CN107419032A - 用于快速筛查egfr基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用 - Google Patents

用于快速筛查egfr基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107419032A
CN107419032A CN201710873302.3A CN201710873302A CN107419032A CN 107419032 A CN107419032 A CN 107419032A CN 201710873302 A CN201710873302 A CN 201710873302A CN 107419032 A CN107419032 A CN 107419032A
Authority
CN
China
Prior art keywords
egfr
mutation
exons
primer
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710873302.3A
Other languages
English (en)
Inventor
曾瀚
其他发明人请求不公开姓名
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Cyan Gene Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Cyan Gene Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Cyan Gene Technology Co Ltd filed Critical Beijing Cyan Gene Technology Co Ltd
Priority to CN201710873302.3A priority Critical patent/CN107419032A/zh
Publication of CN107419032A publication Critical patent/CN107419032A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种用于快速筛查EGFR基因外显子18‑21突变的特异性引物及其应用方法，包括以下步骤：(1)提取外周血样品基因组DNA；(2)设计合成用于扩增EGFR基因外显子18‑21的特异性引物共4对；(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR；(4)曲线分析中得到阳性结果的样本，即发生EGFR基因突变。本发明的检测方法不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。同时针对人群快速筛查，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点。

Description

用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物及 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。尤其是涉及一种用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物及其应用。
背景技术
近年来，我国恶性肿瘤的发生率和病死率呈明显上升趋势，已跃居我国居民死亡病因的首位。然而，对于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断以及防治，尚无突破性研究，部分患者就诊时已处于中晚期，疗效较差。因此，提高恶性肿瘤的早期诊断水平，是改善恶性肿瘤诊治疗效的有效出路。目前临床上，多采用血清学检测的方法监测血清或其他体液中的肿瘤标志物，动态地对肿瘤的存在、发生发展及预后做出判断。然而，任何一种科学指标都不是绝对的。肿瘤标志物的器官特异性和肿瘤特异性较差,既存在于肿瘤中也存在于正常人群和非肿瘤患者血液和体液中,每个人对于肿瘤标志物都有各自的基础水平,不能单凭超过参考范围而进行诊断。有时要借助相关辅助检查,对检测结果进行仔细分析后,才能提高对肿瘤的存在、发展及预后的实用价值。同时，肿瘤标志物浓度会受到体内代谢的很多因素影响，所以准确性也会受到影响。以肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)为例，除绝大多数肝癌病人的血清呈阳性外，还有31％～52％的急性肝炎、15％～58％的慢性肝炎以及11％～47％的肝硬化病人的AFP也会有大幅上升，因此不必一看到“阳性”就“色变”。当然，与此同时，甲胎蛋白阴性自感不适的患者也不能掉以轻心，还要依靠大夫联合多项检查直至细胞学、病理学检查等做进一步查实和鉴别。
基因是具有遗传效应的DNA片段，支持着生命的基本构造和性能。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。无论是碱基置换突变还是移码突变，都能使多肽链中的氨基酸组成或顺序发生改变，进而影响蛋白质或酶的生物功能，使机体的表型出现异常。因此，对基因的突变进行检测，能够在疾病发生的早期阶段被检测出，有利于实现疾病的早发现，早诊断，早治疗。
HRM(高分辨率熔解曲线分析)是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。美中不足的是在进行未知突变筛查、扫描时，只能检测到有无突变，无法确定突变在DNA片段中位置。触底PCR(Touch down(TD)PCR)是一种特殊技术，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)属于酪氨酸激酶受体，它介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化。EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常过表达，EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变,这些突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。外显子19的缺失和外显子21的替代突变，与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的敏感性密切相关。另外，大部分对EGFR-TKI治疗有效地患者最终都会对EGFR-TKI产生耐药性，而EGFR外显子20的体细胞突变是EGFR-TKI激发耐药的主要机制之一。外显子20的突变类型主要是T790M。这一突变仅见于药物治疗后复发者，突变使得非小细胞肺癌患者对吉非替尼和厄洛替尼出现激发耐药。因此，EGFR突变的检测对健康人群体检筛查、早期发现癌症或者癌症的个体化治疗具有重要的参考价值。
发明内容
本发明的技术目的首先是提供一种用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物，其结合高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR方法，可以快速筛查EGFR基因外显子18-21是否发生突变，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点，尤其适用于大量人群的快速筛查需求，如健康人群的体检需求。其可以指示EGFR基因外显子18-21已经突变病变，再通过基因测序法进一步确定突变的具体位置及序列，准确率高，具有极高的实用性价值。
