CN110358820A - 检测ldlr基因突变的方法、引物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测家族性高胆固醇血症相关的LDLR基因突变的方法、引物和试剂盒,所述引物、试剂盒均包括针对LDLR基因7~14外显子的扩增引物和测序引物。基于PCR扩增和Sanger测序,本发明可快速地检测家族性高胆固醇血症相关的LDLR基因突变位点的突变情况。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域,特别涉及检测家族性高胆固醇血症相关的LDLR基因突变的方法、引物和试剂盒。
背景技术
家族性高胆固醇血症(FH)是由于LDLR基因突变导致的一种严重的常染色体显性遗传病,也是最早被明确其临床和基因特征的脂代谢絮乱疾病。世界范围内FH杂合患者的发病率约为1/500,成为最常见的代谢性疾病之一。其发病机制是由于低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)基因突变,导致血浆TC清除障碍,TC 浓度升高并在组织内过度淤积引起动脉硬化性疾病。目前已报道6种致病基因可引起FH,如:低密度脂蛋白受体(LDLR)、载脂蛋白B100(ApoB100)枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)等。LDLR基因突变是FH的主要病理基础,载临床确诊的 FH患者中约50%可检测到LDLR基因突变。因此检测LDLR基因突变对于FH的筛查具有重要意义。
LDLR基因位于第19号染色体p13.1到p13.3之间,全长45kb,由18个外显子和17个内含子组成,编码长860个氨基酸的前体蛋白。LDLR载结构上分为5个区域:(1)为配体结合域,由2~6号外显子编码;(2)为表皮生长因子前体同源域(EGF),由第7~14外显子编码,为受体与配基载胞浆内吞体重的酸依赖性解离所必需,同时该域还为配体结合域处于适当的位置提供了方面,使之能细胞膜上结合LDL;(3)为O-连接糖链结构域,由外显子15编码,位于膜外;(4)为跨膜结构域,由第16外显子和第17外显子的5′端编码;(5)为胞浆结构域,由第17外显子的其余部分和第18外显子5′端编码,位于受体的C-末端,深埋于胞浆中。在基因水平,第1外显子作为信号序列在加工过程中被切除,并不表达氨基酸序列。根据结构和功能的关系,发生在以上不同区域的基因突变会导致不同类型的功能障碍。
目前我国发现的突变大多位于第7~14外显子,即中国人LDLR基因突变高发区可能位于编码表皮生长因子(EGF)的第7~14外显子上,且多为单个碱基置换所致的错义突变,说明中国人FH患者可能有其独特的基因突变谱。EGF由大学400个氨基酸残基组成,该区域高度保守,单个碱基的突变就会导致其功能障碍,引起LDLR发生循环缺陷及结合功能障碍。因此对于该区域的检测能够较为快速的对大规模的中国人群进行FH缺陷的筛查。
发明内容
本发明采用Sanger测序法检测家族性高胆固醇血症相关的LDLR基因突变,并且设计的引物分别扩增包含基因LDLR第7~14外显子上的DNA片段,通过测序结果的分析,可以很直观地了解家族性高胆固醇血症相关的LDLR基因突变位点的突变情况,扩增引物设计时加上了M13接头,并使用M13作为测序引物,简化操作步骤和节约了检测成本。
本发明提供了检测LDLR基因突变的引物,其特征在于,包括至少一对用于扩增LDLR基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R,所述扩增引物选自LDLR-E7-F/LDLR-E7-R、LDLR-E8-F/LDLR-E8-R、LDLR-E9_10-F/LDLR- E9_10-R、LDLR-E11-F/LDLR-E11-R、LDLR-E112-F/LDLR-E12-R和 LDLR-E13_14-F/LDLR-E13_14-R,其碱基序列为:
LDLR-E7-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGAATCACTTGAACCCG
LDLR-E7-R:AACAGCTATGACCATGATGTTGGTCAGGCTGGTCT;
LDLR-E8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTGATTACATCTCCCGAG
LDLR-E8-R:AACAGCTATGACCATGGGTTCCTGTTCCACCAGTAG;
LDLR-E9_10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGCACTCTTGGTTCCA
LDLR-E9_10-R:AACAGCTATGACCATGACAGGTGCTTTGAGCCAC;
LDLR-E11-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E11-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E12-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E12-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E13_14-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGTCTCATCCCAGTG
LDLR-E13_14-R:AACAGCTATGACCATGAGGACGCAGAAACAAGGC;
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT;
M13R:AACAGCTATGACCATG。
进一步地,所述突变选自W462X、R574S、D601Y、A627T等中国人常见突变。
本发明还提供了一种检测检测样品中LDLR基因突变的方法,其包括如下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增,获得扩增产物,所述至少一对扩增引物选自LDLR-E7-F/LDLR-E7-R,LDLR-E8-F/LDLR-E8-R, LDLR-E9_10-F/LDLR-E9_10-R,LDLR-E11-F/LDLR-E11-R,LDLR-E112-F/LDLR- E12-R,LDLR-E13_14-F/LDLR-E13_14-R,(3)利用测序引物M13F与M13R对 (2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序,获得所述扩增产物的基因序列;
(4)将(3)中的基因序列与野生型LDLR基因序列进行比较,确定LDLR基因是否发生突变;
其中所述扩增引物和测序引物的碱基序列为:
LDLR-E7-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGAATCACTTGAACCCG
LDLR-E7-R:AACAGCTATGACCATGATGTTGGTCAGGCTGGTCT;
