CN110218785A - Atp7b基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法 - Google Patents

Atp7b基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法，该ATP7B基因突变检测引物组包括：用于扩增ATP7B基因的第5、8、12、13、16、18号外显子的6个引物对中的至少一个，这6个引物对的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑12所示。利用该引物组进行多重PCR检测时，可以对ATP7B基因的第5、8、12、13、16、18号外显子的所有位点进行突变检测，可有效地缩短检测时间。

Description

ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法。
背景技术
肝豆状核变性(hepatoLenticuLar degeneration，HLD)又名WiLson病(WD)，是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病，其可引起血清铜蓝蛋白合成减少及胆道排铜障碍，蓄积于体内的铜离子在肝、脑、肾、角膜等处沉积，引起进行性加重的肝硬化、锥体外系症状、精神症状、肾损害及角膜色素(K-F)环等。研究发现，导致肝豆状核变性的原因之一为ATP7B基因突变。在正常情况下，ATP7B基因可编码一种铜转运P型ATP酶，而一旦ATP7B基因突变使该酶功能降低或丧失而致病。
目前，ATP7B基因突变检测主要有PCR-Sanger测序法、荧光定量PCR法、高通量测序法等，而传统常规的PCR-Sanger测序法虽然是公认的检测基因分型的金标准，但检测周期长、检测通量低，所以对于多基因多位点或外显子的检测效率低；荧光定量PCR方法虽然具有灵敏度高，分型准确，操作简便快捷等优点，但无法满足临床对于单基因多外显子或者多基因多外显子检测的需求。
发明内容
本发明提供了ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法，可以对ATP7B基因的第5、8、12、13、16、18号外显子的所有位点进行突变检测，能够有效地缩短检测时间。
多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物对，以同时扩增多个核酸片段。在很大程度上弥补了常规PCR检测周期长、检测通量低等的缺点。本发明提供的ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法是经过反复探索和优化找到的一种简便易行、准确性高、成本低廉、易于普及的基于多重PCR技术实现的ATP7B基因突变检测方案。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了针对ATP7B基因第5、8、12、13、16以及18号外显子共6个外显子的突变检测引物组、突变检测试剂盒、突变检测体系和突变检测方法。根据文献调研选择ATP7B基因的第5、8、12、13、16以及18号外显子，通过NCBI查找各外显子的DNA序列，设计并合成最佳的扩增引物，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体。
在本发明中提及的引物对是指包含有上游引物和下游引物的用于扩增特征外显子的引物。
第一方面，本发明提供了ATP7B基因突变检测引物组，包括至少一个下述引物对：
用于扩增ATP7B基因第5号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
用于扩增ATP7B基因第8号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
用于扩增ATP7B基因第12号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
用于扩增ATP7B基因第13号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
用于扩增ATP7B基因第16号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
用于扩增ATP7B基因第18号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
优选地，上述ATP7B基因突变检测引物组包括上述6个引物对，以相对最大程度的提高检测通量。具体地，使用该引物组进行多重PCR扩增反应时，ATP7B基因的6个外显子可同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增包含ATP7B基因中6个外显子。
由于小的序列变化既可能导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，本发明分别针对不同序列设计特异性引物，同时设计了多重PCR引物组，在经过多次优化后，综合产物片段长度和基因/外显子情况，本发明得到了扩增效果优选引物组，覆盖了ATP7B基因第5、8、12、13、16以及18号外显子所有基因位点。其中，多重PCR引物组中各个上游引物和下游引物的核苷酸序列以及产物大小如下表1所示。
表1
上述表1中，ATP7B-5F/ATP7B-5R为一个引物对，分别表示为用于扩增ATP7B的第5号外显子的上游引物和用于扩增ATP7B的第5号外显子的下游引物；ATP7B-8F/ATP7B-8R为一个引物对，分别表示为用于扩增ATP7B的第8号外显子的上游引物和用于扩增ATP7B的第8号外显子的下游引物；ATP7B-12F/ATP7B-12R为一个引物对，分别表示为用于扩增ATP7B的第12号外显子的上游引物和用于扩增ATP7B的第12号外显子的下游引物；ATP7B-13F/ATP7B-13R为一个引物对，分别表示为用于扩增ATP7B的第13号外显子的上游引物和用于扩增ATP7B的第13号外显子的下游引物；ATP7B-16F/ATP7B-16R为一个引物对，分别表示为用于扩增ATP7B的第16号外显子的上游引物和用于扩增ATP7B的第16号外显子的下游引物；ATP7B-18F/ATP7B-18R为一个引物对，分别表示为用于扩增ATP7B的第18号外显子的上游引物和用于扩增ATP7B的第18号外显子的下游引物。
