JP5117853B2 - 甲状腺刺激ホルモンレセプター試料、該甲状腺刺激ホルモンレセプターの結合部位、抗体及び該結合部位とのホルモンの相互作用、およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
(a)TSHをTSHRの試料に結合することを阻害するためにTSHR自己抗体の能力を測定する競合結合測定;
(b)培養組織でTSHRを発現している細胞を刺激するためにTSHR自己抗体の能力を測定する生物検定;
(c)TSHR自己抗体でTSHR試料の免疫沈降;
である。
(i)実質的に、上述の変異型TSHR試料をエンコードするヌクレオチド配列;
(ii)(i)の配列の対立遺伝子のバリエーションからなるヌクレオチド配列;
(iii)(i)の配列の断片からなるヌクレオチド配列;又は
(iv)(i)の配列のストリンジェントな状況でハイブリダイズするヌクレオチド配列;からなるポリヌクレオチドが提供される。
(i)実質的に、ここに記載のような、宿主細胞の提供;
(ii)上記宿主細胞の成長;及び
(iii)その成長した宿主細胞からの本発明による変異型TSHR試料の回収
を含む。
方法
PCRを用いて、ヒトTSHR配列への特定のアミノ酸の突然変異の導入
下記の基本的なクローニング手法にしたがって、TSHRの完全長のヌクレオチド配列(スイスプロットアクセッションナンバー(Swiss prot accession number): Pl 6473 - http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val= 136448; NCBl Entrez Nucleotide accession number NM 000369-http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=4507700)は、BamHI及びXhoIを用いて、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen)にクローニングされた。
FIp-In-CHO細(Invitrogen)のコンフルエント(confluent)フラスコは、1x105−1.5x105細胞/ウェルのDMEM (Invitrogen)、10%胎仔の仔牛血清(FCS) (Invitrogen)、1xのL−グルタミン(Invitrogen)及び抗体がなく、1xの必須でないアミノ酸(NEAA)(Invitrogen)で、24穴のプレートウェルで播種するために使用された。ウェルは、37℃、5%CO2、95%より高い湿度でオーバーナイトにわたって培養された。
野生型及び突然変異型のTSHRの両者を発現する、FIp-In-CHO細胞のサイクリックAMPの生成を刺激する、hMAb TSHR1及びTSHの能力は、WO2004/050708A2に従って分析された。要約すると、CHO細胞は、96穴プレート(12,500−20,000細胞/ウェル)に播種され、10%仔牛の胎児の血清を含むDMEM(インビトロジェン)で48時間にわたってインキュベーションされた。次いで、DMEMが取り除かれ、サイクリックAMPアッセイバッファー(1 g/L グルコース, 20 mmol/L HEPES, 222 mmol/Lスクロース, 15 g/Lウシ血清アルブミン(BSA)と0.5 mmol/L 3イソブチル−1−メチルキサンチン, pH 7.4を含むNaClフリーのHank's バッファー塩溶液)でのブタのTSH(RSR Ltd; 0.01 -3 ng/mL)及びhMAb TSHRl Fab (0.1-10 ng/mL)の希釈液が添加され、5%CO2の大気下にて37℃で1時間インキュベーションされた。試験溶液を除去した後、細胞は溶解されて、アマシャムバイオサイエンスのBiotrak酵素免疫アッセイシステムを用いて、サイクリックAMPをアッセイした。TSHアゴニスト活性を有するTSHレセプター抗体を含有する血清を用いた実験は、アッセイに先立ってサイクリックAMPアッセイバッファーで血清サンプルが1:10に希釈された以外は、同様の手順で実行された。
いくつかの実験において、ブタのTSHの活性を阻害するようにTSHRに対する患者の血清及びマウスモノクローナル抗体の能力が評価された。これは、(a)TSH単独の刺激効果と、(b)患者の血清又はマウスモノクローナル抗体が存在する際のTSHの刺激効果を比較することによって実行された。簡潔すると、サイクリックAMPバッファーで希釈された50μLの患者の血清と、50μLのマウスモノクローナル抗体が、細胞のウェルに添加され、続いて50μLのバッファー又は50μLのTSH(0.6ng/mL終濃度0.3 ng/mL)が添加され、上述の刺激アッセイのようにインキュベーションされた。試験溶液を除去した後、細胞は溶解されて、Biotrak酵素免疫アッセイシステムを用いて、cAMPをアッセイした。
野生型(wt)又は突然変異型TSHRのいずれかを発現する、FIp-In-CHO細胞は、175cm2フラスコでコンフルエンス(confluence)に成長されて、細胞はDulbecco's PBS (カルシウム及びマグネシウムイオンなしで) (Invitrogen)で洗浄されて、ロシュダイアグノスティックスのプロテアーゼインヒビター(50mLの溶液に対して、1タブレット(プロダクトコード1836145))及び1 mmol/Lのフェニルメチルスルフォニルフロライド(PMSF)を含有する10mLの冷却バッファーA(50 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5)にスクレープ(scrape)された。細胞は4℃下にて1000xgで5分間ペレットにされて、ペレットは1mLのバッファーAで再懸濁されて、氷上のグラスホモジナイザーでホモジナイズされた。細胞膜は4℃下にて12,000xgで30分間ペレットにされて、6mLのバッファーAに加えて0.5g/Lのアジ化ナトリウム及び2.75g/Lのヨードアセトアミドで再懸濁されて、上述のようにペレットにされた。次いで、膜ペレットは、1%のTritonX−100及び0.5g/Lのアジ化ナトリウムを含有する1mLの冷バッファーAで再懸濁されて、ホモジナイズされた。可溶化されたTSHR試料は、4℃下にて90,000xgで2時間遠心分離されて、上澄みはアリコートに−70℃で保存された。
