | 1.5μL |
| Promega Taq (5U/ul) | 0.2μL |
| DNA (약 20ng/ul) | 2.0μL |
| ddH2O | 12.8μL |
| 총 | 25.0μL |
여기에서 PInf-C-F2/3/4는 5' 말단에서 순방향 프라이머 인덱스 서열 번호 n (표 2)을 갖는 HLA-C의 F 프라이머를 나타내고, PInr-C-R2 /3/4는 5'말단에서 역방향 프라이머 인덱스 서열을 갖는 HLA-C의 R 프라이머를 나타내고 (여기에서 n≤96), 나머지는 유사하게 유추될 수 있다. 또한, 각 샘플은 PCR 프라이머들의 특이적 세트에 대응한다.
PCR 반응은 Bio-Rad Co.으로부터 PTC-200 PCR 장치에서 실시되었다. PCR 반응 후, 2ul의 PCR 생성물들을 1.5% 아가로오스 겔 전기영동시켰다. 도 6은 처음 20개 샘플들의 HLA-C의 대응 엑손의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내며, DNA 분자 마커는 DL 2000 (Takara Co.)이었다. 전기이동도 중 400bp 내지 500bp의 범위의 길이의 일련의 단일 밴드들이 있었으며, 이는 샘플들의 HLA-C의 엑손 (C2, C3, C4)의 성공적인 PCR 증폭을 나타낸다. 다른 샘플들의 결과들은 유사하였다.
PCR 생성물들의 풀화 및 정제
20㎕의 나머지 PCR 생성물들을 96-웰 플레이트의 HLA-P-C2의 각 웰로부터 취하고(음성 대조구 제외), 3ml EP 튜브 중에서 진탕 하에 균질하게 풀화하였다 (HLA-C2-Mix로 명명). 동일한 조작을 다른 2개의 96-웰 플레이트들에 적용하였으며, 이는 HLA-C3-Mix 및 HLA-C4-Mix로서 명명하였다. 200ul를 HLA-C2-Mix, HLA-C3-Mix 및 HLA-C4-Mix 각각으로부터 취하고, 1.5ml EP 튜브 중에서 혼합하고, HLA-Mix로 명명하였다. HLA-Mix로부터의 500ul DNA 혼합물을 Qiagen DNA 정제 키트 (QIAGEN Co.)를 이용하여 컬럼정제하였다(구체적인 정제 단계들은, 제조자 설명서 참조). 정제에 의하여 수득된 200ul DNA가 50ng/ul의 HLA-Mix DNA 농도를 갖는다는 것을 Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific Co.)에 의하여 결정하였다.
4. Illumina GA PCR-자유 서열화 라이브러리들의 구축
4.1 PCR 생성물들의 전단
정제된 HLA-Mix로부터 취한 총 량 5ug의 DNA를 AFA 섬유 및 스냅식 뚜껑을 갖는 Covaris 마이크로관 안에 담고, Covaris S2 (Covaris Co.) 내에서 전단시켰다. 상기 전단 조건은 다음과 같았다:
주파수 스위핑
| 사용율 | 10% |
| 강도 | 3 |
| 사이클들/버스트 | 200 |
| 시간 (초) | 180 |
4.2 전단된 PCR 생성물들의 정제
HLA-Mix의 모든 전단 생성물들을 회수하고, QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였으며, 각각 37.5ul EB (QIAGEN 용리 버퍼) 중에 용해시켰다.
4.3 말단 복구 반응
상기 정제된 생성물들을 DNA 말단 복구 반응시켰으며, 반응 시스템들은 다음과 같았다 (모든 약제들은 Enzymatics Co.으로부터 구매하였다):
| 이전 단계에서 정제된 생성물들 | 37.5μL |
| 10x 폴리뉴클레오티드 키나아제 버퍼 (B904) | 5μL |
| dNTP 혼합물 (용액 세트 (각 10mM)) | 2μL |
| T4 DNA 폴리머라아제 | 2.5μL |
| Klenow 단편 | 0.5μL |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 | 2.5μL |
| 총 부피 | 50μL |
반응 조건: Thermomixer (Thermomixer, Eppendorf Co.) 중 20℃에서 30분 동안 인큐베이션.
반응 생성물들을 회수하여 QIAquick PCR 정제 키트로 정제하고, 32㎕ EB (QIAGEN 용리 버퍼) 중에 용해시켰다.
4.4 3' 말단에서 A의 첨가
이전 단계에서 회수된 DNA의 3' 말단에 A를 첨가하였으며, 반응 시스템은 하기와 같았다 (모든 약제들은 Enzymatics Co.로부터 구매하였다):
| 이전 단계에서 수득된 DNA | 32μL |
| 10x 블루 버퍼 | 5μL |
| dATP (1mM, GE Co.) | 10μL |
| Klenow (3'-5'엑소-) | 3μL |
| 총 부피 | 50μL |
반응 조건: Thermomixer (Thermomixer, Eppendorf Co.) 중 37℃에서 30분 동안 인큐베이션.
반응 생성물들을 회수하고 MiniElute PCR 정제 키트 (QIAGEN Co.)로 정제하고, 38㎕ EB (QIAGEN 용리 버퍼) 중에 용해시켰다.