上述引物组中的各引物对的理论退火温度Tm值都在(60±2)℃的范围内，扩增效率基本一致(电泳图中各位点的条带亮度)，同时各对引物的扩增产物大小相差142bp以上，不会相互干扰产生非特异性产物或二聚体，在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且单一的目的条带，便于后续通过测序技术如Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、化学降解法测序技术、自动化测序技术以及基因芯片测序技术等进行测序。
优选地，上述ATP7B基因突变检测引物组中各引物对的摩尔比为：ATP7B-5：ATP7B-8：ATP7B-12：ATP7B-13：ATP7B-16：ATP7B-18＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2。其中，ATP7B-5表示用于扩增ATP7B基因第5号外显子的引物对，ATP7B-8表示用于扩增ATP7B基因第8号外显子的引物对，ATP7B-12表示用于扩增ATP7B基因第12号外显子的引物对，ATP7B-13表示用于扩增ATP7B基因第13号外显子的引物对，ATP7B-16表示用于扩增ATP7B基因第16号外显子的引物对，ATP7B-18表示用于扩增ATP7B基因第18号外显子的引物对。
第二方面，基于上述内容，本发明还提供了一种ATP7B基因突变检测试剂盒，包括：上述任一种ATP7B基因突变检测引物组。
在第二方面基础上，优选地，ATP7B基因突变检测试剂盒，进一步包括：
利用所述引物对进行目的基因片段PCR扩增反应的试剂。
其中，进行目的基因片段PCR扩增反应的试剂可包括：PCR Buffer、dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)、Mg2+以及DNA聚合酶中的任意一种或多种。
优选地，上述ATP7B基因突变检测试剂盒进一步包括以下一种或多种试剂：
用于从样品提取基因组DNA的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于测序技术中的试剂；
以及用于对处理后的扩增产物进行测序的试剂。
上述用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于测序技术中的试剂可以为能用于sanger测序技术中的试剂或者能用于焦磷酸测序技术中的试剂、能用于化学降解法测序技术中的试剂、能用于自动化测序技术中的试剂、能用于基因芯片测序技术中的试剂等。
第三方面，本发明提供的ATP7B基因突变检测反应体系包括：上述任意一种ATP7B基因突变检测引物组。
在第三方面基础上，优选地，上述ATP7B基因突变检测反应体系进一步包括：DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA。更优选地，ATP7B基因突变检测反应体系包括：浓度为20-300nM的所述ATP7B基因突变检测引物组，该浓度为20nM到300nM中的任意一个值，例如可以为20nM、30nM、50nM、60nM、65nM、80nM、93nM、100nM、120nM、150nM、160nM、180nM、200nM、250nM以及300nM等；用量0.2-4.0U的DNA聚合酶，该用量可为0.2U到4.0U中的任意一个值，例如可以为0.2U、0.3U、0.5U、0.6U、0.7U、1.0U、1.2U、1.5U、1.6U、1.8U、2.0U、2.5U、2.8U、3.0U、3.4U、3.6U、4.0U等；2*PCR反应缓冲液，浓度为200-800μM的dNTP，该dNTP的浓度可以为200μM到800μM中的任意一个值，例如可以为200μM、220μM、250μM、300μM、320μM、350μM、360μM、380μM、400μM、410μM、420μM、450μM、500μM、530μM、550μM、570μM、580μM、600μM、640μM、680μM、700μM、710μM、730μM、760μM、780μM、800μM等；以及用量为10-100ng的模板DNA，该模板DNA的用量可以为10ng到100ng中的任意一个值，例如可以为10ng、11ng、12ng、15ng、17ng、30ng、40ng、50ng、70ng、80ng、90ng以及100ng等。DNA聚合酶可以选用Taq酶等。
优选地，ATP7B基因突变检测反应体系的体积可为10-50μL，即ATP7B基因突变检测反应体系的体积可为10μL到50μL中的任一值，比如可以为10μL、11μL、12μL、15μL、17μL、20μL、30μL、40μL及50μL等。另外，可以理解得，可补充超纯水，以满足对ATP7B基因突变检测反应体系的体积、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA的配比和用量的要求。
优选地，所述模板DNA为人类基因组DNA。
第四方面，用于非诊断目的ATP7B基因突变检测方法包括：
使用上述任一所述的ATP7B基因突变检测引物组或上述任一所述的ATP7B基因突变检测试剂盒或上述任一所述的ATP7B基因突变检测反应体系，通过PCR扩增反应扩增ATP7B基因第5、8、12、13、16、18号外显子中的至少一个外显子；PCR扩增反应的反应条件为94～98℃2～10min，然后进行25-40个循环，每个循环中94～98℃10～90s，然后55～68℃10-90s，然后68～72℃30～300s，然后68～72℃5～20min；通过测序技术对PCR扩增产物进行测序；将测序结果与ATP7B基因的参考序列比对，确定突变位点。
