JP4326326B2 - Epf受容体アッセイ、化合物および治療用組成物 - Google Patents
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Description
EPFおよびミトコンドリアのシャペロニン10は同一のアミノ酸配列(配列番号4)を有するが、それらは異なる遺伝子によりコードされることができ(非特許文献1)、そして大変異なる生理学的機能を有する。さらにEPFは分泌ペプチドであるが、シャペロニン10は分泌経路に沿った細胞内小胞に見いだされる。
本発明はEPFまたはEPF関連ペプチドと、hDRR受容体の相互作用を研究するためのアッセイを提供する。このアッセイはEPFまたはEPF関連ペプチドが受容体に結合できる条件下で、試験化合物がhDRRsに結合できるかどうかを確認するために有用である。またこのアッセイは、試験化合物がhDRRsのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するためにも有用である。上記アッセイはEPFまたは関連ペプチドとhDRRsとの相互作用を正または負の対照として評価するか、または試験化合物を用いて得られた結果を比較する競合、非競合および比較アッセイを含む種々の形式で行うことができる。
詳細な説明
本発明はEPFまたはEPF関連ペプチドとhDRR受容体との相互作用を利用するアッセイを提供する。シェペロニン10としても知られているEPFおよびEPF関連ペプチドは、受容体に結合した時に受容体を活性化し、そして膜中のイノシトール脂質を加水分解するホスホリパーゼCの活性化を導いてイノシトールトリホスフェートを放出し、これが次に細胞内にカルシウムを動員する(mobilize)hDRRsの高親和性リガンドである。このアッセイはhDRRsのリガンドである、またはhDRR受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を同定する方法、ならびに患者の処置におけるそれらの使用を提供する。
ポリヌクレオチド
したがって第1の態様では、本発明はEPFおよび関連ペプチドとhDRR受容体との相互作用を利用するアッセイにおいて、hDRRまたはその断片をコードする単離され、そして精製された核酸分子の使用に関し、ここで該核酸分子はRNA、DNA、cDNAまたはゲノムDNAのいずれかである。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含んでなるhDRR4をコードする核酸分子;
(b)hDRR4をコードする配列番号1のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子;
(c)(a)または(b)のポリヌクレオチドに相補的な核酸分子;
(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;
(e)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子;または
(f)(a)〜(e)の任意のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として、縮重したヌクレオチド配列を含んでなるhDRR4タンパク質をコードする核酸分子、
からなる群から選択される員を含んでなるhDRR4をコードする単離され、そして精製された核酸分子またはその断片の使用を包含する。
(a)配列番号12のアミノ酸配列を含んでなるhDRR7をコードする核酸分子;
(b)hDRR7をコードする配列番号11のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子;
(c)(a)または(b)のポリヌクレオチドに相補的な核酸分子;
(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;
(e)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子;または
(f)(a)〜(e)の任意のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として、縮重したヌクレオチド配列を含んでなるhDRR7タンパク質をコードする核酸分子、
からなる群から選択される員を含んでなるhDRR7をコードする単離され、そして精製された核酸分子またはその断片の使用を包含する。
(a)配列番号4のアミノ酸配列を含んでなるEPFをコードする核酸分子;
(b)(a)のポリヌクレオチドに対して相補的な核酸分子;
(c)(a)または(b)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;
(d)(a)または(b)のポリヌクレオチド分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子;
(e)(a)または(b)のポリヌクレオチド分子によりコードされるアミノ酸配列に70、80、90、95または99%の配列同一性を有するEPF関連ペプチドをコードする核酸分子;
(f)(a)〜(d)の任意のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として、縮重したヌクレオチド配列を含んでなるEPFポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される員を含んでなるEPFまたはEPF関連ペプチドをコードする単離され、そして精製された核酸分子の使用に関する。
ポリペプチド
また本発明は、EPFおよび関連ペプチドとhDRR受容体との相互作用を利用するアッセイにおいて、hDRR受容体タンパク質またはその断片の使用に関し、ここで該ポリペプチドは本発明に従い単離され、そして精製された核酸分子によりコードされる。
i)配列番号2のアミノ酸配列を有するhDRR4をコードする単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片;
ii)表面に配列番号2のアミノ酸配列を有する受容体タンパク質またはその断片を発現する細胞;または
iii)表面に配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択されるhDRR4受容体である。
i)配列番号12のアミノ酸配列を有するhDRR7をコードする単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片;