所述用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物的核苷酸序列分别是：
进一步地，本发明提供一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的体外检测方法，其不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。同时针对人群快速筛查，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点。
所述检测方法是采用上述的特异性引物，进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR。优选的步骤包括：
(1)提取外周血样品基因组DNA；
(2)合成用于扩增EGFR基因外显子18-21的特异性引物共4对；
(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用分析软件对采集后的曲线进行分析；
(4)HRM曲线分析：如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生EGFR基因突变。例如附图1中箭头所示，相对于阴性对照出现一个单独的峰，为阳性结果，可以表明存在EGFR基因突变。
所述特异性引物，是针对EGFR基因外显子18-21特别设计的引物，经过反复试验筛选和验证，最终筛选得到，具有特异性强、扩增效率高等优点。
所述步骤(3)中PCR的反应体系优选的是：总体积为15μL的反应体系包含：mastermix 10μL；MgCl2 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余为RNasefree H2O。
反应时，向所述反应体系中依次加入样品基因组DNA 5μL、阴性对照、空白对照进行触底PCR反应，其中阴性对照是EGFR野生型序列，空白对照是无DNA模板。
本发明的检测方法，还有一个明显的技术特征是，所述步骤(1)中外周血样品采用干血片收集。只需要0.5mL的外周血即可，对于待检者来说，具有可长途运输、保存时间长、采血简单等优点，是基因检测技术中一项重大的改进。同时步骤(1)中样品基因组DNA的提取可采用商品化试剂盒提取。操作简单易行，也方便高通量检测时使用。
本发明的检测方法可用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变。利用HRM联合触底PCR的方法，能够实现在同一实验条件下，对干血片中提取得到的待检人群的DNA中EGFR基因多个外显子的突变进行检测。实验显示，通过对81例结直肠癌、69例肺癌、79例肝癌、100例乳腺癌以及45例食管癌患者血液中EGFR基因18、19、20、21外显子进行检测，能够成功检测到19例结直肠癌患者、18例肺癌受检者、6例肝癌患者、24例乳腺癌患者、8例食管癌患者血液DNA中EGFR基因存在突变，之后运用一代测序法对PCR产物进行检测并与人类基因组序列进行比对后证实，这75例样本确实存在DNA序列上的改变。证明了本发明方法的准确性。
本发明的检测方法可以应用在任意一种快速筛查EGFR基因突变检测试剂盒中。优选包含用于扩增EGFR基因外显子18-21的特异性引物共4对，其核苷酸序列分别如上表所示。
检测试剂盒还含有PCR试剂、阴性对照、空白对照，其中阴性对照是EGFR野生型序列，空白对照是无DNA模板。
本发明的试剂盒具有如下优点：(1)全部引物能在同一温度下进行稳定的PCR反应，获取特异性的EGFR基因片段；(2)检测灵敏度高，特异性强；(3)小反应体系(15μL)，标本和试剂用量少；(4)采用检测样本为外周血干血片，采集容易，保存时间长，运输容易；(5)反应简便迅速，2小时即可获得实验结果，便于大样本高通量处理；(6)试剂价格低廉，成本低。
附图说明
图1为实施例1中阳性样本的HRM溶解曲线图；
图2为实施例1中阴性样本的HRM溶解曲线图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的体外检测方法，包括以下步骤：
(1)干血片DNA的提取
总DNA提取按照磁珠法干血斑基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书进行，如下：
1、取一块新的96孔深孔板，然后在每孔加入三片3*3mm的干血斑样品。在96深孔板中加入200μL的缓冲液GA。
2、加入20μL蛋白酶K溶液，涡旋震荡10秒混匀后，放入预热至56度的恒温振荡器中，900rpm恒温震荡裂解30分钟。
3、在上一步样品裂解期间，向新的96孔深孔板中加入10μL磁珠悬浮液G，200μL缓冲液GB和200μL无水乙醇，抽打混匀或震荡混匀10秒。
4、样品裂解后，将步骤3中深孔板短暂离心，冰箱裂解液完全移至步骤4中的深孔板，然后将其放入恒温振荡器，室温900rpm震荡3分钟。
5、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
6、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
7、将深孔板从磁力架上取下，加入500μL缓冲液GD，抽打混匀或震荡混匀。
8、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
9、将深孔板从磁力架上取下，加入500μL漂洗液PW，抽打混匀或振荡混匀3分钟。
10、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，带磁珠完全吸附时小心去除液体，使磁珠继续被吸附。
11、缓慢加入750μL漂洗液PWIII，尽量不要冲起磁珠，静置20秒后用移液器小心去除液体，取下深孔板。
12、加入50-100μL洗脱缓冲液TB或去离子水，抽打混匀或振荡混匀，置于56度，孵育5-10分钟。
13、将深孔板放置于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至收集板，并于适当条件保存。
(2)高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR
高分辨率熔解曲线分析的EGFR基因外显子18-21的特异性引物共计4对，序列如下表所示：
配制总体积为15μL的PCR反应体系；
体系包含：master mix 10μL；MgCl2 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；引物F 1μL；引物R 1μL，其余为RNase free H2O。
将配好的反应体系加入96孔板内，之后按照加样顺序，取5μL样品、阴性对照、空白对照依次加入相应孔内，在96孔板上封膜，振荡混匀，之后短暂离心。
