CN107488704A - Cah相关基因靶向二代测序检测方法 - Google Patents

Cah相关基因靶向二代测序检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种先天性肾上腺皮质功能减退症(Congenital Adrenal Hyperplasia,CAH)致病基因的检测方法。具体地，本发明提供了9种CAH致病基因靶向二代测序的方法，尤其是特异性扩增CYP21A2基因的引物以及利用该引物进行CAH二代基因检测的方法，本发明还提供了包含该引物的试剂盒。本发明方法快速、有效、经济，可有效避免CYP21A1P基因的干扰，准确率高，适用于临床和实验室检测。

Description

CAH相关基因靶向二代测序检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地涉及一种CAH相关基因靶向二代测序的检测方法。
背景技术
先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,CAH)是由基因缺陷造成的肾上腺皮质类固醇激素合成障碍，进而引起下丘脑分泌CRH和垂体分泌ACTH代偿性增加，引起肾上腺皮质增生的一组常染色体隐性遗传性疾病。CAH目前共有9种亚型，累及类固醇合成过程中的9种酶缺陷，其中最常见的CAH亚型是21-羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)，约占90％～95％。21-OHD是由CYP21A2基因突变所致，根据临床表型的严重程度可分为经典型和非经典型，经典型21-OHD的发病率为1/16000-1/20000，非经典型21-OHD的发病率为1/500～1000，在高雄激素女性中则可高达2％。
目前CAH的诊断主要依据患者的临床表现、激素水平、ACTH激发实验和基因检测。因为非经典型CAH患者的症状多不明显，临床诊治中的最大问题便是非经典型CAH的诊断。ACTH激发实验(图1)主要用于诊断21-OHD，但常存在假阳性，国外一项前瞻性临床研究显示依据ACTH激发实验诊断非经典型21-OHD存在75％的假阳性。基因检测是比较可靠的一种确诊方法，且CAH的临床表现与基因型存在较好的相关性，因此美国内分泌学会2010年发表的CAH诊疗指南推荐对患者，尤其是根据临床资料难以确诊的患者，进行基因检测。目前CAH的基因诊断主要依赖Sanger测序，对怀疑突变的基因的外显子和/或内含子进行逐一检测，价格昂贵，步骤繁琐，效率极低，且当患者症状极不典型时则需对类固醇合成通路中的多个基因进行检测，十分费时费力。因此，本领域迫切需要开发快速、有效、经济的CAH诊断方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、有效、经济的CAH诊断方法。
在本发明的第一方面，提供了一种引物集，所述引物集包括用于特异性扩增CYP21A2的第一引物对，
其中，所述的CYP21A2的第一引物对包括：
第一上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；和
第一下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述的引物集还包括选自下列(a)－(i)组中的一个或多个引物对：
(a)用于扩增CYP21A2外显子或内含子的引物对；
(b)用于扩增StAR外显子或内含子的引物对；
(c)用于扩增CYP11A1外显子或内含子的引物对；
(d)用于扩增HSD3B2外显子或内含子的引物对；
(e)用于扩增CYP11B1外显子或内含子的引物对；
(f)用于扩增CYP11B2外显子或内含子的引物对；
(g)用于扩增POR外显子或内含子的引物对；
(h)用于扩增CYP17A1外显子或内含子的引物对；
(i)用于扩增H6PD外显子或内含子的引物对。
在另一优选例中，所述(a)－(i)组中的各组，各自独立地含有n个引物对，n为1-30的正整数。
在另一优选例中，所述的用于扩增CYP21A2外显子或内含子的引物对包括：
引物对A：上游引物：序列如SEQ ID NO:17所示；和下游引物：序列如SEQ ID NO:18所示；
引物对B：上游引物：序列如SEQ ID NO:19所示；和下游引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
引物对C：上游引物：序列如SEQ ID NO:21所示；和下游引物：序列如SEQ ID NO:22所示。
在另一优选例中，所述的用于扩增CYP17A1外显子或内含子的引物对包括：
引物对D：上游引物：序列如SEQ ID NO:23所示；和下游引物：序列如SEQ ID NO:24所示；
引物对E：上游引物：序列如SEQ ID NO:25所示；和下游引物：序列如SEQ ID NO:26所示。
在另一优选例中，所述的用于扩增CYP11B1外显子或内含子的引物对包括：
引物对F：上游引物：序列如SEQ ID NO:27所示；和下游引物：序列如SEQ ID NO:28所示。
在另一优选例中，所述的用于扩增HSD3B2外显子或内含子的引物对包括：
引物对G：上游引物：序列如SEQ ID NO:29所示；和下游引物：序列如SEQ ID NO:30所示。
在另一优选例中，所述的引物集还包括以下pool引物子集：
pool引物子集p1，所述的引物子集p1用于进行针对CYP21A2基因的多重PCR(pool1引物)；
pool引物子集p2，所述的引物子集p2用于进行针对CYP21A2基因的多重PCR(pool2引物)；
pool引物子集p3，所述的引物子集p3用于进行针对StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD基因的多重PCR(pool3引物)；和