4.5 Illumina GA PCR-자유 라이브러리 어댑터의 결찰
부가된 A를 갖는 생성물들을 Illumina GA PCR-자유 라이브러리 어댑터들에 결찰하였으며, 반응 시스템은 다음과 같았다 (모든 약제들은 Illumina Co.로부터 구매하였다):
| 이전 단계에서 수득된 DNA | 38μL |
| 10x 결찰 버퍼 | 5μL |
| PCR-자유 어댑터 올리고 믹스 (30mM) | 2μL |
| T4 DNA 리가아제 (신속, L603-HC-L) | 5μL |
| 총 부피 | 50μL |
반응 조건: Thermomixer (Thermomixer, Eppendorf Co.) 중 16℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션.
반응 생성물들을 Ampure Beads (Beckman Coulter Genomics)로 정제하고, 50ul 탈이온수 중에 용해시켰으며, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의해 결정된 DNA 농도는 다음과 같았다:
| qPCR (nM)에 의하여 결정된 결과 | |
| HLA-Mix | 122.71 |
4.6 겔 슬라이싱에 의한 회수
30μL HLA-Mix를 2% 저용융점 아가로오스 겔 전기영동시켰다. 전기영동 조건은 100V, 100분이었다. DNA 마커는 NEB Co.로부터의 50bp DNA Ladder 였다. 400bp 내지 750bp의 범위의 DNA 단편들을 포함하는 겔을 슬라이스하였다 (도 7). 슬라이스된 겔 중 생성물들을 회수하고, QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN Co.)에 의하여 정제하고, 정제 후 부피는 32ul이었으며, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의하여 측정된 DNA 농도는 17.16nM이었다.
5. Illumina GA 서열화
QPCR의 검출 결과들에 따라, 10pmol DNA를 취하여 Illumina GA PE-100 프로그램에 의하여 서열화하였다. 구체적인 조작 절차는, Illumina GA 조작 설명서 (Illumina GA IIx) 참조.
6. 결과들의 분석
Illumina GA로부터의 서열화 결과들은 일련의 DNA 서열들로, 상기 서열 결과물들에서 순방향 및 역방향 프라이머 인덱스 서열들 및 프라이머 서열들을 조사하므로써, 개별적인 프라이머 인덱스에 대응하는 각 샘플에 대한 HLA-C의 각종 엑손의 PCR 생성물들의 서열화 결과들을 포함하는 데이터베이스들을 구축하였다. 각 엑손의 서열화 결과들을 BWA (Burrows-Wheeler Aligner)에 의한 대응 엑손의 참고 서열 (참고 서열들은 http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ 참조)에 대하여 배열하고, 각 데이터베이스의 컨센서스 서열들을 구축하였으며; 염기 서열화의 성질 값, 및 서열 판독값들과 컨센서스 서열들 간의 차이에 근거하여 서열 판독값들을 선택 및 수정하였다. 수정된 DNA 서열들을, 서열 중복 및 연결(페어드-엔드 연결) 관계에 기초하여 HLA-C의 엑손의 대응 서열들로 어셈블리하였다. 도 8의 스크린-캡쳐는 샘플 번호 2의 HLA-C 자리의 엑손 2의 컨센서스 서열의 구축물에 대한 절차를 예시한다.
결과의 DNA 서열은 IMGT HLA 전문 데이터베이스에서 HLA-C의 대응 엑손의 서열 데이터베이스를 이용하여 배열되었다. 서열 배열 결과가 100% 일치를 나타내면, 대응 샘플의 HLA-C 유전형이 결정되었다. 모든 95개 샘플들에서, 상기 방법에 의하여 수득된 타입화 결과들이 알려진 타입화 결과들과 완전히 일치하였으며, 여기에서 샘플 번호 1~32의 타입화 결과들은 다음과 같았다: (표 26에 나타낸 것과 같으며, 모든 수득된 결과들은 본래 알려진 결과들과 동일하였다).
주: HLA-C 유형들 중, C*0303은 C*0320N일 가능성이 배제되지 않으며, C*0401은 C*0409N/0430일 가능성이 배제되지 않고, C*0702는 C*0750일 가능성이 배제되지 않으며, C*0801은 C*0822일 가능성이 배제되지 않고, C*1505는 C*1529일 가능성이 배제되지 않으며, 상기 대립유전자들은 HLA-C의 엑손 2, 3, 4의 서열들에서 완전히 동일하였기 때문이다.
실시예
9:
생어
서열화 방법에 의한
HLA
-C
제노타이핑
1. 샘플 DNA 추출
실시예 1에서 설명된 것과 같이, KingFisher 자동추출기를 이용하여, 알려진 HLA 유전형들을 이용하여 95개 샘플들 중 26개로부터 DNAs를 추출하였다.
