CN104120186B - 先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法 - Google Patents
先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104120186B CN104120186B CN201410383359.1A CN201410383359A CN104120186B CN 104120186 B CN104120186 B CN 104120186B CN 201410383359 A CN201410383359 A CN 201410383359A CN 104120186 B CN104120186 B CN 104120186B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- primer
- sequence
- primer sequence
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法,属于分子生物学和临床检验学领域。一组检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列,由Pax‑8基因PCR引物序列、TG基因PCR引物序列、IYD基因PCR引物序列、DUOX2基因PCR引物序列、NIS基因PCR引物序列、TSHR基因PCR引物序列和TPO基因PCR引物序列中的一种或多种引物序列组成。本发明的优点是:利用新一代测序对引起先天性甲状腺功能减低症的多致病基因同时检测,耗费时间少、检测效率高、成本低、灵敏度和特异度均较高,可以快速、全面实现对临床患者基因突变检测及疾病分类。
Description
技术领域
本发明涉及一种先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法,特别涉及先天性甲状腺功能减低症(简称先天性甲低,Congenital hypothyroidism,CH)多基因测序检测分析方法,属于分子生物学领域和临床检验学领域。
背景技术
先天性甲状腺功能减低症(简称先天性甲低,Congenital hypothyroidism,CH)是导致新生儿智力和体格发育障碍的最常见的内分泌疾病之一,其患病率在不同地域、不同种族、以及不同环境均可存在差异。CH患病率在全国平均水平为1/2050,而在广西患病率可达1/835,早期诊断和治疗是降低疾病危害的主要措施。
目前CH的诊断主要分为一般性诊断和甲状腺核素扫描诊断。一般性诊断主要是通过实验测定血液TSH、FT3、FT4浓度水平,确定甲状腺功能低下的程度和性质。病因学诊断,主要包括放射性核素甲状腺扫描,以明确甲状腺的发生、发育及功能情况。前者的影响因素较多,灵敏度和特异度均有待于提高,且不能对疾病进行分型,而甲状腺核素扫描仅对有形态学改变的永久性CH诊断有效。
核酸测序通过对目的基因片段进行DNA序列检测,从而得到目的基因DNA序列信息,是现代分子生物学中应用广泛的一项重要技术,长久以来广泛应用于基因突变检测以及基因分型等领域。一代测序又称为“Sanger测序”,由于结果直观,因此是DNA测序的“金标准”,但因其成本高,通量过低,手工操作时间长,只能对基因进行单独监测检测,对多基因引起的疾病临床应用存在困难。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有CH检测技术的不足,提供一组能对导致先天性甲状腺功能减低症的多基因进行快速、全面检测的、且适用于临床患者基因突变检测及疾病分类的多基因测序引物。
本发明的第二个目的是提供一种结果准确、通量高、时的间短、成本低能同时检测先天性甲状腺功能减低症的多个候选基因的检测方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一组检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列,由Pax-8基因PCR引物序列、TG基因PCR引物序列、IYD基因PCR引物序列、DUOX2基因PCR引物序列、NIS基因PCR引物序列、TSHR基因PCR引物序列和TPO基因PCR引物序列中的一种或多种引物序列组成。
所述Pax-8基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No:1—SEQ ID No:12所示的核苷酸序列。
所述TG基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No:13—SEQ ID No:72所示的核苷酸序列。
所述IYD基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No:73—SEQ ID No:82所示的核苷酸序列。
所述DUOX2基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No:83—SEQ ID No:100所示的核苷酸序列。
所述NIS基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No:101—SEQ ID No:118所示的核苷酸序列。
所述TSHR基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No:119—SEQ ID No:136所示的核苷酸序列。