高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR反应条件：95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用LightCycler 480所配分析软件对采集后的曲线进行分析。如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生EGFR基因突变，如图1所示。另图2是检测样本中的阴性样本的HRM溶解曲线图，相对于阴性对照，阴性样本的检测曲线未出现明显的差异。
(3)直接测序法进行验证(此为可选步骤)
用高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR的方法得到阳性结果的样本，即发生EGFR基因突变。将发生突变的样本剩余的DNA进行基因测序，验证其有无假阳性。
实施例2：临床样本检测
采用实施例1的方法对多例体检人群血液中EGFR基因18-21外显子进行检测，检测结果如下：
对81例结直肠癌、69例肺癌、79例肝癌、100例乳腺癌以及45例食管癌患者血液中EGFR基因18、19、20、21外显子进行检测，能够成功检测到19例结直肠癌患者、18例肺癌受检者、6例肝癌患者、24例乳腺癌患者、8例食管癌患者血液DNA中EGFR基因存在突变，之后运用一代测序法对PCR产物进行检测并与人类基因组序列进行比对后证实，这75例样本确实存在DNA序列上的改变。
81例结直肠癌患者血液样本，其中有19例(第3、8、15、24、30、31、39、41、44、47、54、65、77、81、83、89、90、92、95号)出现突变，第3、8、15、24、30、31、39、41、44、47、54、65、77、81、83、89、90、92、95号样本EGFR基因外显子20疑似出现核酸序列变化(如图1所示，异常结果图)。经一代测序检测，结果显示第3、8、15、24、30、31、39、41、44、47、54、65、77、81、83、89、90、92、95号样本EGFR基因外显子20的第113位核酸出现C/T变异，即CTG/TTG同义变异，此变异对EGFR的功能无影响。
69例结肺癌患者血液样本，其中有18例(第2、8、9、10、12、15、21、27、36、37、40、42、48、49、50、59、63、64号)出现突变，第2、8、9、10、12、15、21、27、36、37、40、42、48、49、50、59、63、64号样本EGFR基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第2、8、9、10、12、15、21、27、36、37、40、42、48、49、50、59、63、64号样本EGFR基因外显子20的第113位核酸出现C/T变异，即CTG/TTG同义变异，此变异对EGFR的功能无影响。
79例肝癌患者血液样本，其中有6例(第3、13、14、66、68、71号)出现突变，第3、13、14、66、68、71号样本EGFR基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第3、13、14、66、68、71号样本EGFR基因外显子20的第113位核酸出现C/T变异，即CTG/TTG同义变异，此变异对EGFR的功能无影响。
100例乳腺癌患者血液样本，其中有24例(第2、12、13、18、19、20、28、40、46、48、50、58、66、69、70、74、78、85、88、90、91、96、99、100号)出现突变，第18、91、96号样本EGFR基因外显子18疑似出现核酸序列变化；第2、12、13、18、19、20、28、40、46、48、50、58、66、69、70、74、78、85、88、90、99、100号样本EGFR基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第18、91、96号样本EGFR基因外显子18的第38位核酸出现A/C变异，即密码子AAC变成ACC，为错义突变，相应的氨基酸由天冬酰胺变成苏氨酸，影响了蛋白质的氨基酸组成；第2、12、13、18、19、20、28、40、46、48、50、58、66、69、70、74、78、85、88、90、99、100号样本EGFR基因外显子20的第113位核酸出现C/T变异，即CTG/TTG同义变异，此变异对EGFR的功能无影响。
45例结食管癌患者血液样本，其中有8例(第1、3、17、22、26、33、36、47号)出现突变，第1、3、17、22、26、33、36、47号样本EGFR基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第1、3、17、22、26、33、36、47号样本EGFR基因外显子20的第113位核酸出现C/T变异，即CTG/TTG同义变异，此变异对EGFR的功能无影响。
结果表明，本发明提供的特异性引物和检测方法可快速检测EGFR基因18-21外显子的多种突变，适用于健康人群体检筛查需求。具有检测灵敏度高，特异性强，反应简便迅速，2小时即可获得实验结果，便于大样本高通量处理等特点，筛查出的阳性结果再经过基因测序法确定，可以大为减少早期肿瘤筛查的困难度和检测成本。同时还具有以下优点：
1、优选采用干血片收集样本：目前现有的HRM相关技术所用的样本主要包括石蜡包埋肿瘤组织或血清，而本发明技术检测的DNA样本来源于干血片。干血片仅需采集外周血0.5ml，外周血取血量少，且干血片易于保存和远距离邮寄，故适用范围更广。目前，对于微量DNA的提取已有成熟的商品化试剂盒可以完成，保证提取DNA的质量。当然，除了干血片，本发明技术也同样可用于其他所有能提取DNA的样本，如肿瘤组织、血清等。故本发明技术的应用范围更广泛且易于推广。
2、筛查用途：目前现有的检测试剂盒、检测方法等检测的样本均为肿瘤患者术后的肿瘤组织，或已明确肿瘤诊断的肿瘤患者血清，而本发明技术通过干血片获得受检者的DNA，样本的采集并不局限于已明确诊断的肿瘤患者，主要是用于常规体检筛查，而不是疾病的诊断和治疗。对于携带具有遗传倾向的基因突变，可以进行有效的筛查，从而达到预防肿瘤的目的。因此，本发明提供的HRM方法可快速检测EGFR基因18-21号外显子的多种突变，不仅适用于临床肿瘤患者标本检测，还可用于常规体检者的早期筛查。
3、引物特异性：全部引物能在同一温度下进行稳定的PCR反应，获取特异性扩增片段；检测灵敏度高，特异性强；小反应体系，共计15ul，标本和试剂都用量少；采用检测样本为DNA，来源丰富，可支持组织、胸水、血清，特别是干血片等多种来源的标本；反应简便迅速，便于大样本量检测；试剂价格低廉，高通量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京青航基因科技有限公司
<120> 用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物及应用
<130> P1710163