ii)表面に配列番号12のアミノ酸配列を有する受容体タンパク質またはその断片を発現する細胞;または
iii)表面に配列番号12のアミノ酸配列を有するポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択されるhDRR7受容体である。
i)配列番号4のアミノ酸配列を含んでなるEPFをコードする単離されたポリペプチド;
ii)EPFに由来し、そしてhDRR4に結合することができる単離されたポリペプチド;
iii)配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるEPF関連ペプチドをコードする単離されたポリペプチド;または
iv)配列番号8のアミノ酸配列によりコードされるhDRR4結合断片を含んでなる単離されたポリペプチド、
からなる群から選択される。
i)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21、または配列番号8によりコードされるhDRR4結合断片からなる群から選択されるポリペプチド;あるいは
ii)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21、または配列番号8によりコードされるhDRR4結合断片からなる群から選択されるポリペプチドに対する抗体、
を含んでなる診断用キットに関する。
hDRR受容体ポリペプチドの組換え発現
多くのアッセイの重要な観点は、表面に組換えhDRR受容体を発現する宿主細胞を提供する工程である。したがってさらなる観点で本発明は、本発明によるアッセイに使用することができるhDRR発現ベクターに関する。
アッセイ
本発明のアッセイは、生物学的活性について、または結合受容体について化合物をスクリーニングするために一般的に当該技術分野で知られている多くの形式で設計することができる。
a)hDRRまたはその断片を含む供給源を;
i)EPFまたはEPF関連ペプチド
ii)該試験化合物
とインキューベーションし、そして
b)受容体に結合したEPFまたはEPF関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
a)hDRR4またはその断片を含む供給源を;
i)EPFまたはEPF関連ペプチド
ii)該試験化合物
とインキューベーションし、そして
b)受容体に結合したEPFまたはEPF関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
i)配列番号2のアミノ酸配列またはその断片を有する単離され、そして精製されたタンパク質;
ii)表面に配列番号2のアミノ酸配列またはその断片をを有するポリペプチド受容体発現する細胞;
iii)表面に配列番号2のアミノ酸配列またはその断片を有するポリペプチド受容体を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される。
a)hDRR7またはその断片を含む供給源を;
i)EPFまたはEPF関連ペプチド
ii)該試験化合物
とインキューベーションし、そして
b)受容体に結合したEPFまたはEPF関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
i)配列番号12のアミノ酸配列またはその断片を有する単離され、そして精製されたタンパク質;
ii)表面に配列番号12のアミノ酸配列またはその断片を有するポリペプチド受容体を発現する細胞;
iii)表面に配列番号12のアミノ酸配列またはその断片を有するポリペプチド受容体を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される。
i)表面に配列番号2のアミノ酸配列を有する受容体ポリペプチドを発現する細胞、好ましくはHEK293細胞の膜調製物;
ii)該膜と、配列番号8、配列番号18、配列番号19、配列番号20または配列番号21によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる標識されたEPF関連ペプチド、好ましくは配列番号8からなるヨウ素化EPF関連ペプチドとをインキューベーションし;
iii)試験化合物をインキューベーション混合物に加え;そして
iv)hDRR4受容体に結合した標識されたEPF関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる。
i)表面に配列番号12のアミノ酸配列を有する受容体ポリペプチドを発現する細胞、好ましくはHEK293細胞の膜調製物;
ii)該膜と、配列番号8、配列番号18、配列番号19、配列番号20または配列番号2によりコードされるアミノ酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる標識されたEPF関連ペプチド、好ましくは配列番号8からなるヨウ素化EPF関連ペプチドとをインキューベーションし;
iii)試験化合物をインキューベーション混合物に加え;そして
iv)hDRR7受容体に結合した標識されたEPF関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる。
a)hDRRまたはそれらの機能的断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし;
b)hDRR受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し;そして
c)この効果を、EPFまたはEPF関連ペプチドの結合によるhDRR受容体の活性と比較する、
ことを含んでなる。
a)hDRR4またはそれらの機能的断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし;
b)hDRR4受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し;そして
c)この効果を、EPFまたはEPF関連ペプチドとの結合によるhDRR4受容体の活性と比較する、
ことを含んでなる。
a)配列番号2からなるhDRR4受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはpcDNA3および配列番号10からなるGα16をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはpcDNA3で同時トランスフェクトした(co−transfected)宿主細胞、好ましくはHEK293細胞;
