CN106566875A - 用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106566875A
CN106566875A CN201610834589.4A CN201610834589A CN106566875A CN 106566875 A CN106566875 A CN 106566875A CN 201610834589 A CN201610834589 A CN 201610834589A CN 106566875 A CN106566875 A CN 106566875A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mds
primer
gene mutation
genes
asxl1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610834589.4A
Other languages
English (en)
Inventor
郑仲征
杜金伟
徐玉尚
郁晓晨
杨兰
安雪茹
余凯
潘捷
杜可明
王宁娟
胡莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Di Shuo Bacon Ltd Medical Examination
Original Assignee
Shanghai Di Shuo Bacon Ltd Medical Examination
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Di Shuo Bacon Ltd Medical Examination filed Critical Shanghai Di Shuo Bacon Ltd Medical Examination
Priority to CN201610834589.4A priority Critical patent/CN106566875A/zh
Publication of CN106566875A publication Critical patent/CN106566875A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及检测MDS基因突变的方法。本发明针对常见的四种MDS基因，设计了能够高效特异性扩增这四种基因的引物序列，具有高度的特异性。本发明设计的所有引物的退火温度均为58℃，可以使用同一个PCR程序一次完成扩增反应。本发明所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本发明设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。

Description

用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、试剂盒及 方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、试剂盒及方法。
背景技术
骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一组以骨髓病态造血、无效造血和高风险白血病转化为特征的造血干细胞克隆性疾病。临床以病态发育的血细胞形态学、细胞遗传学异常，外加在多数病例中有原始细胞数不同程度的增多和血细胞减少症的存在为主要特征。目前MDS的治疗主要解决两大问题：骨髓衰竭及并发症和AML转化。
随着MDS中越来越多的基因异常被发现以及分子生物学技术的不断发展，其发病机制中多种分子标志物也逐渐被揭示。其中，多种基因被发现与MDS向急性髓系白血病转化密切相关。近年来，有研究显示RNA剪接因子3B第一亚单位(splicing factor 3B subunit1，SF3B1)基因突变与MDS患者环状铁幼粒细胞的出现密切相关。另外，富含丝氨酸/精氨酸剪接因子2(serine/arginine-rich splicing factor，SRSF2)也被报道与MDS发病密切相关，该基因突变提示患者可能预后不良，并较未突变者有更高的向AML转化的几率。与DNA甲基化密切相关的DNMT3A的突变多预示着较差的总生存率，并可能更快地向AML转化。此外，调节组蛋白合成的ASXL1的框移突变被证实为MDS预后不良的分子标志。
对MDS进行多基因检测可能有助于其诊断及进行进一步危险分层，最终实现更为精确的个体化治疗。由于与MDS发病相关的基因突变较多，因而检测方法不一，主要包括直接测序、实时荧光定量PCR、高分辨率溶解曲线等。相较于其他检测方法，直接测序能够对需要检测样本的相关基因序列进行精确测序，从而分析相关基因是否发生突变，具有简便、准确且适合批量操作的特点。目前有不少关于直接测序检测MDS相关基因突变的报道，然而往往由于引物特异性不是很好，造成测序峰图有较高背景峰，从而对突变的判断造成一定困难。因此，目前亟需一种快速、灵敏、成本经济的对MDS常见4种基因(SF3B1、ASXL1、SRSF2、DNMT3A)突变进行检测的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，根据GenBank最新公布的基因序列，重新设计了检测MDS常见4种基因突变的引物，并在此基础上设计了对这4种基因突变进行检测的方法。本发明的方法快速、简便、准确、灵敏、直观，且实验成本低。
为此，本发明一方面提供了一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1-30所示的引物组成，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
在本发明优选的实施方案中，该引物组合进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由SEQ ID NO.1-6所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.7-24所示的引物组成，第3组由SEQID NO.25-28所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.29-30所示的引物组成。
在本发明进一步优选的实施方案中，每条引物的浓度均为5μM。
本发明另一方面提供了一种用于检测MDS基因突变的试剂盒，其包含本发明所述的引物组合，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
在本发明优选的实施方案中，每条引物的浓度均为5μM。
本发明另一方面提供了本发明所述的引物组合在制备检测MDS基因突变的试剂盒中的应用，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合，或者本发明所述的试剂盒在检测MDS基因突变中的应用，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