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtgaccctt gtctctgtgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtgccaggg accttacctt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgcatcgct ggtaacatcc a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaggtgggc ctgaggttca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctccaggaa gcctacgtga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acctttgcga tctgcacaca 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctcacagca gggtcttctc tg 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tggctgacct aaagccacct c 21

Claims (10)

1.用于快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列分别是：
EGFR外显子18正向引物：如SEQ ID No.1所示；
EGFR外显子18反向引物：如SEQ ID No.2所示；
EGFR外显子19正向引物：如SEQ ID No.3所示；
EGFR外显子19反向引物：如SEQ ID No.4所示；
EGFR外显子20正向引物：如SEQ ID No.5所示；
EGFR外显子20反向引物：如SEQ ID No.6所示；
EGFR外显子21正向引物：如SEQ ID No.7所示；
EGFR外显子21反向引物：如SEQ ID No.8所示。
2.权利要求1所述的特异性引物用于高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR方法快速筛查EGFR基因外显子18-21突变。
3.一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的特异性引物，进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)提取外周血样品基因组DNA；
(2)合成权利要求1所述的特异性引物共4对；
(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用分析软件对采集后的曲线进行分析；
(4)HRM曲线分析：如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生EGFR基因突变。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR的反应体系是：
总体积为15μL的反应体系包含：master mix 10μL；MgCl2 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余为RNase free H2O。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中向所述反应体系中依次加入样品基因组DNA 5μL、阴性对照、空白对照进行触底PCR反应。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中外周血样品采用干血片收集。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中样品基因组DNA的提取采用试剂盒提取。
9.权利要求1所述的特异性引物或权利要求4所述的检测方法在快速筛查EGFR基因突变检测试剂盒中的应用。
10.一种快速筛查EGFR基因外显子18-21突变的检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的特异性引物，以及PCR试剂、阴性对照、空白对照。
CN201710873302.3A 2017-09-25 2017-09-25 用于快速筛查egfr基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用 Pending CN107419032A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710873302.3A CN107419032A (zh) 2017-09-25 2017-09-25 用于快速筛查egfr基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710873302.3A CN107419032A (zh) 2017-09-25 2017-09-25 用于快速筛查egfr基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107419032A true CN107419032A (zh) 2017-12-01

Family

ID=60435830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710873302.3A Pending CN107419032A (zh) 2017-09-25 2017-09-25 用于快速筛查egfr基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107419032A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988369A (zh) * 2017-12-28 2018-05-04 北京雅康博生物科技有限公司 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921830A (zh) * 2010-03-29 2010-12-22 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 Egfr基因突变的快速检测
CN103131779A (zh) * 2013-02-25 2013-06-05 深圳市宝安区人民医院 一种无创检测表皮生长因子受体t790m突变的酶切富集pcr法
CN103602734A (zh) * 2013-11-04 2014-02-26 北京海思特临床检验所有限公司 用于检测egfr基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法
CN106834487A (zh) * 2017-03-01 2017-06-13 北京青航基因科技有限公司 快速筛查p53基因外显子5‑8突变的体外检测方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921830A (zh) * 2010-03-29 2010-12-22 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 Egfr基因突变的快速检测
CN101921830B (zh) * 2010-03-29 2013-03-27 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 Egfr基因突变的快速检测
CN103131779A (zh) * 2013-02-25 2013-06-05 深圳市宝安区人民医院 一种无创检测表皮生长因子受体t790m突变的酶切富集pcr法
CN103602734A (zh) * 2013-11-04 2014-02-26 北京海思特临床检验所有限公司 用于检测egfr基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法