2. PCR 증폭
KingFisher 자동추출기를 이용하여 추출된 상기 DNAs를 주형으로서 사용하고, PCR 프라이머들 C-F2/C-R2, C-F3/C-R3, C-F4/C-R4 (표 3)의 3 쌍을 각각 이용하여 단일한 관들 중에서 PCR 증폭을 실시하였다. 프라이머들의 각 쌍에 대한 상기 PCR 절차는 다음과 같았다:
C2: 96℃ 2분
95℃ 30초→62℃ 30초→72℃ 20초 (35 사이클들)
15℃ ∞
C3: 96℃ 2분
95℃ 30초→56℃ 30초→72℃ 20초 (35 사이클들)
15℃ ∞
C4: 96℃ 2분
95℃ 30초→60℃ 30초→72℃ 20초 (35 사이클들)
15℃ ∞
HLA-C의 PCR 반응 시스템은 다음과 같았다:
| Promega 5×버퍼 I (Mg2+ 추가) | 5.0μL |
| dNTP 혼합물 (각각 2.5mM) | 2.0μL |
| 프라이머 믹스 (50ng/μL) | 3.0μL |
| Promega Taq (5 U/μL) | 0.2μL |
| DNA (약 20ng/μL) | 2.0μL |
| ddH2O | 12.8μL |
| 총 계 | 25.0μL |
PCR 생성물들을 정제 전에, 아가로오스 전기영동시켰다(도 9).
3. PCR 생성물들의 정제
Millipore 정제 플레이트들을 이용하여 PCR 생성물들을 정제하였다. 주요 단계들은 다음과 같았다. 사용될 웰들을 PCR 생성물들용 96-웰 정제 플레이트 중에서 마커펜으로 표시하였으며, 50μl 초순수를 사용될 각 웰들에 첨가하였다. 나머지 웰들은 밀봉 필름으로 밀봉하였다. 플레이트를 15분 동안 정치시키거나, 또는 인출 여과 시스템(-10 pa)에 5분 동안 연결하였다. 정제 플레이트를 상기 인출 여과 시스템으로부터 취하였을 때, 정제 플레이트의 바닥에서 배출구에서의 액체를 흡수지를 이용하여 흡수시켰다.
정제될 PCR 생성물들을 4000rpm에서 1분 동안 원심분리하고; 정제될 PCR 생성물들을 위한 커버 또는 실리카 겔 패드를 제거하고, 100㎕ 초순수를 각 PCR 반응 시스템에 첨가하였다. 그 후, 정제될 PCR 생성물들이 첨가되는 정제 플레이트를 상기 인출 여과 시스템에 연결하고, 진공도를 기압계에 나타낸 것과 같이 -10 pa로 조정하였다. 정제 플레이트의 바닥에서 미세다공성의 재생가능성 셀룰로오스 필름 상에 어떤 액체도 남지 않을 때까지 상기 인출 및 여과를 계속하였으며, 빛 아래에서 관찰할 때 온전한 액체 표면의 반사광택이 발견되지 않았다.
정제될 PCR 생성물들을 포함하는 웰들에서, 50μl 초순수 또는 TE를 미세다공성 셀룰로오스 필름에 첨가하고; 정제 플레이트를 실온에서 미세 진동기 중에서 5분 동안 진동시켰고; 대응 웰들에 담긴 전체 액체들을 새로운 96-웰 PCR 플레이트의 대응 웰들로 이동시켰다.
4. 서열화 반응의 수행 및 서열화 반응의 생성물들의 정제
상기 정제된 PCR 생성물들을 서열화 반응을 위한 주형들로서 사용하였다.
서열화 반응용 조건
96℃ 2 분
96℃ 10초→55℃ 5초→60℃ 2분 (25 사이클들)
15℃ ∞
서열화 반응을 위한 시스템은 다음과 같았다:
| 정제된 PCR 생성물들 | 1μL |
| 프라이머들 (3.2pmol/l) | 1μL |
| 2.5*Bigdye | 0.3μL |
| 5*버퍼 | 0.85μL |
| 물 | 1.85μL |
| 총 부피 | 5μL |
서열 반응의 생성물들을 다음 단계들에 의하여 정제하였다: 서열화 반응 플레이트를 균형을 맞추고, 3000g에서 1분 동안 원심분리하였다. 96-웰 플레이트에서, 각 5μL 반응 시스템에, 2μL 0.125 mol/L EDTA-Na2 용액, 33μL 85% 에탄올을 첨가하고, 플레이트를 실리카겔 패드로 덮고 3분 동안 충분히 진동시켰다. 그 후 플레이트를 4℃, 3000g에서 30분동안 원심분리하였다. 원심분리 후 서열화 플레이트를 꺼내고, 실리카 겔 패드를 제거하고, 서열화 플레이트를 흡수지 상에 아래쪽을 향해 놓은 후, 원심력이 185g에 도달할 때까지 역 원심분리하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에, 50μl 70% 에탄올을 첨가하였다. 플레이트를 실리카 겔 패드로 덮고, 1.5분 진동시키고, 4℃, 3000g에서 15분 동안 원심분리하였다. 에탄올 냄새가 느껴지지 않을 때까지 공기 건조시키기 위하여 서열화 반응 플레이트를 그 후 어둡고 통풍이 잘되는 장소에 30분 동안 놓았다. 96-웰 플레이트의 각 웰에, 10 μL HI-DI 포름아미드를 첨가하고(대안적으로, 384-웰 플레이트의 각 웰에, 8μL를 첨가), 그 후 플레이트를 밀봉 필름으로 덮고, 5초 동안 진동 후 1000rpm으로 원심분리하였다.
