NO341778B1 - Assays for EPF-reseptorforbindelser samt terapeutiske sammensetninger - Google Patents

Assays for EPF-reseptorforbindelser samt terapeutiske sammensetninger Download PDF

Info

Publication number
NO341778B1
NO341778B1 NO20035771A NO20035771A NO341778B1 NO 341778 B1 NO341778 B1 NO 341778B1 NO 20035771 A NO20035771 A NO 20035771A NO 20035771 A NO20035771 A NO 20035771A NO 341778 B1 NO341778 B1 NO 341778B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
epf
hdrr4
seq
hdrr7
receptor
Prior art date
Application number
NO20035771A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
NO20035771L (no
Inventor
Eckhard Bender
Arjan Buist
Tom Julia Leon Meeusen
Elke Jenny Henriette Clynen
Liliane Amelie Henrica Shoofs
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Pharmaceutica Nv filed Critical Janssen Pharmaceutica Nv
Publication of NO20035771L publication Critical patent/NO20035771L/no
Publication of NO341778B1 publication Critical patent/NO341778B1/no

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

S a m m e n d r a g Det tilveiebringes assayer for å undersøke vekselvirkningen mellom EPF og EPF-beslektede peptider med en hDRR-receptor. Assayene er nyttige for å identifisere om en testforbindelse kan bindes til hDRR-receptor under betingelser hvor EPF eller beslektede peptider kan bindes til receptoren. Assayene er også nyttige for å bestemme om testforbindelsen er en agonist eller antagonist av hDRR'er. De ovennevnte assayer kan utføres i forskjellige formater, bl.a. kompetitive, ikke-kompetitive og sammenlignende assayer, hvor vekselvirkningen mellom EPF eller EPF-beslektede peptider og hDRR'er bedømmes som positiv- eller negativ-kontroll eller sammenlignes med resultatene som ble erholdt med testforbindelsen.

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for identifisering av en test-forbindelse som er i stand til å binde eller modulere aktiviteten til human dorsalrotreseptor 4 (hDRR4)- eller human dorsalrotreseptor 7 (hDDR7)-polypetid, hvor fremgangsmåten omfatter de trinn som fremgår av krav 1. Oppfinnelsen angår videre isolert og renset hDDR4-bindende fragment og antistoffer som angitt i hhv krav 4, 16 og 17.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
EPF og mitokondrielt chaperonin 10 har identiske aminosyresekvenser (SEKV ID NR: 4), selv om de kan kodes for av forskjellige gener (Summers et al., 1998) og har meget forskjellige fysiologiske funksjoner. Videre er EPF et utsondret peptid, mens chaperonin 10 foreligger i de intracellulære vesikler langs den sekretoriske bane.
Chaperonin 10 tilhører familien varmesjokkproteiner. I mitokodriene danner det et chaperonin-kompleks med varmesjokkprotein 60, som er viktig for den mitokondriske proteinfolding og funksjon. Etter iskjemi kan en oppregulering av disse to proteiner beskytte hjernevevet samt hjertemyocytter (Lau et al., 1997) mot iskjemi/ reperfusjonsskade (Hickey et al., 2000).
Inntil i dag er EPF hovedsakelig kjent som en viktig faktor i embryoens utvikling, i pre-implementeringsfasen samt i peri-implanteringsfasen (Athanasas-Platsis et al., 2000). Dens betydning i disse to faser baserer seg på dens vekstregulerende og immunomodulatoriske egenskaper. Disse virkninger av EPF er også åpenbare idet den produseres av prolifererende primære og neoplastiske celler, hvor den fungerer som en autokrin vekstfaktor både in vitro og in vivo (Morton, 1998).
Nærværet av EPF er gjentatte ganger blitt bekreftet å være uunnværlig for en fremgangsrik graviditet. Nylig demonstrerte Cheng SJ et al. (Am.J.Reprod. Immunol. 2000 okt; 44(4):211-3) at EPF-nivået sank raskt etter kirurgisk abort, hvilket tyder på at en overvåkning av EPF-aktiviteten er en nyttig indeks for den embryoniske pleie og utviklingen av en normal graviditet. Følgelig kunne en suppresjon av EPF-aktiviteten ha en prevensjonsvirkning, mens en forsterkning av EPF-aktiviteten kan forebygge tap av føtus.
EPF utsondres i maternalt serum allerede innen 6-12 timer etter befruktningen, og EPF eller EPF-avledede eller -beslektede peptider kunne derfor være en nyttig tidlig markør for å diagnostisere graviditet. Slik diagnostikk ville være nyttig innen humanmedisinen, men også for veterinærmedisinske formål. EPF-assayene som er i bruk i dag (f.eks. rosette-test), er tungvinte og upålitelige. Videre skjelner de ikke mellom forskjellige former for EPF. Tester basert på antistoffer som er spesifikke for (poly)peptider med EPF-aktivitet eller assayer som skjelner mellom de forskjellige former for bioaktiv EPF (f.eks. på grunnlag av kromatografi og/eller massespektroskopi), kan derfor ha betraktelige fordeler. EPF-aktiviteten har gjentatte ganger blitt bekreftet å være uunnværlig for en fremgangsrik graviditet. Nylig demonstrerte Cheng S.J. et al. (Am.J.Reprod. Immunol. 2000 okt; 44(4):211-3) at EPF-nivået sank raskt etter kirurgisk abort, hvilket tyder på at overvåkning av EPF-aktiviteten er en nyttig indeks for embryoens velferd og utviklingen av en normal graviditet. Følgelig kunne en undertrykking av EPF-aktiviteten ha prevensjonsvirkning, mens en forsterkning av den fysiologiske, eller korrigering av en abnorm, EPF-aktivitet kunne forbygge tap av føtus.
Det er blitt observert at graviditet har en gunstig innvirkning på utviklingen av multippel sklerose, ved å nedsette tilbakefallsraten under graviditeten (Confavreux et al., 1998). Slik Morton (1998) påpeker, anses EPF å være én av hovedfaktorene som er omfattet i modifikasjonen av multippel sklerose som observeres under graviditeten. Den positive virkning av EPF's immunosuppressive virkning under graviditeten kunne også observeres for en annen autoimmun sykdom, nemlig reumatoid artritt (Davis og Maslow, 1992).
Den potensielle aktivitet av EPF og chaperonin 10 i humane systemer gjør peptidene til et mål for undersøkelser rettet mot å identifisere forbindelser som forsterker eller svekker de biologiske virkninger av peptidene. Selv om det har vist seg å finnes bindingsseter for EPF og chaperonin 10, har man imidlertid ikke kunnet identifisere noen reseptor for disse peptider. Mangelen på kjent reseptor har vanskeliggjort utviklingen av assayer, og sinket forsøk på å oppdage og undersøke forbindelser som etterligner eller endrer de biologiske virkninger av EPF eller chaperonin 10.
Foreliggende oppfinnelse løser dette problemet innen faget i og med at revers farmakologi har ført til identifikasjon av humane dorsalrotreseptorer (hDDR'er) som reseptorproteiner for EPF eller chaperonin 10. Med dette funn bekrefter foreliggende oppfinnere dessuten de immunomodulatoriske egenskaper av EPF, idet hDRR-reseptorer viser seg å uttrykkes i lymfeknuter, og den kromosomale kartlegging av hDRR'ene til kromosom 11p15 koblet dem til et antall lymfoblastiske leukemier. Den tilveiebringer dessuten assayer for å identifisere forbindelser som etterligner eller endrer de biologiske virkninger av EPF eller chaperonin 10, samt farmakologisk anvendelse derav.
hDRR'er tilhører familien av G-protein-koblede reseptorer (GPCR'er) som har en felles strukturell organisasjon kjennetegnet ved en ekstracellulær N-terminal ende, syv hydrofobe alfa-spiraler som antakelig utgjør transmembrane domener, og en intracellulær C-terminal domene. GPCR'er binder diverse ligander som utløser intracellulære signaler ved aktivering av overførende G-proteiner (Caron et al., Rec. Prog. Horm. Res. 48:277-290 (1993); Freedman et al., Rec. Prog. Horm. Res.
51:319-353 (1996)).
Nylige oversikter (Stadel et al., 1997; Wilson et al., 1998) anslår antallet av GPCR'er som brukes som mål for kommersielt nyttige legemidler, er 25, og dette utgjør 18 % av de 140 karakteriserte klonede humane GPCR’er. Ekstrapolering fra fullstendig sekvensierte genomer (gjær, C. elegans) til de forventede 30.000 humane gener fører til at man forventer at 5.000 humane GPCR’er vil bli funnet i løpet av de nærmeste 3 årene. Analogt med dagens tall forventer man at 150 av disse nye "orphan" GPCR'er vil utvikle seg til et mål for et kommersielt interessant legemiddel i løpet av det neste tiår. Denne beregning tar ikke betraktning at ytterligere karakteriserte GPCR'er for tiden gir grunnlag for forbindelser som er under utvikling.
