CN104894119A - 检测sf3b1基因第14、15号全外显子的方法和引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测SF3B1基因第14、15号全外显子的方法和引物，所述引物包括扩增覆盖SF3B1基因第14、15号全外显子序列的2对正、反向引物和2对测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述2对测序引物可用于快速检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者的SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变情况，其中包含了位于15号外显子上的主要突变位点K700E。

Description

检测SF3B1基因第14、15号全外显子的方法和引物

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测SF3B1基因第14、15号全外显子突变的引物和方法。

背景技术

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性克隆性疾患，其特征是血细胞减少，髓系细胞一系或多系发育异常，无效造血，骨髓造血功能衰竭以及演变为急性髓系白血病的风险增高。MDS患者常伴有染色体核型异常，但目前对与其发病相关的特定基因突变研究较少。近年来随着第二代测序技术、SNP探针分析和比较基因组学等新技术的发展，在MDS患者中鉴别出更多的基因异常可能与其发病机制有关，其中包括涉及信号转导的CBL基因，调亡通路相关TP53、RAS基因，DNA甲基化调节子编码基因TET2、DNMT3A、IDm/2等，以及影响组氨酸功能的一些蛋白编码基因如EZH2、ASXL1和UTX。然而这些基因在其它髓系肿瘤中突变率往往较MDS高，尚且约20％MDS患者中未检测出现有的基因异常^[3]。近来几个研究组相继报道MDS患者存在剪切体复合物蛋白编码基因的突变包括SF3B1，SRSF2，ZRSR及U2AF35等，从而为研究MDS相关的分子生物学异常开拓出新的方向。

SF3B1基因即剪接因子3B复合物的第一亚单位，定位于染色体2q33.1，含有25个外显子，编码1个由1304个氨基酸组成的蛋白，蛋白质分子量155kDa。mRNA前体的剪接由剪接体复合物完成，剪接体复合物由5种小核核糖核蛋白(snRNP)(U1,U2,U4,U5,U6)及其它蛋白质组分组成。SF3B1基因编码的SF3B1蛋白与U2snRNP形成复合物A进而参与mRNA前体3'剪接位点的识别。由于U2snRNP位于负责mRNA前体3'剪切位点识别的剪切体复合物的催化中心，SF3B1基因是剪切体复合物A中唯一的憐酸化位点，因此SF3B1基因突变引起的异常剪切导致编码蛋白的改变可能与疾病发生密切相关。

SF3B1基因突变在MDS患者中的预后意义尚有争议，有的研究小组认为突变型患者预后良好，与野生组相比，SF3B1突变患者拥有更高的白细胞计数、血小板值、较低的骨髓内原始细胞同时在总体生存率、无病生存率、无事件生存率等预后指标中，突变患者仍拥有较高的生存率及较低的向白血病转化的风险，同时认为SF3B1的突变是影响患者预后的独立因素。

SF3B1的突变集中在第12-16外显子中，即翻译后的4、5、6结构域内，主要突变类型为K700E(700位上的赖氨酸被谷氨酸所代替)占55％。国内外文献报道，SF3B1在MDS伴环形铁粒幼细胞的患者即MDS-RS中突变率很高，在RARS/RCMD-RS(refractory anemia with ringed sideroblasts/refractorycytopenia with multilineagedysplasia and ringed sideroblasts)中为75.3％，RARS-T(refractory anemia withringed sideroblasts and throbocythemia)为66.7％。通过大量临床资料显示SF3B1突变阳性的病人其预后亦相对较好。

多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于SF3B1基因突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于SF3B1基因容量大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布,故而阻止了对SF3B1基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。

本发明采用Sanger测序法检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展整个第14、15号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解SF3B1基因第14、15号全外显子的基因突变情况，并不受SF3B1基因的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。

发明内容

本发明提供检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测MDS患者体内检测SF3B1基因第14、15号全外显子突变的情况。

本发明的目的在于提供检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子突变的2对正、反向引物；其碱基序列为：

SF3B1 E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

进一步地，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列为

SF3B1 S-E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 S-E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 S-E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 S-E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

进一步地，所述2对正、反向引物的使用浓度比为：

SF3B1 E14-F：SF3B1 E14-R＝1：1；

SF3B1 E15-F：SF3B1 E15-R＝1：1。

进一步地，所述2对测序引物的使用浓度比为：

SF3B1 S-E14-F：SF3B1 S-E14-R＝1：1；

SF3B1 S-E15-F：SF3B1 S-E15-R＝1：1。

本发明的目的还在于提供一种检测SF3B1基因第31-34号全外显子的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)利用2对扩增引物SF3B1 E14-F与SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F与SF3B1E15-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测SF3B1基因第31-34号全外显子突变的得扩增产物；

(3)利用2对测序引物SF3B1 S-E14-F与SF3B1 S-E14-R，SF3B1 S-E15-F与SF3B1 S-E15-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与野生型SF3B1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：

SF3B1 E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

SF3B1 S-E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 S-E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 S-E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 S-E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