pool引物子集p4，所述的引物子集p4用于进行针对StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD基因的多重PCR(pool4引物)。
在另一优选例中，pool引物子集和1pool引物子集p2中包含的引物不相同。
在另一优选例中，pool引物子集p3和1pool引物子集p4中包含的引物不相同。
在另一优选例中，pool引物子集p1包含的引物和pool引物子集p2包含的引物之间不形成引物二聚体。
在另一优选例中，pool引物子集p3包含的引物和pool引物子集p4包含的引物之间不形成引物二聚体。
在另一优选例中，pool引物子集p1、p2、p3和p4中包含的引物对所对应的扩增片段的长度为100-300bp，较佳地为150-250bp，更佳地为180-220bp。
在另一优选例中，所述的第一上游引物和第一下游引物特异性扩增对应于CYP21A2基因的扩增产物，但不扩增对应于CYP21A1P基因的扩增产物。
在另一优选例中，所述的的第一上游引物和第一下游引物产生的对应于CYP21A2基因的扩增物数量M1与产生的对应于CYP21A1P基因的扩增物数量M2之比≥105，较佳地≥106。
在另一优选例中，所述的第一引物对用于扩增CYP21A2全长基因。
在另一优选例中，所述的CYP21A2基因包括野生型CYP21A2基因和突变型CYP21A2基因。
在本发明的第二方面，提供了一种PCR扩增体系，所述的扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的本发明第一方面所述的引物集。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括一个或多个容器，和位于所述容器中的如本发明第一方面所述的引物集。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于CYP21A2基因的PCR扩增。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于针对CAH相关基因的PCR扩增。
在另一优选例中，所述的CAH相关基因选自下组：
CYP21A2基因、StAR基因、CYP11A1基因、HSD3B2基因、CYP11B1基因、CYP11B2基因、POR基因、CYP17A1基因、和H6PD基因。
在另一优选例中，所述的PCR扩增包括多重PCR。
在另一优选例中，所述的试剂盒中包括第一容器，和位于所述第一容器用于特异性扩增CYP21A2的第一引物对。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括第二容器，和位于所述第二容器中pool引物子集p1，所述的引物子集p1用于进行针对CYP21A2基因的多重PCR。(pool1引物)
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括第三容器，和位于所述第三容器中pool引物子集p2，所述的引物子集p2用于进行针对CYP21A2基因的多重PCR。(pool2引物)
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括第四容器，和位于所述第四容器中pool引物子集p3，所述的引物子集p3用于进行针对StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD基因的多重PCR。(pool3引物)
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括第五容器，和位于所述第五容器中pool引物子集p4，所述的引物子集p4用于进行针对StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD基因的多重PCR。(pool4引物)
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有用于扩增的试剂。
在另一优选例中，所述用于扩增的试剂包括缓冲剂、dNTP、和扩增酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。
在本发明的第四方面，提供了一种确定CAH相关基因的突变情况的检测方法，其中，CAH相关基因包括：CYP21A2基因、StAR基因、CYP11A1基因、HSD3B2基因、CYP21A2基因、CYP11B1基因、CYP11B2基因、POR基因、CYP17A1基因、和H6PD基因，
所述方法包括步骤：
(a)提供一待测的基因组DNA样品；
(b)利用特异性扩增CYP21A2的第一引物对，对待测的基因组DNA样品进行PCR扩增，从而获得含第一扩增产物的第一混合物；
其中，所述的CYP21A2的第一引物对包括：
第一上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；和
第一下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
(c)以第一扩增产物为模板，对CYP21A2基因进行检测，从而确定CYP21A2基因的突变情况；以及以待测的基因组DNA为模板，对除CYP21A2基因之外的其它CAH相关基因进行检测，从而确定CAH相关基因的突变情况。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的检测包括进行多重PCR，并进行测序分析。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述测序分析包括将测序结果与去除了CYP21A1P基因序列的人基因组参考序列进行比对分析。
在另一优选例中，所述的去除了CYP21A1P基因序列的人基因组参考序列是去除了CYP21A1P基因序列的人基因组hg19参考序列。