Generelt kan man si at revers farmakologi på "orphan" GPCR'er vil levere nye fremgangsmåter for behandling av forskjellige sykdommer, som vil utklassere dagens strategier eller muliggjøre behandling av tilstander som ikke kan behandles med dagens midler. Dette er anerkjent innen den farmasøytiske industri, og er dokumentert i nylige publikasjoner om "orphan" GPCR-ligand-identifikasjon (orphanin FQ (Reinscheid et al, 1995.), orexin (Sakurai et al, 1998), prolaktin-frigivende peptid (Hinuma et al.), apelin (Tatemoto et al., 1998).
Nukleinsyre- og polypeptidsekvensene av humane dorsalrotreseptorer 1-6 ble beskrevet i PCT-søknaden WO 99/32519 A1, som ble publisert den 1. juli 1999. Basert på deres homologi med rotte-dorsalrotreseptor, beskriver dette dokument at hDRR-reseptorene er omfattet i overføringen, moduleringen og fornemmelsen av smerte, og beskriver også anvendelse derav i assayer for identifikasjon av nye midler for anestesi og analgesi. I denne PCT-søknad ble dorsalrotgangliaplasseringen bekreftet for hDRR5 i føtal dorsalrotganglia. Imidlertid kunne man i ingen av de hittil undersøkte humane voksne vev, heller ikke dorsalrotganglia, påvise noe hDRR-spesifikt hybridiseringssignal. I tillegg kunne man ikke identifisere noen naturlig ligand for noen av hDRR-reseptorene som beskrives i denne søknad (WO 99/32519 A1). Karakteriseringen av hDRR4 som en angiotensinreseptor i ovennevnte søknad (WO 99/32519 A1), på grunnlag av stimuleringen av denne reseptor med angiotensin II og III, kunne ikke bekreftes av foreliggende oppfinnere.
For en annen human dorsalrotreseptor, nemlig hDRR7, ble nukleinsyre- og polypeptidsekvensene beskrevet i PCT-søknadene WO 01/16159-A1, publisert den 8. mars 2001, og WO 01/19983-A1, publisert den 22. mars 2001. Liganden for hDRR7-reseptor ble ikke identifisert i noen av disse dokumenter. I PCT-søknaden WO 01/16159-A1 benevnes hDRR7-reseptor TheAnt, og det beskrives et stort antall tilstander som er forbundet med dette polypeptid. Imidlertid tilveiebringes ingen virkelige beviser som kobler denne reseptor til noen av sykdomstilstandene som nevnes. I PCT-søknaden WO 01/19983 beskrives hDRR7-reseptor generelt som en GPCR med lav sekvenslikhet med somatostatin 3-reseptor.
Dermed er det ikke blitt beskrevet noe assay som benytter seg av en konkurranse med en naturlig ligand for hDRR'er, eller som benytter seg av en sammenligning med vekselvirkningen av hDRR'ene med en naturlig ligand. Sistnevnte er uunnværlig for å bruke hDRR'ene som farmakologiske verktøy for å undersøke reseptorfunksjonen og sammenhengen med sykdomstilstander. Foreliggende oppfinnelse løser dette problem innen faget og tilveiebringer assayer som benytter seg av vekselvirkningen mellom hDRR'er og EPF eller EPF-beslektete peptider, for å bestemme om en kandidatforbindelse er en ligand, agonist eller antagonist av hDRR'er.
Nylig demonstrerte Lembo et al. (Nature Neuroscience 5, 201-209 (2002)) at hDRR4-reseptor, også kjent som sensorisk neuron-spesifikk G-protein-koblet reseptor 4 (SNSR4) eller Mas-beslektet genreseptor 1 (hMrgX1) potensielt aktiveres av genprodukter av opioid peptid-forløper proenkefalin A. Spesielt BAM22 og BAM22-fragmenter, som er kjent for å være omfattet innen styringen av nocicepsjon, viste seg å aktivere hDRR i et FLIPR-basert kalsiumassay. I foreliggende oppfinnelse kunne man vise at EPF og EPF-beslektete peptider aktiverer både hDRR4- og hDRR7-reseptor. Videre vises det at hDRR4 hovedsakelig uttrykkes i dorsalrot og trigeminal ganglia (Lembo et al., Nature Neuroscience 5, 201-209 (2002)), mens man for hDRR7 nå kunne demonstrere at denne reseptor overveiende uttrykkes i lymfeknuter. Dette reseptorspesifikke ekspresjonsmønster tyder på forskjellig funksjonalitet som respons på ligandaktivering.
Det ville dermed være fordelaktig hvis man kunne utvikle reseptorspesifikke forbindelser som er nyttige ved behandling av reseptorforbundne forstyrrelser. Identifikasjon av EPF og EPF-beslektete peptider som ligander for hDRR4 og hDRR7 gir nå et grunnlag for utvikling av in vitro-testmetoder for å identifisere forbindelser som har evnen til å modulere en hDRR-implikasjon i overføringen, modulasjonen og fornemmelsen av smerte. Videre er de nyttige som prevensjonsmidler, innen anestesien og analgesien og for å identifisere forbindelser som har evnen til å modulere hDRR-medierte forstyrrelser såsom reumatoid artritt, multippel sklerose eller andre tilstander hvor det er ønskelig med immunosuppressive virkninger, så som inflammatorisk tarmsykdom (IBD), eller for å forebygge transplantatutstøtning.
Disse og andre trekk av oppfinnelsen skal beskrives heri i større detalj.
SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer assayer for å undersøke vekselvirkningen av EPF eller EPF-beslektete peptider med hDRR-reseptorene. Assayene er nyttige for å identifisere om en testforbindelse kan bindes til hDRR'er under betingelser hvor EPF eller EPF-beslektete peptider kan bindes til reseptoren. Assayene er også nyttige for å bestemme om testforbindelsen er en agonist eller antagonist av hDRR'ene. De ovennevnte assayer kan utføres i diverse formater, bl.a. kompetitive, ikkekompetitive og sammenlignende assayer hvor vekselvirkningen mellom EPF eller beslektede peptider med hDRR'er bedømmes som positiv- eller negativ-kontroll eller sammenlignes med resultatene som oppnås med testforbindelsen.
I et annet trekk vedrører foreliggende oppfinnelse de isolerte og rensede polypeptid- og polynukleotidmolekyler som koder for hDRR-bindende fragment av EPF som har aminosyresekvensen (AFRKFLPLFDRVLVERSA (SEKV ID NR: 8)), samt diagnostisk og terapeutisk anvendelse derav.
Følgelig vedrører foreliggende oppfinnelse de isolerte og rensede polypeptider og polynukleotidmolekyler som koder for EPF-beslektete peptider med evnen til å binde og aktivere hDRR-reseptorer som har aminosyresekvensen ((LGKAFRK-FLPLFDRVLVE (SEKV ID NR: 18)), ((LGQAFRKFLPLFDRVLVE (SEKV ID NR:19)), ((LGKAFRKFLPLFDRVL (SEKV ID NR: 20)) og ((LGQAFRKFLPLFDRVL (SEKV ID NR: 21)), som angitt i krav 4.
Forbindelser som identifiseres i assayene som tilveiebringes ifølge oppfinnelsen kan benyttes innen terapeutisk anvendelse derav som prevensjonsmidler, samt i sammenheng med fremgangsmåter for behandling av visse sykdommer, omfattende, kreft såsom overgangs-cellekarsinoma, liposarkoma, adenokarsinoma, diffust storcellet B-celle-lymfoma, lymfocytisk leukemi, lymfoblastisk leukemi, myeloblastisk leukemi, myelomonocytisk leukemi, osteosarkoma; refraktorisk anemi når forbindelsen; for behandling av autoimmune sykdommer så som reumatoid artritt, multippel sklerose eller andre tilstander hvor det er ønskelig med immunosuppressive virkninger, såsom inflammatorisk tarmsykdom (IBD), eller for å forhindre transplantatutstøtning.
I et ytterligere trekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å isolere hDRR fra en cellulær fraksjon som inneholder denne, omfattende å bringe den cellulære fraksjon i berøring med EPF eller et hDRR-bindende fragment derav som er blitt immobilisert på et substrat, og å eluere hDRR derfra.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Fig. 1A: Den nukleotid-kodende sekvens av hDRR4 (SEKV ID NR: 1) vises (start- og stopp-kodon i fet skrift).
Fig. 1B: Aminosyresekvensen av hDRR4 (SEKV ID NR: 2) vises.
