CN106011302A - Atp7b基因突变检测引物组和试剂盒、其检测方法及应用 - Google Patents

Atp7b基因突变检测引物组和试剂盒、其检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、其检测方法及应用，本发明的引物组涉及到ATP7B基因的大部分区域，包括外显子和内含子，能较为全面获取患者的ATP7B基因的核苷酸序列情况，明确突变位点；且该引物组针对长片段扩增，在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，且由于扩增片段长，与短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单。

Description

ATP7B基因突变检测引物组和试剂盒、其检测方法及应用
技术领域
本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、其检测方法及应用。
背景技术
肝豆状核变性，又称Wilson Disease(WD)，是一种具有不同发病年龄和不同临床表型的严重的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病。国外流行病学调查资料显示，期患病率为1.5-3.0/10万，基因频率为0.3-0.7％。在中国汉族人群中的携带率为1/50。肝豆状核变性最常见的临床表现为肝硬化、神经系统症状和精神症状。肝豆状核变性主要是通过临床表现如肝脏或/和神经系统症状、家族史、角膜色素环、生化检查包括检测血清铜蓝蛋白、24小时尿铜以及基因突变分析等来确诊。肝豆状核变性是目前遗传性疾病中治疗效果较好的，早期诊断并给予控制铜摄入和排铜治疗，对患者的治疗效果具有积极和重要的意义。然而，由于该病在临床表现的多样性，容易出现误诊漏诊，错过最佳治疗时间，对病人造成不同程度的不可逆损害。
ATP7B(ATPase Cu2+transporting beta polypeptide，β多肽铜转运ATP酶)是肝豆状核变性致病基因，定位于13q14.3，全长78826bp，包括21个外显子和20个内含子，它编码一个P型铜转运ATP酶。ATP7B基因包括14个功能域：6个铜离子结合区、4个跨膜功能区、1个转导区、1个离子通道及磷酸化区、1个核酸结合域和1个三磷酸腺苷(ATP)结合区。目前，已知ATP7B基因突变超过500种，突变类型包括缺失突变、插入突变、移码突变、错义突变和剪接突变等，其中点突变，尤其是错义突变最为常见。突变分为杂合突变和纯合突变两种突变形式，其中杂合突变更为常见。绝大多数突变位点均位于外显子上，多位于跨膜区及ATP功能区，也有少数突变点位于外显子/内含子交界侧翼区中。因此对ATP7B外显子以外的其他区域进行测序分析，对于明确诊断具有重要的意义。
近年来快速发展的高通量二代测序技术(next-generationsequencing,NGS)是在基于第一代测序技术的基础上被广泛应用于遗传病的诊断与携带者筛查。二代测序由模板制备和序列检测过程以及数据分析过程两部分组成。其中，在技术上以边合成边测序为核心，通过大规模平行测序的手段，同时对数以百万计的短DNA片段测序，获得海量的序列信息，然后利用生物信息学工具进行分析。Nature Methods杂志在2014年点评了过去十年对生物学研究影响最深的十大技术，二代测序居首位。二代测序的策略包括全基因组、外显子组、目标区域、表达谱、甲基化、染色体免疫共沉淀测序等。其中，目标区域重测序是指针对感兴趣的目标区域或基因，通过靶区域捕获或扩增的方法富集，然后进行大规模测序。与全基因组、全外显子组测序方法相比，目标区域重测序能大规模、低成本筛查特定疾病的已知致病位点，在临床诊断方面有着巨大的应用前景。
发明内容
本申请主要解决的技术问题是提供一种ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、其检测方法及应用，能够准确、灵敏地检测ATP7B基因突变。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第一个技术方案是：提供一种用于检测ATP7B基因突变的引物组，与现有技术相比，其不同之处在于，该引物组包括用于在PCR中扩增ATP7B基因多个长片段的检测引物对，该引物组包括选自下列引物对中的至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、或全部10对引物：
序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的引物对。
其中，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第二个技术方案是：提供一种用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，与现有技术相比，其不同之处在于，该试剂盒包括上述的引物组。
其中，该试剂盒还包括以下一种或多种试剂:
用于从样品提取基因组DNA的试剂；
利用所述引物组中的引物对进行PCR反应的试剂；
用于处理PCR扩增产物以使扩增产物能够进行高通量测序的试剂；