其中，测序技术可以为Sanger测序、焦磷酸测序、化学降解法测序、自动化测序以及基因芯片测序等中的任意一种。
可以理解地，上述PCR扩增反应的反应条件为94～98℃之间的任一值如94℃、94.5℃、95℃、96.5℃、97.5℃、98℃等，2～10min中的任一值如2min、2.5min、4min、5min、5.5min、7min、9min、10min等，然后进行25～40个循环中的任一值如25个循环、27个循环、28个循环、30个循环、31个循环、32个循环、35个循环、37个循环、39个循环、40个循环等，每个循环中94～98℃中的任一值如94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、97℃、98℃等10～90s中的任一值如10s、11s、15s、20s、25s、30s、40s、50s、60s、80s、90s等，然后55～68℃中的任一值如55℃、58℃、60℃、61℃、65℃、68℃等10～90s中的任一值如10s、13s、17s、22s、29s、32s、41s、50s、70s、85s、90s等，然后68～72℃中的任一值如68℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等30～300s中的任一值如30s、43s、47s、50s、59s、100s、141s、150s、170s、185s、190s、200s、220s、250s、260s、280s、300s等，然后68～72℃中的任一值如68℃、68.5℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等5～20min中的任一值如5min、5.5min、7min、10min、10.5min、15min、17min、20min等。
另外，优选地，在上述通过PCR扩增反应扩增ATP7B基因第5、8、12、13、16、18号外显子中的至少一个外显子之后，在通过测序技术对PCR扩增产物进行测序之前，可进一步通过电泳检测所述PCR产物，以验证所述PCR产物的扩增片段大小。
与现有技术相比，本发明至少可以具有以下有益效果：
(1)检测成本低，检测时间短，方便快捷，易于普及。由于本发明方案可采用1管多重PCR扩增反应结合测序技术的方法，可同时检测ATP7B基因的6个外显子的所有位点，操作起来非常简便。通过扩增体系及程序优化有效的缩短了扩增时间，整个检测流程2-3h便可以完成。另外，由于引物无需标记荧光，大大节约了检测成本，加上无需昂贵、复杂的设备，任何检测机构均可开展。
(2)提高检测通量：本发明提供的方案可通过一次1管多重PCR扩增反应体系对6个外显子的所有位点的基因突变进行检测。可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。
(3)扩增结果判读直观准确：本发明提供的方案能够使各个引物对的扩增产物大小充分区分，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，确保了结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为Marker，1-3为随机选择血液DNA样本，4为空白对照。
图2为PCR扩增产物测序结果中针对一个突变位点的部分示例。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1待测DNA样本的制备方法
用口腔拭子收集的口腔脱落细胞或收集的新鲜外周血样本采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。
实施例2ATP7B基因突变检测
根据文献调研选择ATP7B基因的第5、8、12、13、16、18号外显子，通过NCBI查找各外显子的DNA序列，设计并合成本发明实施例的扩增引物，对于设计引物来说，可采用PrimerQuest、Primer Premier 5.0、DNAMAN等在线/离线的数据库或软件对引物进行设计及二聚体、茎环错配等分析，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，在包含基因突变位点的两端设计引物，6个引物对的退火温度基本保持一致。然后，根据需要稀释到所需的浓度如10μM，本发明实施例的扩增引物的核苷酸序列及产物大小如上述的表1所示。本实施例所提供的引物组覆盖了ATP7B基因第5、8、12、13、16、18号外显子所有基因位点。
按照实施例1步骤准备DNA样本。
根据表1所列的引物组，将6个外显子的6对引物合并在1管扩增试剂中进行多重PCR扩增，引物组摩尔配比为：ATP7B-5：ATP7B-8：ATP7B-12：ATP7B-13：ATP7B-16：ATP7B-18＝2：1：1.5：1：1：1.5，另外，引物组摩尔配比还可为ATP7B-5：ATP7B-8：ATP7B-12：ATP7B-13：ATP7B-16：ATP7B-18＝1：1.5：1：1：1.5：1.5，引物组摩尔配比还可为ATP7B-5：ATP7B-8：ATP7B-12：ATP7B-13：ATP7B-16：ATP7B-18＝＝0.5：0.5：2：2：2：1，引物组摩尔配比还可为ATP7B-5：ATP7B-8：ATP7B-12：ATP7B-13：ATP7B-16：ATP7B-18＝＝1：1：0.5：2：0.5：2等。PCR扩增体系如表2所示。
表2
PCR反应体系 体积
2*PCR反应缓冲液 25μL
2.0mM dNTP 10μL
10μM引物组 5μL
DNA聚合酶 2μL
模板DNA 3μL
ddH<sub>2</sub>O 5μL
TotaL 50μL