在另一优选例中，所述的去除了CYP21A1P基因序列的人基因组参考序列是hg19-new，其中，所述hg19-new是将参考序列hg19中的CYP21A1P的碱基全部替换为X所得到的序列，所述X是除ATCG外的字母。
在另一优选例中，所述的字母X为字母N。
在另一优选例中，在步骤(e)中，所述的测序包括步骤：对待测序的扩增产物添加Barcode标记，然后进行测序。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的检测包括先进行分组的多重PCR，然后将所有的PCR扩增产物进行混合，再进行测序。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的分组的多重PCR包括分成4个pool。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的多重PCR针对外显子区域进行。
在另一优选例中，在步骤(c)中，分别采用引物子集p1和引物子集p2进行针对CYP21A1P基因的多重PCR。
在另一优选例中，在步骤(c)中，采用引物子集p3和引物子集p4进行针对StAR、CYP11A1、HSD3B2、CYP11B1、CYP11B2、POR、CYP17A1和H6PD基因的多重PCR。
在另一优选例中，在步骤(c)中，采用所述的引物子集p1、p2、p3、p4进行PCR扩增，分别获得含扩增产物的第二混合物(pool1)、第三混合物(pool2)、第四混合物(pool3)和第五混合物(pool4)；
将第二混合物(pool1)、第三混合物(pool2)、第四混合物(pool3)和第五混合物(pool4)进行混合，形成总混合物；
和对所述总混合物进行测序。
在另一优选例中，在所述混合步骤中，第二混合物(pool1)、第三混合物(pool2)、第四混合物(pool3)和第五混合物(pool4)的混合比例为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(50-200):(50-200)，较佳地为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(80-150):(80-150)，更佳地为约1：1：100:100。
在另一优选例中，所述混合步骤中，先对第二混合物(pool1)和/或第三混合物(pool2)进行稀释，然后再与第四混合物(pool3)和第五混合物(pool4)的混合。
在另一优选例中，所述的稀释为1：10稀释。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的待测DNA样品提取自选自下组的样本：血液、毛发、和唾液。
在本发明的第五方面，提供了一种确定CYP21A2基因的突变情况的检测方法，包括步骤：
(a)提供一待测DNA样品；
(b)利用特异性扩增CYP21A2的第一引物对，对检测样品进行PCR扩增，从而获得第一混合物；
其中，所述的CYP21A2的第一引物对包括：
第一上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；和
第一下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
(c)以第一混合物为模板进行多重PCR，从而获得第二混合物；和
(d)对获得的第二混合物进行检测，从而获得CYP21A2基因的突变情况。
在另一优选例中，在步骤(d)中，所述的检测包括测序分析。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性方法。
在本发明的第六方面，提供了一种引物集，所述引物集包括用于特异性扩增CYP21A2的引物对，所述引物对包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和
下游引物：序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的第七方面，提供了一种引物集，所述引物集包括用于特异性扩增CYP21A2的引物对，所述引物对包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:5所示；和
下游引物：序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的第八方面，提供了一种引物集，所述引物集包括用于特异性扩增CYP21A2的引物对，所述引物对包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:7所示；和
下游引物：序列如SEQ ID NO:8所示。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了ACTH激发实验鉴别21-羟化酶缺陷症的流程。注：CCAH，即ClassicalCAH，经典型CAH，包括失盐型和单纯男性化型；NCCAH，Non-classical CAH，非经典型CAH。NCCAH随机检测17-OHP基础值可能正常，因此需在早晨8:00前筛查。因检测方法的不同，上述参考范围可能略有差别。
图2A显示了CYP21基因在染色体上的定位，箭头代表基因转录的方向。其中，C4A和C4B代表编码血清C4补体的两个基因；RP1编码一个功能未知的核蛋白的基因；RP2是其有删减的假基因；TNXB,tenascin-X gene，即肌腱蛋白基因，TNXA是其删减的假基因。TNXB基因和TNXA基因分别位于CYP21与CYP21A1P附近，且与相应的CYP21基因3’端有重叠。
图2B显示了CYP21A2基因10个常见突变的位置，其中9个来源于与假基因CYP21A1P的重组。
图3显示了CAH-Panel的工作流程。