LDLR-E8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTGATTACATCTCCCGAG
LDLR-E8-R:AACAGCTATGACCATGGGTTCCTGTTCCACCAGTAG;
LDLR-E9_10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGCACTCTTGGTTCCA
LDLR-E9_10-R:AACAGCTATGACCATGACAGGTGCTTTGAGCCAC;
LDLR-E11-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E11-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E12-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E12-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E13_14-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGTCTCATCCCAGTG
LDLR-E13_14-R:AACAGCTATGACCATGAGGACGCAGAAACAAGGC;
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT;
M13R:AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测样品中LDLR基因突变的试剂盒,所述试剂盒包括扩增体系PCR反应液和测序体系反应液,其中扩增体系PCR反应液包括至少一对扩增引物,测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R,所述至少一对扩增引物选自LDLR-E7-F/LDLR-E7-R,LDLR-E8-F/LDLR-E8-R, LDLR-E9_10-F/LDLR-E9_10-R,LDLR-E11-F/LDLR-E11-R,LDLR-E112-F/LDLR- E12-R,LDLR-E13_14-F/LDLR-E13_14-R,所述扩增引物和测序引物的碱基序列为:
LDLR-E7-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGAATCACTTGAACCCG
LDLR-E7-R:AACAGCTATGACCATGATGTTGGTCAGGCTGGTCT;
LDLR-E8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTGATTACATCTCCCGAG
LDLR-E8-R:AACAGCTATGACCATGGGTTCCTGTTCCACCAGTAG;
LDLR-E9_10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGCACTCTTGGTTCCA
LDLR-E9_10-R:AACAGCTATGACCATGACAGGTGCTTTGAGCCAC;
LDLR-E11-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E11-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E12-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E12-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E13_14-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGTCTCATCCCAGTG
LDLR-E13_14-R:AACAGCTATGACCATGAGGACGCAGAAACAAGGC;
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT;
M13R:AACAGCTATGACCATG。
进一步地,所述扩增体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
进一步地,所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地,所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
进一步地,所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地,所述突变选自W462X、A627T、D601Y等中国人常见突变。
有益效果:(1)本发明设计了扩增基因LDLR第7~14外显子的正、反向引物,并创新性地在PCR扩增上游引物前端和下游引物前端分别加了一段长 18bp的的M13F引物序列和长16bp的M13R引物序列,这样扩增以后的产物两端都会带上所引入的M13F及M13R引物序列,随后进行测序反应的时候,所有的扩增产物可以使用统一的M13F和M13R引物就可以进行正反向测序了,而不用针对每个扩增产物都设计一对测序引物,这样就可以显著地降低检测成本;(2) 在设计扩增引物时,通过分析这几种热点突变所在的外显子位置,让扩增第9 外显子的正反向引物和扩增第10外显子的正反向引物共用一对正反向扩增引物: LDLR-E9_10-F和LDLR-E9_10-R,让扩增第13外显子的正反向引物和扩增第 14外显子的正反向引物共用一对正反向扩增引物:LDLR-E13_14-F和 LDLR-E13_14-R,从而降低扩增引物的使用数量,这会进一步降低检测成本;(3) 对送检样本进行PCR扩增,过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件,可使扩增效率达到最佳,随后采用Sanger测序法,对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测基因LDLR第7~14外显子突变位点的突变情况;(4)利用本发明所述扩增引物和测序引物,可以扩增基因 LDLR第7~14外显子,通过测序结果的分析,可以很直观的了解基因LDLR第 7~14外显子突变位点基因突变情况,并不受基因突变多样化的影响,可覆盖待检测的所有突变位点;(5)采用本发明的扩增引物对目的基因进行扩增并利用 Sanger测序法检测基因LDLR的热点突变,具有有很高的特异性、准确性和灵敏度,以及操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1为外显子7测序截图。
图2为外显子8测序截图。
图3为外显子9、10测序截图。
图4为外显子11测序截图。
图5为外显子12测序截图。
图6为外显子13、14测序截图。