其中，扩增试剂为购买的商品化扩增试剂，包括PCR Buffer、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等，本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)；DNA用量75ng。上述2*PCR反应缓冲液为配置PCR反应体系时PCR反应缓冲液的使用量；2.0mM dNTP为配置PCR反应体系时dNTP的使用浓度，10μM引物组为配置PCR反应体系时引物组的使用浓度。另外，可以理解地，通过调整2*PCR反应缓冲液、2.0mM dNTP、10μM引物组、DNA聚合酶、ddH2O以及模板DNA的体积，使得ATP7B基因突变检测反应体系中所述ATP7B基因突变检测引物组浓度位于20-300nM范围中的任意一个值，例如可以为20nM、30nM、50nM、60nM、65nM、80nM、93nM、100nM、120nM、150nM、160nM、180nM、200nM、250nM以及300nM等，DNA聚合酶用量位于0.2-4.0U范围中的任意一个值，例如可以为0.2U、0.3U、0.5U、0.6U、0.7U、1.0U、1.2U、1.5U、1.6U、1.8U、2.0U、2.5U、2.8U、3.0U、3.4U、3.6U、4.0U等，dNTP浓度位于200-800μM范围中的任意一个值，例如可以为200μM、220μM、250μM、300μM、320μM、350μM、360μM、380μM、400μM、410μM、420μM、450μM、500μM、530μM、550μM、570μM、580μM、600μM、640μM、680μM、700μM、710μM、730μM、760μM、780μM、800μM等以及模板DNA用量位于10-100ng范围中的任意一个值，例如可以为10ng、11ng、12ng、15ng、17ng、30ng、40ng、50ng、70ng、80ng、90ng以及100ng等。
根据选取的扩增酶系，对退火及延伸的温度及时间进行优化，保证ATP7B基因的6个外显子的6个扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的结果中均有明亮且单一的条带，并且扩增时间最短，其中，确定出的PCR扩增程序如表3所示。
表3
值得说明的是，上述预变性温度可为94～98℃之间的任一值如94℃、94.5℃、95℃、96.5℃、97.5℃、98℃等；预变性时间可为2～10min中的任一值如2min、2.5min、4min、5min、5.5min、7min、9min、10min等，变性温度可为94～98℃中的任一值如94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、97℃、98℃等；变性时间可为10～90s中的任一值如10s、11s、15s、20s、25s、30s、40s、50s、60s、80s、90s等，退火温度可为55～68℃中的任一值如55℃、58℃、60℃、61℃、65℃、68℃等，退火时间可为10～90s中的任一值如10s、13s、17s、22s、29s、32s、41s、50s、70s、85s、90s等，延伸温度可为68～72℃中的任一值如68℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等；延伸时间可为30～300s中的任一值如30s、43s、47s、50s、59s、100s、141s、150s、170s、185s、190s、200s、220s、250s、260s、280s、300s等，上述从变性程序到延伸程序中涉及到的循环次数可为68～72℃中的任一值如68℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等30～300s中的任一值如30s、43s、47s、50s、59s、100s、141s、150s、170s、185s、190s、200s、220s、250s、260s、280s、300s等，最后延伸温度可为68～72℃中的任一值如68℃、68.5℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等；最后延伸时间可为5～20min中的任一值如5min、5.5min、7min、10min、10.5min、15min、17min、20min等。
琼脂糖凝胶电泳验证并测序
预先配制2％的琼脂糖凝胶，取上一步扩增的PCR扩增产物5uL点样与凝胶上，电压120V，电泳30min后于凝胶成像仪上观察PCR产物片段的大小，并拍摄清晰照片保存，其拍摄的PCR产物片段的大小反映在凝胶上的结果如图1所示。图1中所示出的M为Marker，1-3为随机选择血液DNA样本，4为空白对照。根据空白对照的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的6个亮带分别对应于6个扩增引物对分别对应的的PCR扩增产物，亮带数量与理论保持一致；6个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明上述利用引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组合理。
验证扩增片段大小正确后将PCR扩增产物送至测序公司(北京诺赛基因组研究中心有限公司)进行序列测定。测序结果是.ab1格式的数据，通过Chromas序列分析软件分析可获得ATP7B基因6个外显子所有位点的基因突变情况，部分测序结果如图2所示。
通过比较普通PCR和多重PCR测序方法，所获得的结果一致，所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、体系和方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第5号外显子的上游引物
<400> 1
ccaacgttcc tttgctctac agatac 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第5号外显子的下游引物
<400> 2
gtaccttggg accacctttg attac 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第8号外显子的上游引物
<400> 3
gcagccttca ctgtccttgt ctttc 25
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第8号外显子的下游引物