b)細胞にFura−2、FLUO−3またはFLUO−4、好ましくはFLUO−3またはFLUO−4のようなカルシウム感受性蛍光色素を乗せ;
c)細胞と試験化合物をインキューベーションし;
d)hDRR4受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し;そして
e)この効果をEPFまたはEPF関連ペプチドとの結合によるhDRR4受容体の活性と比較する、ことからなる。
a)配列番号2からなるhDRR4受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはpcDNA3でトランスフェクトした宿主細胞、好ましくはHEK293細胞;
b)細胞にFura−2、FLUO−3またはFLUO−4、好ましくはFLUO−3またはFLUO−4、好ましくはFLUO−4のようなカルシウム感受性蛍光色素を乗せ;c)細胞と試験化合物をインキューベーションし;
d)hDRR4受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し;そして
e)この効果をEPFまたはEPF関連ペプチドとの結合によるhDRR4受容体の活性と比較する、ことからなる。
a)hDRR7またはそれらの機能的断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし;
b)hDRR7受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し;そして
c)この効果を、EPFまたはEPF関連ペプチドとの結合によるhDRR7受容体の活性と比較する、
ことを含んでなる。
a)配列番号12からなるhDRR7受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはpcDNA3および配列番号10からなるGα16をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはpcDNA3で同時トランスフェクトした(co−transfected)宿主細胞、好ましくはHEK293細胞;
b)細胞にカルシウム感受性蛍光色素、好ましくはFLUO−4を乗せ;
c)細胞と試験化合物をインキューベーションし;
d)hDRR7受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し;そして
e)この効果をEPFまたはEPF関連ペプチドとの結合によるhDRR7受容体の活性と比較する、ことからなる。
a)配列番号12からなるhDRR7受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはpcDNA3でトランスフェクトした宿主細胞、好ましくはHEK293細胞;
b)細胞にカルシウム感受性蛍光色素、好ましくはFLUO−4を乗せ;
c)細胞と試験化合物をインキューベーションし;
d)hDRR7受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し;そして
e)この効果をEPFまたはEPF関連ペプチドとの結合によるhDRR7受容体の活性と比較する、ことからなる。
a)hDRR上のEPFまたはEPF誘導体とのリガンド結合部位の構造をプロービングし;
b)結合中にEPFリガンドと相互作用するhDRR受容体のリガンド結合部位中の接触原子を同定し;
c)hDRR受容体の活性モジュレートするために、(b)で同定した原子と相互作用する試験化合物を設計し;そして
d)該設計した試験化合物とhDRRまたはそれらの機能的断片を含む供給源を接触させて、該化合物がhDRR活性をモジュレートする能力を測定する、
ことによりポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの構造に基づく、または合理的な設計法にも使用できると考えるだろう。
治療的使用
一般にアゴニストまたはアンタゴニストは、これまでに挙げたような疾患の治療的および予防的目的に使用することができる。化合物は種々の供給源、例えば細胞、無細胞調製物、化学品ライブラリーおよび天然産物の混合物から同定することができる。そのように同定されたアゴニストまたはアンタゴニストは、場合により受容体ポリペプチドの天然または修飾ペプチド、リガンド、酵素等でよく;あるいはそれらの構造的もしくは機能的模造物でもよい(Coligan et al.,免疫学における現在のプロトコール(Current Protocols in Immunology) 1(2);第5章(1991)を参照にされたい)。
材料および方法
材料
拡張高フィデリティ(expand high fidelity)ポリメラーゼ、PCRバッファー、T4 DNAリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼはベーリンガー(Boehringer)(マンハイム、ドイツ)から得た。オリゴヌクレオチドはユーロジェンテック(Eurogentec)(シェーリング、ベルギー)から購入した。プラスミド調製キットおよびQiaquick PCR増幅キットは、キアジェン(Qiagen)(ヒルデン、ドイツ)からであった。PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle SequencingキットおよびABI377または373Aシークエンシング機はアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)(ホスター市、カリフォルニア州、米国)からであった。Geneamp PCRシステム9600はパーキン−エルマー(Perkin−Elmer)(ノーウォーク、コネチカット州、米国)からであった。哺乳動物発現ベクターpcDNA3はインビトロゲン(Invitrogen)(カールスバッド、カリフォルニア州、米国)から得た。ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)、ウシ胎児血清および透析ウシ胎児血清はライフテクノロジーズ(Life Technologies)(ゲチスバーグ、メリーランド州、米国)からであった。
DNAシークエンシング
DNAシークエンシングはABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(PEバイオシステムズ(Biosystems)からの試薬を用いてPTC−200PCR機(MJリサーチ(Reserch))で行った。反応生成物はSEQueaky Kleen 96ウェルTerminator Removalキットカラム(バイオラッド(BioRad)で精製し、そしてABI377 DNAシークエンシング機で解像した。配列分析に我々はGeneCodes(アンハーバー、ミシガン州)からのSequencherソフトウェアを使用した。
hDRR4のクローニング
PCRはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて(クローンテック(Clontech)、パロアルト、カリフォルニア州、米国)、フォワードプライマー(GGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG)およびリバースプライマー(GTCTCGAGTCACTGCTCCAATCTGCTTCCC)を使用して行った。生成したPCR産物はTOPO(商標)TA Cloningキット(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)でクローン化した。完全長の読み取り枠を哺乳動物発現ベクターpcDNA3(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)に挿入し、そして続いてスクリーニング実験に使用した。
hDRR7のクローニング
PCRはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて(クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国)、hDRR7フォワードプライマー(CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG)(配列番号13)およびhDRR7リバースプライマー(GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC)(配列番号14)を使用して行った。生成したPCR産物は哺乳動物発現ベクターpcDNA3(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)に挿入し、そして続いてスクリーニング実験に使用した。
哺乳動物細胞での一過性の発現およびFLIPRアッセイ
hDRR4発現プラスミドまたはhDRR7発現プラスミドは、Gα16−pcDNA3構築物を用いて、FuGENE6試薬(ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)、マンハイム、ドイツ)を使用してHEK293細胞に一過性の同時−トランスフェクションを行った。細胞には供給元の推薦に従いFluo−4(モレキュラー プローブズ(Molecular Probes)、ユージーン、オレゴン州、米国)を乗せた。続いて細胞をFLIPR装置(モレキュラー デバイスイズ(Molecular Devices)、サニーバレ、カリフォルニア州、米国)でCa2+トランジェントについてアッセイした。
組織抽出物の調製および抽出物分画
5kgのブタ視床下部を均一化し、そしてメタノール/水/酢酸、90/9/1、(容量/容量/容量)で抽出した。遠心後、上清をn−ヘキサン抽出により脱脂し、そして水性層をMegabondelute分別により分画した。50%アセトニトリル/H2Oで溶出した材料をさらにHPLC C18カラムで分画した。それらの画分をhDRR4 GPCRの活性化についてFLIPRアッセイで試験した。水性トリフルオロ酢酸(0.1%)中の0〜60%アセトニトリルで溶出したMegabondelute画分をさらに調製用DeltaPak C18カラム(ウォーターズ社(Waters Ass)、25x100mm、15μm、300Å)でさらに分画した。それらの画分をhDRR4 GPCRの活性化についてFLIPRアッセイで試験した。ひき続き調製用Hypersil C18、分析用Symmetry C18カラム(4.6x250mm)、細孔Xterra C8カラム(2.1x250mm)、細孔Xterra C8カラム(2.1x250mm)カラム、そして最後に細孔Symmetry C18カラム(2.1x150mm)での精製段階に続いて、hDRR4トランスフェクト細胞を活性化する画分についてFLIPRに基づく活性のアッセイを行った。
質量分析およびエドマン分解に基づくシークエンシング
エレクトロスプレーイオン化(ESI)二連四重極型(Qq)直交加速(oa)飛行時間(Tof)質量分析を、Q−Tofシステム(マイクロマス(Micromass)、英国)で行った。活性分子は衝突誘起解離(CID)を使用してフラグメントイオンの分析により同定した。活性画分を含む1μlのアセトニトリル/水/ギ酸(50/49.9/0.1、容量、容量、容量)を、金をコートした毛細管(プロタナ(Protana) L/Q 針)に乗せた。この針の電圧を900Vに、そしてサンプリングコーンを25Vに設定した。サンプルは約25nl/分の流速で噴霧し、その間にMSならびにMS/MSスペクトルが得られる延長した分析時間を与えた。MS/MSまたはタンデム質量分析中、フラグメントイオンが選択した前駆体イオンから衝突誘起解離(CID)により生じ、衝突エネルギーは典型的には20から35Vの間で変動し、アルゴンを衝突ガスとして使用した。精製したペプチドのN−末端アミノ酸シークエンシングは、パルスモードで流すパーキン−エルマー/アプライドバイオシステムズ Procise492ミクロ−シークエンサーで行った。
膜の調製
膜は全粒子画分として調製した。細胞系は145mmのペトリ皿上で90%の集密度に培養し、そして5mM酪酸ナトリウムで回収24時間前に処理した。培養基を除去し、そして細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS w/o Ca2+およびMg2+)で2回洗浄し、プレートから50mM Tris−HClバッファー、pH7.4に掻き取り、そして遠心により集めた(4℃にて16,000RPMで10分間)。細胞ペレットを低張5mM Tris−HClバッファー、pH7.4に再懸濁し、そしてUltra Turraxホモジナイザーで均一化した。均一物を4℃にて18,000RPMで20分間遠心した。最後にペレットを50mM Tris−HClバッファー、pH7.4に再懸濁し、そして−70℃でアリコートにて保存した。タンパク質決定はブラッドフォード(Bradford)タンパク質アッセイ(バイオラッド)を使用して、標準としてウシ血清アルブミン(BSA)を使用して行った。