图4显示了本发明的CYP21A2基因扩增引物序列。其中，Fw即Forward，正向引物，Rv即Reverse，反向引物，该对引物扩增CYP21A2基因全长，扩增片段长度3.5kb。红色字母是与CYP21A1P基因不同的核苷酸。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种特异性扩增CYP21A2基因的引物组合，以及利用该引物进行检测的方法，本发明还提供了包含该引物的试剂盒。实验表明，本发明的方法利用特异性扩增CYP21A2基因的引物进行预扩增，再分别进行CYP21A2基因和其他8种CAH相关基因多重PCR，并优化扩增产物混合比例，利用hg19-new为参比序列进行分析，可有效避免CYP21A1P基因的干扰，准确率高，适用于临床和实验室检测。在此基础上完成本发明。
术语
CAH
如本文所用，术语“先天性肾上腺皮质增生症”，英文名为congenital adrenalhyperplasia，缩写为CAH，是由基因缺陷造成的肾上腺皮质类固醇激素合成障碍，进而引起下丘脑分泌CRH和垂体分泌ACTH代偿性增加，引起肾上腺皮质增生的一组常染色体隐性遗传性疾病。
CAH目前共有9种亚型，累及类固醇合成过程中的9种酶缺陷(表1)，其中最常见的CAH亚型是21-羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)，约占90％～95％。21-OHD是由CYP21A2基因突变所致，根据临床表型的严重程度可分为经典型和非经典型，经典型21-OHD的发病率为1/16000-1/20000，非经典型21-OHD的发病率为1/500～1000，在高雄激素女性中则可高达2％。
表1九种不同类型的CAH
注：摘自第12版《威廉姆斯内分泌学》
根据The Human Gene Mutation Database公开数据库，CAH的9个致病基因，涉及575个突变位点(表2)，其中最为常见的CYP21A2共有179个突变位点，并无明显的热点突变可以使基因检测简化到只检测热点突变。
表2 CAH panel包含的9个基因突变数目及位置汇总
注：统计数据来源于HGMD公开数据库资料
CAH的诊断
目前CAH的诊断主要依据患者的临床表现、激素水平、ACTH激发实验和基因检测。由于非经典型CAH患者的症状多不明显，临床诊治中的最大问题便是非经典型CAH的诊断。ACTH激发实验可用于诊断21-OHD，但常存在假阳性。基因检测是比较可靠的一种确诊方法，主要依赖Sanger测序，对怀疑突变的基因的外显子和/或内含子进行逐一检测，价格昂贵，步骤繁琐，效率极低。
超过90％的CAH由CYP21A2基因突变导致，CYP21A2(Gene ID:1589)位于染色体6p21.3，全长3.5kb，在据其30kb处有一个高度同源的假基因CYP21A1P(Gene ID:1590)，外显子同源性达98％，内含子同源性达96％。假基因与CYP21A2的主要区别为外显子3中8bp的缺失，外显子7中1bp的插入，及外显子8发生的C到T的点突变形成终止密码子，这些变异导致假基因没有功能。需要强调的是，CYP21A2的突变70％-80％来源于CYP21A2与CYP21A1P的微重组(图2)。
目前，二代测序都是通过延长reads的长度来解决假基因的干扰，但能延长的reads长度最多为1000kb。对于CYP21A2，显然无法通过延长reads的长度来解决假基因的干扰。以上事实导致无法使用二代测序的方法直接进行基因组DNA检测所有CAH的致病基因。
本发明创造性地先用高保真酶扩增出CYP21A2基因全长，并单独对CYP21A2进行多重PCR，以确保假基因不被扩增。此外，本发明还通过替换形成了hg19-new参考序列，避免来源于假基因的突变比对到假基因序列，从而成功的避免了假阴性。
具体地，本发明采用以下方法，实现快速、有效、经济的CAH诊断：
(a)设计扩增CYP21A2基因全长的特异引物(图4)，获得CYP21A2基因全长的PCR产物。
(b)分别针对CYP21A2和其他8个CAH致病基因设计多重PCR引物，分别针对CYP21A2基因全长PCR产物与基因组DNA进行多重PCR扩增。
(c)混合后进行测序文库构建，最终利用Ion PGM平台测序。
(d)将hg19中CYP21A1P的序列全部用N替换，形成hg19-new，进行序列分析。
二代测序技术
下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS，也可称为“二代测序技术”)是近年来新发展的一项基因测序技术，核心特征是大规模平行测序，可同时对成千上万条短核苷酸片段进行平行测序。目前下一代测序技术主要应用于全基因组测序，全外显子测序，全转录组测序和针对特定基因的靶向测序。前三者多用于科学研究，后者多用于临床分子诊断。
本发明应用NGS技术将CAH的9个致病基因合成一个panel(CAH-Panel)，并通过157例CAH患者充分验证了CAH-Panel的有效性和准确性，为CAH的分子诊断提供了一种快速、有效、经济的诊断方法。
如本文所用，所述“CAH-Panel”指针对CAH的9个致病基因设计的靶向二代测序技术。
引物
本发明包括两类引物，一类是用于特异性扩增CYP21A2基因的第一引物(序列如SEQ ID NO:1所示)和第二引物(序列如SEQ ID NO:2所示)，即进行CYP21A2基因预扩增，扩增产物命名为p-DNA；另一类是用于CAH相关基因的多重PCR引物。其中，CAH相关基因的多重PCR分四个pool进行，pool 1、pool2的引物用于扩增p-DNA，结合的靶基因均为CYP21A2基因；pool3、pool4的引物用于扩增基因组DNA，结合的靶基因均为StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD。
需要注意的是：
Pool1中有11对引物，每对引物的扩增片段长度约为200bp。(注：因为CYP21A2基因的22对引物存在互补序列，为避免形成引物二聚体，故分为两个pool。)
Pool2中有11对引物，每对引物的扩增片段长度约为200bp。(注：因为CYP21A2基因的22对引物存在互补序列，为避免形成引物二聚体，故分为两个pool。)
