CN110951862A - 检测cyp21a2基因突变的方法、引物和试剂盒 - Google Patents
检测cyp21a2基因突变的方法、引物和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括针对CYP21A2基因全外显子的扩增引物和测序引物。基于PCR扩增和Sanger测序，本发明可快速地检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变位点的突变情况。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变的方法、引物和试剂盒。
背景技术
先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一组由肾上腺皮质激素合成过程中酶的缺陷所引起的常染色体隐性遗传性疾病。根据酶缺乏成都CAH可以分为失盐型CAH、单纯男性化型CAH、非典型性CAH，前两者统称为典型CAH。该病的发病率较低，新生儿CAH的发病率约为1/16000～1/20000，典型的CAH发病率约为1/10000，非典型CAH的发病率约为典型的10倍，且女性多于男性。而21羟化酶缺陷症(21OHD)是其中最常见的类型，约占90％～95％，21OHD在新生儿中的发病率约为1/15000～1/18000。
人体中编码21羟化酶的基因CYP21A2定位于6p21.3的HLAⅢ区域，具有10个外显子和9个内含子，该基因与不具有活性的假基因(CYP21P)串联排列在C4A和C4B基因的3’端，两者相距30Kb，而且外显子和内含子的同源性分别为98％和95％。这种高度的同源性造成检测CYP21A2突变较为困难，因此通过qPCR技术，无法应用于复杂重排的检测，难以广泛开展。其他的诸如Southern杂交技术、等位基因特异性聚合酶链反应、等位基因特异性寡核苷酸探针、RFLP等都存在繁琐、耗时耗力或无法检测所有突变类型等，都无法使用这些方法检测基因CYP21A2的突变。所以目前最好的方法就是对CYP21A2基因进行直接测序，可以快速准确诊断出患者的病情。目前该病在中国人群的常见的突变是IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp等。
发明内容
本发明采用Sanger测序法检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变，并且设计的引物分别扩增包含基因CYP21A2全外显子上的DNA片段，通过测序结果的分析，可以很直观地了解先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变位点的突变情况，扩增引物设计时加上了M13接头，并使用M13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。
本发明提供了检测CYP21A2基因突变的引物，其特征在于，包括至少一对用于扩增CYP21A2基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物选自自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R；，其碱基序列为：
CYP21A2-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；
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CYP21A2-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述突变选自IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp等突变。
本发明还提供了一种检测检测样品中CYP21A2基因突变的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，所述至少一对扩增引物选自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R；
(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型CYP21A2基因序列进行比较，确定CYP21A2基因是否发生突变；
其中所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
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M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测样品中CYP21A2基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括扩增体系PCR反应液和测序体系反应液，其中扩增体系PCR反应液包括至少一对扩增引物，测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，所述至少一对扩增引物选自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R；，所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
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进一步地，所述扩增体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地，所述突变选自IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp等突变。
有益效果：(1)本发明设计了扩增基因CYP21A2全外显子的正、反向引物，并创新性地在PCR扩增上游引物前端和下游引物前端分别加了一段长18bp的的M13F引物序列和长16bp的M13R引物序列，这样扩增以后的产物两端都会带上所引入的M13F及M13R引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增产物可以使用统一的M13F和M13R引物就可以进行正反向测序了，而不用针对每个扩增产物都设计一对测序引物，这样就可以显著地降低检测成本；(2)在设计扩增引物时，通过分析这几种热点突变所在的外显子位置，让扩增第1外显子的正反向引物与扩增第2外显子的正反向引物共用一对正反向扩增引物：CYP21A2-1_2-F和CYP21A2-1_2R，让扩增第3外显子的正反向引物与扩增第4、5、6外显子的正反向引物共用一对正反向扩增引物：CYP21A2-3_6F和CYP21A2-3_6R，让扩增第7外显子的正反向引物和扩增第8、9外显子的正反向引物共用一对正反向扩增引物：CYP21A2-7_9F和CYP21A2-7_9R，从而降低扩增引物的使用数量，这会进一步降低检测成本；(3)对送检样本进行PCR扩增，过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，随后采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测基因CYP21A2全外显子突变位点的突变情况；(4)利用本发明所述扩增引物和测序引物，可以扩增基因CYP21A2全外显子，通过测序结果的分析，可以很直观的了解基因CYP21A2全外显子突变位点基因突变情况，并不受基因突变多样化的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；(5)采用本发明的扩增引物对目的基因进行扩增并利用Sanger测序法检测基因CYP21A2的热点突变，具有有很高的特异性、准确性和灵敏度，以及操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1为外显子1、2测序截图。
图2为外显子3、4、5、6测序截图。
图3为外显子7、8、9测序截图。
图4为外显子10测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测基因CYP21A2突变位点的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的DNA提取试剂盒)；无水乙醇；扩增体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
扩增体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mMdNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；至少一对扩增引物用于扩增基因CYP21A2，扩增引物选自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R，其碱基序列为：
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CYP21A2-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG。
测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：M13F(3.2μm)与M13R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U，所述测序引物的碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