[ 3 H]アデニン結合
[3H]アデニン結合実験は一過性のトランスフェションを行った細胞系を特性決定するために行った。膜は氷上で解凍し、そして10mM MgCl2および1mM EGTAを補充した50mM HEPESバッファー、pH7.4中で希釈した。非−特異的結合は1μMアデニンの存在下で定め、そして[3H]アデニン(30.4Ci/ミリモルの比活性)と25℃で1時間のインキューベーションが競合結合アッセイに最適であることが分かった。アッセイは500μlの最終容量中で、トランスフェトした細胞ならびに野生型COS細胞用に20μgの膜タンパク質を使用して行った。反応はブランデル(Brandel)マルチ−チャンネル細胞回収器(96ウェル)を使用してワットマン(Whatman)のGF/Bフィルターに急激に通すことにより止めた。フィルターは3mlの氷冷50mM HEPESバッファー、pH7.4で3回洗浄し、液体シンチレーションバイアルに移し、そして3mlのシンチレーション流体(Ultima Gold MV)を加えた。サンプルはガラスファイバーフィルターを均一な透明とするために、β−シンチレーションカウンターで少なくとも6時間後にカウントした。
遺伝子発現レベルのリアルタイム定量PCRを介した証明
種々の組織からのRNAは、アナリティカルバイオオジカルリサーチから得た後根神経節RNAを除きクローンテックから得た。hDRR4遺伝子用のSDSプライマーおよびTaqManプローブは、PrimerExpress1.0ソフトウェア(パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国)を使用して設計した。hDRR4遺伝子用のフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ5’−GCGCAGGAACGCCTTCT−3’(配列番号22)および5’−CGGCCGCTGAGGAAGAG−3’(配列番号23)であった。hDRR4用のTaqManプローブ(5’−TCCTCAACTTGGCCGCAGCAGA−3’(配列番号24)はPrimerExpress1.0ソフトウェア(パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国)を使用して設計し、そして標的配列の上鎖および下鎖のいずれかから選択することができる。TaqMan hDRR4プローブはレポーター蛍光色素、6−カルボキシフルオレセイン(FAM)で5’末端を標識した。
結果
hDRR4の生成およびcDNA配列
ヒトゲノムコスミドライブラリーでPCRを行った後、1つのPCR産物を得た。PCR産物のシークエンシングにより、hDRR3(97%のaa同一性)およびhDRR4(99%のaa同一性)の配列と強い類似性が示された(W9932519特許)。しかし配列はEMBLデータベースに登録された配列の長さ(stretch)と同一であった(AC023078)。我々は図1に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列にたどり着いた。
ブタの視床下部に由来するhDRR4の自然なアゴニストの精製
本質的に、分泌されたペプチドが豊富な供給源である事が知られている組織、例えば視床下部に由来する抽出物を調製し、そして材料および方法に記載したように自然なリガンドの精製にオーファンGPCRの活性化に基づく細胞アッセイが続いた。
質量分析によるhDRR4活性化物質の同定
SymmetryC18(4.6×250mm;5μm、ウォーターズ)逆相カラムからの活性精製画分の質量分析は、1つの主要な質量−ピークを2163Da(2164.7M+H+)に与えた。異なるHPLCカラムでの活性画分の溶出プロフィールは、受容体活性化化合物がペプチドであることを示した。したがってこの質量をエドマン分解に基づくシークエンシングによりに引き続き分析した。配列は:
AFRKFLPLFDRVLVERSAと決定した(1文字アミノ酸表記)。
FLIPRアッセイに基づく細胞に及ぼすhDRR4活性化物質の効果 150nMの試験濃度でEPF(配列番号8)のhDRR結合断片によるオーファンGPCR hDRR4(配列番号2)の活性化を、Gα16−pcDNAで同時−トランスフェクトしたHek293細胞で測定した。相対的蛍光単位(RFU)は、細胞にFluo−4(モレキュラー プローブス、ユージーン、オレゴン州、米国)を乗せることにより測定した。Gα16−pcDNA発現ベクターでトランスフェクトしただけのHek293細胞は、図3に示すようにhDRR結合断片に応答しなかった。異なる試験濃度の配列番号8からなるhDRR活性化ペプチドでこのFLIPRアッセイを使用して、12nMのEC50−値が決定された(図7)。
hDRR4遺伝子の発現
リアル−タイム定量PCRでは、後根神経節(DRG)および三叉神経節におけるhDRR4発現が明らかにされた。この知見は疼痛の知覚またはモジュレーションにおけるこの受容体の潜在的役割を証明している。試験したすべての組織の中で、hDRR4は図6に示すように後根神経節および三叉神経節でほぼ排他的に発現され、ここで他の組織中の発現レベルを後根神経節および三叉神経節で観察された発現レベルと比較した。
材料および方法
材料
拡張高フィデリティポリメラーゼ、PCRバッファー、T4 DNAリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼはベーリンガー(マンハイム、ドイツ)から得た。オリゴヌクレオチドはユーロジェンテック(シェーリング、ベルギー)から購入した。プラスミド調製キットおよびQiaquick PCR増幅キットは、キアジェン(ヒルデン、ドイツ)からであった。PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle SequencingキットおよびABI377または373Aシークエンシング機はアプライドバイオシステムズ(ホスター市、カリフォルニア州、米国)からであった。Geneamp PCRシステム9600はパーキン−エルマー(ノーウォーク、コネチカット州、米国)からであった。哺乳動物発現ベクターpcDNA3はインビトロゲン(カールスバッド、カリフォルニア州、米国)から得た。ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)、ウシ胎児血清および透析ウシ胎児血清はライフテクノロジーズ(ゲチスバーグ、メリーランド州、米国)からであった。