本发明的目的还在于提供一种检测SF3B1基因第14、15号全外显子的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括2对扩增引物SF3B1 E14-F与SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F与SF3B1E15-R，测序体系包括2对测序引物SF3B1 S-E14-F与SF3B1 S-E14-R，SF3B1S-E15-F与SF3B1 S-E15-R，包括：

SF3B1 E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

SF3B1 S-E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 S-E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 S-E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 S-E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer；dNTPs；KOD FXDNA Polymerase。

进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。

进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。

本发明设计了扩增覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的2对正、反向引物，以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的2对测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。

有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个第14、15号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解SF3B1基因第14、15号全外显子的基因突变情况，并不受SF3B1基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。

附图说明

图1为SF3B1基因在染色体上定位图。

图2为SF3B1 E14-F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-24为送检的MDS患者血液样本1-24号，如图2所示，引物SF3B1 E14-F/R扩增有效，且条带单一。

图3为SF3B1 E15-F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-24为送检的MDS患者血液样本1-24号，如图2所示，引物SF3B1 E15-F/R扩增有效，且条带单一。

图4样本114号外显子部分测序结果。

图5样本214号外显子部分测序结果。

图6样本314号外显子部分测序结果。

图7样本115号外显子部分测序结果。

图8样本215号外显子部分测序结果。

图9样本315号外显子部分测序结果。

其中，方框注部分为SF3B1基因第700个氨基酸编码的位置，图中测序结果显示未发生突变，翻译为赖氨酸。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的2对正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：

SF3B1 E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

SF3B1 S-E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 S-E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 S-E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 S-E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

在检测中，先利用上述2对正、反向引物对覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述2对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。

在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区域包括了该外显子的全部序列。虽然SF3B1基因在MDS患者中有较为主要的突变位点K700E(在15号外显子上)，但不明确的突变位点也很多，突变类型不定。因此本发明所述引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。

检测SF3B1基因第14、15号全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中，

检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；检测目的基因用的2对上、下游引物SF3B1 E14-F(10μm)与SF3B1 E14-R(10μm)，SF3B1 E15-F(10μm)与SF3B1 E15-R(10μm)。

测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：SF3B1 S-E14-F(3.2μm)与SF3B1 S-E14-R(3.2μm)，SF3B1 S-E15-F(3.2μm)与SF3B S-E15-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。

检测体系PCR反应液配制如下：

其中，SF3B1 E14-F与SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F与SF3B1 E15-R的碱基序列为：

SF3B1 E14-F：5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1 E14-R：5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1 E15-F：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1 E15-R：5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'

阳性对照品：含有SF3B1序列的溶液。

阴性对照品：无SF3B1序列的溶液。

空白对照品：1μl生理盐水或不加任何物质。

实施例2

血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组DNA:

1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入2个检测体系PCR反应液中各1μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加1μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

(5)sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与测序引物：SF3B1 S-E14-F(3.2μm)与SF3B1S-E14-R(3.2μm)，SF3B1 S-E15-F(3.2μm)与SF3B1 S-E15-R(3.2μm)按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(6)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:NG_009018.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取临床骨髓增生异常综合征患者样本24份，检测该24份样本是否存在SF3B1基因突变，样本编号1-24。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中1μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。

电泳结果如图2、3所示，表明本发明所述引物SF3B1 E14-F/R、SF3B1 E15-F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样品1的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图4所示，为野生型，未检测出SF3B1突变。

样品2的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图5所示，为野生型，未检测出SF3B1突变。

样品3的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图6所示，为野生型，未检测出SF3B1突变。

样品1的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图7所示，为野生型，未检测出SF3B1突变。

样品2的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图8所示，为野生型，未检测出SF3B1突变。

样品3的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图9所示，为野生型，未检测出SF3B1突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出SF3B1基因第14、15号全外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出SF3B1基因第14、15号全外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出SF3B1基因突变。

Claims (5)

1.检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的正、反向引物。其碱基序列为：

SF3B1E14-F：5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1E14-R：5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1E15-F：5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1E15-R：5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列为：

SF3B1S-E14-F：5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'

SF3B1S-E14-R：5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'

SF3B1S-E15-F：5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'

SF3B1S-E15-R：5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'。

3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对正、反向引物的使用浓度比为：SF3B1E14-F：SF3B1E14-R＝1：1；

SF3B1E15-F：SF3B1E15-R＝1：1。

4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对测序引物的使用浓度比为：SF3B1S-E14-F：SF3B1S-E14-R＝1：1；

SF3B1S-E15-F：SF3B1S-E15-R＝1：1。

5.一种检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)利用2对扩增引物SF3B1E14-F与SF3B1E14-R，SF3B1E15-F与SF3B1E15-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的扩增产物；

(3)利用2对测序引物SF3B1S-E14-F与SF3B1S-E14-R，SF3B1S-E15-F与SF3B1S-E15-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与野生型SF3B1基因序列进行比较，确定突变位点是 否存在；其中所述引物序列为：

SF3B1E14-F：5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3' 

SF3B1E14-R：5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3' 

SF3B1E15-F：5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3' 

SF3B1E15-R：5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3' 

SF3B1S-E14-F：5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3' 

SF3B1S-E14-R：5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3' 

SF3B1S-E15-F：5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3' 

SF3B1S-E15-R：5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'。