5. 서열화 및 결과 분석
서열화 반응의 정제 생성물들을 ABI 3730XL에서 모세관 전기영동 서열화하였다. 서열화 피크들을 uType 소프트웨어(Invitrogen)를 이용하여 분석하여 HLA 타입화 결과들을 수득하였다 (도 10). 상기 방법에 의하여 수득된 모든 결과들은 본래 알려진 결과들과 동일하였으며, 이는 표 29에 나타낸 바와 같았다.
실시예
10: 제 2 세대 서열화 기술 (
Illumina
Solexa
)을 이용한
HLA
-
DQB1
제노타이핑
알려진 HLA-SBT 타입화 결과들을 갖는 94개의 혈액 샘플들을, 아래 내용을 제외하고, 실시예 8에 기재된 것과 같은 방법들에 따라 HLA-DQB1 제노타이핑하였다.
94세트들의 PCR 인덱스 프라이머들을 이용하여 94개의 DNA 샘플들을 각각 증폭하였으며, 여기에서 PCR 인덱스 프라이머들의 각 세트는 HLA-DQB1의 엑손 2 또는 3의 증폭을 위한 PCR 프라이머들(표 5) 및 한 쌍의 양방향성 프라이머 인덱스들 (상기 기재된 것과 같음)로 이루어졌으며, 각 순방향 PCR 프라이머는 5' 말단에서 연결된 프라이머 인덱스들의 쌍의 순방향 프라이머 인덱스를 갖고, 역방향 PCR프라이머는 5' 말단에서 연결된 프라이머 인덱스들의 쌍의 역방향 프라이머 인덱스를 갖는다. 프라이머들의 합성 동안, 상기 프라이머 인덱스들은 PCR 프라이머들의 5'말단에 직접 첨가되었으며, 여기에서 프라이머들은 Shanghai Invitrogen Co.에 의하여 합성되었다.
샘플 추출 단계에서 수득된 94 DNA들을 1~94로서 명명하였다. PCR 반응은 96-웰 플레이트들에서 실시하였으며, 각 샘플 중 DQB1의 엑손 2, 3을 동일한 웰에서 증폭하였다. 어떤 주형도 첨가하지 않은 2개의 음성 대조구들을 각 플레이트에 놓았으며, 음성 대조구들에 사용되는 프라이머 인덱스들은 PI-95 및 PI-96이다. 실험 동안, 프라이머 인덱스들의 각 쌍에 대응하는 샘플의 번호매김 정보를 기록하였다.
사용된 프라이머 인덱스들은 표 6에 열거된 것과 같은 프라이머 인덱스들 PI-1 내지 PI-94이고, 음성 대조구들에 대해서는 하기 프라이머 인덱스들 PI-95 및 PI-96 (표 30)이다.
HLA-DQB1에 대한 PCR 절차는 하기와 같았다:
96℃ 2분
95℃ 30초→60℃ 30초→72℃ 20초 (32 사이클들)
15℃ ∞
HLA-DQB1을 위한 PCR 반응 시스템은 다음과 같았다:
| Promega 5× 버퍼 I (Mg2+ 추가) | 5.0 ul |
| dNTP 혼합물 (각각 2.5mM) | 2.0 ul |
| PInf-Q-F2 (2pmol/ul) | 1.0 ul |
| PInf-Q-R2 (2pmol/ul) | 1.0 ul |
| PInf-Q-F3 (2pmol/ul) | 1.0 ul |
| PInf-Q-R3 (2pmol/ul) | 1.0 ul |
| Promega Taq (5U/ul) | 0.2 ul |
| DNA (약 20ng/ul) | 5.0 ul |
| ddH2O | 8.8 ul |
| 총 계 | 25.0 ul |
여기에서, PInf-Q-F2/3는 5' 말단에서 번호 n (표 1)의 순방향 프라이머 인덱스 서열을 갖는 HLA-DQB1의 F 프라이머를 나타내고; PInf-Q-R 2/3는 5' 말단에서 번호 n(여기에서 n≤96)의 역방향 프라이머 인덱스 서열을 갖는 HLA-DQB1의 R 프라이머를 나타내고; 나머지는 유사하게 유추될 수 있다. 또한, 각 샘플은 PCR 프라이머들의 특이적 세트에 대응한다.
Bio-Rad Co.로부터의 PTC-200 PCR 장치에서 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응 후, 2ul PCR 생성물들을 1.5% 아가로오스 겔 전기영동시켰다. 도 11은 94개 샘플들의 HLA-DQB1의 엑손 2+3의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 나타내고, DNA 분자 마커는 DL 2000 (Takara Co.)이었다.
PCR 생성물들의 풀화 및 정제
20μl의 나머지 PCR 생성물들을 96-웰 플레이트 HLA-P-DQB1의 각 웰로부터 취하고 (음성 대조구 제외), 3ml EP 튜브 중에서 균질하게 혼합하였다 (HLA-Q-Mix로서 명명). HLA-Q-Mix로부터의 500ul DNA 혼합물을 Qiagen DNA 정제 키트 (QIAGEN Co.)를 이용하여 컬럼정제하였다 (구체적인 정제 단계는, 제조자 설명서 참조). 정제에 의하여 수득된 200ul DNA가 48ng/ul의 HLA-Q-Mix DNA 농도를 갖는다는 것을 Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific Co.)에 의하여 결정하였다.
