CN112553313A - 用于Sanger法的测序反应产物的变性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法，所述方法包括：向96孔板中的用于Sanger测序技术的测序反应产物中加入去离子水或去离子甲酰胺，然后将96孔板置于振荡器上充分震荡，振荡后直接上机测序。本发明根据试剂HiDi的特性，利用实验室现有的仪器改为震荡后直接上机测序，减少了操作环节和高温导致的有害气体的产生，节省了操作时间以及不必要的人力物力的浪费。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法。
背景技术
测序技术是分子生物学最重要的检测手段，是基因多态性和基因突变检测的金标准，也是其他众多技术方法的参考标准。测序技术的优势在于，直接测定样本的基因序列，得到基因变异的精确情况，并且能够对某一段DNA序列进行多位点突变检测，或未知突变检测，广泛应用在肿瘤靶向药物个体化治疗检测、遗传疾病基因突变检测、血液病基因突变检测、HLA分型与配型、病原微生物耐药性检测等诸多领域。
第一代DNA测序技术是1975年由Sanger和Coulson开创的链终止法，或Maxam和Gilbert发明的化学法(链降解)。其中常用的Sanger测序(双脱氧末端终止法)的原理是将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这种PCR产物与普通PCR产物不同，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。它们具有共同的起始点，终止在不同的核苷酸上，每一个碱基都有相同的概率被终止。将不同大小的片段进行毛细管电泳，通过对荧光信号的采集和拼接，最终获得目的片段的序列。其特点是高读长；检测通量中等；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序，广泛应用于临床检测和科学研究。DNA变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变，上机测序需要保持片段是单链，否则将严重影响测序质量。
目前常用方法是将测序反应产物在95℃变性3min，然后冷却；需要使用PCR仪或者水浴锅和冰块，可能产生一些有害气体，需要耗费较多的时间成本及人力成本等。因此，亟需对现有测序反应产物的变性方法进行改良。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法，所述方法包括：向96孔板中的用于Sanger测序技术的测序反应产物中加入去离子水或去离子甲酰胺(HiDi)，然后将96孔板置于振荡器上充分震荡，振荡后直接上机测序。
前述的方法，按照DNA与去离子水或去离子甲酰胺16-300ng:10-30μL的比例，向96孔板的各孔中加入去离子水或去离子甲酰胺。
可以根据峰图的高低调整去离子水或去离子甲酰胺加入的量，10-30ulHiDi。一般地，扩增目的片段时人的DNA 16-100ng加入10μL HiDi。酶解纯化的PCR产物3μL(测序反应时取0.8μL的酶解产物测序)，只需加入10μL HiDi，峰高(信号值)即可维持在1000左右，峰高≥500RFU为合格，低于100RFU无法辨认序列中的碱基。
前述的方法，各孔中的DNA为经过纯化处理后自然晾干的DNA。
前述的方法，振荡器的设置如下：转速为780rpm左右，振幅为3mm左右，振荡时间为5min左右。
前述的方法，测序反应产物的大小为20-600bp(信号比较清晰，信号值平均在500RFU以上)。
优选地，所述DNA来自于人类。
高温+HiDi或者震荡+HiDi变性测序反应产物的原理示意图见图1。DNA变性的本质是双链间氢键断裂，变成单链。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
(一)避免使用PCR仪，节约能源。
(二)避免大量使用冰块。
(三)避免有毒气体可能的外泄(HiDi有神经毒，在高温条件下易挥发)。
(四)采用向测序反应产物中加去离子水或去离子甲酰胺进行震荡变性所达到的技术效果与高温变性冰浴基本相同。
(五)本发明不仅适用于Sanger法测序反应产物变性，还可应用于大片段产物的变性上机测序。
附图说明
图1为高温+HiDi或者震荡+HiDi变性测序反应产物的原理示意图。
图2为本发明震荡仪变性96孔板示意图，至少一次可以完成10板以上96孔板测序产物变性。
图3为双模块的PCR仪变性96孔板示意图，如10板变性，也需要5台PCR仪。
图4为水浴锅和冰盒变性96孔板示意图，最多放置8块96孔板高温变性，同时需要冰盒处理，人力需求量大。
图5为本发明较佳实施例中NUDT15基因(SNP 415CC型)PCR仪变性质量图(A)和震荡仪变性质量图(B)。同一NUDT15基因(SNP 415CC型)不同的变性方法上机测序，4种碱基的信号质量差不多。
图6为本发明较佳实施例中NUDT15基因(SNP 415CT型)PCR仪变性质量图(A)和震荡仪变性质量图(B)。同一NUDT15基因(SNP 415CT型)不同的变性方法上机测序，4种碱基的信号质量差不多。