Pool3中有66对引物，用于扩增StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD的片段，每对引物的扩增片段长度约为200bp。(注：因为此8个基因的130对引物存在互补序列，为避免形成引物二聚体，故分为两个pool。)
Pool4中有64对引物，用于扩增StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD的片段，每对引物的扩增片段长度约为200bp。(注：因为此8个基因的130对引物存在互补序列，为避免形成引物二聚体，故分为两个pool。)
所述引物集中包括的代表性的多重PCR引物对(各基因中发病频率最高的突变位点对应的引物)如下：
CYP21A2基因的预扩增涉及如下引物：
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的方法可以有效避免CYP21A1P基因的干扰，准确率高。
(b)本发明的方法测序CYP21A2基因与其他8个CAH相关基因的均一性好。
(c)本发明的方法简单快捷，时间和成本均优于传统方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用材料和方法
1.CAH-panel的设计
由于CYP21A2基因存在一个高度同源的假基因，设计了针对CYP21A2基因全长与CAH其他8个致病基因(StAR、CYP11A1、HSD3B2、CYP21A2、CYP11B1、CYP11B2、POR、CYP17A1、H6PD)外显子区的多重PCR引物，分为4个pool，总共152对引物，pool1和pool2用于扩增CYP21A2，即CYP21A2-panel，包括22个扩增子，target size 4.06kb，coverage 98.06％；pool3和pool4用于扩增另外8个基因，即8gene-panel，包括130个扩增子，target size22.88kb，coverage 98.35％。
2.CAH-panel的操作流程
CAH-panel操作流程如图3所示，具体地，包括：
2.1样本的准备
(1)提取患者DNA：经患者知情同意后，用QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen,Hilden,Germany)抽提患者EDTA抗凝外周血白细胞DNA，记为g-DNA。
(2)CYP21A2基因预扩增：设计特异引物，引物序列如图4所示，用KOD-Plus-Ver2高保真酶(保真性为Taq DNA Polymerase的80倍)扩增患者外周血基因组中的CYP21A2基因全长，扩增产物命名为p-DNA，其长度为3.5kb。
(3)样本的纯化：用AgencourtAMPure XP磁珠(简称“AMP磁珠”,Beckman Coulter,USA)对g-DNA和p-DNA进行纯化，然后用Qubit试剂(QubitdsDNA HS Assay Kit,LifeTechnologies,USA)测定DNA浓度，要求DNA浓度不低于6.67ng/μL，纯化10个样本耗时约2.5h，以下耗时均按同时操作10个样本计算。
2.2文库的构建
(1)多重PCR：按下述反应体系进行多重PCR
5×HiFi 1μL
2×pool 2.5μL
DNA 10ng
无酶水将该反应体系补足至5μL。
pool1、pool2的引物用于扩增p-DNA，pool3、pool4的引物用于扩增g-DNA。配好反应体系后，放入PCR仪，99℃2min→(99℃15sec→60℃4min)×19cycles→10℃hold。此步耗时约2.5h，其中需人工操作的时间约为1h。
(2)消化引物及磷酸化：将pool 1、pool2的多重PCR产物均稀释10倍，然后将同一样本的pool 1、pool2稀释后的产物各取0.5μL与其pool3、pool4的多重PCR产物(各5μL)混合，加9μL无酶水补足至20μL，再加2μLFupaReagent，混匀后放入PCR仪，50℃10min→55℃10min→60℃20min→10℃hold。此步耗时约2h,其中需人工操作的时间约为1h。
(3)连接接头：首先稀释Barcode，按Barcode:P1：H2O＝1:1:2的比例稀释Barcode。22μL的消化产物中加4μL Switch终止FupaReagent的消化作用，再加2μL稀释后的Barcode及2μL DNA Ligase，放入PCR仪，22℃30min→72℃10min→10℃hold。注意同一张芯片不可有相同的Barcode。此步耗时约2h，其中需人工操作的时间约为1h。
(4)连接产物的纯化：30μL的连接产物加45μL AMP磁珠进行纯化，最后用50μL lowTE洗脱DNA，将上清转移至干净EP管中，样本的文库构建即完成。此步耗时约1.5h。
(5)qPCR测文库浓度：用Ion Library TaqMan Quantitation Kit(AppliedBiosystems by Life Technologies，USA)对文库进行qPCR定量，耗时约2h，其中需人工操作的时间约为1h。
2.3DNA测序
(1)油包水PCR：取一定量各样本的文库稀释至同一浓度后混合，按Ion PGMOT2Kit进行油包水PCR，然后富集ISP磁珠。耗时约5h～6h，其中需人工操作的时间约为1h。
(2)上机测序：提前启动Ion Torrent PGM，进行初始化。连接测序引物，然后load到Ion芯片上，启动Sequencing Run，耗时约3h，其中需人工操作的时间约为0.5h。
2.4数据分析