これらの実験において、125Iを用いた標識及び未標識のブタのTSH(RSR Ltdの70units/mg)及びモノクローナル抗体(Fab又はIgG)が、既に記載されたように調製された(WO2004/050708A2)。
様々な突然変異を含み、TSHRでトランスフェクションされたCHO細胞でサイクリックAMP生成を刺激する、TSH又はhMAb TSHR1の能力が評価された。結果は表2a−2j、15a−15x及び27a−27hに示され、さらに、表3、16及び28に要約された。大部分の突然変異は、TSH及びhMAb TSHR1の両方の反応に対して、わずかな減少を引き起こした。しかしながら、しかしながら、Alaに対するArg80、Aspに対するArg80、Alaに対するTyr82、Alaに対するGIu 107、Alaに対するArgl09、Aspに対するArg109、Alaに対するLysl29、Aspに対するLysl29、Alaに対するPhel30、Alaに対するLysl83、Aspに対するLysl83、Alaに対するTyrl85、Alaに対するAsp232、Alaに対するArg255、Alaに対するAla、並びにダブルミューテーション(double mutation)Alaに対するArg255及びAlaに対するTrp258;Alaに対するTrp258及びAlaに対するLysl83; Alaに対するTrp258及びAlaに対するTyrl85の場合において、突然変異の効果の明確な相違が、ホルモン及び抗体に対する反応にあった。TSHへの反応が基本的に維持されたのに対して、これらのアミノ酸のいずれかの突然変異はhMAb TSHR1に対する反応において、著しい減少を引き起こした。
TSH、hMAb TSHR1及び9D33 MAbの結合において、アラニン、アルギニン又はアスパラギン酸に対して変異する、様々なTSHRのアミノ酸の効果が表12、25、29及び要約表26に示される。
1)TSHRの選択された一つのアミノ酸を突然変異させる効果は、様々なリガンドによって、サイクリックAMP生成の刺激に関して観察された。
Claims (28)
- 少なくとも1つの点突然変異を含む変異型TSHR試料であって、完全長のヒトTSHRのアミノ酸255に対応する位置の少なくともアミノ酸Argが、負に帯電したアミノ酸残基に点突然変異され、それによって、該変異型TSHR試料は、差別的に患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHと相互作用し、(i)該完全長のヒトTSHRのアミノ酸255に対応する位置でArgの変異が基準TSHR試料に存在しないことを除いて、該変異型TSHR試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する該基準TSHR試料と相互作用する患者の血清の刺激型TSHR自己抗体の刺激作用と比較した場合、該変異型TSHR試料と相互作用する、該患者の血清の刺激型TSHR自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失され、(ii)該基準TSHR試料と相互作用するTSHの刺激作用と比較すると、該変異型TSHR試料と相互作用する場合のTSHの刺激作用は基本的に影響されず、(iii)該基準TSHR試料と相互作用する患者の血清の遮断型TSHR自己抗体の遮断作用と比較すると、該変異型TSHR試料と相互作用する患者の血清の遮断型TSHR自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇し、それによって、該変異型TSHR試料は、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHの差別的スクリーニング及び識別に対して効果的であることを特徴とする変異型TSHR試料。
- 前記完全長のヒトTSHRのアミノ酸255に対応する位置で少なくともアミノ酸Argが、Aspに点突然変異されることを特徴とする請求項1に記載の変異型TSHR試料。
- 少なくとも1つの点突然変異を含む変異型TSHR試料であって、完全長のヒトTSHRのアミノ酸255に対応する位置の少なくともアミノ酸Argが、該変異型TSHR試料でAspに突然変異し、それによって、該変異型TSHR試料は、差別的に患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHと相互作用し、(i)該完全長のヒトTSHRのアミノ酸255に対応する位置でArgの変異が基準TSHR試料に存在しないことを除いて、該変異型TSHR試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する該基準TSHR試料と相互作用する患者の血清の刺激型TSHR自己抗体の刺激作用と比較した場合、該変異型TSHR試料と相互作用する、患者の血清の刺激型TSHR自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失され、(ii)該基準TSHR試料と相互作用するTSHの刺激作用と比較すると、該変異型TSHR試料と相互作用する場合のTSHの刺激作用は基本的に影響されず、(iii)該基準TSHR試料と相互作用する患者の血清の遮断型TSHR自己抗体の遮断作用と比較すると、該変異型TSHR試料と相互作用する患者の血清の遮断型TSHR自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇し、それによって、該変異型TSHR試料は、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHの差別的スクリーニング及び識別に対して効果的であることを特徴とする変異型TSHR試料。