Fig. 2: Aktivering av "orphan"-GPCR-hDRR4 med grise-hypotalamus-ekstrakt-C18-fraksjoner etter forbigående kotransfeksjon med Gα16-pcDNA inn i Hek293. De relative fluorescensenheter (RFU) ble bestemt ved å laste cellene med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.) og å teste cellene for Ca2+-transienter i FLIPR-instrumentet (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.).
Fig. 3: Aktivering av "orphan"-GPCR-hDRR4 (SEKV ID NR: 2) med det hDRR-bindende fragment av EPF (SEKV ID NR: 8) i testkonsentrasjonen 150 nM etter forbigående kotransfeksjon med Gα16-pcDNA inn i Hek293. De relative fluorescensenheter (RFU) ble bestemt ved å laste cellene med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.).
Fig. 4: Aktivering av "orphan"-GPCR-hDRR7 (SEKV ID NR: 12) med det hDRR-bindende fragment av EPF (SEKV ID NR: 8) i test-konsentrasjonen 150 nM etter forbigående kotransfeksjon med Gα16-pcDNA inn i Hek293. De relative fluorescens enheter (RFU) ble bestemt ved å laste cellene med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.).
Fig. 5: Relativ ekspresjon av hDRR7 i et antall vev sammenlignet med lymfeknuteekspresjonen som settes til 100 %. Ekspresjonsnivåene ble bestemt ved bruk av sanntids kvantitativ PCR.
Fig. 6: Relativ ekspresjon av hDRR4 i et antall vev sammenlignet med den relative ekspresjon av humant cyklofilin A i de bedømte vev. Ekspresjonsnivåene ble bestemt ved bruk av sanntids kvantitativ PCR.
Fig. 7: Doseresponskurve for det hDRR-bindende fragment av EPF (SEKV ID NR: 8) på hDRR4-reseptor, bestemt ved bruk av FLIPR-kalsiumassayet.
Fig. 8: Doseresponskurve for det hDRR-bindende fragment av EPF (SEKV ID NR: 8) på hDRR7-reseptor, bestemt ved bruk av FLIPR-kalsiumassayet.
Fig. 9: Doseresponskurve av de EPF-beslektete peptider PEFI-16 (SEKV ID NR: 19) og EPF1-18 (SEKV ID NR: 21) på hDRR4-reseptor, bestemt ved bruk av FLIPR-kalsiumassayet.
Fig. 10: Doseresponskurve for de EPF-beslektete peptider EPF1-16 (SEKV ID NR: 19) og EPF1-18 (SEKV ID NR: 21) på hDRR7-reseptor, bestemt ved bruk av FLIPR-kalsiumassayet.
DETALJERT BESKRIVELSE
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer assayer som benytter seg av vekselvirkningen mellom EPF eller et EPF-beslektet peptid og en hDRR-reseptor. EPF, også kjent som Chaperonin 10, og EPF-beslektete peptider er høyaffinitetsligander for hDRR'er som aktiverer reseptoren når de bindes dertil og fører til en aktivering av fosfolipase C, som hydrolyserer inositollipider i membraner for å frigi inositoltrifosfat, som i sin tur mobiliserer kalsium innen en celle. Assayene tilveiebringer fremgangsmåter for å identifisere forbindelser som er ligande av hDRR'er eller er agonister eller antagonister av hDRR-reseptorer.
Anvendt heri viser "EPF eller EPF-beslektete peptider" til tidlig graviditetsfaktor, også kjent som chaperonin 10, som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 4, eller EPF-beslektete peptider, hvor de beslektede peptider er avledet fra den ovennevnte sekvens ved substitusjon, delesjon og/eller tilføyelse av én eller flere aminosyrer av aminosyresekvensen som koder for EPF, og hvor de EPF-beslektete peptider har evnen til å bindes til hDRR4-reseptorproteinet ifølge oppfinnelsen. I en foretrukken utførelse omfatter de EPF-beslektete peptider hDRR-bindende region som kodes for av SEKV ID NR: 8. I en mer foretrukken utførelse består det EPF-beslektete peptid av den hDRR-bindende region som kodes for av SEKV ID NR: 8. I en ytterligere utførelse omfatter de EPF-beslektete peptider en aminosyresekvens valgt fra gruppen omfattende ((LGKAFRKFLPLFDRVLVE (SEKV ID NR:18)), ((LGQAFRKFLPLFDRV-LVE (SEKV ID NR:19)), ((LGKAFRKFLPLFDRVL (SEKV ID NR:20)) og ((LGQAFRK-FLPLFDRVL (SEKV ID NR:21)). I et annet trekk av oppfinnelsen består de EPF-beslektete peptider av peptider som har en aminosyresekvens valgt fra gruppen omfattende (SEKV ID NR: 18), (SEKV ID NR: 19), (SEKV ID NR: 20) og (SEKV ID NR: 21).
I en bestemt utførelse er hDRR-reseptorpolypeptidet i et assay ifølge oppfinnelsen enten hDRR4-reseptorproteinet, omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2 eller fragmenter derav, eller hDRR7-reseptorprotein, omfattende aminosyresekvensen SEVK ID NR: 12 eller fragmenter derav.
Begrepet "fragmenter derav" beskriver et parti, eller en delregion, av et proteinmolekyl hvis sekvens frembringes heri, slik at fragmentet omfatter 5 eller flere aminosyrer som er sammenhengende i moder-proteinet. Begrepene "fragmenter derav" skal omfatte "funksjonelle fragmenter" hvor det isolerte fragment, parti eller delregionen omfatter en funksjonelt avgrenset region såsom et aktivt sete, et bindingssete eller et fosforylasjonssete av reseptorproteinet. Funksjonelle fragmenter kan fremstilles ved kloningsteknologi, eller som de naturlige produkter av alternative skjøtemetoder.
Begrepet "avledet fra" beskriver et parti eller en delregion av et proteinmolekyl hvis sekvens beskrives heri, slik at partiet eller delregionen har en høy grad av sekvensbeslektethet med modersekvensen. Denne beslektethet kan kvantifiseres ved å bestemme graden av sekvensidentitet med modersekvensen, hvor en høy grad av sekvensbeslektethet viser til et isolert peptid eller polypeptid som har minst 70, 80, 90, 95 eller 99 % identitet med modersekvensen, bestemt ved bruk av lokal linjestilling.
Fremgangsmåter for å sammenligne identiteten og likheten mellom to eller flere sekvenser er velkjent innen faget. Slik kan f.eks. programmer som er tilgjengelige i Winconsin Sequence Analysis Package, versjon 9.1 (Devreux J. et al, Nucleic Acid Res., 12, 387-395, 1984), f.eks. programmene BESTFIT og GAP, brukes til å bestemme andelen identitet mellom to polynukleotider og andelen identitet og andelen likhet mellom to peptid- eller polypeptidsekvenser. BESTFIT benytter seg av den "lokale homologi"-algoritme til Smith and Waterman (J.Mol.Biol., 147, 195-197, 1981) og finner den beste enkelte region med likhet mellom to sekvenser. BESTFIT er bedre egnet til å sammenligne to polynukleotidsekvenser eller to peptid- eller polypeptidsekvenser som har forskjellig lengde, idet programmet antar at den kortere sekvens utgjør et parti av den lengre sekvens. Derimot linjestiller GAP to sekvenser og finner en "maksimal likhet" i henhold til algoritmen til Needleman and Wunsch (J.Mol.Biol., 48, 443-453, 1970). GAP er bedre egnet til å sammenligne sekvenser som er omtrent like lange, og hvor en linjestilling forventes over hele lengde. Parameterne "bruddvekt" og "lengdevekt" som brukes i programmene, er fortrinnsvis henholdsvis 50 og 3 for polynukleotidsekvenser og 12 og 4 for polypeptidsekvenser. Fortrinnsvis bestemmes % identitet og likhet når de to sekvenser som skal sammenlignes, er optimalt linjestilt. Andre programmer for å bestemme identiteten og/eller likheten mellom sekvenser er også kjent innen faget, f.eks. BLAST-programfamilien (Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997).
Anvendt heri er en "forbindelse" en organisk eller uorganisk sammensetning av atomer av hvilken som helst størrelse, og omfatter små molekyler (mindre enn ca.
2.500 Da) eller større molekyler, f.eks. peptider, polypeptider, hele proteiner og polynukleotider.
Anvendt heri er en "test"-forbindelse en forbindelse som brukes i en test for å bedømme om testforbindelsen eventuelt kunne være en ligand for et hDRR-reseptorpolypeptid. En testforbindelse kan også være en agonist eller antagonist av hDRR-reseptor. Om testforbindelsen er en faktisk ligand, agonist eller antagonist av et hDRR-polypeptid, bestemmes i et assay ifølge oppfinnelsen.