(1)原始数据分析：成功测序后，原始数据用Torrent Suite进行分析，主要包括信号处理、碱基召唤、PCR多克隆的删除、测序质量评分、比对到hg19-new参考序列(将hg19中CYP21A1P的序列全部用N替换，故命名为hg19-new，下文<讨论>部分会解释这么做的原因)、Coverage Analysis插件分析测序深度及覆盖率、Variant Caller插件Call出所有的变异位点(碱基替换、小片段的插入与缺失突变)等。此分析过程与测序的过程同时进行。
(2)变异位点的注释：Variant Caller插件分析后会产生一个VCF文件，将该文件上传到https://ionreporter.thermofisher.com/ir/网站进行在线分析，可对变异位点进行功能学注释及SIFT、PolyPhen预测，同时与dbSNP、Clinvar、5000Exoms等数据库进行比对分析。通过一系列过滤设置，如UCSC Common SNPs NOT IN、MAF<0.5、突变位点位置位于外显子等条件进行过滤，可快速找出可能的致病突变。耗时约0.5h。
3.样本的来源
根据2010年美国内分泌学分会发布的CAH指南及第12版《威廉姆斯内分泌学》CAH的诊断标准，入组了2008-2015年期间瑞金医院收治的157例CAH患者及10位正常对照者，经知情同意，留取2mL EDTA抗凝外周血。
4.CAH-Panel有效性的验证
21-OHD是最常见的CAH类型，由CYP21A2基因突变所致，该基因常见的突变有8种：I172N，I2g，Ex3del，P30L，Q318X，V281L，R356W及Ex6Cluster。为了验证该Panel的敏感性及可靠性，选取已经Sanger测序证明有上述8种突变中一种或一种以上的21-OHD患者6名，经Sanger测序明确诊断的CYP17A1、CYP11B1、HSD3B2和CYP11A1基因突变的CAH患者各一名及10位正常对照者，进行CAH-Panel测序。
5.CAH-Panel的推广应用
经上述10位CAH患者及10位正常对照者验证后，对其他147位CAH患者进行了CAH-Panel测序，对发现的突变位点均进行Sanger测序验证，验证本发明的CAH-Panel的可行性。
实施例1
CAH诊断方法的改良
待测者为阳性验证者C1，根据临床表现已确诊为21-OHD，PCR-Sanger测序确定为CYP21A2基因的I172N和Q318复合杂合突变。
为获得较佳地CAH诊断方法，用如下方案检测待测者的基因突变情况
初始方案：设计170对引物,分装为3个primer pool,多重PCR扩增CAH的9个致病基因，然后进行油包水PCR、上机测序，测序结果比对到人基因组参考序列hg19。
改良方案1：使用hg19-new作为新参考序列；
改良方案2：CYP21A2与其他8基因分别进行多重PCR扩增；
改良方案3：CYP21A2多重PCR上样量调至5pg～10ng，多重PCR循环数14～19；
改良方案4：CYP21A2基因的多重PCR产物直接稀释10倍，然后与8gene的多重PCR产物1:10混合。
各方案的测试结果如表3所示。
表3测序方案结果总结
变异位点 数据通量比值
PCR-Sanger测序 I172N和Q318X NA
初始方案 无基因突变 NA
改良方案1 14个(具体见表2) NA
改良方案2 I172N和Q318X 2:1
改良方案3 I172N和Q318X 1～2.35:1
改良方案4 I172N和Q318X 1/5～1/2:1
具体地，设计的最初版CAH-panel(初始方案)，用Variant Caller插件进行变异位点分析，未能检测出这两个杂合突变，而原始BAM文件提示假基因CYP21A1P处N172位点和318个密码子处均有大量reads。提示CYP21A1P假基因在序列分析过程中干扰了序列比对，导致假阳性。
为了排除CYP21A1P的干扰，改良方案1将hg19中CYP21A1P的序列全部用N替换，形成hg19-new。重新进行序列分析，发现14个变异位点，具体位点参见表4。但这些突变位点均是CYP21A2与CYP21A1P存在差异的位点。原始BAM文件确认这些变异位点确实存在突变的reads。除此之外，其他9个验证样本，包括17-OHD，11β-OHD，3β-HSD等验证者的CYP21A2基因均出现14个同样的突变位点，提示多重PCR过程引入了大量假阳性位点。
表4以hg19-new为reference重分析的结果
改良方案2通过CYP21A2基因全长的特异性扩增引物(图4)，用保真性为Taq酶80倍的高保真酶KOD Plus Ver2，获得CYP21A2基因全长。分别针对CYP21A2和其他8个CAH致病基因进行多重PCR扩增，成功检测出已经Sanger测序确认过的I172N和Q318混合杂合突变。
虽然改良方案2成功解决了假阳性与假阴性的问题，还有一个问题不容忽视，CYP21A2基因所占的数据通量是8gene的近2倍，导致其他8个突变基因(8gene)的测序深度不足，样本测序的均一性不好。改良方案3降低了CYP21A2基因的多重PCR上样量及多重PCR循环数，但数据通量均无明显改善。改良方案4直接稀释了CYP21A2基因多重PCR产物10倍，然后与其他8个突变基因的多重PCR产物1:10混合，使得CYP21A2的数据通量降到其他8个突变基因数据通量的1/5-1/2，碱基覆盖的均一性提高到90％以上，具体结果见表5。
表5 CAH-Panel数据通量比例优化过程
实施例2
CAH-Panel有效性的验证