图7为外显子8测序图谱的局部截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应当注意的是,实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测基因LDLR突变位点的试剂盒,包括:组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的DNA提取试剂盒);无水乙醇;扩增体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品,其中
扩增体系PCR反应液包括:2×PCR Buffer;2mM dNTPs;KOD FX DNA Polymerase(1U/μl);至少一对扩增引物用于扩增基因LDLR,扩增引物选自 LDLR-E6-F/LDLR-E6-R,LDLR-E7-F/LDLR-E7-R,LDLR-E8-F/LDLR-E8-R, LDLR-E9_10-F/LDLR-E9_10-R,LDLR-E11-F/LDLR-E11-R,LDLR-E112-F/LDLR- E12-R,LDLR-E13_14-F/LDLR-E13_14-R,其碱基序列为:
LDLR-E7-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGAATCACTTGAACCCG
LDLR-E7-R:AACAGCTATGACCATGATGTTGGTCAGGCTGGTCT;
LDLR-E8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTGATTACATCTCCCGAG
LDLR-E8-R:AACAGCTATGACCATGGGTTCCTGTTCCACCAGTAG;
LDLR-E9_10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGCACTCTTGGTTCCA
LDLR-E9_10-R:AACAGCTATGACCATGACAGGTGCTTTGAGCCAC;
LDLR-E11-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E11-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E12-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E12-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E13_14-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGTCTCATCCCAG TG;
LDLR-E13_14-R:AACAGCTATGACCATGAGGACGCAGAAACAAGGC。
测序体系包括:测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HID I(高度去离子甲酰胺)、测序引物:M13F(3.2μm)与M13R(3.2μm),以及Bigd ye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司),其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U,所述测序引物的碱基序列为:
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT;
M13R:AACAGCTATGACCATG。
扩增体系PCR反应液配制如下:
其中,PrimerF/Primer选自LDLR-E6-F/LDLR-E6-R,LDLR-E7-F/LDLR-E7-R, LDLR-E8-F/LDLR-E8-R,LDLR-E9_10-F/LDLR-E9_10-R,LDLR-E11-F/LDLR- E11-R,LDLR-E112-F/LDLR-E12-R,LDLR-E13_14-F/LDLR-E13_14-R。
阳性对照品:含有LDLR序列的溶液。
阴性对照品:无LDLR序列的溶液。
空白对照品:2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2血液样本DNA检测流程
(1)抽提血液中的基因组DNA:
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液,颠倒混匀,室温放置5分钟,期间再颠倒混匀几次,接着3000rpm离心5min,吸去上清,留下白细胞沉淀,加 200uL缓冲液GA,振荡至彻底混匀;
2)加入20μl蛋白酶K溶液,混匀;
3)加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10分钟,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠;
4)加入200μl无水乙醇,充分振荡混匀15秒,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠;
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm(13,400×g)离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中;
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(13,400×g)离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中;
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(13,400×g)离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中;
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW,12,000rpm(13,400×g)离心 30秒,倒掉废液;
9)将吸附柱CB3放回收集管中,12,000rpm(13,400×g)离心2分钟,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加 100μl洗脱缓冲液TE,室温放置2~5分钟,12,000rpm(13,400×g)离心2分钟,将溶液收集到离心管中,从而获得血液样本DNA溶液。
(2)试剂配置:按检测人份数配置扩增体系PCR反应液各Xμl,每人份18μl 分装:
X=18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样:将2μl步骤(1)中获得的DNA加入到检测体系PCR反应液中;对阳性对照而言,直接加2μl阳性对照品;对阴性对照实验而言,直接加2μl阴性对照品;对空白对照实验而言,加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增:检测在常规PCR仪上进行,获得扩增产物,可用仪器包括ABI veriti (美国Applied Biosystems公司)等。扩增反应条件如表1所示。