Anvendt heri er en "ligand" en forbindelse som har evnen til å bindes til en hDRR-reseptor, hvor etter bindingen til reseptoren, en eventuell endring i konformasjonen av ligand/reseptorkomplekset fører til en overføring av den biologiske respons via en andre messenger. Liganden kan være enten en agonist eller en antagonist av reseptoren.
Anvendt heri er en "agonist" en forbindelse som vekselvirker med og aktiverer et polypeptid av hDRR-reseptor. Et aktivert hDRR-reseptorpolypeptid induserer en endring av den biokjemiske bane forbundet med reseptoren, dvs. kan stimulere et G-proteins spaltning av GTP, aktivere adenylatcyklasebanen eller aktivere fosfolipase C-banen.
Anvendt heri er en "antagonist" en forbindelse som vekselvirker med og inhiberer eller forebygger aktivering av et polypeptid av hDRR-reseptor.
Polynukleotider
Følgelig vedrører en første utførelse av foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte hvor det anvendes et isolert og renset nukleinsyremolekyl som koder for hDRR eller et fragment derav, hvor nukleinsyremolekylet er enten RNA, DNA, cDNA eller genomisk DNA, i et assay som benytter seg av vekselvirkningen mellom EPF og de beslektede peptider med hDRR-reseptor.
I en andre utførelse vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte hvor det anvendes et isolert og renset nukleinsyremolekyl som koder for EPF eller beslektede peptider, hvor nukleinsyremolekylet er enten RNA, DNA, cDNA eller genomisk DNA, i et assay som benytter seg av vekselvirkningen mellom EPF og de beslektede peptider med hDRR-reseptor.
Anvendt heri viser "isolert" til det faktum at polynukleotidene, proteinene og polypeptidene, eller aktuelle fragmenter derav, er blitt fjernet fra sitt in vivo-miljø slik at de kan manipuleres av fagmannen, så som sekvensering, restriksjonsspaltning, sete-rettet mutagenese og delkloning inn i ekspresjonsvektorer for et nukleinsyrefragment, samt å erholde proteinet eller proteinfragmentene i utbytter som gjør det mulig å generere polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer, aminosyresekvensering og peptidspaltning. Derfor kan nukleinsyrene som kreves beskyttet heri, foreligge i hele celler eller i cellelysater eller i en delvis, vesentlig eller fullstendig renset form.
Et polynukleotid anses å være "renset" når det er renset bort fra forurensninger i miljøet. Dermed anses et polynukleotid som er isolert fra celler, å være i det vesentlige renset når det er blitt renset for cellulære komponenter ved standardmetoder, mens en kjemisk syntetisert nukleinsyresekvens anses å være i det vesentlige renset når den er blitt renset fra sine kjemiske forløpere. Et "i det vesentlige rent" protein eller ditto nukleinsyre vil vanligvis omfatte minst 85% av en prøve, hvor høyere prosentdeler er å foretrekke. Én fremgangsmåte for å bestemme renheten av et protein- eller nukleinsyremolekyl er ved å elektroforesebehandle et preparat i en matrise såsom polyakrylamid eller agarose. Renheten synliggjøres ved at det opptrer ett enkelt bånd etter synliggjøring. Andre fremgangsmåter for å bedømme renheten omfatter kromatografi, massespektrometri og analytisk sentrifugering.
Begrepene "fragmenter derav" beskriver et stykke eller en delregion av et nukleinsyremolekyl hvis sekvens beskrives heri, slik at fragmentet omfatter 15 eller flere nukleotider som er sammenhengende i modernukleinsyremolekylet. Begrepet "fragmenter derav" skal omfatte "funksjonelle fragmenter" hvor det isolerte fragment, parti eller delregionen omfatter en funksjonelt avgrenset region såsom et aktivt sete, et bindingssete eller et fosforylasjonssete av en reseptor. Funksjonelle fragmenter kan dannes ved kloningsteknologi, eller som naturlige produkter av alternative skjøteteknikker.
Spesielt muliggjør foreliggende oppfinnelse anvendelse, i et assay ifølge oppfinnelsen, av et isolert og renset nukleinsyremolekyl som koder for hDRR4 eller et fragment derav, omfattende et element valgt fra gruppen omfattende:
(a) et nukleinsyremolekyl som koder for hDRR4, omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2;
(b) et nukleinsyremolekyl som omfatter nukleotidsekvensen SEKV ID NR: 1, som koder for hDRR4;
(c) et nukleinsyremolekyl som er komplementært med polynukleotidet fra (a) eller (b);
(d) et nukleinsyremolekyl omfattende i det minste 15 sekvensielle baser av polynukleotidet fra (a), (b) eller (c);
(e) et nukleinsyremolekyl som hybridiserer under stringente betingelser til polynukleotidmolekylet fra (a), (b) eller (c); eller
(f) et nukleinsyremolekyl som koder for et hDRR4-protein omfattende en nukleotidsekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske kode, til en nukleotidsekvens av et polypeptid fra hvilket som helst av punktene (a) til (e).
I en mer foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse består det hDRR4-kodende nukleinsyremolekyl av SEKV ID NR: 1.
Følgelig muliggjør foreliggende oppfinnelse anvendelse, i et assay ifølge oppfinnelsen, av et isolert og renset nukleinsyremolekyl som koder for hDRR7 eller et fragment derav, omfattende et element valgt fra gruppen omfattende:
(a) et nukleinsyremolekyl som koder for hDRR7, omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12;
(b) et nukleinsyremolekyl som omfatter nukleotidsekvensen SEKV ID NR: 11, som koder for hDRR7;
(c) et nukleinsyremolekyl som er komplementært med polynukleotidet fra (a) eller (b);
(d) et nukleinsyremolekyl omfattende i det minste 15 sekvensielle baser av polynukleotidet fra (a), (b) eller (c);
(e) et nukleinsyremolekyl som hybridiserer under stringente betingelser til polynukleotidmolekylet fra (a), (b) eller (c); eller
(f) et nukleinsyremolekyl som koder for et hDRR7-protein omfattende en nukleotidsekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske kode, til en nukleotidsekvens av et polypeptid fra hvilket som helst av punktene (a) til (e).
I en mer foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse består det hDRR7-kodende nukleinsyremolekyl av SEKV ID NR: 11.
I en ytterligere utførelse muliggjør foreliggende oppfinnelse anvendelse, i et assay ifølge oppfinnelsen, av et isolert og renset nukleinsyremolekyl som koder for EPF eller EPF-beslektede peptider, omfattende et element valgt fra gruppen omfattende:
(a) et nukleinsyremolekyl som koder for EPF, omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR: 4;
(b) et nukleinsyremolekyl som er komplementært med polynukleotidet fra (a); (c) et nukleinsyremolekyl omfattende i det minste 15 sekvensielle baser av polynukleotidet fra (a) eller (b);
(d) et nukleinsyremolekyl som hybridiserer under stringente betingelser til polynukleotidmolekylet fra (a) eller (b);
(e) et nukleinsyremolekyl som koder for et EPF-polypeptid som har 70, 80, 90, 95 eller 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen som kodes for av polynukleotidmolekylet fra (a) eller (b);
(f) et nukleinsyremolekyl som koder for et EPF-polypeptid omfattende en nukleotidsekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske kode, til en nukleotidsekvens av et polynukleotid fra hvilket som helt av punktene (a) til (d).
I en mer foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse består det EPF-kodende nukleinsyremolekyl av SEKV ID NR: 3, og det EPF-beslektede peptid består av et polypeptid som har en aminosyresekvens valgt fra gruppen omfattende SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 og SEKV ID NR: 21, eller av det hDRR4-bindende fragment som kodes for av SEKV ID NR: 8.
Fagmannen vil forstå at på grunn av degenerasjonen av den genetiske kode, kunne det innføres tallrike "stumme" substitusjoner av nukleotidbasepar i sekvensen som identifiseres som SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR: 11 eller SEKV ID NR. 3, uten å endre identiteten av den eller de kodede aminosyrer eller proteinprodukter. Alle slike substitusjoner anses å ligge innen rammen for oppfinnelsen.
Begrepene "komplementær" eller "komplementaritet" som brukes heri, viser til evnen av purin- og pyrimidin-nukleotider til å forbindes via hydrogenbindinger for å danne dobbeltkjedede nukleinsyremolekyler. De følgende basepar er beslektet ved komplementaritet: guanin og cytosin; adenin og tymidin; og adenin og uracil. Anvendt heri betyr "komplementær" at det ovennevnte forhold gjelder for i det vesentlige alle basepar som omfatter to enkeltkjedede nukleinsyremolekyler, over hele molekylets lengde. "Delvis komplementaritet" viser til det ovennevnte forhold, hvor ett av de to enkeltkjedede nukleinsyremolekyler er kortere enn det andre, slik at en del av ett av molekylene forblir enkeltkjedet.
