CN102344966B

CN102344966B - 促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒、使用方法和应用

Info

Publication number: CN102344966B
Application number: CN2011103227545A
Authority: CN
Inventors: 丁钢强; 楼晓明; 朱文明; 朱旭平; 朱勤玮; 邵俊斌
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention; Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention; Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2031-10-21
Also published as: CN102344966A

Abstract

本发明公开了一种促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒及其使用方法和应用，本发明的试剂盒包括：1）荧光PCR检测混合液；2）Taq酶；3）TSHR野生型阳性对照品；4）TSHR突变型阳性对照品；5）ddH₂O。本发明的试剂盒通过荧光定量PCR法对TSHR蛋白623位点和/或631位点的编码基因进行检测，判断是否有所述编码基因的突变，进而判断是否存在甲状腺激素受体蛋白623位点和/或631位点突变。该蛋白位点的突变可以用于甲状腺疾病的辅助诊断和预防，具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好。

Description

促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒、使用方法和应用

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体涉及一种促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒、使用方法和应用。

背景技术

甲状腺的主要生理功能是通过促甲状腺激素(TSH)作用于甲状腺细胞膜上的促甲状腺激素受体(TSHR)来控制的，TSHR属于G蛋白偶联受体家族的一员，其膜外区氨基酸末端很长，是决定与TSH及TSAB特异性结合的主要部分。TSHR的主要功能是与TSH结合，通过腺昔酸环化酶(AC)-CAMP途径引起一系列生物学反应，促进甲状腺激素的分泌，提高甲状腺的摄碘能力并促进甲状腺激素的合成、释放，对甲状腺组织的生长、分化等起着非常重要的作用。许多甲状腺疾病与TSHR基因突变有关。由于TSHR基因突变，患者体内存在一种特殊免疫球蛋白TSHR抗体(TSHRAb)，根据抗体与TSHR结合后产生的效应不同，TSHRAb分为两种类型：刺激型和抑制型。刺激型为：甲状腺刺激抗体(TSAb)；抑制型为：促甲状腺激素结合阻断免疫球蛋白(TB I)和甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)。前者结合到甲状腺细胞膜上的TSHR上可引起甲状腺增生和甲状腺激素的产生和分泌增多，而后者则阻断TSH与TSHR结合，导致甲状腺萎缩和功能下降。

研究发现，TSHR基因的突变与甲状腺腺瘤、Grave’s病、先天性甲状腺机能亢进症、先天性甲状腺功能减退症等多种甲状腺疾病相关，在A Hebrant等的研究(Genetichyperthyroidism：hyperthyroidism due to activating TSHR mutations European Journalof Endocrinology[J].2011.164：1-9)中指出TSHR上多个易突变基因的位点示意图(见说明书附图图1)。在TSHR的突变位点中，有多个突变位点同时与两种以上的甲状腺疾病形成相关，如：TSHR 623位点和631位点的突变均与甲状腺腺瘤和先天性甲亢相关，当623位点由Ala突变为Ile，则表明与甲状腺腺瘤形成相关；当623位点由Ala突变为Val时，则导致甲亢和弥漫性甲状腺肿。

因此TSHR基因突变位点的检测，一方面可作为临床对相关甲状腺疾病的辅助诊断，另外一方面也可为相关甲状腺疾病的预防提供依据。现有技术中对于突变位点的检测，主要有两个层次，一是蛋白质层次的间接检测；二是对遗传物质的直接检测，包括SSCP、RFLP、HTX、DGGE、DC、DHPLC、测序等，这些方法各有其优缺点，有的需要昂贵的检测设备，有的操作周期较长，需要2-3天才能出结果，不适合临床开展TSHR突变检测。

以荧光定量PCR为代表的基因扩增技术迅速发展，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。荧光定量PCR技术之所以由于常规PCR的最大原因是其引人了荧光探针，尤其是以近年来新推出TaqMan-MGB、TaqMan-LNA探针技术，这两种技术能提高退火温度，缩短引物探针长度，提高特异性，降低设计难度，因此多被用于一些SNP和高变异病原体的检测等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种突变位点检测试剂盒、使用方法和应用，作为临床对甲状腺疾病的辅助诊断，为相关甲状腺疾病的预防提供依据。

本发明一方面提供了一种促甲状腺激素受体(TSHR)基因突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包括针对促甲状腺激素受体蛋白623位点突变的TSHR 623体系和/或针对促甲状腺激素受体蛋白631位点突变的TSHR 631体系：

所述TSHR 623体系包括TSHR 623位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR 623位点突变型阳性对照品；所述TSHR 623位点核酸荧光PCR混合液含有1)引物、2)623-野生型探针、3)623-突变型探针、4)RT-PCR MIX、5)ddH₂O；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白623位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述623-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因，所述623-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因；所述TSHR 631体系含有TSHR 631位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR 631位点突变型阳性对照品；所述TSHR 631位点核酸荧光PCR混合液含有1)引物、2)631-野生型探针、3)631-突变型探针、4)RT-PCR MIX、5)ddH₂O；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述631-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR蛋白631位点编码基因，所述631-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白631位点编码基因；