所述TPO基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No:137—SEQ ID No:166所示的核苷酸序列。
本发明主要利用oligo 6.0软件设计DUOX2、TG、TSHR等七种CH相关基因共139个外显子的PCR扩增引物(表1),根据外显子相距远近程度,合并部份外显子共同设计引物,共计83对引物。引物设计遵循如下几个原则:引物的长度范围在19-23bp适宜;引物应无二聚体,尤其是3’端二聚体形成的可能性;无发夹结构;上下游引物Tm值相差不宜超过5℃;GC含量以45-55%为宜。当上下游引物确定以后,在NCBI数据库中利用Blast对上游和下游引物进行比对分析,确保引物的特异性及扩增效率。与目前illumina、安捷伦以及罗氏公司的捕获技术获得150-400bp片段相比,扩增产物长度平均在1.5kb左右,通过PCR长片段扩增,可以对目标区域进行有效地捕获。
表1:本发明多基因PCR引物序列
一种检测先天性甲状腺功能减低症的多基因测序检测方法,采用新一代测序对CH多个致病基因和相关基因同时进行突变检测。
所述CH多个致病基因为Pax-8基因、TG基因、IYD基因、DUOX2基因、NIS基因、TSHR基因和TPO基因中的一种或多种。
所述方法包括以下步骤:
1.设计多基因PCR引物序列:为序列表SEQ ID No:1—SEQ ID No:166中的一组或多组;
2.提取DNA样本:用常规方法提取测试者的DNA样本;
3.扩增目标区域:利用TAKARA高保真酶,按照25μl体系,利用美国AB Veriti梯度PCR仪,扩增30个循环,其中各基因外显子PCR扩增的热循环条件如下:
95℃预变性5min;95℃,30sec,60℃,30sec,72℃,2min30sec;30个循环,72℃延伸10min;
4.PCR产物纯化:所有产物均取2.5μl进行电泳鉴定;所有剩余PCR产物均采用美国Omega公司过柱试剂盒进行纯化回收;
5.文库的制备:携带测序引物片段的转座子,随机打断上述步骤的扩增产物(扩增子),并将测序引物片段连接于片段化的扩增子(长度约为300bp)的两端进行PCR扩增,测序引物由标签序列、P5/P7序列等组成,得到可用于测序的DNA片段;(所采用试剂盒为美国illumina公司XT DNA建库试剂盒,具体P5/P7、标签序列见XT DNASample Preparation Guide)
6.miseq测序:利用MiSeq Reagent Kit(300cycles PE)试剂盒测序,稀释文库并使其变性,制备所需的预填充试剂盒,将文库混合液装到指定槽的试剂盒中,设置实验步骤并检查各运行参数,选择Sequence开始运行,实验结束后查看测序结果;
7.生物信息学分析
首先对新一代测序数据进行预处理,包括剪除3'端质量值低于20的序列、去除平均质量值低于20的序列;然后使用bwa将质控后的序列比对到参考基因组序列上(版本号hg19),利用GATK工具判读SNP和Indel位点;利用SNPnexus工具注释SNP,找到可能性的功能性位点,最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库,过滤人群中存在的多态性位点。
本发明采用二代测序技术,该技术又称为新一代测序(next generationsequencing,NGS),是测序技术革命性的进步,采用“边合成边测序”的理念,能一次对上百万个DNA分子进行序列测定,使得对一个物种的转录组和全基因组进行细致全貌的分析成为现实。在保证高精确度的基础上,使测序成本降低。新一代测序法与传统一代测序法相比具有下述优点:1)成本低,仅为传统测序成本的1%;2)通量高,可以同时对多个样品进行测序,并且进行一次可以产生大约600G碱基的数据;3)精确性高(高于98.4%),有效地解决了多聚重复序列的读取问题。另一方面,高测序通量在进行测序的序列数目确定的情况下,又反过来提高了序列的测序深度(例如,针对每个序列,可以进行多次测序),从而确保了测序结果的可靠性。新一代测序的诞生,使基因组学和功能基因组学进入了一个低成本、大规模、高通量的测序时代。
新一代测序技术由于其高通量,低成本,适用于多基因致病、致病基因庞大及遗传模式不明疾病的基因诊断。目前有关CH基因致病因素尚不明确,且疾病涉及基因较多。通过新一代基因测序法检测研究CH相关基因突变类型和特点,由于新一代测序技术可以在短时间内筛查数十上百个相关基因,可以让CH临床基因诊断变得更加快速,更加全面,极大提高CH相关基因检出率,有助于我们对CH基因的突变谱有更深入的认识,了解其相关基因在CH患者病程中的作用和影响,加深我们对CH发病机制的研究,并为后续的CH分子诊断以及诊断试剂盒的研发打下基础。
我们运用此方法不仅能快速检测上述7种基因的突变类型,而且我们还意想不到地发现了CH患者24种DUOX2基因新突变类型,目前在国内外研究中未见报道,分别为:外显子Exon3中的密码子62的CCA变为TCA,使密码子62的脯氨酸(pro)变为丝氨酸(ser);外显子Exon3的密码子76位的CCG变为CTG,使密码子76位的脯氨酸(pro)变为亮氨酸(leu);外显子Exon3的密码子82位的CGC变为AGC,使密码子82位的精氨酸(Arg)变为丝氨酸(ser);外显子Exon5的密码子185的TAT变为GAT,使密码子185位的酪氨酸(Tyr)变为天冬氨酸(Asp);外显子Exon5的c.596delC,使cDNA序列596位缺失碱基C;外显子Exon5的密码子TCG变为CCG,使密码子188位的丝氨酸(Ser)变为脯氨酸(Pro);外显子Exon7的密码子301位TGG变为TGT,使密码子301位的色氨酸(Trp)变为半胱氨酸(Cys);外显子Exon8的密