Begrepet "hybridisering" betyr slik det brukes heri, en prosess hvor et enkeltkjedet nukleinsyremolekyl føyes sammen med en komplementær kjede ved nukleotidbaseparring.
Begrepet "stringens" viser til hybridiseringsbetingelser. Høystringente betingelser motarbeider ikke-homolog baseparring. Lavstringente betingelser har den motsatte virkning. Stringensen kan endres ved hjelp av f.eks. temperaturen og saltkonsentrasjonen. "Stringente betingelser" viser til en overnatten-inkubasjon ved 42 ºC i en oppløsning omfattende 50 % formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 7,6), 5x Denhardt's oppløsning, 10 % dekstransulfat og 20 µg/ml denaturert, kuttet laksesperma-DNA, fulgt av vasking av filtrene i 0,1 x SSC ved ca. 65 ºC. Andre egnede hybridiseringsbetingelser beskrives i eksemplene.
Nukleinsyresekvensene som koder for hDRR'er, uttrykkes fortrinnsvis i dorsalrotganglia (PCT-publikasjon WO 99/32519-A1), og disse ganglier kan tjene som kilde for isolasjon av nukleinsyrer som koder for reseptoren. Andre celler og cellelinjer kan også være egnet for å isolere hDRR-nukleinsyrer. Seleksjon av egnede celler kan utføres ved å teste for hDRR-aktivitet i celleekstrakter eller i helcelleassayer, som beskrevet heri. Celler som har dorsalrotreseptoraktivitet i ett av disse assayer, kan være egnet for isolasjon av hDRR-nukleinsyrer.
Hvilken som helst av et utvalg av prosedyrer som er kjent innen faget, kan brukes til å molekylært klone hDRR-nukleinsyrer. I én fremgangsmåte isoleres mRNA, og førstekjede-cDNA-syntese utføres. En andre runde med DNA-syntese kan utføres for å produsere den andre kjede. Deretter kan det erholdes et isolert cDNA ved spesifikk PCR-amplifikasjon av hDRR-DNA-fragmenter ved utvikling av degenererte oligonukleotidprimere fra aminosyresekvensen av de hDRR-protein, eller ved DNA-syntese ved bruk av sekvensspesifikke primere avledet fra den genomiske DNA-sekvens.
Et foretrukket sett av primere består av hDRR4-fremadprimer (CAGAATTCGCCAC-CATGGATCCAACGGTCTCAAC) (SEKV ID NR: 5) eller et fragment derav omfattende nukleotidene 15 til 34 av SEKV ID NR: 5, hDRR4-revers primer (GTCTCGAGTCAC-TGCTCCAATCTGCTTCCC) (SEKV ID NR: 6) eller et fragment derav bestående av nukleotidene 9 til 30 av SEKV ID NR: 6, hDRR7-fremadprimer (CGAATTCCGCCAC-CATGGATCCAACCACCCCGG) (SEKV ID NR: 13) og hDRR7-revers primer (GCTCTA-GAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC) (SEKV ID NR: 14).
Om ønsket, kan det dobbeltkjedede cDNA klones inn i hvilken som helst egnet vektor, f.eks. et plasmid, hvorved det dannes et cDNA-bibliotek. En annen metode er å søke gjennom et cDNA-bibliotek som er konstruert i en bakteriofag- eller plasmidskyttelvektor, med en merket oligonukleotidprobe som er målrettet mot hvilken som helst egnet region av SEKV ID NR: 1 eller SEKV ID NR: 11. Se f.eks. PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990).
Fremgangsmåter for å konstruere cDNA-bibliotek i en egnet vektor så som et plasmid eller en fag for propagering i prokaryotiske eller eukaryotiske celler er velkjent for fagmannen. [Se f.eks. Maniatis et al. Supra.] Egnede kloningsvektorer er velkjent og lett tilgjengelige.
Det er åpenbart for fagmannen at andre typer biblioteker, samt biblioteker satt sammen fra andre celler eller celletyper, kan være nyttige for å isolere nuleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen. Andre typer biblioteker omfatter cDNA-biblioteker avledet fra andre celler, fra andre organismer enn menneske eller mus, og genomiske DNA-biblioteker som omfatter YAC (kunstig gjærkromosom, "yeast artificial chromosome") og kosmidbiblioteker. Konstruksjon av genomiske DNA-biblioteker kan utføres ved standardteknikker som er velkjent innen faget. Velkjente genomiske DNA-biblioteks-konstruksjonsteknikker finnes i T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.utg. kap. 14 (1989).
Fagmannen vil forstå at i mange tilfeller vil en isolert cDNA-sekvens være ufullstendig, i og med at regionen som koder for polypeptidet er kort i 5'-ende av cDNA'et. Dette er en følge av revers transkriptase, et enzym med i og for seg lav "prosesserbarhet" (et mål for enzymets evne til å forbli bundet til opphavs-sekvensen under polymerisasjonsreaksjonen), som ikke fullfører noen DNA-kopi av mRNA-opphavssekvensen under syntesen av første kjede-cDNA.
Flere metoder er tilgjengelige og velkjent for fagmannen for å erholde hellengdes cDNA, eller forlenge kort cDNA, f.eks. basert på metoden Rapid Amplification of cDNA ends (RACE) (Frohman et al., 1988, PNAS USA 85, 8998-9002), eller nylige modifikasjoner av denne teknikk.
Polypeptider
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes hDRR-reseptorproteiner eller fragmenter derav i et assay som benytter seg av vekselvirkningen til EPF og de beslektede peptider med hDRR-reseptor, hvor polypeptidet kodes for av et isolert og renset nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen.
I et ytterligere trekk av oppfinnelsen er hDRR-reseptorproteinet hDRR4-reseptor valgt fra gruppen omfattende:
i) et isolert og renset protein som koder for hDRR4 som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2, eller et fragment derav;
ii) celler som på sin overflate uttrykker reseptorproteinet som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2, eller et fragment derav; eller
iii) membranpreparater av celler som på sin overflate uttrykker polypeptidreseptoren som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2, eller et fragment derav.
I en foretrukken utførelse omfatter hDRR4-reseptorprotein aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2 eller fragmenter derav. I en mer foretrukken utførelse omfatter hDRR4-reseptorprotein aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2 eller fragmenter derav.
I et ytterligere trekk av oppfinnelsen er hDRR-reseptorproteinet hDRR7-reseptor valgt fra gruppen omfattende:
i) et isolert og renset protein som koder for hDRR7 som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12, eller et fragment derav;
ii) celler som på sin overflate uttrykker reseptorproteinet som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12, eller et fragment derav; eller
iii) membranpreparater av celler som på sin overflate uttrykker polypeptidreseptoren som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12, eller et fragment derav.
I en foretrukken utførelse omfatter hDRR7-reseptorproteinet aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12 eller fragmenter derav. I en mer foretrukken utførelse består hDRR7-reseptorproteinet av aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12 eller fragmenter derav.
Begrepet "fragmenter derav" beskriver et parti, eller en delregion, av et proteinmolekyl hvis sekvens frembringes heri, slik at fragmentet omfatter 5 eller flere aminosyrer som er sammenhengende i moder-proteinet. Begrepet "fragmenter derav" skal omfatte "funksjonelle fragmenter" hvor det isolerte fragment, parti eller delregionen omfatter en funksjonelt avgrenset region såsom et aktivt sete, et bindingssete eller et fosforylasjonssete av reseptorproteinet. Funksjonelle fragmenter kan fremstilles ved kloningsteknologi, eller som de naturlige produkter av alternative skjøtemetoder.
I et ytterligere trekk kan det i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes EPF og de beslektede peptider. I en foretrukken utførelse er EPF'et eller de EPF-beslektede peptider valgt fra gruppen omfattende:
i) et isolert polypeptid som koder for EPF, omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR: 4;
ii) et isolert polypeptid avledet fra EPF og som har evnen til å bindes til hDRR4; iii) et isolert polypeptid som koder for et EPF-relatert peptid omfattende en aminosyre valgt fra gruppen omfattende SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 og SEKV ID NR: 21; eller
iv) et isolert polypeptid omfattende det hDRR4-bindende fragment som kodes for av aminosyresekvensen SEKV ID NR: 8.
I en mer foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse består EPF av aminosyresekvensen som kodes for av SEKV ID NR: 4, og et EPF-relatert peptid består av en aminosyresekvens valgt fra gruppen omfattende SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 og SEKV ID NR: 21, eller av det hDRR4-bindende fragment som kodes for av SEKV ID NR: 8.
Reseptorproteinet og peptidene benyttet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter alle mulige konservative aminosyreendringer, hvor "konservative aminosyreendringer" viser til en erstatning av ett eller flere aminosyreresiduer i et moderreseptorprotein eller -peptid, uten å påvirke den biologiske aktivitet av modermolekylet, på grunnlag av substituerbarheten av visse aminosyrer som er anerkjent innenfaget (se f.eks. M. Dayhoff, In Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Supp. 3, s. 345-352, 1978).
