CN110938685A - 新生儿遗传代谢病与血红蛋白病的基因检测探针组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新生儿遗传代谢病与血红蛋白病的基因检测探针组及其应用，属于基因检测技术领域。所述的探针组涵盖785个探针捕获区域，对应的49个基因，基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针，结合靶序列液相杂交捕获技术和高通量测序技术，可以实现新生儿26种遗传代谢病与3种血红蛋白病的有效筛查，其具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域中基因检测领域，具体涵盖49个单基因的检测探针组，及其在新生儿26种遗传代谢病和3种血红蛋白病中的应用。
背景技术
过去14年(2005-2019年),下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)逐步从新技术成长为主流的测序技术，并逐渐走进临床诊断领域。NGS以其简单、快速、高分辨率、高通量的特点，在传染性疾病防控、肿瘤的早诊早治、遗传病的早期筛查和诊断、无创产前筛查、胚胎植入前诊断和筛查等领域发挥越来愈大的作用。
遗传性代谢病(inherited metabolic diseases,IMD)是因为维持机体正常代谢所必需的某种酶、运载蛋白、膜或受体等的编码基因发生突变，使其编码的产物功能发生改变，而出现相应的实验室检查异常和临床症状的一类疾病。它涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、溶酶体、类固醇等多种物质代谢的异常。该类疾病大多为单基因遗传病，虽然其单一病种患病率低，但其种类繁多，总体发病率较高(约1/800)。遗传性代谢病可以在新生儿期起病，也可以在成年期发病，常累及全身多个脏器。这类疾病发病后常呈进行性加重，如未能早期识别诊断、干预、治疗，常导致早期夭折或终身残疾，且以神经、智力残疾为最多，对人口素质、家庭乃至社会的发展构成了极大的威胁。
血红蛋白病是世界上最为常见的人类单基因遗传病。它主要包括异常血红蛋白和地中海贫血(地贫)两组疾病，是我国南方严重影响人口健康的致死性出生缺陷。我国长江以南的广大地域，特别是广东、广西和海南三省(区)则是该病的高发区，重型地贫患儿的出生已成为上述地区的公共卫生问题。
新生儿筛查是指在新生儿群体中，用快速、敏感的实验室方法对新生儿的遗传代谢病、先天性内分泌异常以及某些危害严重的遗传性疾病进行筛查的总称，其目的是对那些患病的新生儿在临床症状尚未表现之前或表现轻微时通过筛查，得以早期诊断、早期治疗，防止机体组织器官发生不可逆的损伤，避免患儿发生智力低下、严重的疾病或死亡。
目前我国新生儿遗传代谢病筛查发展趋势逐渐提高到以串联质谱联用技术(MS/MS)为中心的筛查，此方法用于新生儿遗传疾病筛查具有局限性，筛查阳性结果的儿童往往需要进一步酶学分析、单基因分析等临床辅助诊断方法方能确诊。血红蛋白病则以高效液相色谱法(HPLC)、电泳法、MCV法和红细胞脆性法4种方法为主要临床筛查手段，上述方法操作繁琐，检测周期长，花费大。
为同时开展大规模的新生儿遗传性代谢病和血红蛋白病筛查，开发一种价格低廉、准确性高且同时涵盖常见遗传代谢疾病和血红蛋白病的高通量基因检测技术是十分必要的。
发明内容
为实现上述目的，发明人提供了一种新生儿26种遗传代谢病和3种血红蛋白病基因检测探针组及筛查方法。具体的技术方案如下：
一种新生儿遗传代谢病和血红蛋白病基因检测探针组，所述探针组依据785个捕获区域设计获得，所述捕获区域如表1所示。
表1 26种遗传代谢病与3种血红蛋白病对应49个致病基因的捕获区域
一种新生儿遗传代谢病和血红蛋白病基因筛查试剂盒，所述试剂盒包括上述新生儿26种遗传代谢病和3种血红蛋白病基因检测探针组。
一种新生儿遗传代谢病和血红蛋白病基因检测探针组在制备新生儿遗传代谢病和血红蛋白病筛查试剂中的应用。所述的应用方法，包括如下步骤：
(1)样品采集与提取：收集待测样品，提取基因组DNA；
(2)DNA片段化：将基因组DNA超声打断或者酶切至100～500bp的DNA片段；
(3)末端修复与接头连接：对DNA片段进行末端修复及测序接头连接；产物进行纯化；