DNAシークエンシング
DNAシークエンシングはABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(PEバイオシステムズ)からの試薬を用いてPTC−200PCR機(MJリサーチ)で行った。反応生成物はSEQueaky Kleen 96ウェルTerminator Removalキットカラム(バイオラッド)で精製し、そしてABI377 DNAシークエンシング機で解像した。配列分析に我々はGeneCodes(アンハーバー、ミシガン州)からのSequencherソフトウェアを使用した。
hDRR7のクローニング
PCRはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて(クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国)、hDRR7フォワードプライマー(CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG)(配列番号13)およびhDRR7リバースプライマー(GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC)(配列番号14)を使用して行った。生成したPCR産物は哺乳動物発現ベクターpcDNA3(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)に挿入し、そして続くスクリーニング実験に使用した。
哺乳動物細胞での一過性発現およびFLIPRアッセイ
hDRR7発現プラスミドは、Gα16−pcDNA3構築物を用いて、FuGENE6試薬(ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ(マンハイム、ドイツ)を使用してHEK293細胞に一過性の同時−トランスフェクションを行った。細胞には供給元の推薦に従いFluo−4(モレキュラー プローブズ、ユージーン、オレゴン州、米国)を乗せた。続いて細胞をFLIPR装置(モレキュラー デバイスイズ、サニーバレ、カリフォルニア州、米国)でCa2+トランジェントについてアッセイした。
膜の調製
膜は全粒子画分として調製した。細胞系は145mmのペトリ皿上で90%の集密度に培養し、そして5mM酪酸ナトリウムで回収24時間前に処理した。培養基を除去し、そして細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS w/o Ca2+およびMg2+)で2回洗浄し、プレートから50mM Tris−HClバッファー、pH7.4に掻き取り、そして遠心により集めた(4℃にて16,000RPMで10分間)。細胞ペレットを低張5mM Tris−HClバッファー、pH7.4に再懸濁し、そしてUltra Turraxホモジナイザーで均一化した。均一物を4℃にて18,000RPMで20分間遠心した。最後にペレットを50mM Tris−HClバッファー、pH7.4に再懸濁し、そして−70℃でアリコートにて保存した。タンパク質決定はブラッドフォードタンパク質アッセイ(バイオラッド)を使用して、標準としてウシ血清アルブミン(BSA)を使用して行った。
遺伝子発現レベルのリアルタイム定量PCRを介した証明
種々の組織からのRNAは、アナリティカルバイオオジカルリサーチから得た後根神経節RNAを除きクローンテックから得た。hDRR7遺伝子用のSDSプライマーおよびTaqManプローブは、PrimerExpress1.0ソフトウェア(パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国)を使用して設計した。hDRR7遺伝子用のSDSフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ5’−TGGAAATGACCAAGCCCTTCT−3’(配列番号15)および5’−GAAAAGGATCAGGAAGACCGG−3’(配列番号16)であった。hDRR7用のTaqManプローブ(5’−ATCAGGGTCTCCTTGCCACAAAGCAGT−3’(配列番号17)はPrimerExpress1.0ソフトウェア(パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国)を使用して設計し、そして標的配列の上鎖および下鎖のいずれかから選択することができる。TaqMan hDRR7プローブはレポーター蛍光色素、6−カルボキシフルオレセイン(FAM)で5’末端を標識した。
結果
hDRR7の生成およびcDNA配列
ヒトゲノムコスミドライブラリーでPCRを行った後、1つのPCR産物を得た。PCR産物のシークエンシングにより、配列はEMBLデータベースの配列に登録されている配列の長さ(stretch)と同一であった(AX099247)。我々は配列番号11に示すヌクレオチド配列にたどり着いた。
FLIPRアッセイに基づく細胞中のhDRR4活性化物質の効果
HEK293細胞にGα16−pcDNAで一過性の同時−トランスフェクションを行った後に、150nMの試験濃度でEPF(配列番号8)のhDRR結合断片によるオーファンGPCR hDRR7(配列番号12)の活性化。相対的蛍光単位(RFU)は、細胞にFluo−4(モレキュラー プローブス、ユージーン、オレゴン州、米国)を乗せることにより測定した。Gα16−pcDNA発現ベクターでトランスフェクトしただけのHek293細胞は、図4に示すようにhDRR結合断片に応答しなかった。異なる試験濃度の配列番号8からなるhDRR活性化ペプチドを用いたこのFLIPRアッセイを使用して、354nMのEC50−値が決定された(図8)。
hDRR7遺伝子の発現
リアル−タイム定量PCRでは、リンパ節におけるhDRR7発現が明らかになった。この知見はhDRR受容体の自然なアゴニストとして早期妊娠因子の同定と組み合わせて、、妊娠中に観察されるEPFの免疫抑制活性におけるこの受容体の潜在的役割を証明している(Davis and Maslow,1992)。試験したすべての組織の中で、hDRR7は図5に示すようにリンパ節で優勢に発現され、ここでは他の組織中の発現レベルをリンパ節で観察された発現レベルと比較した。
材料および方法
材料