전단 조건은 다음과 같았다:
주파수 스위핑
| 사용율 | 10% |
| 강도 | 5 |
| 사이클들/버스트 | 200 |
| 시간 (초) | 300 |
반응 생성물들을 말단 회복 반응시키고, 그 후 QIAquick PCR 정제 키트에 의하여 회수 및 정제하였고, 34ul EB (QIAGEN 용리 버퍼)에 용해시켰다.
반응 생성물들에 대해 3' 말단에서 A를 첨가하고, 그 후 MiniElute PCR 정제 키트 (QIAGEN Co.)에 의하여 회수 및 정제하였으며, 이를 13㎕ EB 용액 (QIAGEN 용리 버퍼) 중에 용해시켰다.
라이브러리 어댑터들의 결찰 후, 반응 생성물들을 Ampure Beads (Beckman Coulter Genomics)로 정제하고, 50μl 탈이온수 중에 용해시켰으며, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의해 결정된 DNA 농도는 다음과 같았다:
| qPCR에 의해 결정된 결과(nM) | |
| HLA-Q-Mix | 115.3 |
350bp 내지 550bp 범위의 DNA 단편들을 포함하는 겔을 슬라이스하였다(도 12). 겔로부터 생성물들을 정제 및 회수한 후, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의해 결정된 DNA 농도는 18.83nM이었다.
결과들의 분석
Illumina GA로부터의 서열화 결과들은 일련의 DNA 서열들이었으며, 서열화 결과들 중에서 순방향 및 역방향 프라이머 인덱스 서열들 및 프라이머 서열들을 조사하므로써, 개별적인 프라이머 인덱스에 대응하는 각 샘플에 대한 HLA-DQB1의 각종 엑손들의 PCR 생성물들의 서열화 결과들을 포함하는 데이터베이스들을 구축하였다. 각 엑손의 서열화 결과들을 BWA (Burrows-Wheeler Aligner)에 의하여 대응 엑손의 참조 서열에 대하여 배열하고 (참조 서열들은 http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ 참조), 각 데이터베이스의 컨센서스 서열들을 구축하고, 염기 서열화의 성질 값, 및 서열 판독값들과 컨센서스 서열들간의 차이에 근거하여, 서열 판독값들을 선택 및 수정하였다. 수정된 DNA 서열들을, 서열 중복 및 연결 (페어드-엔드 연결) 관계에 근거하여 HLA-DQB1의 엑손 2, 3의 대응 서열들로 어셈블리하였다. 도 13의 스크린-캡쳐는 샘플 번호 7에서 HLA-DQB1 자리의 엑손 2, 3의 컨센서스 서열의 구축을 위한 절차를 예시한다.
HLA-DQB1의 엑손 2, 3에 대한 결과의 DNA 서열을 IMGT HLA 전문 데이터베이스에서 HLA-DQB1의 대응 엑손의 서열 데이터베이스를 이용하여 배열하였다. 서열 배열의 결과가 100% 일치하면, 대응 샘플의 HLA-DQB1 유전형이 결정된다.
모든 94개 샘플들에 대하여, 상기 방법에 의하여 수득된 타입화 결과들은 본래 알려진 타입화 결과들에 완전히 일치하였으며, 여기에서 샘플 번호 1~32의 결과들은 표 34와 같았다:
실시예 11: 생어 서열화 방법에 의한 HLA-DQB1 제노타이핑
1. 샘플 DNA 추출
실시예 1에서 설명된 것과 같이, KingFisher 자동추출기를 이용하여, 알려진 HLA 유전형들을 이용하여 94개 샘플들 중 20개로부터 DNAs를 추출하였다.
2. PCR 증폭
KingFisher 자동추출기를 이용하여 추출된 상기 DNA들을 주형으로서 사용하였으며, 단일한 관들에서 표 5에 열거한 것과 같은 PCR 프라이머들 (Q-F2와 Q-R2, Q-F3와 Q-R3)을 각각 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 프라이머들의 각 쌍에 대한 PCR 절차는 다음과 같았다:
96℃ 2분
95℃ 30초→56℃ 30초→72℃ 20초 (35 사이클들)
15℃ ∞
HLA-Q에 대한 PCR 반응 시스템은 다음과 같았다:
| Promega 5× 버퍼 I (Mg2+ 추가) | 5.0 μL |
| dNTP 혼합물 (각각 2.5mM) | 2.0 μL |
| 프라이머 혼합물 (25 ng/μL) | 3.0 μL |
| Promega Taq (5 U/μL) | 0.2 μL |
| DNA (약 20 ng/μL) | 2.0 μL |
| ddH2O | 12.8 μL |
| 총 계 | 25.0 μL |
PCR 생성물들을 정제 전에 아가로오스 겔 전기영동시켰다.
3. PCR 생성물들의 정제
방법 및 단계들은 실시예 9에서 설명된 것과 동일하였다.
4. 서열화 반응의 수행 및 서열화 반응의 생성물들의 정제
방법 및 단계들은 실시예 9에서 설명된 것과 동일하였다.