图7为本发明较佳实施例中NUDT15基因(SNP 415TT型)PCR仪变性质量图(A)和震荡仪变性质量图(B)。同一NUDT15基因(SNP 415TT型)不同的变性方法上机测序，4种碱基的信号质量差不多。
图8为本发明较佳实施例中NUDT15基因(SNP 415CC型)PCR仪变性测序图(A)和震荡仪变性测序图(B)。同一NUDT15基因(SNP 415CC型)不同的变性方法上机测序，4种碱基的峰图高度差不多。
图9为本发明较佳实施例中NUDT15基因(SNP 415CT型)PCR仪变性测序图(A)和震荡仪变性测序图(B)。同一NUDT15基因(SNP 415CT型)不同的变性方法上机测序，4种碱基的峰图高度差不多。
图10为本发明较佳实施例中NUDT15基因(SNP 415TT型)PCR仪变性测序图(A)和震荡仪变性测序图(B)。同一NUDT15基因(SNP 415TT型)不同的变性方法上机测序，4种碱基的峰图高度差不多。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的振荡器购自Thermo Scientifi Co.,Ltd.，型号TITER PlateShaker，去离子甲酰胺(HiDi)购自Life Technologies。
测序反应产物的制备及纯化方法概述如下：
1、利用预先设计的用于扩增目的片段的引物，以人的基因组DNA为模板，在一定条件下进行PCR反应，扩增得到大量目的片段。
2、利用酶解去除步骤1中的引物和dNTP，便于后续测序产物的制备。
3、利用单链测序引物、buffer、BigDye和步骤2中的酶解产物得到不同大小的带ddNTP的单链DNA。
4、用125mM EDTA溶液、3M乙酸钠溶液(pH5.2)、75％乙醇去除步骤3中的杂质，得到纯度较高、不同大小的带ddNTP的单链DNA。
5、不同大小的带ddNTP的单链DNA之间可能会形成氢链，高温HiDi变性或者震荡HiDi变性都可以让其分开，便于后期的毛细管电泳。
实施例1用于Sanger法的测序反应产物的变性方法
针对现有技术中对基于Sanger法的测序反应产物先进行高温变性，再用冰浴冷却，需使用大量的PCR仪或水浴锅，浪费较多冰块，并且可能产生一些有害气体，花费较多时间和人力等缺点，本实施例根据试剂HiDi的特性，利用实验室现有的仪器改为震荡后直接上机测序，减少了操作环节和高温导致的有害气体的产生，节省了操作时间以及不必要的人力物力的浪费。具体方法如下：
向96孔板中的测序反应产物(自然晾干后每孔中DNA约30ng)中加入HiDi 10μL，然后将96孔板(可将多个96孔板垂直叠加，用橡皮筋固定后，水平放置在振荡器上)置于振荡器上充分震荡，振荡后直接上机测序。
如图2所示，HiDi可以与碱基间形成氢键，保持测序片段为单链。高温可以使双链片段之间的氢键充分打开与HiDi结合保持单链。而在振荡器上选择中间档位以上(保证96孔板不甩下来即可，如图中选择了7档)震荡5min，借助震荡和HiDi也可以让其保持单链。在振荡器上使用橡皮筋可以捆绑10板以上96孔板，相当于省去10台以上的PCR仪或水浴锅和大量冰块(图3和图4)，同时不会造成试剂HiDi大量挥发。仅利用振荡器的震荡效果就完成了纯化后的测序反应产物的变性，便于上机测序。
NUDT15基因(SNP 415CC型)、NUDT15基因(SNP 415CT型)、NUDT15基因(SNP 415TT型)测序反应产物的变性质量图分别见图5～图7，变性测序图分别见图8～图10。
PCR仪的设置如下：95℃3min，4℃∞。
振荡器的设置如下：转速780rpm，振幅3mm，振荡时间5min。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.用于Sanger法的测序反应产物的变性方法，其特征在于，所述方法包括：向96孔板中的用于Sanger测序技术的测序反应产物中加入去离子水或去离子甲酰胺，然后将96孔板置于振荡器上充分震荡，振荡后直接上机测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照DNA与去离子水或去离子甲酰胺16-300ng:10-30μL的比例，向96孔板的各孔中加入去离子水或去离子甲酰胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，各孔中的DNA为经过纯化处理后自然晾干的DNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，振荡器的设置如下：转速780rpm，振幅3mm，振荡时间5min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA来自于人类。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述测序反应产物的大小为20-600bp。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述上机测序是指采用毛细管电泳法进行测序。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210326 |