拡張高フィデリティポリメラーゼ、PCRバッファー、T4 DNAリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼはベーリンガー(マンハイム、ドイツ)から得た。オリゴヌクレオチドはユーロジェンテック(シェーリング、ベルギー)から購入した。プラスミド調製キットおよびQiaquick PCR増幅キットは、キアジェン(ヒルデン、ドイツ)からであった。PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle SequencingキットおよびABI377または373Aシークエンシング機はアプライドバイオシステムズ(ホスター市、カリフォルニア州、米国)からであった。Geneamp PCRシステム9600はパーキン−エルマー(ノーウォーク、コネチカット州、米国)からであった。哺乳動物発現ベクターpcDNA3はインビトロゲン(カールスバッド、カリフォルニア州、米国)から得た。ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)、ウシ胎児血清および透析ウシ胎児血清はライフテクノロジーズ(ゲチスバーグ、メリーランド州、米国)からであった。
DNAシークエンシング
DNAシークエンシングはABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(PEバイオシステムズ)からの試薬を用いてPTC−200PCR機(MJリサーチ(Reserch))で行った。反応生成物はSEQueaky Kleen 96ウェルTerminator Removalキットカラム(バイオラッド)で精製し、そしてABI377 DNAシークエンシング機で解像した。配列分析に我々はGeneCodes(アンハーバー、ミシガン州)からのSequencherソフトウェアを使用した。
hDRR4のクローニング
PCRはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて(クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国)、フォワードプライマー(GGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG)およびリバースプライマー(GTCTCGAGTCACTGCTCCAATCTGCTTCCC)を使用して行った。生成したPCR産物はTOPO(商標)TA Cloningキット(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)の援助でクローン化した。完全長の読み取り枠を哺乳動物発現ベクターpcDNA3(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)に挿入し、そして続いてスクリーニング実験に使用した。
hDRR7のクローニング
PCRはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて(クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国)、hDRR7フォワードプライマー(CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG)(配列番号13)およびhDRR7リバースプライマー(GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC)(配列番号14)を使用して行った。生成したPCR産物は哺乳動物発現ベクターpcDNA3(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)に挿入し、そして続いてスクリーニング実験いて使用した。
哺乳動物細胞での一過性発現およびFLIPRアッセイ
hDRR4発現プラスミドまたはhDRR7発現プラスミドは、Gα16−pcDNA3構築物を用いて、FuGENE6試薬(ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ(、マンハイム、ドイツ)を使用してHEK293細胞に一過性の同時−トランスフェクションを行った。細胞には供給元の推薦に従いFluo−4(モレキュラー プローブズ、ユージーン、オレゴン州、米国)を乗せた。続いて細胞をFLIPR装置(モレキュラー デバイスイズ、サニーバレ、カリフォルニア州、米国)でCa2+トランジェントについてアッセイした。
甲状腺抽出物からの精製
2.5kgのブタ甲状腺を均一化し、そしてメタノール/水/酢酸(90/9/1、容量/容量/容量)に抽出した。遠心後、上清はn−ヘキサン抽出により脱脂し、そして水性相をMegabondElute固相抽出により分画した。水性トリフルオロ酢酸(0.1%)中の0〜50%アセトニトリルから溶出する材料を、調製用DeltaPak C18カラム(40x100mm)で逆相HPLCによりさらに分画した。それらから派生した画分をhDRR4 GPCRの活性化についてFLIPRアッセイで試験した。hDRR4トランスフェクト細胞を活性化する画分について、引き続き調製用DeltaPakC4カラム(25x10mm)、 C18カラム(25x10mm)、分析用C18カラム(4.6x250mm)、細孔X−terra C18カラム(2.1x250mm)、そして最後に毛細管SymmetryC18カラム(0.32x150mm)での精製工程、続いてFLIPRに基づくアッセイを行った。
結果
ブタ甲状腺に由来するhDRR4の自然なアゴニストの精製
本質的に、分泌されたペプチドの豊富な供給源である事が知られている組織、例えば甲状腺に由来する抽出物を調製し、そして材料および方法に記載したように自然なリガンドの精製にオーファンGPCRの活性化に基づく細胞アッセイが続いた。
FLIPR測定
精製されたペプチドまたは乾燥組織画分はカルシウムバッファーに溶解し、そして通常のマルチ−ウェル96プレートに乗せた。続いて細胞をCa2+トランジェントについてFLIPR装置(モレキュラーデバイス サニーバレ、カリフォルニア州、米国)でアッセイした。EPF−関連ペプチドに関して、以下のpEC50を決定した:
Claims (19)
- EPFまたはEPF関連ペプチドとhDRR受容体またはhDRR関連受容体との相互作用を利用するアッセイ。
- EPFまたはEPF関連ペプチドが:
i)配列番号4のアミノ酸配列を含んでなるEPFをコードする単離されたポリペプチド;
ii)EPFに由来し、そしてhDRR4に結合することができる単離されたポリペプチド;または