5. 서열화 및 결과 분석
서열화 반응의 정제된 생성물들을 ABI 3730XL에서 모세관 전기영동 서열화하였다. 서열화 피크들을 uType 소프트웨어 (Invitrogen)로 분석하여 HLA 타입화 결과들을 수득하였다 (도 15). 상기 방법에 의해 수득된 모든 결과들은 본래의 알려진 결과들과 동일하였으며, 이는 표 36에 나타낸 바와 같다.
실시예
12:
950개 샘플들
중
HLA
-A/B/C의 엑손 2, 3, 4 및
HLA
-
DQB1
의 엑손 2, 3의
제노타이핑
본 실시예에서, 950개 샘플들 중 HLA-A/B/C의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DQB1의 엑손 2, 3을 프라이머 인덱스들, DNA 불완전 전단 전략, 라이브러리 인덱스들, PCR-자유 라이브러리들 제조, 및 Illumia GA 페어드-엔드 100 서열화 기술 (300bp 내지 500bp 범위의 길이를 갖는 PCR 생성물들)의 조합을 이용하여 제노타입화하여, 본 발명의 방법이 서열분석기의 최대 판독값 길이를 초과하는 길이의 유전자 단편들의 제노타이핑을 달성할 수 있음을 증명하였으며, 또한 본 발명이 저비용, 고처리량, 높은 정확성 및 높은 해상능으로 HLA 제노타이핑을 달성할 수 있다는 것도 증명하였다.
원리: 분석될 샘플들을 10개의 군으로 나누었다; 각 군의 샘플들에 대하여, 프라이머 인덱스들을, PCR 반응에 의하여 HLA-A/B/C의 엑손 2, 3, 4 및 HLA-DQB1의 엑손 2, 3의 PCR 생성물들의 2개의 말단에 도입하여, 상기 PCR 생성물들의 샘플 정보를 특이적으로 표지하였다. 샘플들의 각 군에서 4개의 자리들 (HLA-A/B/C/DQB1)의 PCR 증폭 생성물들을 함께 혼합하여 PCR 생성물들의 라이브러리를 수득하였다; PCR 생성물들의 라이브러리들의 불완전 초음파 전단 후, 인덱스화된 PCR-자유 서열화 라이브러리들을 구축하였다 (여기에서 각 샘플 군의 PCR 생성물 라이브러리에 대하여 상이한 어댑터가 사용되었으며, 이에 의하여 10개의 인덱스화된 서열화 라이브러리들이 구축된다). 10개의 인덱스화된 서열화 라이브러리들을 균등 몰 량으로 함께 풀화하여 혼합된 인덱스 서열화 라이브러리를 구축하였다. 혼합된 인덱스 서열화 라이브러리를 2% 저용융점 아가로오스 겔 전기영동시키고, 450bp 내지 750bp 범위의 길이의 모든 DNA 밴드들을 겔 슬라이싱에 의하여 회수 및 정제하였다. 회수된 DNA를 Illumina GA PE-100 방법에 의하여 서열화하였다. 모든 시험된 샘플들의 서열 정보는 프라이머 인덱스 서열들 및 라이브러리 인덱스 서열들에 의하여 추적할 수 있으며, 전체 PCR 생성물의 서열은 알려진 참조 서열들 및 DNA 단편들의 서열들간의 중복 및 연결 관계에 근거하여 어셈블리될 수 있다. 본래 PCR 생성물의 완전한 서열은 HLA-A/B/C/DQB1의 대응 엑손의 표준 데이터베이스에 따라 배열될 수 있으며, 이에 따라 HLA-A/B/C/DQB1 제노타이핑이 달성된다.
1. 샘플 추출
알려진 HLA-SBT 타입화 결과들 (중국 골수 공여자 프로그램, 이하 (CMDP)로 언급됨)로, KingFisher 자동추출기(US Thermo Co.)를 이용하여, 950개 혈액 샘플들로부터 DNA들을 추출하였다. 과정은 실시예 1에 설명된 것과 동일하였다.
2. PCR 증폭
샘플 추출 단계로부터 수득된 950개의 DNA들을 번호 1~950으로 명명하고, 10개의 군으로 나누어 (각 군에 대하여 95 DNA들), 이들을 HLA-1, HLA-2, HLA-3, HLA-4, HLA-5, HLA-6, HLA-7, HLA-8, HLA-9, HLA-10으로 명명하였다. 샘플들의 각 군에 대하여, 각각 HLA-A/B의 엑손 2, 3, 4의 증폭 (표 2), HLA-C의 엑손 2, 3, 4의 증폭 (표 4), 및 HLA-DQB1의 엑손 2, 3의 증폭 (표 5)을 위한 양방향성 프라이머 인덱스들 (표 6)을 갖는 95 세트들의 PCR 프라이머들에 의하여, 95개 DNA 샘플들을 증폭시켰다. PCR 반응은 96-웰 플레이트들에서, 총 100개의 플레이트들을 이용하여 수행되었으며, 이들은 HLA-X-P-A2, HLA-X-P-A3, HLA-X-P-A4, HLA-X-P-B2, HLA-X-P-B3, HLA-X-P-B4, HLA-X-P-C2, HLA-X-P-C3, HLA-X-P-C4 및 HLA-X-P-DQB1 ("X"는 그룹 번호 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 정보를 나타내고, "A2/3/4", "B2/3/4", "C2/3/4", "DQB1"는 증폭 자리들을 나타낸다)로 명명되고, 여기에서 어떤 주형도 첨가되지 않은 음성 대조구를 각 플레이트에 설정하였으며, 상기 음성 대조구에 대하여 사용된 프라이머들은 PI-1 (표 6)에 의하여 라벨된 프라이머들이었다. 실험 동안, 그룹 번호 및 프라이머 인덱스에 대한 각 샘플의 정보를 기록하였다. 예로서, 프라이머 인덱스들 PI-1 및 PI-2에 대한 관련 정보는 다음과 같았으며, 나머지는 유사하게 유추될 수 있다.