(4)杂交前扩增：将上一步纯化产物进行PCR扩增富集、纯化，获得用于杂交捕获的DNA文库；
(5)第一次探针捕获：将DNA文库进行杂交前封闭，采用上述检测探针组进行杂交捕获；
(6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行PCR扩增，获得富集的靶序列；
(7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的DNA文库，再进行一次探针捕获及目标区域富集，对第二次富集的靶序列进行纯化，获得待测序产物；
(8)测序及分析：将待测序产物进行二代测序，采用生物信息学分析测序结果。
其中，所述步骤(1)中，待测样品包括血斑、血液、口腔黏膜细胞。
所述步骤(3)和所述步骤(4)中，纯化方法为磁珠纯化法，优选VAHTS DNA CleanBeads作为纯化磁珠，所述步骤(4)中，PCR扩增富集的体系为：
反应条件为：
所述步骤(6)中，PCR扩增的体系为：
反应条件为：
其中，接头引物为适应测序平台接头的选择，包括Illumina测序平台的接头引物。
所述步骤(6)中，洗脱采用
Hybridization and Wash Kit。
所述步骤(3)中，末端修复与接头连接采用KAPA Hyper Plus Kit(Illumina)试剂盒。
所述步骤(8)中，二代测序采用Illumina平台NovaSeq6000测序。
区别于现有技术，上述技术方案的有益效果是：
本发明针对新生儿26种遗传代谢病和3种血红蛋白病的49种基因，并结合靶序列液相杂交捕获技术和高通量测序技术，设计了785个探针捕获区域，基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针，实现新生儿26种遗传代谢病和3种血红蛋白病有效筛查，其具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。
附图说明
图1为具体实施方式所述的血液基因组样本电泳图，图中10个泳道从左到右的样本依次为：1号、1kb ladder、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号，其中1kb ladder为5μL，1-9号提取的血液基因组样品各1.5μL。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
发明人结合靶序列液相杂交捕获技术和高通量测序技术，设计了一组新生儿26种遗传代谢病与3种血红蛋白病的基因检测探针，并提供了新生儿遗传代谢病和血红蛋白病的筛查方法。
实施例1新生儿26种遗传代谢病与3种血红蛋白病的基因检测探针组
发明人经过查阅大量新生儿遗传代谢病和血红蛋白病致病基因相关文献及数据库，获得了新生儿26种遗传代谢病与3种血红蛋白病及其相关基因(详见表2、表3)，通过高通量的实验筛选及相关实验验证，最终优选出785个探针捕获区域(捕获区域见表1所示)，针对探针捕获区域的探针联合使用可用于检测新生儿26种遗传代谢病与3种血红蛋白病的致病基因；针对所设计的探针捕获区域的探针特异性强、灵敏度高，对新生儿遗传代谢病和血红蛋白病致病基因缺失、重复、点突变的情况均能进行有效的检测。
表2新生儿26种遗传代谢病及其相关致病基因
表3新生儿3种血红蛋白病及其相关致病基因
实施例2新生儿26种遗传代谢病和3种血红蛋白病的筛查方法
新生儿遗传代谢病与血红蛋白病的筛查试剂盒：包括基因组DNA提取试剂，DNA末端修复与接头连接试剂，PCR反应试剂，产物纯化试剂，新生儿遗传代谢病与血红蛋白病的基因检测探针组混合液等。
试剂盒的使用步骤如下：
(1)样品采集与提取：以上海市儿童医院提供的9例经临床确诊为新生儿遗传病的患者血液样本为例，分别采用QIAamp DNA Blood Mini Kit进行基因组DNA提取；
(2)DNA片段化：将基因组DNA超声打断至100～500bp的DNA片段；
(3)末端修复与接头连接：使用KAPA Hyper Plus Kit(Illumina)试剂盒对DNA片段进行末端修复及测序接头连接；产物用VAHTS DNA Clean Beads纯化；
(4)杂交前扩增：将上一步纯化产物进行PCR扩增富集，PCR体系为：
反应条件为：
PCR扩增产物用VAHTS DNA Clean Beads进行纯化，获得用于杂交捕获的DNA文库；