所述探针均为荧光标记探针。

较优的，所述TSHR 623体系与TSHR 631体系共用一对引物，即所述623体系与631体系的引物序列相同，扩增含TSHR蛋白623位点编码基因和631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段。

最优的，所述引物序列见下表：

较优的，所述TSHR 623体系的623-突变型探针包括623-1型突变探针、623-2型突变探针以及623-3型突变探针，所述TSHR 623体系和TSHR 631体系的探针序列见下表：

更优的，623-野生型探针和631-野生型探针的5’端连接有FAM荧光报告基团，3’端连接有非发光的淬灭基团；623-突变型探针和631-突变型探针的5’端连接有HEX荧光报告基团，3’端连接有非发光的淬灭基团。

最优的，所述TSHR 623体系的荧光探针为Taqman-MGB探针，所述TSHR 631体系的荧光探针为Taqman-MGB-LNA探针；探针结构见下表：

上表探针中加()的碱基采用的是LNA修饰的碱基

最优的，所述TSHR 623体系和TSHR 631体系的野生型阳性对照品为含有SEQ ID NO：9基因序列的质粒；所述TSHR 623位点突变型阳性对照品与TSHR 631位点突变型阳性对照品均为含有SEQ ID NO：10基因序列的质粒，该突变型阳性对照品在TSHR蛋白623位点编码基因和TSHR蛋白631位点编码基因处都发生基因突变。

GTTGCCTTCGTCATCGTCTGCTGCTGTTATGTGAAGATCTACATCACAGTCCGAAATCCGCAGTACAACCCAGGGGACAAAGATACCAAAATTGCCAAGAGGATGGCTGTGTTGATCTTCACCGACTTCATATGCATGGCCC (SEQ ID NO：9)

GTTGCCTTCGTCATCGTCTGCTGCTGTTATGTGAAGATCTACATCACAGTCCGAAATCCGCAGTACAACCCAGGGGACAAAGATACCAAAATTATCAAGAGGATGGCTGTGTTGATCCTCACCGACTTCATATGCATGGCCC (SEQ ID NO：10)

较优的，所述质粒为pMD18-T。

最优的，所述TSHR 623位点核酸荧光PCR混合液包括：

所述TSHR 631位点核酸荧光PCR混合液包括：

较优的，所述试剂盒还包含有DNA提取剂。

较优的，所述试剂盒的扩增程序为37℃2min；94℃2min；93℃15sec、60℃60sec40个循环。

较优的，所述试剂盒以H₂O为检测样品的检测结果应为阴性；以TSHR 623位点野生型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测Ct值≤35，在HEX通道检测为UNDET或40；以TSHR 623位点突变型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值≤35；以TSHR 631位点野生型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测Ct值≤35，在HEX通道检测为UNDET或40；以TSHR 631位点突变型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值≤35。如果荧光PCR反应的阳性对照品不符合上述条件，则试验视为无效。

较优的，所述试剂盒用于检测时，针对TSHR 623位点的检测：FAM通道检测Ct值≤38，HEX通道检测为UNDET，则待测样品为TSHR 623位点野生型；FAM通道检测为UNDET，HEX通道检测Ct值≤38，则待测样品为TSHR 623位点突变型；针对TSHR 631位点的检测：FAM通道检测Ct值≤38，HEX通道检测为UNDET，则待测样品为TSHR 631位点野生型；FAM通道检测为UNDET，HEX通道检测Ct值≤38，则待测样品为TSHR 631位点突变型。

本发明第二方面公开了促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒的使用方法，具体步骤如下：

1.待测DNA样品的制备：采用经典的基因组DNA提取方法或是商品化的基因组提取试剂盒，从样本中提取基因组DNA备用；

2.配置试剂：每管取荧光PCR混合液与Taq酶，振荡混匀，获得荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液；

3.加样：每支PCR管取步骤2制备的荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液，然后将待测DNA样品、ddH₂O、TSHR野生型阳性对照品、TSHR突变型阳性对照品分别加入装有所述共混液的各支PCR管中，盖好管盖，组成PCR反应体系；

4.PCR扩增：对步骤3的PCR反应体系进行PCR扩增；

5.荧光PCR检测：单点荧光检测在60℃，选用FAM和HEX通道，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过H₂O检测荧光曲线的最高点，读取各PCR管的Ct值；