Fagmannen vil forstå at polypeptidene benyttet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, dvs. hDRR4-reseptorprotein, hDRR7-reseptorprotein og EPF eller EPF-beslektede peptider, kan erholdes ved bruk av flere rekombinante DNA-teknikker, omfattende f.eks. hybridisering, polymerasekjedereaksjon (PCR)-amplifikasjon eller de novo-DNA-syntese (se f.eks. T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. kap. 14 (1989)).
Peptidene og derivatene benyttet i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan lett fremstilles i henhold til veletablerte, standard væske- eller fortrinnsvis fastfase-peptidsyntesemetoder, og beskrivelser av dette er lett tilgjengelige, eller de kan fremstilles i oppløsning, ved væskefasemetoden eller ved hvilken som helst kombinasjon av fastfase-, væskefase- og oppløsningskjemi.
Som et eksempel kan de aktuelle polypeptidene syntetiseres ved bruk av N-a-9-fluorenylmetyloksykarbonyl-, eller Fmoc-, fastfasepeptidsyntesekjemi ved bruk av en RaininSymphony Multiplex Peptide Synthesizer.
Standardsyklusen som brukes for å koble en aminosyre til den peptid-resinvoksende kjede, omfatter å: (1) vaske peptidresinet tre ganger i 30 sekunder med N,N-dimetylformamid (DMF); (2) fjerne den Fmoc-beskyttende gruppe på aminoterminus ved avbeskyttelse med 20% piperidin i DMF, med to vaskinger i hver 15 minutter, under hvilken prosess blanding utføres ved å boble nitrogen gjennom reaksjonskaret i ett sekund hvert 10. sekund for å hindre peptidresin-avleiring; (3) vaske peptidresinet tre ganger i 30 sekunder med DMF; (4) koble aminosyren til peptidresinet ved å tilsette like volumer av en 250 mM oppløsning av Fmocderivatet av den egnede aminosyre, og en aktivator-blanding bestående av 400 mM N-metylmorfolin og 250 mM (2-(1H-benzotriazol-1-4))-1,1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HHTU) i DMF; (5) la oppløsningen blandes i 45 minutter; og (6) vaske peptidresinet tre ganger i 30 sekunder med DMF.
Denne syklus kan gjentas etter behov med de egnede aminosyrer i etter hverandre for å fremstille det ønskede peptid. Unntak til denne syklus er aminosyrekoblinger som forutsies å være vanskelige på grunn av deres hydrofobisitet eller forutsette innlemmelse i en spiralformasjon under syntesen. I disse situasjoner kan ovennevnte syklus modifiseres ved å gjenta trinn 4 en andre gang umiddelbart etter fullføring av det første 45-minutters koblingstrinn, for å "dobbeltkoble" den aktuelle aminosyre. I det første koblingstrinn i peptidsyntesen kan resinet få svulme opp for å bevirke en mer virksom kobling, ved å forlenge blandetiden i de opprinnelige DMF-vaskinger til tre 15-minutters vaskinger, heller enn tre 30-sekunders vaskinger.
Etter syntesen kan peptidet spaltes fra resinet som følger: (1) vaske peptidet tre ganger i 30 sekunder med DMF; (2) fjerne den Fmoc-beskyttende gruppe på aminoterminus ved å vaske to ganger i 15 minutter i 20 % piperidin i DMF; (3) vaske peptidresinet tre ganger i 30 sekunder med DMF; og (4) blande en spaltningsblanding bestående av 95 % trifluoreddiksyre (TFA), 2,4 % vann, 2,4 % fenol og 0,2 % trisopropylsilan med peptidresinet i to timer, deretter filtrere peptidet i spaltningsblandingen bort fra resinet, og felle peptidet ut av oppløsningen ved tilsetning av to volumdeler etyleter.
For å isolere peptidet kan eterpeptidoppløsningen få stå ved -20 ºC i 20 minutter og blir deretter sentrifugert ved 6.000xg i 5 minutter for å pelletere peptidet. Peptidet kan vaskes med etyleter for å fjerne gjenværende spaltningsblandingsingredienser. Det endelige peptidprodukt ka renses ved reversfase-høytrykks væskekromatografi (RP-HPLC) med det primære løsemiddel bestående av 0,1 % TFA og elueringsbufferen bestående av 80 % acetonitril og 0,1 % TFA. Det rensede peptid kan deretter frysetørkes til et pulver.
Rensede biologisk aktive hDRR-proteiner kan ha flere forskjellige fysiske former. De aktuelle polypeptidene kan foreligge som hellengdes nascente eller uprosesserte polypeptider, eller som delvis prosesserte polypeptider eller kombinasjoner av prosesserte polypeptider. Det hellengdes nascente polypeptid kan modifiseres posttranslasjonelt, bl.a. ved spesifikke proteolytiske spaltningshendelser som fører til dannelsen av fragmenter av det hellengdes nascente polyupeptid. Et fragment, eller en fysisk forbindelse av fragmenter, kan ha den fullstendige biologiske aktivitet som forbindes med hDRR4 eller hDRR7; men imidlertid kan graden av reseptoraktivitet variere i de forskjellige fragmenter og fysisk forbundne reseptorpolypeptidfragmenter.
I et annet trekk kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringe modifiserte hDRR-polypeptider som har aminosyredelesjoner, -tilføyelser eller -substitusjoner, men som fortsatt har i det vesentlige samme biologiske aktivitet, dvs. binding av EPF eller EPF-beslektede peptider, som det native hDRR-polypeptid. Et hDRR-polypeptid har "i det vesentlige samme biologiske aktivitet" som villtypepolypeptidet hvis dette polypeptid har en EC50-verdi for det EPF-beslektede peptid som kodes for av aminosyresekvensen SEKV ID NR: 8, som ikke er mer enn 10 ganger, fortrinnsvis ikke mer enn 5 ganger, så stor som EC50-verdien for villtypehDRR-reseptorpolypeptidet for den samme ligand. For hDRR4-reseptor har man bestemt en EC50-verdi fra 10,6 til 12 nM for det EPF-beslektede peptid bestående av SEKV ID NR: 8. For hDRR7-reseptor har man bestemt en EC50-verdi som varierer fra 345 til 82,9 nM for de EPF-beslektede peptid bestående av SEKV ID NR: 8.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffer og epitoper av EPF og de EPF-beslektede peptider ifølge oppfinnelsen, også antisera og både polyklonale og monoklonale utførelser av slike antistoffer, og hybridomacellelinjer som produserer slike monoklonale antistoffer. Antistoffer som er generert mot polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan erholdes ved å administrere polypeptidene eller epitop-bærende fragmenter, eller celler, til et dyr, fortrinnsvis et ikke-humant dyr, ved bruk av rutinemessige protokoller.
De ovenfor beskrevne antistoffer kan brukes til å rense polypeptidene ifølge oppfinnelsen ved affinitetskromatografi, eller til å behandle sykdommer ifølge oppfinnelsen. Slike antistoffer kan benyttes for å diagnostisere en patologisk tilstand i et individ som forbindes med en forstyrrelse forbundet med hDRR-aktivitet, ved å: bringe antistoffene i berøring med en testprøve hvor testen fortrinnsvis består av kroppsvæsker såsom blod, spytt, sæd, cerebrospinal væske, plasma eller lymfe; og å måle reaktiviteten av antistoffene på testprøven.
Reaktiviteten av antistoffer på en prøve kan bestemmes på hvilken som helst egnet måte. Markering med enkelte reportermolekyler er én mulighet. Disse reportermolekyler kan direkte eller indirekte generere påvisbare, og fortrinnsvis målbare, signaler.
De isolerte polypeptider kan benyttes et diagnostisk sett omfattende:
i) et slikt polypeptid, fortrinnsvis polypeptidene valgt fra gruppen omfattende SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 2 og SEKV ID NR: 21, eller av det hDRR4-bindende fragment som kodes for av SEKV ID NR: 8; eller ii) et antistoff mot et slikt polypeptid, fortrinnsvis et polypeptid valgt fra gruppen omfattende SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 og SEKV ID NR: 21; eller det hDRR4-bindende fragment som kodes for av SEKV ID NR: 8.
Et slikt sett vil være nyttig for å diagnostisere en sykdom eller følsomhet for en sykdom, spesielt sykdommer som er nevnt ovenfor.
Rekombinant ekspresjon av hDRR-reseptorpolypeptider
Et viktig trekk av mange assayer er trinnet med å tilveiebringe en vertcelle som uttrykker en hDRR-reseptor på sin overflate. hDRR-reseptorer kan kodes av DNA som foreligger i ekspresjonsvektorer.