(5)第一次探针捕获：使用xGen Hybridization and Wash Kit试剂盒，按说明书操作，将DNA文库进行杂交前封闭，获得已封闭的DNA文库；再将实施例1针对探针捕获区域的探针配制成探针混合液；与已封闭的DNA文库进行4-16小时的杂交捕获；
(6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物使用
Hybridization and WashKit进行洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行PCR扩增，获得富集的靶序列，PCR扩增体系为：
反应条件为：
(7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的DNA文库，再进行一次探针捕获及目标区域富集，第二次富集的靶序列用VAHTS DNAClean Beads进行纯化，获得待测序产物；
(8)测序及分析：将待测序产物用llumina平台测序，采用生物信息学分析测序结果。
本实施例中，基因组DNA的电泳结果见图1，提取浓度及DNA文库浓度的Qubit定量结果见表4。
表4基因组DNA提取浓度及DNA文库浓度
本实施例中，捕获后文库的Qubit定量结果如表5所示。
表5捕获后文库的Qubit定量浓度
本实施例中，9份样本的新生儿遗传代谢病和血红蛋白病的筛查结果，如表6所示。
表6 9份样本的新生儿遗传代谢病和血红蛋白病的筛查结果
综上，根据本发明的探针捕获区域(如表1所示)设计相应的探针，即可实现新生儿26种遗传代谢病和3种血红蛋白病的筛查。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (7)
1.一种新生儿遗传代谢病与血红蛋白病的基因检测探针组，其特征在于：所述的探针组依据785个捕获区域设计获得，所述的捕获区域如下所示：
2.一种新生儿遗传代谢病与血红蛋白病基因筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的新生儿遗传代谢病与血红蛋白病基因检测探针组。
3.一种如权利要求1所述的新生儿遗传代谢病与血红蛋白病基因检测探针组在制备新生儿遗传代谢病与血红蛋白病筛查试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的新生儿遗传代谢病与血红蛋白病基因检测探针组在制备新生儿遗传代谢病与血红蛋白病筛查试剂中的应用，其特征在于：所述的应用方法包括以下步骤：
样品采集与提取：收集待测样品，提取基因组DNA；
DNA片段化：将基因组DNA超声打断或者酶切至100～500bp的DNA片段；
末端修复/dA尾添加与接头连接：对DNA片段进行末端修复/dA尾添加与接头连接，并对产物进行纯化；
杂交前扩增：将上一步纯化产物进行PCR扩增富集、纯化，获得用于杂交捕获的DNA文库；
第一次探针捕获：将DNA文库进行杂交前封闭，采用如权利要求1所述的检测探针组进行杂交捕获；
目标区域富集：将第一次探针捕获产物洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行PCR扩增，获得富集的靶序列；
第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的DNA文库，再进行一次探针捕获及目标区域富集，对第二次富集的靶序列进行纯化，获得待测序产物；
测序及分析：将待测序产物进行二代测序，采用生物信息学分析测序结果，查找基因变异情况。
5.根据权利要求4所述的新生儿遗传代谢病与血红蛋白病基因检测探针组在制备新生儿遗传代谢病与血红蛋白病筛查试剂中的应用，其特征在于：所述的待测样品包括血斑、血液或口腔黏膜细胞。
6.根据权利要求4所述的新生儿遗传代谢病与血红蛋白病基因检测探针组在制备新生儿遗传代谢病与血红蛋白病筛查试剂中的应用，其特征在于：所述的杂交前扩增中，PCR扩增富集的体系为：
反应条件为：
7.根据权利要求4所述的新生儿遗传代谢病与血红蛋白病基因检测探针组在制备新生儿遗传代谢病与血红蛋白病筛查试剂中的应用，其特征在于：所述的目标区域富集中，PCR扩增的体系为：
反应条件为：
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