6.结果分析：按上述条件进行检测结果判断。

较优的，步骤1所述的样本来源于测试者的外周静脉血或是甲状腺肿组织。

较优的，步骤2的配置试剂的具体操作为：每管取36μl荧光PCR检测混合液与0.4μl Taq酶，振荡混匀，3000rpm离心，获得荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液。

较优的，步骤3的配置试剂的具体操作为：每支PCR管取36μl步骤2制备的荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液，然后将待测DNA样品、ddH₂O、TSHR野生型阳性对照品、TSHR突变型阳性对照品各4μl分别加入装有所述共混液的各支PCR管中，盖好管盖，组成40μl的PCR反应体系。

读取TSHR野生型阳性对照和TSHR突变型阳性对照的Ct值，与试剂盒的质量控制标准核对：H₂O检测结果应为阴性；TSHR 623体系的TSHR 623位点野生型阳性对照品在FAM通道检测Ct值≤35，在HEX通道检测为UNDET或40；TSHR 623位点突变型阳性对照品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值≤35；

TSHR 631体系的TSHR 631位点野生型阳性对照品在FAM通道检测Ct值≤35，在HEX通道检测为UNDET或40；TSHR 631位点突变型阳性对照品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值≤35；

如果荧光PCR反应的阳性对照品不符合以上质控标准，则试验视为无效。

在阳性对照品符合质量控制标准的前提下，参照下表的检测标准对待测DNA样品的突变类型进行判断。

利用本发明的促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒对待测样本进行检测，如果判断结果为TSHR 623位点突变型和/或TSHR 631位点突变型，则说明样本已经患有，或者将来有较大几率患有甲状腺腺瘤、甲亢或弥漫性甲状腺肿等甲状腺疾病。

本发明第三方面公开了促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒在制备辅助诊断或预防甲状腺疾病的试剂中的应用。

较优的，所述甲状腺疾病选自甲状腺腺瘤、先天性甲亢或弥漫性甲状腺肿等甲状腺疾病。

本发明的有益效果为：本发明采用的Taqman-MGB和TaqMan-LNA荧光PCR技术，形成的TSHR部分突变位点检测试剂盒具有具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点，能同时检测多个TSHR突变位点。因此该试剂盒一方面可用于TSHR基因突变位点的检测，一方面可作为临床对相关甲状腺疾病的辅助诊断，为相关甲状腺疾病的预防提供依据。

附图说明

图1：TSHR上多个易突变基因位点的示意图

图2：阳性对照品扩增曲线图

图3：样本1扩增曲线图

图4：样本2扩增曲线图

图5：样本3扩增曲线图

图6：样本4扩增曲线图

图7：样本5扩增曲线图

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制明本发明的范围。

实施例1阳性对照品的制备

以NCBI注册号：NM_000369(GI：64085120)的TSHR基因序列为依据，设计上游引物TSHR-F(SEQ ID NO：1)和下游引物TSHR-R(SEQ ID NO：2)。用这两条引物扩增正常人的TSHR基因，基因序列为NCBI注册号：NM_000369(GI：64085120)。所得的PCR产物经纯化后TA克隆至pMD18-T载体上并经测序鉴定，将经测序验证的质粒转化入DH5α克隆得到大量重组质粒；稀释重组质粒，即为野生型阳性对照品。该野生型阳性对照品中引物扩增的序列为SEQ ID NO：9。

以重组质粒为模板，用Stratagene的多定点突变试剂盒，对编码TSHR蛋白623位点和631位点的基因序列进行定点突变，将编码TSHR蛋白623位点氨基酸的碱基由GCC突变为ATC(使TSHR蛋白623位点由丙氨酸突变为异亮氨酸)，将编码TSHR蛋白631位点氨基酸的碱基由TTC突变为CTC(使TSHR蛋白631位点由苯丙氨酸突变为亮氨酸)，所得的突变质粒即为突变型阳性对照品。该突变型阳性对照品中包含的突变的TSHR基因序列为SEQ IDNO：10。

实施例2试剂盒检测

通过本发明的促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒及试剂盒的使用方法，对5名实验者的样本进行促甲状腺激素受体(TSHR)基因突变位点检测，具体步骤如下：

1.待测DNA样品的制备：通过基因组提取试剂盒，从5份血浆样本中提取基因组DNA备用；

2.配置试剂：每管取36μl TSHR 623位点核酸荧光PCR混合液与0.4μl Taq酶，振荡混匀，3000rpm离心数秒，获得TSHR 623位点核酸荧光PCR混合液与Taq酶的共混液；每管取36μl TSHR 631位点核酸荧光PCR混合液与0.4μl Taq酶，振荡混匀，3000rpm离心数秒，获得TSHR 631位点核酸荧光PCR混合液与Taq酶的共混液；