Ekspresjonsvektorer defineres heri som DNA-sekvenser som er nødvendige for transkripsjon av klonede kopier av gener og translasjon av deres mRNA i en egnet vert. Slike vektorer kan brukes til å uttrykke eukaryotiske gener i forskjellige verter, så som bakterier omfattende E. coli, cyanobakterier, planteceller, insektceller, fungale celler omfattende gjærceller, og dyreceller, også menneskeceller.
Spesialutviklede vektorer muliggjør en skytteltrafikk av DNA fra vert til vert, såsom bakterie-gjær eller bakterie-dyrecelle eller bakterie-soppcelle eller bakterie-virvelløs dyre-celle. En egnet konstruert ekspresjonsvektor kan inneholde: et replikasjonsopphav for autonom replikasjon i vertsceller, selekterbare markører, et begrenset antall nyttige restriksjonsenzymseter, et potensiale for høyt kopiantall, og aktive promotere. En promoter defineres som en DNA-sekvens som styrer RNA-polymerase til å bindes til DNA og initiere RNA-syntese. En sterk promoter er en promoter som gjør at mRNA'er initieres med høy frekvens. Ekspresjonsvektorer kan omfatte, klonevektorer, modifiserte klonevektorer, spesialutviklede plasmider eller virus.
De isolerte og rensede nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen som koder for hDRR4 eller hDRR7, kan klones inn i en ekspresjonsvektor for ekspresjon i en rekombinant vertscelle. Rekombinante vertsceller kan være prokaryotiske ellr eukaryotiske, omfattende bakterier så som E. coli, soppceller så som gjær, pattedyrceller omfattende, cellelinjer av humant, bovint, porkint, ape- og gnager-opphav, og insektceller, omfattende Drosophila- og silkeormavledede cellelinjer. Cellelinje avledet fra pattedyrarter som kan være nyttige og som er handelstilgjengelige, omfatter CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-celler, neuroblastomaer, glialceller og HEK-293 (ATCC CRL1573).
I en ytterligere utførelse har det i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes en rekombinant vertscelle som inneholder et rekombinant klonet nukleinsyremolekyl som koder for et hDRR-protein eller fragmenter derav. I et ytterligere trekk inneholder den rekombinante vertscelle et nukleinsyremolekyl som enten er genomisk DNA eller som har en nukleotidsekvens bestående av SEKV ID NR: 1, og fragmenter derav.
I en mer foretrukken utførelse av oppfinnelsen består den rekombinante vertscelle av HEK293-celler omfattende nukleotidsekvensen bestående av SEKV ID NR: 1 eller fragmenter derav, i pattedyr-ekspresjonsvektoren pcDNA3.
Ekspresjonsvektoren kan innføres i vertsceller via én av et antall teknikker, omfattende transfomasjon, transfeksjon, protoplastfusjon, lipofeksjon og elektroporasjon. De ekspresjonsvektorholdige celler formeres klonalt og analyseres for å bestemme om de produserer et pDRR4-protein. Identifikasjon av reseptor-uttrykkende vertcellekloner kan utføres på forskjellige måter, omfattende immunologisk reaktivitet med antistoffer som er rettet mot polypeptidene ifølge oppfinnelsen, og nærværet av vertscelleforbundet hDRR4-aktivitet.
De aktuelle proteinene kan syntetiseres enten ved direkte ekspresjon eller som et fusjonsprotein omfattende det aktuelle protein som en translasjonell fusjon med et annet protein eller peptid som kan kunne fjernes ved selvspaltning, enzymatisk spaltning eller kjemisk spaltning.
Videre kunne man f.eks. brukt en pattedyrcelle som i sitt genom allerede omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for et DRR-polypeptid som beskrevet ovenfor, men som ikke uttrykker dette eller ikke uttrykker det på ordentlig måte på grunn av f.eks. en svak promoter, og innføre en regulatorisk sekvens, såsom en sterk promoter, i pattedyrcellen i umiddelbar nærhet av det endogene nukleinsyremolekyl som koder for reseptorpolypeptidet, for å indusere ekspresjon derav.
I foreliggende beskrivelse viser begrepet "regulatorisk sekvens" til et nukleinsyremolekyl som kan brukes til å heve ekspresjonen av DRR-reseptorpolypeptidet, grunnet sin integrasjon i genomet av en celle i umiddelbar nærhet til det DRR-reseptorkodende gen. Slike regulatoriske sekvenser omfatter promotere, forsterkere, inaktiverte forstumningsintronsekvenser, 3'UTR- og/eller 5'UTR-kodende regioner, protein og/eller RNA-stabiliserende elementer, nukleinsyremolekyler som koder for et regulatorisk protein, f.eks. en transkripsjonsfaktor, som har evnen til å indusere eller utløse en ekspresjon av DRR-reseptorgenet eller andre genekspresjonsstyrende elementer som er kjent for å aktivere genekspresjon og/eller heve mengden av genproduktet. Innføringen av den regulatoriske sekvens fører til en heving og/eller induksjon av ekspresjonen av DRR-reseptorpolypeptider, som til slutt fører til en hevet mengde DRR-reseptorpolypeptider i cellen.
Innføring av konstruksjonen inn i vertscellen kan oppnås ved kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-dekstranmediert transfeksjon, kationisk lipid-mediert transfeksjon, elektroporasjon, transduksjon, infeksjon eller andre metoder. Slike metoder beskrives i flere standard laboratoriemanualer, så som Davis, Basic Methods In Molecular Biology (1986).
I tillegg kan ekspresjon av polynukleotider ifølge oppfinnelsen også utføres ved bruk av in vitro-produsert syntetisk mRNA. Syntetisk mRNA eller mRNA som er blitt isolert fra hDRR-produserende celler, kan virksomt translateres i forskjellige cellefrie systemer, omfattende hvetekimekstrakter og retikulocytt-ekstrakter, og virksomt translateres i celle-baserte systemer, omfattende mikroinjeksjon inn i paddeoocytter (Xenopus laevis).
Assayer
Assayer ifølge foreliggende oppfinnelse kan utvikles i mange formater som er allment kjent innen faget for å teste forbindelser for sin biologiske aktivitet eller for bindingen av reseptorer.
Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse er ansvarlige for én eller flere biologiske funksjoner, omfattende én eller flere sykdomstilstander, spesielt de ovennevnte sykdommer. Det er derfor ønskelig å utvikle testmetoder for å identifisere forbindelser som stimulerer eller som inhiberer funksjonen av hDRR-reseptorer.
Assayene ifølge foreliggende oppfinnelse drar på fordelaktig måte nytte av det faktum at EPF eller EPF-relaterte peptider er høyaffinitetsligander for hDRR-reseptorpolypeptider og aktiverer hDRR-reseptorene etter å ha bundet seg til dem.
Derfor omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å identifisere forbindelser som spesifikt bindes til hDRR-reseptorpolypeptider av type 4 og 7, hvor forbindelsene kan være ligander, agonister eller antagonister av hDRR-reseptorpolypeptidet. Assaymetodene ifølge foreliggende oppfinnelse skiller seg fra hva som er blitt beskrevet innen faget ettersom foreliggende assayer innlemmer minst ett trinn hvor vekselvirkningen mellom EPF eller EPF-beslektede peptider med hDRR-reseptor innlemmes i assayet. Spesifisiteten av bindingen kan påvises ved å måle affiniteten av forbindelsene for celler som uttrykker et hDRR-reseptorpolypeptid på overflaten derav, eller affiniteten for membraner av slike celler.
Dermed tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å binde en hDRR-reseptor av type 4 og 7, omfattende de trekk som er angitt i krav 1.
I en foretrukken utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å binde hDRR4-reseptor, omfattende å:
a) inkubere en kilde som inneholder hDRR4 eller et fragment derav, med
i) EPF eller EPF-beslektede peptider
ii) testforbindelsen; og
b) måle virkningen av testforbindelsen på mengden av EPF eller EPF-beslektede peptider som bindes til reseptoren.
I en ytterligere utførelse av foreliggende oppfinnelse er den hDRR4-holdige kilde valgt fra gruppen omfattende:
i) et isolert og renset protein som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2 eller et fragment derav;
ii) celler som på sin overflate uttrykker polypeptidreseptoren som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2 eller et fragment derav; eller
iii) membranpreparater av celler som på sin overflate uttrykker polypeptidreseptoren som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2 eller fragmenter derav.
I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å binde hDRR7-reseptor, omfattende å:
a) inkubere en kilde som inneholder hDRR7 eller et fragment derav, med
i) EPF eller EPF-beslektede peptider
ii) testforbindelsen; og
b) måle virkningen av testforbindelsen på mengden av EPF eller EPF-beslektede peptider som bindes til reseptoren.
