CN109628576A - 检测fgd1基因突变的引物和方法 - Google Patents

检测fgd1基因突变的引物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109628576A
CN109628576A CN201910012761.1A CN201910012761A CN109628576A CN 109628576 A CN109628576 A CN 109628576A CN 201910012761 A CN201910012761 A CN 201910012761A CN 109628576 A CN109628576 A CN 109628576A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fgd1
primer
site
exon
sequencing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910012761.1A
Other languages
English (en)
Inventor
牛林梅
吴鹏飞
王淑
王淑一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Original Assignee
HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd filed Critical HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Priority to CN201910012761.1A priority Critical patent/CN109628576A/zh
Publication of CN109628576A publication Critical patent/CN109628576A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了检测FGD1 659+27T>C和482‑113C>T两个碱基突变的引物和方法；采用Sanger测序技术，可用于快速检测该突变位点。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断Aarskog综合征患者的基因突变情况。利用本发明所述引物和方法便于判断和分析产生的基因突变是否会造成Aarskog综合征，对Aarskog综合征的临床鉴别及诊断有重要的参考意义。

Description

检测FGD1基因突变的引物和方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测FGD1位点的突变情况。
背景技术
Aarskog综合征(Aarskog Syndrome，AAS)是一种罕见的遗传性面-指-生殖器异常综合征，主要临床表现为身材矮小、面部、指(趾)和生殖器形态改变，但程度各异，还可合并其他多种异常，目前诊断必备的表型尚不明确。AAS是由位于Xp11.21的FGD1基因突变所致的一种X连锁隐性遗传性疾病。
FGD1基因(FYVE，RhoGEF and PH domain containing l,NC_000023)共含有18个外显子，能够编码形成一种鸟嘌呤核苷酸转化因子(guanine nucleotide exchangefactor,GEF)。目前已经发现有多种FGD1的突变可导致AAS的发生，包括第4，6，9-12及17号外显子区的缺失突变，第3和7号外显子区的插入突变，第3-8及15号外显子区的错义突变，以及在7、8、11号内含子剪切位点上的突变等。FGD1基因的突变可导致其编码的GEF的结构域发生空间结构改变，从而干扰了FGD1/Cdc42正常的信号传递系统，导致AAS的发生。
AAS患者可出现身材矮小、智力缺陷及生育障碍等多种复杂、严重的临床症状，严重威胁着患者的身体健康和生活质量。通过检测FGD1基因突变情况，将有望据此对高危的可疑人群(如有相关家族史，或有放射性辐射接触史等)开展早期筛查和干预，从而将有利于对该病进行基因筛查、产前诊断、植入前遗传学分析、靶位治疗和新药研发等，最终对该病的早期预防与诊断、优生与优育等产生重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变的引物，采用PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点的突变情况。所述检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的引物，包括：扩增FGD1659+27T>C和482-113C>T位点5号外显子的引物，其碱基序列为：
FGD1-EXON-3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAAT
FGD1-EXON-3-R：AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG
本发明提供了检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提血液中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点是否发生突变。
本发明还提供了一种检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂。
本发明还提供了一种检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，所述检测体系PCR扩增反应液包括至少FGD1-EXON-3-F和FGD1-EXON-3-R这对扩增引物，所述测序体系反应液包括M13F和M13R这对测序引物。
进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FXDNA Polymerase。
进一步地，所述测序体系反应液还包括EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和BigdyeTerminator V3.1。
有益效果：本发明设计了扩增FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用Sanger测序技术检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变的方法，可以准确将FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计2个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为20例临床样本引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker DL 2000，1-20为20例血液样本，经验证，引物扩增有效，且目的条带清晰，产物大小正确。
图2为样本3FGD1 659+27T位点的测序截图，表明为阴性样本。
图3为样本1FGD1 659+27T位点的测序截图，表明为阳性样本。
图4为样本3FGD1 482-113C位点的测序截图，表明为阴性样本。
图5为样本1FGD1 482-113C位点的测序截图，表明为阳性样本。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
一种检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变的引物和方法，该引物是针对扩增FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变所设计的特异性扩增引物，其碱基序列为：
FGD1-EXON-3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAAT
FGD1-EXON-3-R：AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。
一种检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点上、下游引物(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：M13F和M13R(3.2μM)。
实施例2
血液基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组DNA
1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
FGD1-EXON-3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAAT；
FGD1-EXON-3-R：AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，35min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为2例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。
(6)Sanger测序：
取9PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与FGD1(NC_000023)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取20例临床样品，按实施例1和2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。样本加入检测体系PCR反应液中1μL，同时做阳性，阴性，空白对照各一份。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。
测序后发现共有8例样本发生FGD1 659+27T>C和482-113C>T突变，分别为样本1、2、6、10、11、12、13、18，两种突变在样本中同时发生，且全部为纯合突变。样本1(阳性样本)和样本3(阴性样本)的测序结果如图2-5所示。图2和图3为FGD1 659+27T位点阴性和阳性样本的测序截图。图4和图5为FGD1 482-113C位点阴性和阳性样本的测序截图。
序列表
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测FGD1基因突变的引物和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgc ctcctgagtt caagcaat 38
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgtctg aggtgggtgg tggac 35
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatg 16