码子320位CTA变为CCA,使密码子320位的亮氨酸(Leu)变为脯氨酸(Pro);外显子Exon10的密码子411位的AGG变为AAG,使密码子411位的精氨酸(Arg)变为赖氨酸(Lys);外显子Exon11的密码子432位的CGT变为CAT,使密码子432位的精氨酸(Arg)变为组氨酸(His);外显子Exon14的密码子579位CTG变为CCG,使密码子579位的亮氨酸(Leu)变为脯氨酸(Pro);外显子Exon14的密码子606的TGC变为CGC,使密码子606位的半胱氨酸(Cys)变为精氨酸(Arg);外显子Exon14的密码子570的CAA变为TAA,使密码子570位的谷氨酸(CAA)变为终止密码子(TAA);外显子Exon15c.1868delG,使cDNA序列1868缺失碱基G;外显子Exon16c.2102-2104delGAG,使cDNA序列2102-2104缺失碱基GAG;外显子Exon17的密码子734TGG变为TGA,使密码子734位的色氨酸(Trp)变为终止密码子;外显子Exon21c.2885insTCGA,使cDNA序列2885插入碱基TCGA;外显子Exon24的密码子CGA变为CAA,使密码子1084位的精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln);外显子Exon24c.3339delC,使cDNA序列3339缺失碱基C;外显子Exon25c.3475-3477delCTG,使cDNA序列3475-3477缺失碱基CTG;外显子Exon29密码子1323位的GCG变为ACG,使密码子1323位的丙氨酸(Ala)变为苏氨酸(Thr);外显子Exon33的密码子1521位的GGA变为TGA,使密码子1521位的甘氨酸(Gly)变为终止密码子;内含子30的下游第2个碱基由T变为G(IVS30+2T>G);内含子27的下游第1个碱基由G变为T(IVS27+1G>T)。
本发明的优点是:本发明利用新一代测序对引起先天性甲状腺功能减低症的多致病基因同时检测,包括:Pax-8基因、TG基因、IYD基因、DUOX2基因、NIS基因、TSHR基因和TPO基因的DNA序列。该方法适用于大样本及多个外显子检测,具有耗费时间少、检测效率高、成本低、灵敏度和特异度均较高的特点,可以快速、全面实现对临床患者基因突变检测及疾病分类。应用于临床基因突变检测有助于先天性甲状腺功能减低症病因分析和诊断,有助于对甲状腺功能减低症基因的突变谱有更深入的认识,加深对先天性甲状腺功能减低症发病机制的研究。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为:这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册见New York Cold Spring HarborLaboratory出版社1989年版中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
具体实施方式
实施例1:CH多基因PCR引物设计
利用oligo软件设计DUOX2、TG、TSHR等七种CH相关基因的PCR扩增引物(表1),引物设计遵循如下几个原则:引物的长度范围在19-23bp适宜;引物应无二聚体,尤其是3’端二聚体形成的可能性;无发夹结构;上下游引物Tm值相差不宜超过5℃;GC含量以45-55%为宜。当上下游引物确定以后,在NCBI数据库中利用Blast对上游和下游引物进行比对分析,确保引物的特异性及扩增效率。根据外显子相距远近程度,合并部份外显子共同设计引物,共设计83对引物,平均扩增产物长度在1.5kb左右。
实施例2:血液样本收集和基因组DNA的提取:
按卫生部《新生儿疾病筛查技术规范》诊断标准入选病例,共选取来自广西地区无血缘关系的CH患者192例(年龄:9天-6岁,中位年龄18天)。所有受检者或家属均签署书面知情同意书,这项研究得到经本院伦理委员会同意,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》:人体医学研究的伦理原则。
192例血液样品按以下方法准备样品,使用试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司,血液基因组提取试剂盒(DP318)
1.在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer 1000μl,充分颠混至清亮。以4000rpm,离心5min。弃上清液。
2.沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分混匀。以6000rpm,离心5min。
3.彻底弃去上清,加入extractionbuffer500μl(裂解细胞),混匀置于37℃,水溶1h。
4.加入8μl的蛋白酶K,颠混,37℃过夜(或55℃,3h)。
5.每管加入450μl饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min,以5500rpm,离心15min。
6.取上清,每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。
7.取上清,每管加入500μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。
8.取上清,每管加50μl的3M的NaAC+,适量无水乙醇(预冷)至满,摇匀放入-20℃保存2h以上。