CN106834487A (zh) * 2017-03-01 2017-06-13 北京青航基因科技有限公司 快速筛查p53基因外显子5‑8突变的体外检测方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONGDO DO等: "High resolution melting analysis for rapid and sensitive EGFR and KRAS mutation detection in formalin fixed paraffin embedded biopsies", 《BMC CANCER》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988369A (zh) * 2017-12-28 2018-05-04 北京雅康博生物科技有限公司 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒
CN107988369B (zh) * 2017-12-28 2020-11-17 北京雅康博生物科技有限公司 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Han et al. Detection of EGFR mutation status in lung adenocarcinoma specimens with different proportions of tumor cells using two methods of differential sensitivity
US20230127823A1 (en) Non-Invasive Gene Mutation Detection in Lung Cancer Patients
EP3218518B1 (en) Determining tumor load and biallelic mutation in patients with calr mutation using peripheral blood plasma
Ren et al. The prognostic value of circulating plasma DNA level and its allelic imbalance on chromosome 8p in patients with hepatocellular carcinoma
US10697022B2 (en) PIK3CA novel mutations detection for diagnosis of acquired cetuximab resistance in metastatic colorectal cancer patients
EP2890815A2 (en) Methods for diagnosis and treatment of cancer
JP6864089B2 (ja) 進行性胃癌患者の手術後の予後または抗癌剤適合性予測システム
Tang et al. Coexistent genetic alterations involving ALK, RET, ROS1 or MET in 15 cases of lung adenocarcinoma
CN103382503B (zh) Egfr基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒及检测方法
Park et al. Optimization to detect TP53 mutations in circulating cell-free tumor DNA from patients with serous epithelial ovarian cancer
Lee et al. Comparison of direct sequencing, PNA clamping-real time polymerase chain reaction, and pyrosequencing methods for the detection of EGFR mutations in non-small cell lung carcinoma and the correlation with clinical responses to EGFR tyrosine kinase inhibitor treatment
CN105463111A (zh) 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒
JP6387001B2 (ja) Ｃｄｋ阻害剤と関連するバイオマーカー
EP2373816B1 (en) Methods for screening, predicting and monitoring prostate cancer
CN108913772B (zh) 基于捕获测序的bMSI检测技术
CN106755551A (zh) 一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用
CN107419032A (zh) 用于快速筛查egfr基因外显子18‑21突变的特异性引物及应用
JP2011511635A (ja) 癌標識としての結腸癌関連転写因子１（ｃｃａｔ−１）
CN106834487A (zh) 快速筛查p53基因外显子5‑8突变的体外检测方法及应用
WO2014190927A1 (zh) 胰腺神经内分泌肿瘤易感基因位点及检测方法和试剂盒
CN109207595A (zh) 一种人egfr基因t790m突变检测试剂盒及其检测方法
JP7057668B2 (ja) 治療剤に対する抵抗性の診断に使用するためのＥＲＣＣ１アイソフォーム３のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質ならびにこのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質を使用する治療剤に対する抵抗性を診断するための方法
Shi et al. Association between clinical characteristics and the diagnostic accuracy of circulating single‐molecule amplification and resequencing technology on detection epidermal growth factor receptor mutation status in plasma of lung adenocarcinoma
CN113999852B (zh) circ_0001772作为结直肠癌诊断和治疗标志物的应用
Gaber et al. Mini review: immunohistochemistry using EGFR-mutant specific antibodies in non-small cell lung carcinoma: accuracy and reliability

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171201