<400> 4
gccctgaagg ccaggtttct ttagtt 26
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第12号外显子的上游引物
<400> 5
gaggctcaga tgtcaaaggt aatg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第12号外显子的下游引物
<400> 6
cactagactg ggctaggaat aaga 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第13号外显子的上游引物
<400> 7
cacaaacacc gtcactcact cttcac 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第13号外显子的下游引物
<400> 8
tgactctgct cctgtaatgc ctctt 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第16号外显子的上游引物
<400> 9
agcacacgct gttagaaagt gatagg 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第16号外显子的下游引物
<400> 10
ggaaggaagg cagaagcaga agatac 26
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第18号外显子的上游引物
<400> 11
ggcaagggta acttgaggtt tctg 24
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 用于PCR扩增ATP7B基因第18号外显子的下游引物
<400> 12
cagcaaatca ttctgatgga gaggag 26

Claims (10)

1.ATP7B基因突变检测引物组，其特征在于，包括至少一个下述引物对：
用于扩增ATP7B基因第5号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
用于扩增ATP7B基因第8号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
用于扩增ATP7B基因第12号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
用于扩增ATP7B基因第13号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
用于扩增ATP7B基因第16号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
用于扩增ATP7B基因第18号外显子的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的ATP7B基因突变检测引物组，其特征在于，
所述ATP7B基因突变检测引物组中各引物对的摩尔比为：ATP7B-5：ATP7B-8：ATP7B-12：ATP7B-13：ATP7B-16：ATP7B-18＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2。
3.ATP7B基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的ATP7B基因突变检测引物组。
4.根据权利要求3所述的ATP7B基因突变检测试剂盒，其特征在于，进一步包括：
利用所述引物对进行目的基因片段PCR扩增反应的试剂。
5.根据权利要求4所述的ATP7B基因突变检测试剂盒，其特征在于，
进行目的基因片段PCR扩增反应的试剂，包括：PCR Buffer、dNTP、Mg2+以及DNA聚合酶中的任意一种或多种；
和/或，
所述ATP7B基因突变检测试剂盒进一步包括以下一种或多种试剂：
用于从样品提取基因组DNA的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于测序技术中的试剂；
以及用于对处理后的扩增产物进行测序的试剂。
6.ATP7B基因突变检测反应体系，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的ATP7B基因突变检测引物组。
7.根据权利要求6所述的ATP7B基因突变检测反应体系，其特征在于，进一步包括：
DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA。
8.根据权利要求7所述的ATP7B基因突变检测反应体系，其特征在于，
所述ATP7B基因突变检测反应体系包括：浓度为20-300nM的所述ATP7B基因突变检测引物组，用量0.2-4.0U的DNA聚合酶，2*PCR反应缓冲液，浓度为200-800μM的dNTP以及用量为10-100ng的模板DNA。
9.根据权利要求7或8所述的ATP7B基因突变检测反应体系，其特征在于，
所述模板DNA为人类基因组DNA。
10.用于非诊断目的ATP7B基因突变检测方法，其特征在于，包括：
使用权利要求1或2所述的ATP7B基因突变检测引物组或权利要求3至5任一所述的ATP7B基因突变检测试剂盒或权利要求6至9任一所述的ATP7B基因突变检测反应体系，通过PCR扩增反应扩增ATP7B基因第5、8、12、13、16、18号外显子中的至少一个外显子；PCR扩增反应的反应条件为94～98℃2～10min，然后进行25-40个循环，每个循环中94～98℃10～90s，然后55～68℃10-90s，然后68～72℃30～300s，然后68～72℃5～20min；
通过测序技术对PCR扩增产物进行测序；
将测序结果与ATP7B基因的参考序列比对，确定突变位点。
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