iii)配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるEPF関連ポリペプチドをコードする単離されたポリペプチド;または
iv)配列番号8のアミノ酸配列によりコードされるhDRR4結合断片を含んでなる単離されたポリペプチド、
からなる群から選択される請求項1に記載のアッセイ。 - hDRR受容体ポリペプチドが;
i)配列番号2のアミノ酸配列を含んでなる、hDRR4をコードする単離されたポリペプチドまたはその断片;あるいは
ii)配列番号12のアミノ酸配列を含んでなる、hDRR7をコードする単離されたポリペプチドまたはその断片、
からなる群から選択される請求項1に記載のアッセイ。 - EPFまたはEPFと少なくとも70%の配列同一性を有するペプチドの単離され、そして精製されたhDRR結合断片であって、
(a)配列番号8または配列番号18または配列番号19または配列番号20または配列番号21のアミノ酸配列からなる該hDRR結合断片、ならびに
(b)配列番号8、18、19、20および/または21のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する16〜21個のアミノ酸のペプチド
からなる群より選択される、上記hDRR結合断片。 - EPFまたはEPF関連ペプチドをコードする単離され、そして精製された核酸分子の請求項1に記載のアッセイにおける使用。
- hDRR4をコードする単離され、そして精製された核酸分子、またはその断片の請求項1に記載のアッセイにおける使用。
- hDRR7をコードする単離され、そして精製された核酸分子、またはその断片の請求項1に記載のアッセイにおける使用。
- hDRR受容体を結合することができる試験化合物を同定し、そして得る方法であって:
a)hDRRまたはその断片を含む供給源を;
i)EPFまたはEPF関連ペプチドおよび
ii)該試験化合物
とインキューベーションし、そして
b)受容体に結合するEPFまたはEPF関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、ことを含んでなる、上記方法。 - hDRRを含有する供給源が;
i)配列番号2のアミノ酸配列を有する単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片;
ii)配列番号12のアミノ酸配列を有する単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片;
iii)表面に配列番号2のアミノ酸配列を有するhDRR4ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞;
iv)表面に配列番号12のアミノ酸配列を有するhDRR7ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞;
v)表面に配列番号2のアミノ酸配列を有するhDRR4ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物;または
vi)表面に配列番号12のアミノ酸配列を有するhDRR7ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される請求項8に記載の方法。 - 単離され、そして精製されたタンパク質が固体支持体に結合している請求項8に記載の方法。
- EPFまたはEPF関連ペプチドが標識され、そして該標識が受容体に結合するEPFまたはEPF関連ペプチドの量に影響を及ぼす試験化合物の効果を測定するために使用される、請求項8ないし10のいずれか1項に記載の方法。
- a)hDRR上のEPFまたはEPF関連ペプチドとのリガンド結合部位の構造をプロービングし;
b)結合中にEPFリガンドと相互作用するhDRR受容体のリガンド結合部位中の接触原子を同定し;
c)hDRR受容体の活性をモジュレートするために、(b)で同定した原子と相互作用する試験化合物を設計し;そして
d)該設計した試験化合物とhDRRまたはその機能的な断片を含む供給源を接触させて、該化合物がhDRR活性をモジュレートする能力を測定する、
工程を含んでなる、合理的な薬剤設計である請求項8に記載の方法。 - hDRR受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法であって:
a)hDRRまたはその機能的な断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし;
b)hDRR受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し;そして
c)この効果を、EPFリガンドまたはEPF関連ペプチドの結合によるhDRR受容体の活性と比較する、
ことを含んでなる、上記方法。 - hDRRを含有する供給源が、表面に配列番号2または配列番号12のアミノ酸配列を有するポリペプチド受容体を発現する細胞である、請求項13に記載の方法。
- hDRR受容体に及ぼすモジュレーターの効果が、hDRR受容体により媒介される細胞内第2メッセンジャー形成のモジュレーションである、請求項13または14に記載の方法。
- 細胞内第2メッセンジャーがcAMP、カルシウムまたはレポーター遺伝子産物である、請求項13に記載の方法。
- 配列番号8によりコードされるhDRR結合断片または請求項4に記載のEPF関連ペプチドに対するモノクローナル抗体。
- hDRR活性に関連する障害に関連する個体の病理学的状態の検出の指標とするための方法における請求項17に記載の抗体の使用であって;
該抗体を試験サンプルと接触させ;そして
該試験サンプル内のペプチドに対する該抗体の結合を測定する、
工程を含んでなる上記使用。 - i)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21、または配列番号8によりコードされるhDRR4結合断片からなる群より選択されるポリペプチド;あるいは
ii)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21、または配列番号8によりコードされるhDRR4結合断片からなる群より選択されるポリペプチドに対する抗体、
を含んでなる診断用キット。
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