本发明最后一方面提供了一种检测MDS基因突变的方法，其包含以下步骤：
1、获取待测样品DNA。
2、采用本发明所述的引物组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增。
3、对PCR扩增产物进行Sanger测序。
4、得到测序峰图后，进行结果判读，获得待测样品中MDS基因突变的种类。
所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
在本发明优选的实施方案中，步骤2中每条引物的浓度均为5μM。
在本发明进一步优选的实施方案中，步骤3中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
1、本发明根据GenBank最新公布的基因序列，针对常见的四种MDS基因SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A，采用不同的引物设计，设计了能够高效特异性地扩增这四种MDS基因的引物序列，具有高度的特异性。
2、本发明设计的所有引物的退火温度均为58℃，可以使用同一个PCR程序一次完成扩增反应。PCR反应可以将四种基因的所需检测区域全部扩增出来，然后进行测序，并将测得的序列与标准序列比对，检测是否存在基因突变。除了对比已确认的突变外，还能发现新的突变。
3、本发明采用Sanger测序法，可检测MDS相关的四种基因突变，而且本发明设计的引物所扩增的产物覆盖所有待检测突变位点，在很大程度上节省了检测时间及成本，而且结果更准确。
综上所述，本发明所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本发明设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。
附图说明
图1：ASXL1基因突变的测序峰图。
图2：DNMT3A基因野生型与突变型的对比图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：设计用于检测MDS常见4种基因突变的PCR引物
本实施例中，根据GenBank最新公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。为了减少测序峰图底峰，最大限度地保障了测序引物的纯度，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。按照上述引物设计原则，本发明针对MDS常见4种基因突变所设计的具体引物情况参见表1。
表1：四种基因的扩增及测序引物序列
实施例2：制备用于检测MDS常见4种基因突变的试剂盒
将合成的引物，PCR扩增反应液和测序体系进行分装后包装，组成本发明试剂盒。
其中，PCR扩增反应液包括，10×PCR Buffer、2.5mMdNTPs、LA Taq DNAPolymerase、ddH2O等。
测序体系包括，PCR产物消化反应液：虾碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatas(Shrimp))和外切酶(Exonuclease I)按1:1进行混合；测序反应液：Terminator V3.1cycle Sequencing Kit、5×Bigdye buffer；测序纯化液：EDTA(125mM)；85％无水乙醇；75％无水乙醇；HI-DI(高度去离子甲酰胺)。
实施例3：对样本中MDS基因突变进行检测
按照以下具体步骤对样本中的MDS基因突变进行检测：
1、按照QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒的方法提取样本DNA。
2、以上述DNA为模板，和所述的PCR扩增引物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
将所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％)，电压为140V，时间为35min，电泳结束后使用凝胶成像系统观察。其中，PCR扩增体系参见表2。
表2：PCR扩增体系
PCR反应条件参见表3。
表3：PCR反应条件
3、Sanger测序
每个PCR反应体系(25μL)加入1μL消化酶，依靠Alkaline Phosphatase水解残余的dNTP，Exonuclease I水解单链核酸从而去除双链DNA以外的杂质。其消化反应条件参见表4。
表4：消化反应条件
温度 时间
37℃ 60min
80℃ 15min
4℃ ∞
得到PCR消化产物后，进行Sanger测序反应，其反应体系参见表5。
表5：Sanger测序反应体系
Sanger测序反应条件参见表6。
表6：Sanger测序反应条件
4、测序反应后纯化
纯化操作前，需预冷离心机至4℃。此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能地去除，以减少之后3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。
每5μL反应体系加入0.125mol/L EDTA-Na2溶液2μL，85％无水乙醇30μL，盖上硅胶垫，充分振荡3～5分钟，3000g，4℃，离心30分钟。EDTA作为金属离子螯合剂，能与测序PCR反应体系里的离子结合从而去除离子。
离心结束后，倒离心至185g时立即停止。每孔加入50μL 70％无水乙醇，DNA片段在70％乙醇中溶解度低，能通过离心沉淀下来。盖上硅胶垫，充分振荡3分钟，3000g，4℃，离心15分钟，离心结束后再次倒离心。然后将离心后产物放置避光通风处20分钟。
5、变性处理
20分钟后，在生物安全柜中操作，每孔加入8μL HI-DI甲酰胺进行变性处理，程序参见表7。
表7变性反应程序
温度 时间
95℃ 3min
4℃ ∞
变性结束并冷却离心后，上ABI3730测序仪测序。
6、结果分析
得到测序峰图后，经严格改名后加载入软件Variant ReporterTM software v1.1，自动与Genbank中相关基因野生型序列比对，并同时有阴性对照进行控制，根据实际突变情况，分析编码氨基酸的改变。
图1为样本FG95中发现ASXL1突变的测序峰图，此突变发生在非编码区域(Chr20:32437360：A>G)。
图2为样本FG95中发现DNMT3A突变的测序峰图，对比野生型(ZP)，此突变为错义突变(R827C)，现有COSMIC数据库未见报道，临床意义暂不明确。
通过测序报告可发现本发明所呈现的峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，且本发明设计的引物、试剂与方法的检测成本经济，特异性强。

Claims (10)