HLA-A/B/C에 대한 PCR 절차 및 PCR 반응 시스템은 실시예 2에 기재된 것과 동일하였다. HLA-A/B의 대응 엑손의 증폭을 위한 PCR 프라이머들은 표 2에 나타내었으며, HLA-C의 대응 엑손의 증폭을 위한 PCR 프라이머들을 표 4에 나타내었다.
HLA-DQB1에 대한 PCR 절차는 다음과 같았다.
96℃ 2분
95℃ 30초→55℃ 30초→72℃ 20초 (32 사이클들)
15℃ ∞
HLA-DQB1을 위한 다중 PCR 반응 시스템(엑손 2, 3의 동시 증폭)은 실시예 10에 기재된 것과 동일하며, HLA-DQB1의 대응 엑손의 증폭을 위한 PCR 프라이머들은 표 5에 나타낸 것과 같았다.
여기에서, PInf-A/B/C-F2/3/4 및 PInf-Q-F2/F3은 5' 말단에서 순방향 프라이머 인덱스 서열 번호 n을 갖는 HLA-A/B/C/DQB1의 F 프라이머들 (표 6)을 나타내고, PInr-A/B/C-R2/3/4 및 PInr-Q-R2/R3은 5' 말단에서 역방향 프라이머 인덱스 서열 번호 n을 갖는 (여기에서 n≤95) HLA-A/B/C/DQB1의 R 프라이머들을 나타내고, 나머지는 유사하게 유추될 수 있다. 또한, 각 샘플은 특정 세트의 PCR 프라이머들 (PInf-A/B/C-F2/3/4, PInr-A/B/C-R2/3/4, PInf-Q-F2/F3, PInr-Q-R2/R3)에 대응한다.
Bio-Rad Co.로부터의 PTC-200 PCR 장치에서 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응 후, 3ul PCR 생성물들을 2% 아가로오스 겔 전기영동시켰다. 도 16은 샘플 번호 1의 HLA-A/B/C/DQB1의 대응 엑손의 PCR 생성물들의 전기영동 결과를 보여주며, DNA 분자 마커는 DL 2000 (Takara Co.)이었다. 전기이동도에서 300bp 내지 500bp 범위의 길이의 일련의 단일 밴드들이 있었으며, 이는 샘플 번호 1의 HLA-A/B/C/DQB1의 엑손 (A2, A3, A4, B2, B3, B4, C2, C3, C4, DRB1)의 성공적인 PCR 증폭을 나타낸다. 음성 대조구에서는 증폭 밴드가 없었다 (N). 다른 샘플들의 결과들은 유사하였다.
3. PCR 생성물들의 풀화 및 정제
그룹 X ("X"는 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10)의 샘플들에 대하여, 20㎕의 나머지 PCR 생성물들을 96-웰 플레이트 HLA-X-P-A2 (음성 대조구 제외)의 각 웰로부터 취하여, 3ml EP 튜브 중 진탕 하에 균질하게 혼합하였다(HLA-X-A2-Mix로 명명). 동일한 조작을 그룹 X의 샘플들의 다른 9개의 96-웰 플레이트들에 적용하였으며, 이들을 HLA-X-A3-Mix, HLA-X-A4-Mix, HLA-X-B2-Mix, HLA-X-B3-Mix, HLA-X-B4-Mix, HLA-X-C2-Mix, HLA-X-C3-Mix, HLA-X-C4-Mix 및 HLA-X-DQB1-Mix로서 명명하였다. 200ul를 각 HLA-X-A2-Mix, HLA-X-A3-Mix, HLA-X-A4-Mix, HLA-X-B2-Mix, HLA-X-B3-Mix, HLA-X-B4-Mix, HLA-X-C2-Mix, HLA-X-C3-Mix, HLA-X-C4-Mix, 및 HLA-X-DQB1-Mix로부터 취하여, 3ml EP 튜브 중에 혼합하고, HLA-X-Mix로서 명명하였다. HLA-X-Mix로부터의 500ul DNA 혼합물을 Qiagen DNA 정제 키트 (QIAGEN Co.)로 컬럼 정제하여 (구체적인 정제 단계들에 대해서는, 제조자 지시사항 참조) 200ul의 정제 DNA를 수득하였으며, 그의 DNA 농도는 Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific Co.)에 의하여 결정하였다. 동일한 조작을 다른 9개 군들의 샘플들에 적용하였다. 최종적으로 결정된 샘플들의 10개 군들의 DNA 농도들은 다음과 같았다.