对10位CAH患者及10位正常对照者进行CAH-Panel测序验证，共产生4.36Mb的reads，其中mapped reads为2.9Mb，平均每个样本的每个扩增子有940.3条reads(0-2671)，CYP21A2基因有3个扩增子位于UTR区，扩增效率很低，H6PD基因有一个扩增子基本扩增不出来，可能是由于该区GC含量很高或引物设计的问题，去除这四个扩增子产生的极端值，则每个扩增子的reads为39-2671。每个样本的平均reads长度为161bp(141-175bp)。98％的碱基可以比对到参考基因组序列hg19-new，平均97.71％(95.36-98.69％)的reads可以比对到靶向区域，碱基的平均测序深度为878.5(298.1-1746)。每个扩增子覆盖率的均一性为92.18％(82.24％-94.08％)，平均每个样本有99.05％(96.71％-100％)的扩增子至少有1条read，98.03％(Range 97.37％-98.68％)的扩增子至少有20条reads，94.08％(Range78.95％-99.34％)的扩增子至少有100条reads。2013年美国医学遗传学和基因组学学院(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)建议对于来源于生殖细胞的疾病，每个扩增子至少要有20-30条reads以保证二代测序的准确性，除去这4个低效率扩增的扩增子，检测的扩增子的reads数均不低于20，完全符合要求。
10位CAH验证者共涉及30个突变，包括碱基置换和小片段缺失，CAH-Panel均可准确检出相应的基因突变(表6)，而10个正常对照者则未检测出基因突变，说明该CAH-Panel的准确性为100％。
表6 CAH-panel的验证
实施例3
CAH-Panel的推广应用
对另外147位CAH患者进行CAH-Panel测序，共产生10.46M的reads，其中mappedreads为10.38M，平均每个样本的每个扩增子有477.1条reads(20-65425，4个低效率扩增子未包括在内)，reads平均长度172bp。碱基平均测序深度为422.3(113-1746)，均一性为92.4％(79.7％-97.0％)。161个样本总共检测出8443个变异位点，包括碱基置换和小片段插入/缺失，过滤掉同义突变、SNP位点改变及大部分内含子、UTR区突变后，剩余致病突变385个。161例患者中6例患者未检测出致病突变，15例患者属于杂合携带者，其余130例患者均检测出CAH相关致病突变，且其中4位患者同时有两个基因检测出致病突变。所有检测出的致病突变均用Sanger测序验证，检测出的变异位点与CAH-Panel完全一致。
对比例
CYP21A2基因存在一个高度同源的假基因CYP21A1P，对CYP21A2基因预扩增时，应尽量避免假基因的非特异性扩增。
根据上述原则，申请人设计了八对引物，引物信息如下表所示。
利用上述八对引物，用KOD-Plus-Ver2高保真酶(保真性为Taq DNA Polymerase的80倍)，分别扩增患者外周血基因组中的CYP21A2基因全长。结果发现，引物对1、2、3、4的扩增效果较好，扩增效率高且特异性好，其中引物对1的扩增效果最好，以引物对1进行后续的检测试验；引物对5、6、7、8的扩增效果比较差，或是扩增效率低，或是特异性差，非特异性扩增CYP21A1P基因，不适合进行后续试验。
讨论
作为人类最常见的常染色体隐性遗传病之一，CAH目前的诊断主要依据患者的临床表现和激素水平。但对于非经典型CAH，患者的临床表现和激素改变水平均不明显，临床诊断困难。基因检测虽然可以协助诊断，但传统的Sanger测序方法，费时费力，价格不菲。
NGS技术是近年来发展的一种基因测序技术，其中针对靶基因的NGS技术在临床分子诊断中具有很好的前景。本发明利用这一新技术，设计了CAH-Panel，针对CAH的9个致病基因，设计了4个引物池，用于扩增152个扩增子，主要扩增基因的外显子区及邻近内含子区，基因覆盖率98％以上，并用来自于本中心150余例CAH患者的数据证实了该Panel的有效性。
本发明的CAH-Panel为CAH的分子诊断提供了一种新的简单快捷的方法，可以同时检测9个基因，仅需12-15个小时，其中需人工操作的时间不足10小时。而且CAH-Panel所需的样本量极少，所需DNA量仅为40ng-240ng(扩增CYP21A2基因需要20-200ng gDNA，pool3和pool4的多重PCR反应各需要10ng gDNA)。平均每个样本的检测成本约为1000元。而且随着二代测序的进一步发展，该测序成本有望进一步降低，相比Sanger测序，在时间及成本方面具有绝对优势。
本发明的CAH-Panel的第二个创新之处是成功解决了CYP21A2的二代测序问题。CYP21A2基因位于染色体6p21.3，全长3.4kb，编码21羟化酶，超过90％的CAH是由CYP21A2基因缺陷造成的21-OHD。在距CYP21A2基因30kb处存在一个与其高度同源的假基因CYP21A1P，外显子同源性高达98％，内含子同源性为96％。CYP21A2的突变70％以上来源于其与假基因的微重组。目前，二代测序技术只能扩增150-400bp的片段，测序片段根据最大相似性比对人类基因组数据。因而，两个问题无法回避：一是CYP21A2基因的特异扩增，由于CYP21A2与CYP21A1P的高度同源性，在150-400bp的范围内难以设计特异性的引物仅扩增CYP21A2，CYP21A1P的扩增使得测序结果存在大量假阳性位点；二是与基因组中CYP21A2基因的特异比对，由于CYP21A2基因70％以上的突变来源于与假基因CYP21A1P的重组，而测序的片段是通过最大相似性比对到全基因组，如果恰好是来自于假基因的突变，就会被比对到基因组中假基因的序列中，从而导致假阴性。针对假基因的问题，其他的一些二代测序研究中往往选择延长扩增片段的长度到800bp左右，然而CYP21A2与CYP21A1P的同源性如此之高，即使延长扩增片段的长度到800bp也难以解决，而目前的二代测序技术没法将扩增片段长度延伸到更长。因此本发明首先用高保真酶扩增出CYP21A2基因全长，单独对CYP21A2进行多重PCR，以确保假基因不被扩增。同时为避免其他8个基因可能存在的测序深度不足，本发明对多重PCR步骤中DNA上样量、PCR循环数、PCR产物的混合比例等环节进行测试，最终较好的均衡CYP21A2基因与另外8个基因所占的数据通量。而为了解决假阴性的问题，本发明将hg19参考基因组序列中的CYP21A1P假基因序列全部用N替换，即形成hg19-new参考序列，这样来源于假基因的突变就不会比对到假基因序列，从而成功的避免了假阴性。