表1.扩增反应条件
(5)Sanger测序:
取9μl(4)中的PCR扩增产物与2μl测序纯化反应液。按照如表2 所示的程序进行纯化,获得纯化产物。
表2
将1μl纯化产物分别与测序引物M13F(3.2μm)、M13R(3.2μm)按照如表3、表4所示的体系进行混合。
表3
表4
测序反应程序如表5所示。
表5
沉淀环节:
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA,静置5min;加入15ml 无水乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心30min;倒置离心15sec,加入50ml70%乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心15min;倒置离心15sec,置于95℃金属浴上;加入10μl HiDi后进行变性试验。变性程序如表6所示。
表6
变性程序结束后,上测序仪(ABI3500)测序。
(6)结果判断:将测序结果与野生型参考序列进行比对,根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床全血样本3份,检测每份样本家族性高胆固醇血症相关的LDLR基因7~14外显子突变情况。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。对每份样品而言,将2μl提取出的基因组DNA,加入到扩增体系PCR反应液中,同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次。一台96孔的普通PCR仪可同时检测46份样品,每份样品2次重复,一份阳性对照,一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。
另外,样本1的测序结果如图1~7所示,均为野生型。样本2的测序结果也均为野生型。
样本3的测序结果除外显子9、10之外,其他外显子均为野生型,其中样本3 的第12外显子测序图谱的局部截图如图7(b)所示。为了比较,样本2的第12外显子测序图谱的局部截图如图7(a)所示。由图7可知,样本3在第12外显子上发生R574S突变,而且是杂合型突变。
从检测结果可以看出,本发明所述引物已经把想要检测的LDLR基因第7~ 14外显子都包括在内了,能够扩增出LDLR基因的这些外显子,并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确地扩增出LDLR基因第7~14外显子,无论是野生型还是突变型。
序列表
<110> 南昌艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测LDLR基因突变的方法、引物和试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgg agaatcactt gaacccg 37
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgatgt tggtcaggct ggtct 35
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtcc ttgattacat ctcccgag 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatgggtt cctgttccac cagtag 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtga ggcactcttg gttcca 36
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacagctatg accatgacag gtgctttgag ccac 34
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtgt tcccagcagg actatttc 38
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacagctatg accatggaca gaccaagacc tcatctc 37
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtgt tcccagcagg actatttc 38
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacagctatg accatggaca gaccaagacc tcatctc 37
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtaaaacga cggccagtcc tgtgtctcat cccagtg 37
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacagctatg accatgagga cgcagaaaca aggc 34
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacagctatg accatg 16
Claims (9)
1.检测LDLR基因突变的引物,其特征在于,包括至少一对用于扩增LDLR基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R,所述扩增引物选自LDLR-E7-F/LDLR-E7-R、LDLR-E8-F/LDLR-E8-R、LDLR-E9_10-F/LDLR-E9_10-R、LDLR-E11-F/LDLR-E11-R、LDLR-E112-F/LDLR-E12-R和LDLR-E13_14-F/LDLR-E13_14-R,其碱基序列为:
LDLR-E7-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGAATCACTTGAACCCG
LDLR-E7-R:AACAGCTATGACCATGATGTTGGTCAGGCTGGTCT;
LDLR-E8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTGATTACATCTCCCGAG
LDLR-E8-R:AACAGCTATGACCATGGGTTCCTGTTCCACCAGTAG;
LDLR-E9_10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGCACTCTTGGTTCCA
LDLR-E9_10-R:AACAGCTATGACCATGACAGGTGCTTTGAGCCAC;