扩增体系PCR反应液配制如下：
其中，PrimerF/Primer选自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R。
阳性对照品：含有CYP21A2序列的溶液。
阴性对照品：无CYP21A2序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2血液样本DNA检测流程
(1)抽提血液中的基因组DNA：
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次，接着3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液；
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(13，400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12，000rpm(13，400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，从而获得血液样本DNA溶液。
(2)试剂配置：按检测人份数配置扩增体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：将2μl步骤(1)中获得的DNA加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照而言，直接加2μl阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2μl阴性对照品；对空白对照实验而言，加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，获得扩增产物，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。扩增反应条件如表1所示。
表1.扩增反应条件
(5)Sanger测序：
取9μl(4)中的PCR扩增产物与2μl测序纯化反应液。按照如表2所示的程序进行纯化，获得纯化产物。
表2
将1μl纯化产物分别与测序引物M13F(3.2μm)、M13R(3.2μm)按照如表3、表4所示的体系进行混合。
表3
表4
测序反应程序如表5所示。
表5
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HiDi后进行变性试验。变性程序如表6所示。
表6
变性程序结束后，上测序仪(ABI3500)测序。
(6)结果判断：将测序结果与野生型参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床全血样本3份，检测每份样本先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因全外显子突变情况。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。对每份样品而言，将2μl提取出的基因组DNA，加入到扩增体系PCR反应液中，同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次。一台96孔的普通PCR仪可同时检测46份样品，每份样品2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。
另外，样本1的测序结果如图1-4所示，均为野生型。样本2和3的测序结果也均为野生型。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把想要检测的CYP21A2基因全外显子都包括在内了，能够扩增出CYP21A2基因的这些外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确地扩增出CYP21A2基因全外显子，无论是野生型还是突变型。
序列表
<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测cyp21a2基因突变的方法、引物和试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgatgtggaa ccagaaagct gtaaaacgac ggccagt 37
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggcagcata gcaagaacaa cagctatgac catg 34
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcccacctca gcctcaagtt gtaaaacgac ggccagt 37
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acccgcctca tagcaatgaa cagctatgac catg 34
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acagccagtg atgctaccgt gtaaaacgac ggccagt 37
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accagcctcc accacattta acagctatga ccatg 35
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acagtcatca ttccgaacct tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagcacagtg gaccatcaga acagctatga ccatg 35
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacagctatg accatg 16
Claims (9)
1.检测CYP21A2基因突变的引物，其特征在于，包括至少一对用于扩增CYP21A2基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物选自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R、CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R、CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R、CYP21A2-10F/CYP21A2-10R，其碱基序列为：
CYP21A2-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述突变选自IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp突变。
3.一种检测样品中CYP21A2基因突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，其中，所述至少一对扩增引物选自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R；
(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型CYP21A2基因序列进行比较，确定CYP21A2基因是否发生突变；
所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
CYP21A2-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
4.一种检测样品中CYP21A2基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增体系PCR反应液和测序体系反应液，其中扩增体系PCR反应液包括至少一对扩增引物，测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，扩增引物选自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R，所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
CYP21A2-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；
CYP21A2-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT
CYP21A2-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
5.如权利要求4所述的试剂盒，所述扩增体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
9.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述突变选自G447A、525delT13、G615R、D645E突变。
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