Claims (4)

1.检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的引物，其特征在于，包括扩增FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点的引物，其碱基序列为：
FGD1-EXON-3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAAT
FGD1-EXON-3-R：AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
3.检测FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提血液中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点是否发生突变；
步骤2中的PCR扩增引物为扩增FGD1 659+27T>C和482-113C>T位点的引物，其碱基序列为：
FGD1-EXON-3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCCTGAGTTCAAGCAAT
FGD1-EXON-3-R：AACAGCTATGACCATGTCTGAGGTGGGTGGTGGAC。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
CN201910012761.1A 2019-01-07 2019-01-07 检测fgd1基因突变的引物和方法 Withdrawn CN109628576A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910012761.1A CN109628576A (zh) 2019-01-07 2019-01-07 检测fgd1基因突变的引物和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910012761.1A CN109628576A (zh) 2019-01-07 2019-01-07 检测fgd1基因突变的引物和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109628576A true CN109628576A (zh) 2019-04-16

Family

ID=66058058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910012761.1A Withdrawn CN109628576A (zh) 2019-01-07 2019-01-07 检测fgd1基因突变的引物和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109628576A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110029161A (zh) * 2019-05-16 2019-07-19 中国人民解放军第四军医大学 Charge综合征致病基因chd7突变检测试剂盒
CN110904216A (zh) * 2019-12-17 2020-03-24 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测CHD7基因c.1670-98和c.2375+49位点突变的引物和方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110029161A (zh) * 2019-05-16 2019-07-19 中国人民解放军第四军医大学 Charge综合征致病基因chd7突变检测试剂盒
CN110904216A (zh) * 2019-12-17 2020-03-24 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测CHD7基因c.1670-98和c.2375+49位点突变的引物和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593841A (zh) 检测f13a1基因突变的方法、试剂盒、寡核苷酸及其应用
CN109486938A (zh) 检测smn1和smn2基因突变的方法、引物及应用
CN104745697B (zh) 检测nf1基因第31‑34号全外显子的方法和引物
CN109402234A (zh) 检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物和方法
CN105506107A (zh) 检测dock2基因多态热点突变情况的引物和方法
CN106987642A (zh) 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法
CN108048553A (zh) 检测slc25a13基因突变的方法、引物和试剂盒
CN108998525A (zh) 检测atrx基因位点突变的引物、方法和试剂盒
CN109628576A (zh) 检测fgd1基因突变的引物和方法
CN105936940A (zh) 检测耳聋基因的核酸序列及其应用
CN110358820A (zh) 检测ldlr基因突变的方法、引物和试剂盒
CN106399567A (zh) 检测wrap53基因突变的引物及其应用
CN104862407A (zh) 检测ezh2基因的引物和方法
CN105755132A (zh) 检测was基因多态突变位点的方法、寡核苷酸和试剂盒
CN106755399A (zh) 一种i型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂
CN109576367A (zh) 检测bcor基因突变的引物、试剂盒和方法
CN110358821A (zh) 检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症g6pd基因突变的引物、试剂盒和方法
CN108531574A (zh) 检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性的引物和方法
CN108004309A (zh) 检测mthfr677、mthfr1298和mtrr66的引物、方法和试剂盒
CN109628563A (zh) 检测piga基因启动子区域4972a&gt;g突变位点的引物、试剂盒和方法
CN106868174A (zh) 检测adamts13基因全外显子的试剂盒和方法
CN106222287A (zh) 检测ela2基因的方法和引物
CN103540659B (zh) 检测dnmt3a突变位点的方法、引物和试剂盒
CN107841554A (zh) 检测凝血因子xii(f12)基因突变的引物、试剂盒和方法
CN114032303A (zh) 检测基因abcb11新突变的寡核苷酸和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20190416