LDLR-E11-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E11-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E12-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E12-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E13_14-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGTCTCATCCCAGTG
LDLR-E13_14-R:AACAGCTATGACCATGAGGACGCAGAAACAAGGC;
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT;
M13R:AACAGCTATGACCATG。
2.如权利要求1所述的引物,其特征在于,所述突变选自W462X、R574S、D601Y、A627T突变。
3.一种检测样品中LDLR基因突变的方法,其特征在于,其包括如下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增,获得扩增产物,其中,所述至少一对扩增引物选自LDLR-E7-F/LDLR-E7-R,LDLR-E8-F/LDLR-E8-R,LDLR-E9_10-F/LDLR-E9_10-R,LDLR-E11-F/LDLR-E11-R,LDLR-E112-F/LDLR-E12-R,LDLR-E13_14-F/LDLR-E13_14-R;
(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序,获得所述扩增产物的基因序列;
(4)将(3)中的基因序列与野生型LDLR基因序列进行比较,确定LDLR基因是否发生突变;
所述扩增引物和测序引物的碱基序列为:
LDLR-E7-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGAATCACTTGAACCCG
LDLR-E7-R:AACAGCTATGACCATGATGTTGGTCAGGCTGGTCT;
LDLR-E8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTGATTACATCTCCCGAG
LDLR-E8-R:AACAGCTATGACCATGGGTTCCTGTTCCACCAGTAG;
LDLR-E9_10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGCACTCTTGGTTCCA
LDLR-E9_10-R:AACAGCTATGACCATGACAGGTGCTTTGAGCCAC;
LDLR-E11-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E11-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E12-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E12-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E13_14-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGTCTCATCCCAGTG
LDLR-E13_14-R:AACAGCTATGACCATGAGGACGCAGAAACAAGGC;
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT;
M13R:AACAGCTATGACCATG。
4.一种检测样品中LDLR基因突变的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括扩增体系PCR反应液和测序体系反应液,其中扩增体系PCR反应液包括至少一对扩增引物,测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R,扩增引物选自LDLR-E7-F/LDLR-E7-R,LDLR-E8_9-F/LDLR-E8_9-R,LDLR-E10-F/LDLR-E10-R,LDLR-E11-F/LDLR-E11-R,LDLR-E13-F/LDLR-E13-R,所述扩增引物和测序引物的碱基序列为:
LDLR-E7-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGAATCACTTGAACCCG
LDLR-E7-R:AACAGCTATGACCATGATGTTGGTCAGGCTGGTCT;
LDLR-E8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTGATTACATCTCCCGAG
LDLR-E8-R:AACAGCTATGACCATGGGTTCCTGTTCCACCAGTAG;
LDLR-E9_10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGCACTCTTGGTTCCA
LDLR-E9_10-R:AACAGCTATGACCATGACAGGTGCTTTGAGCCAC;
LDLR-E11-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E11-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E12-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTCCCAGCAGGACTATTTC
LDLR-E12-R:AACAGCTATGACCATGGACAGACCAAGACCTCATCTC;
LDLR-E13_14-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGTCTCATCCCAGTG
LDLR-E13_14-R:AACAGCTATGACCATGAGGACGCAGAAACAAGGC;
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT;
M13R:AACAGCTATGACCATG。
5.如权利要求4所述的试剂盒,所述扩增体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
6.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
8.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
9.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述突变选自W462X、R574S、D601Y、A627T突变。
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