3.加样：每PCR管取36μl TSHR 623位点核酸荧光PCR混合液与Taq酶的共混液，然后将待测DNA样品、H₂O、TSHR 623位点野生型阳性对照品、TSHR 623位点突变型阳性对照品各4μl分别加入各PCR管中，盖好管盖，反应体系为40μl；每PCR管取36μl TSHR 631位点核酸荧光PCR混合液与Taq酶的共混液，然后将DNA样品、H₂O、TSHR 631位点野生型阳性对照品、631位点突变型阳性对照品各4μl分别加入各PCR管中，盖好管盖，反应体系为40μl；

4.PCR扩增：扩增程序为37℃2min；94℃2min；93℃15sec、60℃60sec 40个循环；单点荧光检测在60℃；

5.荧光PCR检测：选用FAM和HEX通道，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过H₂O检测荧光曲线的最高点；读取Ct值。

6.结果分析：

检测结果：H₂O在两个检测混合液中的检测结果均为阴性；TSHR 623位点野生型阳性对照品在FAM通道检测Ct值为20.3，在HEX通道检测为UNDET；TSHR 623位点突变型阳性对照品在FAM通道检测为UNDET，在HEX通道检测Ct值为19.8；TSHR 631位点野生型阳性对照品在FAM通道检测Ct值为22.05，在HEX通道检测为UNDET；TSHR 631位点突变型阳性对照品在FAM通道检测为UNDET，在HEX通道检测Ct值为22.21，符合质量控制标准的要求，实验结果有效。

样本的荧光PCR图见说明书附图3-7，实验结果分析见下表：

由上述实验结果可见知，本次实验的试剂盒检测结果见下表：

上述试剂盒检测结果与待测样本的基因测序结果一致。

Claims

1.一种促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包括针对促甲状腺激素受体蛋白623位点突变的TSHR623体系和/或针对促甲状腺激素受体蛋白631位点突变的TSHR631体系：

所述TSHR623体系包括TSHR623位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR623位点突变型阳性对照品；所述TSHR623位点核酸荧光PCR混合液含有1)引物、2)623-野生型探针、3)623-突变型探针、4）RT-PCR MIX、5)ddH₂O；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白623位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述623-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因，所述623-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因；

所述TSHR631体系含有TSHR631位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR631位点突变型阳性对照品；所述TSHR631位点核酸荧光PCR混合液含有1)引物、2)631-野生型探针、3)631-突变型探针、4）RT-PCR MIX、5)ddH₂O；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述631-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR蛋白631位点编码基因，所述631-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白631位点编码基因；

所述探针均为荧光标记探针；所述623体系与631体系的引物序列相同，扩增含TSHR蛋白623位点编码基因和631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段；所述引物序列为SEQ ID NO:1～2；所述TSHR623体系的623-野生型探针序列为SEQ ID NO:3，所述623-突变型探针包括623-1型突变探针、623-2型突变探针和623-3型突变探针，探针序列分别为SEQ ID NO:4～6；所述TSHR631体系的631-野生型探针序列为SEQ IDNO:7，所述631-突变型探针序列为SEQ ID NO:8。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述623-野生型探针和631-野生型探针的5’端连接有FAM荧光报告基团，3’端连接有非发光的淬灭基团；所述623-突变型探针和631-突变型探针的5’端连接有HEX荧光报告基团，3’端连接有非发光的淬灭基团。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TSHR623体系的荧光探针为Taqman-MGB探针，所述TSHR631体系的荧光探针为Taqman-MGB-LNA探针。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TSHR623体系和TSHR631体系的野生型阳性对照品为含有SEQ ID NO：9基因序列的质粒；所述TSHR623位点突变型阳性对照品与TSHR631位点突变型阳性对照品均为含有SEQ ID NO：10基因序列的质粒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒为pMD18-T。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为37℃2min；94℃2min；93℃15sec、60℃60sec40个循环。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以H₂O为检测样品的检测结果应为阴性；以TSHR623位点野生型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测Ct值≤35，在HEX通道检测为UNDET或40；以TSHR623位点突变型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值≤35；以TSHR631位点野生型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测Ct值≤35，在HEX通道检测为UNDET或40；以TSHR631位点突变型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值≤35；

所述试剂盒用于检测时：

针对TSHR623位点的检测：FAM通道检测Ct值≤38，HEX通道检测为UNDET，则待测样品为TSHR623位点野生型；FAM通道检测为UNDET，HEX通道检测Ct值≤38，则待测样品为TSHR623位点突变型；针对TSHR631位点的检测：FAM通道检测Ct值≤38，HEX通道检测为UNDET，则待测样品为TSHR631位点野生型；FAM通道检测为UNDET，HEX通道检测Ct值≤38，则待测样品为TSHR631位点突变型。

8.如权利要求1-7任一权利要求所述的促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒在制备辅助诊断或预防甲状腺疾病的试剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甲状腺疾病选自甲状腺腺瘤、先天性甲亢或弥漫性甲状腺肿。