至于应用，本发明的CAH-Panel不仅可以用于科学研究以及CAH的基因诊断，还可用于婚前检测基因突变携带者、产前筛查及科学研究等。多囊卵巢综合征与非经典型CAH常常难以鉴别，CAH-Panel则可以用于两者之间的鉴别诊断。据报道，在高雄血症的女性中高达2％的患者其实是CAH，因此CAH-Panel可以用于在高雄血症的女性中筛查CAH。此外，因为CAH的临床表现与基因型存在一定的相关性，运用CAH-Panel对患者进行快速的分子诊断，可以指导临床治疗，从而实现真正的精准医学。
综上所述，本发明提供了一种经济快速、准确有效的CAH基因检测方法，大大地优于现有的CAH分子诊断方法，并且创新性地解决了CYP21A2的二代测序难题，使该CAH-Panel在临床分子诊断及科研中都具有重要的应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种引物集，其特征在于，所述引物集包括用于特异性扩增CYP21A2的第一引物对，
其中，所述的CYP21A2的第一引物对包括：
第一上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；和
第一下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的引物集还包括选自下列(a)－(i)组中的一个或多个引物对：
(a)用于扩增CYP21A2外显子或内含子的引物对；
(b)用于扩增StAR外显子或内含子的引物对；
(c)用于扩增CYP11A1外显子或内含子的引物对；
(d)用于扩增HSD3B2外显子或内含子的引物对；
(e)用于扩增CYP11B1外显子或内含子的引物对；
(f)用于扩增CYP11B2外显子或内含子的引物对；
(g)用于扩增POR外显子或内含子的引物对；
(h)用于扩增CYP17A1外显子或内含子的引物对；
(i)用于扩增H6PD外显子或内含子的引物对。
3.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的引物集还包括以下pool引物子集：
pool引物子集p1，所述的引物子集p1用于进行针对CYP21A2基因的多重PCR(pool1引物)；
pool引物子集p2，所述的引物子集p2用于进行针对CYP21A2基因的多重PCR(pool2引物)；
pool引物子集p3，所述的引物子集p3用于进行针对StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD基因的多重PCR(pool3引物)；和
pool引物子集p4，所述的引物子集p4用于进行针对StAR,CYP11A1,HSD3B2,CYP11B1,CYP11B2,POR,CYP17A1,H6PD基因的多重PCR(pool4引物)。
4.如权利要求3所述的引物集，其特征在于，pool引物子集p1、p2、p3和p4中包含的引物对所对应的扩增片段的长度为100-300bp，较佳地为150-250bp，更佳地为180-220bp。
5.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的第一上游引物和第一下游引物特异性扩增对应于CYP21A2基因的扩增产物，但不扩增对应于CYP21A1P基因的扩增产物。
6.一种PCR扩增体系，其特征在于，所述的扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的权利要求1所述的引物集。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括一个或多个容器，和位于所述容器中的如权利要求1所述的引物集。
8.一种确定CAH相关基因的突变情况的检测方法，其中，CAH相关基因包括：CYP21A2基因、StAR基因、CYP11A1基因、HSD3B2基因、CYP21A2基因、CYP11B1基因、CYP11B2基因、POR基因、CYP17A1基因、和H6PD基因，其特征在于，
所述方法包括步骤：
(a)提供一待测的基因组DNA样品；
(b)利用特异性扩增CYP21A2的第一引物对，对待测的基因组DNA样品进行PCR扩增，从而获得含第一扩增产物的第一混合物；
其中，所述的CYP21A2的第一引物对包括：
第一上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；和
第一下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
(c)以第一扩增产物为模板，对CYP21A2基因进行检测，从而确定CYP21A2基因的突变情况；以及以待测的基因组DNA为模板，对除CYP21A2基因之外的其它CAH相关基因进行检测，从而确定CAH相关基因的突变情况。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述的检测包括进行多重PCR，并进行测序分析。
10.一种确定CYP21A2基因的突变情况的检测方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一待测DNA样品；
(b)利用特异性扩增CYP21A2的第一引物对，对检测样品进行PCR扩增，从而获得第一混合物；
其中，所述的CYP21A2的第一引物对包括：
第一上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；和
第一下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
(c)以第一混合物为模板进行多重PCR，从而获得第二混合物；和
(d)对获得的第二混合物进行检测，从而获得CYP21A2基因的突变情况。
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