- 前記変異型TSHR試料は、変異した完全長のヒトTSHRであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料。
- 前記変異型TSHR試料は、ヒトTSHRの変異した断片であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料。
- 前記変異型TSHR試料は、患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHで、前記変異型TSHR試料の差別的な相互作用を増強する、アミノ酸の突然変異をさらに含むことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料。
- 前記変異型TSHR試料は、前記変異型TSHR試料の生物学的活性又は機能を変えないかあるいは実質的に変化する、サイレント置換、付加又は削除を表す、アミノ酸の突然変異をさらに含むことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料。
- TSHRに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる被験者から得られるサンプル中の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体及びTSHの差別的スクリーニング及び識別での請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料の使用。
- TSHRに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる被験者から得られる体液サンプルに存在する、刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体及びTSHと前記変異型TSHR試料との差別的な相互作用をモニタリング可能な検出手段を伴うことを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料からなるキット。
- TSHRに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる被験者から得られる体液サンプルの刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体及びTSHの差別的なスクリーニングのための方法であって、該方法は、被験者から得られる体液のサンプルでTSHRに反応して生成される、刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体及びTSHと差別的に相互作用し、且つ、検出する、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料を活用することを特徴とする方法。
- TSHRに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の治療に対して効果的な、少なくとも一つの治療薬の治療上の有効量を伴う組み合わせの請求項9に記載のキット。
- 薬学的に受け入れられるキャリア、希釈剤または賦形剤を伴う、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料からなる医薬品組成物。
- 治療で使用するための請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料。
- グレーブス病の治療のための薬剤の製造に使用するための請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料。
- グレーブス病の目の徴候の治療のための薬剤の製造に使用するための請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料。
- (i)請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料をエンコードするヌクレオチド配列;
からなるポリヌクレオチド。 - 請求項16に記載のポリヌクレオチドを有し、宿主細胞のゲノムに対してポリヌクレオチドを導入可能な、生物学的に機能的なベクターシステム。
- 請求項16に記載のポリヌクレオチドの1つ以上、又は請求項17のベクターシステムで形質転換されるか又はトランスフェクションされる宿主細胞。
- 請求項1乃至7のいずれか一項に記載の変異型TSHR試料を調製するための方法であって、該方法は、
(i)請求項18に記載の宿主細胞の提供;
(ii)当該宿主細胞の成長;及び
(iii)当該成長した宿主細胞からの本発明による変異型TSHR試料の回収
を含むことを特徴とする方法。 - 体液のサンプル中の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体及びTSHの差別的スクリーニング及び識別に対して使用できる変異型TSHR試料を識別する方法であって、該方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、該TSHRのための結合パートナーと相互作用するそれらの能力によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型TSHR試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、変異型TSHRの少なくとも1つの刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体及びTSHとの結果として相互作用の阻害で生じる点突然変異を識別し、