以及
用于对处理后的PCR扩增产物进行高通量测序的试剂。
其中，所述高通量测序为Ion Torrent测序。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第三个技术方案是：提供一种ATP7B基因突变的检测方法，与现有技术相比，其不同之处在于，该方法包括如下步骤：
获得样品的基因组DNA；
利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；
将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进行基因型分析以确定基因突变情况。
或者，一种ATP7B基因突变的检测方法，与现有技术相比，其不同之处在于，该方法包括如下步骤：
获得样品的基因组DNA；
利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；
将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进行高通量测序；
对高通量测序结果进行分析，确定ATP7B基因突变情况。
其中，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第四个技术方案是：提供一种利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒在ATP7B基因突变检测中的应用。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第五个技术方案是：提供一种利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒在肝豆状核变性筛查中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明的引物组涉及到ATP7B基因的大部分区域，包括外显子和内含子，能较为全面获取患者的ATP7B基因的核苷酸序列情况，明确突变位点；且该引物组针对长片段扩增，在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，且由于扩增片段长，与短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单；本发明的试剂盒及检测方法采用长片段DNA扩增方法结合二代测序技术的方式，具有高效、特异性强、灵敏度高、低成本的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中家系成员ATP7B基因上家系谱图。
具体实施例
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本发明提供了ATP7B基因突变检测引物组和试剂盒、ATP7B基因突变检测方法及引物组和试剂盒在ATP7B基因突变检测以及肝豆状核变性筛查中的应用。本说明书中所述“突变”可以是一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失，或基因扩增突变。所述“扩增突变”是指基因或基因的外显子或基因的外显子的区域的拷贝数选择性地增加的现象和过程，属于基因拷贝数变异(Copy number variations,CNV)的一种，扩增突变很有可能导致相应蛋白表达的增加。
本发明的引物组分别用于扩增ATP7B基因的相应区域的长片段，然后将扩增的目标片段进行基因型分析以确定基因突变情况，例如，将扩增后的目标片段进行高通量测序，以获得扩增的目标片段的序列信息，并由此获得突变检测结果。
因此，本发明的引物组涉及到ATP7B基因的大部分区域，包括外显子和内含子，其包括选自表1所示引物对中的至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、或全部10对引物：
表1检测引物对
肝豆状核变性致病基因的信息：
通过Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，http://omim.org/)数据库获得肝豆状核变性(#277900.WilsonDisease)致病基因(*606882,ATPase,Cu(2+)-Transporting,BetaPolypeptide；ATP7B)信息，包括ATP7B基因位置信息(表2)。
表2肝豆状核变性致病基因ATP7B位置信息
序号 临床分型 致病基因 基因全区间 基因全长
1 肝豆状核变性 ATP7B chr13:52,506,806-52,585,630 78,825bp
针对ATP7B基因设计引物：
以基因组DNA为模板，根据UCSC Genome Bioinformatics数据库提供的标准序列(GRCh37/hg19)，下载的ATP7B基因序列位置分别在头部和尾部加约1200bp和4300bp，共设计10对长片段引物扩增ATP7B基因全长(包含内含子和外显子)，每对引物扩增约10kb的片段长度，具体的引物序列如表1。然后经二代测序(NGS)筛选突变位点。