9.以12000rpm,离心20min。去上清,加入70%乙醇500μl,以12000rpm,离心5min,去上清,50-60℃干燥。
10.加入50μl灭菌去离子水,转弹,混匀。
实施例3:目标区域扩增
将实施例1设计的所有引物均送往上海生工合成,引物合成后经12,000g离心2min使干粉沉淀,按照说明添加高压灭菌双蒸水稀释至终浓度10uM,待其充分溶解后用于PCR实验。所有引物退火温度均利用美国AB Veriti梯度PCR仪进行摸索,PCR扩增体系为25ul。针对高GC含量的目标片段,均在体系中添加DMSO至终浓度为2%。对于扩增条带特异性较低的引物,考虑更换退火温度或重新设计引物,保证扩增目的条带清晰、特异。
利用TAKARA高保真酶,按照25μl体系,利用美国AB Veriti梯度PCR仪,扩增30个循环,其中各基因外显子PCR扩增的热循环条件如下:
95℃预变性5min;95℃,30sec,60℃,30sec,72℃,2min30sec;30个循环,72℃延伸10min;
所有产物均取2.5μl进行电泳鉴定;所有剩余PCR产物均采用美国Omega公司过柱试剂盒进行纯化回收。
实施例4:PCR产物的纯化
使用试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司,大量琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP210)
1.PCR反应结束后,从PCR反应管中将反应液移至干净的1.5ml离心管中,加入5倍体积的Binding Solution B,上下颠倒混匀。
2.将混合液转移到套放收集管的GenClean柱中,室温放置2min,于8000rpm离心1min。
3.取下GenClean Column,倒掉收集管中废液。
注意:将废液转移回GenClean Column重复步骤2和3可适当提高回收效率。
4.将GenClean柱重新放回收集管中,加入500μl Wash Solution,于12000rpm离心1min,倒掉收集管中废液。
5.重复步骤4一次。
6.将GenClean柱重新放回收集管中,12,000rpm离心1min,以彻底去除WashSolution。
7.将GenClean柱放入干净的1.5ml离心管中,在GenClean柱吸附膜的中央小心加入30~50μl Elution Buffer,37℃放置2min。12,000rpm离心1min,离心管中的液体即为纯化好的DNA片段。
取2~5μl进行电泳检测浓度,纯化好的DNA可立即用于后续实验或于-20℃冻存。
实施例5:文库制备
使用试剂盒:美国illumina公司XT DNA建库试剂盒
1.NTA制备
(1)取出一个新的NTA板(Nextera XT Tagment Amplicon Plate),依次往每个孔里加10μl TD buffer,5μl 0.2ng/μl DNA(上样量为1ng)以及5μl ATM。
(2)排枪混匀5次后封膜,20℃280g离心1min,金属浴55度5min。
(3)温度降到10℃后,立刻撕开膜加入5μl NT buffer,中和NTA,排枪混匀5次后封膜。
(4)20℃280g离心1min,室温放置5min。
2.PCR扩增
(1)解冻试剂NPM以及index primers,混匀。
(2)index 1primers(i7)横放,确保N701在第一个,N706在第六个;index2primers(i5)竖放,确保S501在A位,S504在D位,并记录上述位置。
(3)96孔板放在Truseq index plate fixture上,加入15μl NPM,并利用排枪分别加入5μl index 2和5μl index 1,为了避免交叉污染,更换新的白色和橙色盖子,排枪混匀5次。
(4)封膜,滚筒压平,20℃280g离心1min。
3.PCR纯化
(1)将96孔板20℃280g离心1min,准备一个新的MIDI板子(CAA),排枪转移50μlPCR产物(从NTA至CAA)。
(2)混匀磁珠,用排枪每个孔加入25μl AMpure XP磁珠,轻柔吹打混匀10次,室温静置5min。
(3)将CAA板放置磁力架2分钟,去除上清,加入200μl 80%乙醇放置30秒,去除上清,重复洗涤一次,吸干乙醇,在磁力架上晾干15min。
(4)将CAA板从磁力架上拿开,加入52.5μl RSB,轻轻吹打10次,室温放置2min,准备一个新的CAN板(clean amplified NTA Plate),用排枪从CAA板转移50μl上清至CAN板。
4.文库标准化
(1)洗涤LNP,准备一个新的MIDI板LNP,排枪从CAN板转移20μl上清至LNP板。
(2)对于96个样品(192个样品分两次上样,每次为96个样品),加4.4ml LNA1到15ml管用枪混匀LNB1,转移800μl LNB1到含有LNA1的15ml管混匀。
(3)排枪每孔加入45μlLNA1/LNB1混合液封膜后微型震荡仪1800rpm 30min,磁力架放置2min,去除上清,将LNP从磁力架上拿开。
(4)重复洗涤LNWI一次,每孔用排枪加入45μl LNW1,封膜后微型震荡仪1800rpm5min,磁力架放置2min,弃上清。
(5)将LNP板从磁力架上拿开,加入30μl0.1N NaOH封膜微型震荡仪1800rpm 5min,在这期间准备SGP(storaGe Plate)条形码贴在一个新的96孔PCR板上在SGP板中。
(6)每孔加入30μl LNS1微型震荡仪1800rpm 5min后,确保液体充分混匀。磁力架放置2min。从LNP板转移30μl上清至SGP板,封膜后1000g离心1min。
实施例6:miseq测序