| HLA-1-Mix | HLA-2-Mix | HLA-3-Mix | HLA-4-Mix | HLA-5-Mix | HLA-6-Mix | HLA-7-Mix | HLA-8-Mix | HLA-9-Mix | HLA-10-Mix | |
| 농도 (ng/ul) | 53.1 | 52.3 | 56.1 | 57.2 | 50.5 | 55.7 | 54.2 | 58.6 | 53.9 | 54.8 |
4. Illumina GA 서열화 라이브러리들의 구축
실시예 4에 설명된 것과 같이, 정제된 HLA-X-Mix로부터 취한 총량 5ug의 DNA를 DNA 전단, 전단 후 정제, 말단 복구 반응, 3' 말단에서 A의 부가 및 Illumina GA PCR-자유 라이브러리 어댑터의 결찰에 적용시켰다.
샘플 그룹들 및 라이브러리 어댑터들간의 대응 관계는 다음과 같았다.
| 샘플 그룹 번호 | HLA-1 | HLA-2 | HLA-3 | HLA-4 | HLA-5 | HLA-6 | HLA-7 | HLA-8 | HLA-9 | HLA-10 |
| 라이브러리 어댑터 번호 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
수득된 반응 생성물들을 Ampure 비즈 (Beckman Coulter Genomics)에 의하여 정제하고, 50ul 탈이온수 중에 용해시키고, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의해 결정된 DNA 농도는 다음과 같았다:
| HLA-1-Mix | HLA-2-Mix | HLA-3-Mix | HLA-4-Mix | HLA-5-Mix | HLA-6-Mix | HLA-7-Mix | HLA-8-Mix | HLA-9-Mix | HLA-10-Mix | |
| 농도/nM | 86.60 | 78.21 | 54.56 | 87.35 | 84.37 | 85.09 | 96.21 | 85.81 | 88.14 | 88.26 |
6. 겔 슬라이싱에 의한 회수
HLA-1-Mix, HLA-2-Mix, HLA-3-Mix, HLA-4-Mix, HLA-5-Mix, HLA-6-Mix, HLA-7-Mix, HLA-8-Mix, HLA-9-Mix 및 HLA-10-Mix를 균등 몰 량으로 혼합하고 (최종 농도 70.86nM/ul), HLA-Mix-10으로서 명명하였다. 30μL HLA-Mix-10을 2% 저용융점 아가로오스 겔 전기영동시켰다. 전기영동 조건은 100V, 100분이었다. DNA 마커는 NEB Co.로부터의 50bp DNA 마커였다. 450bp 내지 750bp의 범위의 DNA 단편들을 포함하는 겔을 슬라이스하였다 (도 17). 슬라이스된 겔에서 생성물들을 QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN Co.)에 의하여 회수 및 정제하였으며, 정제 후 부피는 32ul였으며, 형광 정량 PCR (QPCR)에 의해 측정된 DNA 농도는 10.25nM이었다.
5．Illumina GA 서열화 및 결과 분석
서열화 및 결과 분석은 실시예 5 및 6에 설명된 것과 같은 방법에 따라 실시하였다.
각 프라이머 인덱스에 대응하는 각 샘플에 대한 HLA-A/B/C/DQB1의 각종 엑손의 PCR 생성물들의 서열화 결과들을 포함한 데이터베이스들을 구축하였다. 결과의 DNA 서열을 IMGT HLA 전문 데이터베이스에서 HLA-A/B/C/DQB1의 대응 엑손의 서열 데이터베이스를 이용하여 배열하였다. 서열 배열 결과가 100% 일치를 나타내는 경우, 대응 샘플의 HLA-A/B/C/DQB1 유전형이 결정되었다. 도 18에 나타낸 것과 같은, 샘플 번호 1에서 HLA-C 자리의 엑손 2의 컨센서스 서열의 구축을 위한 프로그램의 스크린-캡쳐 참조. 모든 950개 샘플들의 경우, 상기 방법에 의한 타입화 결과들은 본래 알려진 타입화 결과들과 완전히 일치하였으며, 여기에서 샘플 번호 1~32의 결과들은 다음과 같았다:
주: 엑손 2, 3, 4 of HLA-A/B/C의 엑손 2, 3, 4의 서열들이 완전히 동일한 경우, 일반 유형이 선택되었다.
알려진 HLA-SBT 타입화 결과들을 갖는 950개의 샘플들을, 본 발명의 전략에 의하여 HLA-A/B/C/DQB1 자리들의 제노타이핑에 투입하였으며, 그 결과들은 본 발명의 전략에 의해 수득된 타입화 결과들이 본래 알려진 결과들과 완전히 일치하였음을 나타내었다.
본 발명의 구체예들은 이미 상세하게 설명되었지만, 개시된 것과 같은 모든 교시내용에 근거하여, 본 발명의 기술사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 각종 변경 및 치환이 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 본 발명의 범주는 첨부된 특허청구범위 및 그에 균등한 내용에 의하여 정의된다.
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<213> artificial
<220>
<223> primer index
<400> 205
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer index
<400> 206
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<212> DNA
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<223> primer index
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- 제1항에 있어서,
DNA 증폭, DNA 정제 또는 DNA 서열화를 위한 약제들을 더 포함하는 키트. - 삭제
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