本发明的用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，包括上述的引物组，还包括以下一种或多种试剂:
用于从样品提取基因组DNA的试剂；
利用所述引物组中的引物对进行PCR反应的试剂；
用于处理PCR扩增产物以使扩增产物能够进行高通量测序的试剂；
以及
用于对处理后的PCR扩增产物进行高通量测序的试剂。
其中，所述高通量测序为Ion Torrent测序。
本发明的ATP7B基因突变的检测方法，与现有技术相比，其不同之处在于，该方法包括如下步骤：
获得样品的基因组DNA；
利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；
将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进行基因型分析以确定基因突变情况。
或者，该方法包括如下步骤：
获得样品的基因组DNA；
利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；
将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进行高通量测序；
对高通量测序结果进行分析，确定ATP7B基因突变情况。
其中，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。
高通量测序为Ion Torrent测序，优选使用Life Technologies公司的Ion PGM测序仪进行。Ion Torrent测序技术也被本领域技术人员称为二代测序技术，其是基于DNA合成过程所产生的化学变化。DNA聚合酶以单链DNA为模板，按碱基互补原理，合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，导致局部pH变化。Ion Torrent半导体测序芯片的每个微孔里的微球表面含有约100万个DNA分子拷贝。测序时核苷酸分子连续流过芯片微孔。如果一个核苷酸与某个微孔中的DNA分子互补，则该核苷酸被合成到DNA分子中，并且释放质子，该微孔中溶液的pH发生变化。离子传感器检测到pH变化后，将该化学信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有两个相同的碱基，则记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配，则无质子释放，也就没有电压信号的变化。Ion Torrent测序技术属于直接检测DNA的合成，即，边合成边检测。另外，Ion Torrent测序技术不需要CCD扫描、荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间，从而提高了检测效率。
试剂盒包含的从样品中提取基因组DNA是本领域的常规技术，并且目前市场上有很多成熟完善的商品化试剂可供选择。
试剂盒包含的用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。PCR扩增产物一般无法直接用于高通量测序，还需要进行处理，例如，末端修复，连接接头和标签、纯化、修复缺口等。对于掌握高通量测序的普通技术人员而言，上述处理步骤和所需要的试剂是容易理解的。本申请的实施例也提供了示例性的处理方法。
试剂盒包含的用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。高通量测序通常是在微孔芯片上进行的。目前，商业化的芯片和反应试剂容易购得，例如可购自Life Technologies Inc.。
具体地，样本基因组DNA的提取：取外周静脉血2ml，枸橼酸钠抗凝。采用QIAamp DNA MiniKit(Qiagen)提取全血基因组DNA，并放置-20℃保存。
PCR扩增，反应体系为20μl，长片段扩增酶0.5U，DNA模板30ng和上下游引物(10μM)各0.4μl。反应条件：94℃预变性1min；98℃10s，65℃退火30s，68℃延伸10min；30个循环后68℃孵育30min。取扩增产物4μl经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
Ion Torrent测序：PCR产物混合后，通过Ion Shear Plus ReagentKit(Life technologies)酶切片段化，并采用Ion Plus FragmentLibrary Kit(Life technologies)和Ion Xpress Barcode Adapter 1-16(Life technology)连接标签接头(Barcode Adapter)，不同的家系成员使用不同的标签接头(Barcode Adapter)。连接完成后通过E-gel电泳制备平均大小约250bp的文库模板，纯化处理后再用Ion PlusFragment Library Kit(Life technologies)进行PCR扩增制备文库，制备好的DNA文库需要通过Qubit 2.0进行定量，然后稀释成相应的浓度再通过Ion One Touch进行乳液PCR，并通过磁珠颗粒在Ion One TouchES上对阳性模板进行富集，最后采用Ion PGM 200Sequencing Kit(Lifetechnologies)及Ion Torrent 318芯片在Ion Torrent PGM平台进行测序反应，共125测序循环。