利用MiSeq Reagent Kit(300cycles PE)试剂盒,96例样品(192个样品分两次上样,每次为96个样品)分为两个run来测序。
1.准备1.5ml管的金属浴至96℃,解冻试剂至室温。
2.混匀试剂盒和样品,从SGP转移5μl待测文库放置PCR 8连管中,编号一个新的PAL(pooled amplicon library)EP管,将8连管中样品转移至PAL管并混合。
3.编号一个新的DAL(Diluted amplicon library)EP管,分别加入576μl HT1及24μl PAL管中样品至DAL管,吹打混匀。
4.震荡仪混匀DAL,96℃2min后,颠倒混匀并立即放在冰水中。
5.冰浴5min,-20℃保存PAL和SGP板。
6.将DAL放在MISEQ盒的指定位置开始测序,从软件界面,选择Sequence以开始运行设置步骤,清洗并彻底干燥流动槽表面,装入流动槽,装入PR2瓶,并确保废水瓶是空的,装入试剂盒,查看运行参数和运行前检查结果。
实施例7:生物信息学分析
1.数据质控,除去低质量序列:首先出去平均质量值低于20的reads,其次每条reads从3'端截去质量值低于20的碱基,直到某一碱基质量值大于或等于20。
2.序列比对,运用bwa(0.7.5a-r405)序列比对软件将质控后的数据与人类参考基因组序列(hg19)进行比对,错配碱基个数小于3,允许比对时出现gap;
3.除去由PCR产生重复序列,先运用samtools view将sam格式的比对结果文件转换成bam格式文件,再运用samtools sort对比对结果进行排序,再用去samtools rmdup移除重复序列。
4.检测单碱基突变(SNP)和小片段插入、缺失(indel):首先运用GATK的RealignerTarget Creator和IndelRealigner模块对序列重排,再用GATK的Select Variants模块检测SNP和Indel。
5.SNP注释:运用SNPnexus工具注释SNP,找到可能性改变基因功能性的位点,包括错义、无意、移码突变等。
6.注释已报道的位点,利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库,过滤人群中存在的多态性位点。
本实施例操作步骤切实可行,所设引物特异性好、扩增效率高。本发明与一代测序相比,具有成本低、通量高、精确性高等优点。应用本发明可以在短时间内筛查数十上百个CH相关基因,可以让CH临床基因诊断变得更加快速、更加全面,适用于临床患者基因突变检测及疾病分类。
Claims (1)
1.一组检测先天性甲状腺功能减低症的多个基因的PCR引物,其特征在于:由Pax-8基因PCR引物、TG基因PCR引物、IYD基因PCR引物、DUOX2基因PCR引物、NIS基因PCR引物、TSHR基因PCR引物和TPO基因PCR引物组成;所述Pax-8基因PCR引物为序列表SEQ ID No:1—SEQ IDNo:12所示的核苷酸序列;所述TG基因PCR引物为序列表SEQ ID No:13—SEQ ID No:72所示的核苷酸序列;所述IYD基因PCR引物为序列表SEQ ID No:73—SEQ ID No:82所示的核苷酸序列;所述DUOX2基因PCR引物为序列表SEQ ID No:83—SEQ ID No:100所示的核苷酸序列;所述NIS基因PCR引物为序列表SEQ ID No:101—SEQ ID No:118所示的核苷酸序列;所述TSHR基因PCR引物为序列表SEQ ID No:119—SEQ ID No:136所示的核苷酸序列;所述TPO基因PCR引物为序列表SEQ ID No:137—SEQ ID No:166所示的核苷酸序列。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410383359.1A CN104120186B (zh) | 2014-08-06 | 2014-08-06 | 先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410383359.1A CN104120186B (zh) | 2014-08-06 | 2014-08-06 | 先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104120186A CN104120186A (zh) | 2014-10-29 |
CN104120186B true CN104120186B (zh) | 2017-07-11 |
Family
ID=51765816
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410383359.1A Expired - Fee Related CN104120186B (zh) | 2014-08-06 | 2014-08-06 | 先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104120186B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106636418A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-10 | 河北德路通生物科技有限公司 | 荧光定量RT‑PCR检测促甲状腺激素受体基因mRNA表达的试剂盒及其使用方法 |
CN108410976A (zh) * | 2018-03-19 | 2018-08-17 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 针对先天性甲减的靶向二代测序的基因芯片 |