前記変異型TSHR試料が刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHと差別的に相互作用するように、点突然変異がヒトTSHRの完全長のアミノ酸255に対応する位置に存在するアミノ酸Argにおいて実行され、前記アミノ酸Argは、負に帯電したアミノ酸残基に選択的に点突然変異される
ことを特徴とする方法。 - TSHRの1つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとの相互作用において必要とされるアミノ酸残基を識別する方法であって、該識別方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、TSHRのための結合パートナーと相互作用するそれらの能力によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、この方法は、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型TSHR試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、TSHRと1つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとのそれぞれの相互作用において必要とされる、重要なアミノ酸を識別し、
前記変異型TSHR試料が刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHと差別的に相互作用するように、点突然変異がヒトTSHRの完全長のアミノ酸255に対応する位置に存在するアミノ酸Argにおいて実行され、前記アミノ酸Argは、負に帯電したアミノ酸残基に選択的に点突然変異される
ことを特徴とする方法。 - 1つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRの形態に必要なアミノ酸残基の相互作用を可能にするように、TSHRの形態に必要なアミノ酸残基を識別する方法であって、該識別方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、TSHRのための結合パートナーと相互作用するそれらの能力によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型TSHR試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、TSHRと1つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとのそれぞれの相互作用が可能となるように、TSHRの形態において必要とされる、重要なアミノ酸を識別し、
前記変異型TSHR試料が刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHと差別的に相互作用するように、点突然変異がヒトTSHRの完全長のアミノ酸255に対応する位置に存在するアミノ酸Argにおいて実行され、前記アミノ酸Argは、負に帯電したアミノ酸残基に選択的に点突然変異される
ことを特徴とする方法。 - 前記ヒトTSHRの完全長のアミノ酸255に対応する位置に存在する、少なくともアミノ酸Argは、選択的に、負に電荷されたアミノ酸残基へと点突然変異されることを特徴とする請求項20乃至22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記負に帯電したアミノ酸はAspであることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- スクリーニングされる体液サンプルで1つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型自己抗体及びTSHの差別的スクリーニングのための、完全長ヒトTSHRのアミノ酸255に対応する位置で変異したアミノ酸残基を有する変異型TSHR試料の使用であって、
前記アミノ酸255は、前記変異型TSHR試料が刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHと差別的に相互作用するように、負に帯電したアミノ酸残基に選択的に点突然変異されている、使用。 - 体液のサンプルに存在しないか、存在する、刺激型TSHR自己抗体の識別において、完全長ヒトTSHRのアミノ酸255に対応する位置で変異した変異型アミノ酸残基を有する変異型TSHR試料の使用であって、
前記アミノ酸255は、前記変異型TSHR試料が刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHと差別的に相互作用するように、負に帯電したアミノ酸残基に選択的に点突然変異されている、使用。 - スクリーニングされる体液のサンプルにおいて、1つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHの差別的スクリーニングのために、ヒトTSHRの完全長のアミノ酸255に対応する位置で変異したAspを有する変異型TSHR試料の使用。
- 体液のサンプル中の刺激型TSHR自己抗体の有無の識別で、ヒトTSHRの完全長のアミノ酸255に対応する位置で変異したAspを有する変異型TSHR試料の使用。
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