测序结果分析：采用Ion Torrent Suite v3.0软件进行Ion Torrent数据提取及序列比对和过滤。得到的突变位点经dbSNP数据库过滤后，检索肝豆状核变性数据库(http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/database.asp)，筛选可能的致病突变位点。
核心家系遗传分析：二代测序发现并经数据库比对得到的后续突变位点，通过核心家系遗传分析，确定符合孟德尔隐性遗传规律的位点为该先证者的致病基因突变位点。
在本发明中，设计了10对引物，采用长片段DNA的PCR扩增方法对肝豆状核变性的致病基因ATP7B进行富集，然后在Ion TorrentPGM/ion Proton二代测序平台进行全基因重测序。该方法能够全面覆盖ATP7B基因的所有外显子、内含子及其他区域，具有简单易行、准确率高、速度快、成本低等特点。此方法在肝豆状核变性的分子诊断中将具有非常高的实际临床应用价值。
实施例1：
1、家系情况：先证者临床表现为肝功能异常，转氨酶升高，血浆铜蓝蛋白69.6mg/L，角膜K-F环(-)。父母双方家族中无其他患者，先证者父母均表型正常，非近亲婚配，且孕期无用药史或不良环境接触史。本研究经深圳市人口和计划生育科学研究所医学伦理委员会批准，所有基因诊断均取得患者家属的同意并签署知情同意书。
2、方法：
(1)标本收集和DNA提取：取先证者及其父母的外周静脉血各2mL，枸橼酸钠抗凝。采用QIAamp DNA MiniKit(Qiagen)提取全血基因组DNA，并放置-20℃保存。(2)致病基因全长基因序列分析：筛查致病基因ATP7B。以基因组DNA为模板，根据UCSC Genome Bioinformatics数据库提供的标准序列(GRCh37/hg19)，共设计10对长片段引物扩增ATP7B基因全长(包括全部内含子和外显子)，每对引物扩增约10kb的片断长度，然后经二代测序(NGS)筛选突变位点。具体的引物序列如表1。(3)PCR扩增：反应体系为20μL，长片段扩增酶0.5U，DNA模板30ng和上下游引物(10μM)各0.4μL。反应条件：94℃预变性1min；98℃10s，65℃退火30s，68℃延伸10min；30个循环后68℃孵育30min。取扩增产物4μL经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。(4)Ion Torrent测序：PCR产物混合后，通过Ion Shear Plus Reagent Kit(Life technologies)酶切片段化，并采用Ion Plus Fragment Library Kit(Lifetechnologies)和Ion Xpress Barcode Adapters 1-16(Lifetechnologies)连接Barcode Adapter，不同的家系成员使用不同的Barcode Adapter。连接完成后通过E-gel电泳制备平均大小约250bp的文库模板，纯化处理后再用Ion Plus Fragment Library Kit(Lifetechnologies)进行PCR扩增制备文库。制备好的DNA文库需要通过Qubit 2.0进行定量，然后稀释成相应的浓度再通过Ion OneTouch进行乳液PCR，并通过磁珠颗粒在Ion OneTouch ES上对阳性模板进行富集，最后采用Ion PGM 200Sequencing Kit(Life technologies)及Ion Torrent 318芯片在Ion Torrent PGM平台进行测序反应，共125个测序循环。(4)测序结果分析：采用Ion Torrent Suite v3.0软件进行Ion Torrent数据提取及序列比对和过滤。得到的突变位点经dbSNP数据库过滤后，检索HGMD、LOVD等数据库及查询相关文献，并查询检索肝豆状核变性数据库(http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/database.asp)筛选出可能的突变位点。(5)核心家系遗传分析：二代测序发现并经数据库比对得到的候选突变位点，通过核心家系遗传分析，确定符合孟德尔隐性遗传规律的位点为该先证者的致病基因突变位点。
3、结果：
(1)基因测序质量：从表3看出，父亲、母亲和患者的样本测序读数分别为225972、222637和168159,测序平均深度分别为342.1、335.0和248.9，平均读长分别是166bp、164bp和163bp。(2)基因测序诊断：先证者：先证者的ATP7B基因共检测到双重杂合突变，分别为p.Ala1328Thr(c.3982G>A)和p.Pro992Leu(c.2975C>T)。父亲：父亲的ATP7B基因检测到1个杂合突变p.Ala1328Thr(c.3982G>A)。母亲：母亲的ATP7B基因检测到1个杂合突变，p.Pro992Leu(c.2975C>T)。(见表4)。(3)核心家系分析：数据分析)p.Ala1328Thr和p.Pro992Leu均为已知的Wilson Disease致病突变(Wilson Disease疾病数据库收纳，且在1000Genomes数据库正常人群无检出)。其中，p.Pro992Leu为中国人群突变热点。先证者为肝豆状核变性患者，致病突变为c.3982G>A和c.2975C>T构成双重杂合子突变，其中c.3982G>A突变遗传来自父亲，c.2975C>T遗传来自母亲，符合孟德尔常染色体隐性遗传规律(见家系图1)。建议该家庭在二胎妊娠过程中做产前基因诊断，以避免再出生于先证者类似病情的患儿。