1.一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1-30所示的引物组成，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由SEQ IDNO.1-6所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.7-24所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.25-28所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.29-30所示的引物组成。
3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其中每条引物的浓度均为5μM。
4.一种用于检测MDS基因突变的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的引物组合，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中每条引物的浓度均为5μM。
6.权利要求1-3中任一项所述的引物组合在制备检测MDS基因突变的试剂盒中的应用，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
7.权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或者权利要求4或5中所述的试剂盒在检测MDS基因突变中的应用，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
8.一种检测MDS基因突变的方法，其包含以下步骤：
(1)获取待测样品DNA；
(2)采用权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或采用权利要求4或5中所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行Sanger测序；
(4)得到测序峰图后，进行结果判读，获得待测样品中MDS基因突变的种类；
所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(2)中每条引物的浓度均为5μM。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中步骤(3)中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。
CN201610834589.4A 2016-09-20 2016-09-20 用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法 Pending CN106566875A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610834589.4A CN106566875A (zh) 2016-09-20 2016-09-20 用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610834589.4A CN106566875A (zh) 2016-09-20 2016-09-20 用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106566875A true CN106566875A (zh) 2017-04-19

Family

ID=58531894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610834589.4A Pending CN106566875A (zh) 2016-09-20 2016-09-20 用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106566875A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304331A (zh) * 2020-03-09 2020-06-19 南京实践医学检验有限公司 基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒及制备方法
CN113764044A (zh) * 2021-08-31 2021-12-07 华南理工大学 一种构建骨髓增生异常综合征进展基因预测模型的方法
CN113817811A (zh) * 2020-06-18 2021-12-21 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 用于检测flt3-itd基因突变的引物组、试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894119A (zh) * 2015-06-04 2015-09-09 长沙艾迪康医学检验所有限公司 检测sf3b1基因第14、15号全外显子的方法和引物
CN105916876A (zh) * 2013-09-16 2016-08-31 分子医学研究中心责任有限公司 用于骨髓恶性肿瘤诊断的突变钙网蛋白

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105916876A (zh) * 2013-09-16 2016-08-31 分子医学研究中心责任有限公司 用于骨髓恶性肿瘤诊断的突变钙网蛋白
CN104894119A (zh) * 2015-06-04 2015-09-09 长沙艾迪康医学检验所有限公司 检测sf3b1基因第14、15号全外显子的方法和引物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T HAFERLACH等: ""Landscape of genetic lesions in 944 patients with myelodysplastic syndromes"", 《LEUKEMIA》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304331A (zh) * 2020-03-09 2020-06-19 南京实践医学检验有限公司 基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒及制备方法
CN113817811A (zh) * 2020-06-18 2021-12-21 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 用于检测flt3-itd基因突变的引物组、试剂盒及其应用
CN113764044A (zh) * 2021-08-31 2021-12-07 华南理工大学 一种构建骨髓增生异常综合征进展基因预测模型的方法
CN113764044B (zh) * 2021-08-31 2023-07-21 华南理工大学 一种构建骨髓增生异常综合征进展基因预测模型的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113073150B (zh) 一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字pcr检测试剂盒
CN109468384B (zh) 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒
CN111440896B (zh) 一种新型β冠状病毒变异检测方法、探针和试剂盒
CN116656850B (zh) 基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合及其应用
CN113337639A (zh) 一种基于mNGS检测COVID-19的方法及其应用
CN106566875A (zh) 用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法
CN110894542A (zh) 一种鉴别水稻gs5基因和glw7基因类型的引物及其应用
CN115058543B (zh) 一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒
CN108192965B (zh) 一种检测线粒体基因组a3243g位点异质性的方法
CN107841566B (zh) 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用
CN104894230B (zh) 一种hla-dqb1基因分型的组特异性引物pcr-sbt方法及试剂
CN110241212B (zh) 一种用于brca1和brca2基因扩增子测序检测的引物组及其应用
CN107988334B (zh) 口腔拭子直接pcr进行snp分型的方法
CN110735003A (zh) 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法
CN106434908A (zh) 用于检测与骨髓增殖性肿瘤mpn相关基因突变的引物、试剂盒及方法
CN113943789B (zh) 一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr方法、引物及试剂盒
KR102147340B1 (ko) Ganoderma 속 미생물 검출 및 뿌리 썩음병 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
CN110387399B (zh) 一种线性扩增双链dna的方法及应用
CN113604583A (zh) 一种山羊kcnj15基因cnv标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒
CN112899385A (zh) 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用
CN111560420A (zh) 一种abo基因单倍体分型方法及试剂
CN110592237A (zh) 一种用于检测浙东白鹅体重性状的引物、探针、试剂盒及其检测方法
KR102492587B1 (ko) Ganoderma 속 미생물 검출 및 뿌리 썩음병 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 방법
CN111235292B (zh) 一种黑麦4rs染色体臂特异kasp分子标记及其应用
CN114395626B (zh) 用于宫颈癌筛查的标志物、探针组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170419