CN111534582A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-08-14 | 常州市妇幼保健院 | 一组先天性甲状腺功能减低症的多基因检测引物及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001087957A3 (en) * | 1999-11-10 | 2002-04-25 | J David Lambeth | Novel dual oxidases as mitogenic and endocrine regulators |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2593952C2 (ru) * | 2011-06-15 | 2016-08-10 | Хилл'С Пет Ньютришн, Инк. | Композиции и способы для диагностики и мониторинга гипертиреоза у животных семейства кошачьих |
CN102344966B (zh) * | 2011-10-21 | 2013-08-07 | 浙江省疾病预防控制中心 | 促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒、使用方法和应用 |
-
2014
- 2014-08-06 CN CN201410383359.1A patent/CN104120186B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001087957A3 (en) * | 1999-11-10 | 2002-04-25 | J David Lambeth | Novel dual oxidases as mitogenic and endocrine regulators |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104120186A (zh) | 2014-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105779590A (zh) | 一种用于人类线粒体基因检测的捕获探针组及试剂盒 | |
CN106591273B (zh) | 一组与先天性代谢缺陷病相关的基因新突变及检测试剂盒 | |
CN105734679B (zh) | 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法 | |
CN108998508A (zh) | 扩增子测序文库的构建方法及引物组和试剂盒 | |
CN104120186B (zh) | 先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法 | |
CN107142320B (zh) | 用于检测肝癌的基因标志物及其用途 | |
Rouse et al. | MicroRNA biomarkers of pancreatic injury in a canine model | |
CN103966228B (zh) | 一种Rh血型DEL型RHD93T>A等位基因及其检测方法 | |
CN109852689A (zh) | 一组脉管畸形相关的生物标志物及相关检测试剂盒 | |
WO2018228028A1 (zh) | 用于检测肝癌的基因标志物及其用途 | |
CN109609632A (zh) | 检测融合基因的试剂、试剂盒及应用 | |
TW201934568A (zh) | 一種用於檢測食道癌的基因標誌物及其用途和檢測方法 | |
CN103275987B (zh) | Aqp5基因突变体及其应用 | |
CN107190071B (zh) | 一种用于检测RhD变异表型的SNP标记 | |
CN105331623A (zh) | 结核分枝杆菌rpoB突变基因及其用途 | |
CN110938685A (zh) | 新生儿遗传代谢病与血红蛋白病的基因检测探针组及其应用 | |
KR102559124B1 (ko) | Flt3 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도 | |
CN110042153A (zh) | 一种smn1基因突变的检测方法及其引物组 | |
CN106086193A (zh) | 一种基于indel‑snp连锁关系分析混合样本dna的方法 | |
CN103397089B (zh) | 一种用于染色体数目异常快速检测的半特异性扩增引物组、方法及试剂盒 | |
CN104120187B (zh) | Duox2基因突变的检测探针及其检测方法 | |
CN107988370A (zh) | 一种circRNA基因在制备诊断慢性粒细胞性白血病试剂中的应用 | |
CN108707648A (zh) | Pkd1基因和pkd2基因突变的检测方法和检测试剂盒 | |
CN108977449A (zh) | 原发性免疫缺陷病的致病突变及其应用 | |
CN109797210A (zh) | 一种y染色体微缺失的检测方法及其引物组 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170711 Termination date: 20190806 |