表3 Ion Torrent的测序质量
表4家系成员中的ATP7B基因突变情况
a等位基因父亲来源，b等位基因母亲来源；致病基因用粗体显
本实施例的积极有益效果：
1、本实施例采用长片段DNA扩增方法结合二代测序技术筛查肝豆状核变性致病基因ATP7B的突变。与传统方法相比，该测序方法覆盖了基因全部区域，包全部外显子和内含子，能全面获取患者在ATP7B中核苷酸序列情况，明确突变位点，为检测基因突变提供了可靠的方法，具有很强的灵敏度和准确性，为肝豆状核变性的临床诊断提供分子生物学的诊断依据。
2、本实施例的PCR引物设计合理、高效、特异性强、灵敏度高，利用该引物通过检测外周血提取DNA进行体外扩增，得到所需的PCR产物再进行测序，与全基因组测序、外显子组测序方法相比，具有高效、低成本的优势。
3、本实施例设计的引物在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，且由于扩增片段长，与短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单。
4、本实施例针对ATP7B基因全部外显子、内含子进行PCR扩增再测序，可以为发现肝豆状核变性在ATP7B新突变的科学研究提供技术手段。
5、本实施例还可以应用在其他与ATP7B突变相关的筛查。
以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测ATP7B基因突变的引物组，其特征在于，该引物组包括用于在PCR中扩增ATP7B基因多个长片段的检测引物对，该引物组包括选自下列引物对中的至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、或全部10对引物：
序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的引物对；
序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的引物对。
2.根据权利要求1所述的用于检测ATP7B基因突变的引物组，其特征在于，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。
3.一种用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2的引物组。
4.根据权利要求3所述的用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括以下一种或多种试剂:
用于从样品提取基因组DNA的试剂；
利用所述引物组中的引物对进行PCR反应的试剂；
用于处理PCR扩增产物以使扩增产物能够进行高通量测序的试剂；
以及
用于对处理后的PCR扩增产物进行高通量测序的试剂。
5.根据权利要求3所述的用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，所述高通量测序为Ion Torrent测序。
6.一种ATP7B基因突变的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
获得样品的基因组DNA；
利用权利要求1或2的引物组或权利要求3至5任一项的试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；
将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进行基因型分析以确定基因突变情况。
7.一种ATP7B基因突变的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
获得样品的基因组DNA；
利用权利要求1或2的引物组或权利要求3至5任一项的试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；
将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进行高通量测序；
对高通量测序结果进行分析，确定ATP7B基因突变情况。
8.根据权利要求6或7所述的用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。
9.权利要求1或2的引物组或权利要求3至5任一项的试剂盒在ATP7B基因突变检测中的应用。
10.权利要求1或2的引物组或权利要求3至5任一项的试剂盒在肝豆状核变性筛查中的应用。
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