I en ytterligere utførelse av foreliggende oppfinnelse er den hDRR7-holdige kilde valgt fra gruppen omfattende:
i) et isolert og renset protein som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12 eller et fragment derav;
ii) celler som på sin overflate uttrykker polypeptidreseptoren som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12 eller et fragment derav; eller
iii) membranpreparater av celler som på sin overflate uttrykker polypeptidreseptoren som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 12 eller fragmenter derav.
Testmetoden kan helt enkelt måle bindingen av en kandidatforbindelse til polypeptider eller til celler eller membraner som bærer polypeptidet eller et fusjonsprotein derav, ved hjelp av en markør som er direkte eller indirekte forbundet med kandidatforbindelsen. Alternativt kan testmetoden omfatte konkurranse med en merket konkurrent. I en foretrukken utførelse er den merkede konkurrent en ligand som er kjent for å bindes til hDRR'er så som EPF, også kjent som chaperonin 10, eller EPF-beslektede peptider. I en ytterligere utførelse består det EPF-beslektede peptid av det hDRR-bindende fragment som kodes for av SEKV ID NR: 8 eller de EPF-beslektede peptider som kodes for av SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 eller SEKV ID NR: 21.
I en mer foretrukken utførelse omfatter testmetoden derfor merket EPF eller merkede EPF-beslektede peptider, hvor markøren brukes til å måle virkningen av testforbindelsen på mengden av EPF eller EPF-beslektet peptid som bindes til reseptoren.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å binde hDDR4-reseptor, omfattende å:
i) membranpreparater av celler, fortrinnsvis HEK293-celler, som på sin overflate uttrykker reseptorpolypeptidet som har aminosyresekvensen ID NR: 2; ii) inkubere membranene med et merket EPF-beslektet peptid omfattende en aminosyresekvens som kodes for av SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 eller SEKV ID NR: 21, fortrinnsvis jodert EPF-beslektet peptid bestående av SEKV ID NR:8;
iii) tilsette testforbindelsen til inkubasjonsblandingen; og
iv) måle virkningen av testforbindelsen på mengden merket EPF-beslektet peptid som bindes til hDRR4-reseptor.
I samsvar med dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å binde hDRR7-reseptor, omfattende å:
i) membranpreparater av celler, fortrinnsvis HEK293-celler, som på sin overflate uttrykker reseptorpolypeptidet som har aminosyresekvensen ID NR: 12;
ii) inkubere membranene med et merket EPF-beslektet peptid omfattende en aminosyresekvens som kodes for av SEKV ID NR: 8, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 eller SEKV ID NR: 21, fortrinnsvis jodert EPF-beslektet peptid bestående av SEKV ID NR:8;
iii) tilsette testforbindelsen til inkubasjonsblandingen; og
iv) måle virkningen av testforbindelsen på mengden merket EPF-beslektet peptid som bindes til hDRR7-reseptor.
Videre kan disse testmetoder teste om kandidatforbindelsen fører til et signal som genereres ved at polypeptidet aktiveres eller inhiberes, ved bruk av påvisningssystemer som er egnet for celler som bærer polypeptidet. Inhibitorer av aktivering testes generelt for i nærvær av en kjent agonist, og virkningen på agonistens aktivering som forårsakes av kandidatforbindelsens nærvær, observeres. Konstitutivt aktive reseptorpolypeptider kan benyttes i testmetoder for inverse agonister eller inhibitorer, i fravær av agonist eller inhibitor, ved å teste om kandidatforbindelsen fører til inhibering eller aktivering av polypeptidet.
Dermed tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å inhibere og erholde en testforbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av hDRR-reseptor, omfattende å:
a) inkubere en kilde som inneholder hDRR eller funksjonelle fragmenter derav, med testforbindelsen;
b) måle virkningen av testforbindelsen på aktiviteten av hDRR-reseptoren; og c) sammenligne denne virkning med aktiviteten av hDRR-reseptoren etter binding av EPF eller EPF-beslektede peptider.
I en ytterligere utførelse av foreliggende oppfinnelse er den hDRR-holdige kilde i en fremgangsmåte for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av en hDRR-reseptor av type 4 eller 7, en celle som på sin overflate uttrykker polypeptidreseptoren som har aminosyresekvensen SEKV ID NR: 2 eller SEKV ID NR: 12. I en foretrukken utførelse kan cellen være en rekombinant vertscelle som inneholder et rekombinant klonet nukleinsyremolekyl som koder for et hDRR4- eller et hDRR7-protein eller fragmenter derav slik det tilveiebringes i de ovenfor beskrevne metoder. Virkningen av modulatoren på en hDRR reseptor kan være modulering av en intracellulær andre messenger-dannelse som medieres av hDRR-reseptorer, såsom intracellulært kalsium, cAMP eller et reportergen-produkt. hDRR tilhører den klasse av proteiner som er kjent som G-proteinkoblede reseptorer (GPCR'er). GPCR'ene overfører signaler over cellemembranene etter binding av liganden. Det ligand-bundne GPCR aktiverer intracellulære signaleringshendelser som medieres av heterotrimere G-proteiner, såsom aktivering av adenylat cyklase-banen eller aktivering av fosfolipase C- β-banen. Assayer for å bedømme aktiveringen av de ovennevnte intracellulære signaleringshendelser er allment kjent innen faget og omfatter bl.a. cellebaserte assayer for signaltransduksjon omfattende kimære ligand-induserbare transkripsjonsfaktorer, bindingsassayer for G-protein-koblede reseptorer ved bruk av fluorescensintensitetsfordelingsanalyse, cellesignaleringsassayer ved bruk av cykliske nukleotider koblet til luminoforer, eller måling av responser fra G-protein-koblede reseptorer ved bruk av et multippelt responselement eller et cAMP-responselementrettet reporter-assay.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av hDRR4-reseptor, omfattende å:
a) inkubere en kilde som inneholder hDRR4 eller funksjonelle fragmenter derav, med testforbindelsen;
b) måle virkningen av testforbindelsen på aktiviteten av hDRR4-reseptor; og c) sammenligne denne virkning med aktiviteten av hDRR4-reseptor etter binding av EPF eller EPF-beslektede peptider.
I en foretrukken utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av hDRR4-reseptor, omfattende å:
a) vertsceller, fortrinnsvis HEK293-celler, kotransfisert med en pattedyrekspresjonsvektor, fortrinnsvis pcDNA3, som koder for hDRR4-reseptorprotein bestående av SEKV ID NR: 2 og en pattedyrekspresjonsvektor, fortrinnsvis pcDNA3 som koder for G α16 bestående av SEKV ID NR: 10;
b) fylle cellene med et kalsium-følsomt fluorescerende fargestoff såsom Fura-2, FLUO-3 eller FLUO-4, fortrinnsvis FLUO-3 eller FLUO-4;
c) inkubere cellene med testforbindelsen;
d) måle virkningen av testforbindelsen på hDRR4-reseptoraktiviteten som endringen i relative fluorescensenheter av det kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoff; og
e) sammenligne virkningen med aktiviteten av hDRR4-reseptor etter binding av EPF eller EPF-beslektede peptider.
I en annen foretrukken utførelse omfatter fremgangsmåten for å identifisere og erholde en forbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av hDRR4-reseptor å:
a) kotransfisere vertsceller, fortrinnsvis HEK293-celler, med en pattedyrekspresjonsvektor, fortrinnsvis pcDNA3, som koder for hDRR4-reseptorprotein bestående av SEKV ID NR: 2;
b) fylle cellene med et kalsiumfølsomt fluorescerende fargestoff såsom Fura-2, FLUO-3 eller FLUO-4, fortrinnsvis FLUO-3 eller FLUO-4; fortrinnsvis FLUO-4; c) inkubere cellene med testforbindelsen;
d) måle virkningen av testforbindelsen på hDRR4-reseptoraktiviteten som endringen i relative fluorescensenheter av det kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoff; og
e) sammenligne virkningen med aktiviteten av hDRR4-reseptor etter binding av EPF eller EPF-beslektede peptider.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av hDRR7-reseptor, omfattende å:
a) inkubere en kilde som inneholder hDRR7 eller funksjonelle fragmenter derav, med testforbindelsen;
b) måle virkningen av testforbindelsen på aktiviteten av hDRR7-reseptor; og c) sammenligne denne virkning med aktiviteten av hDRR7-reseptor etter binding av EPF eller EPF-beslektede peptider.
I en foretrukken utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en mulighet for å identifisere og erholde en testforbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av hDRR7-reseptor, omfattende å:
a) kotransfisere vertsceller, fortrinnsvis HEK293-celler, med en pattedyrekspresjonsvektor, fortrinnsvis pcDNA3, som koder for hDRR7-reseptorprotein bestående av SEKV ID NR: 12 og en pattedyrekspresjonsvektor, fortrinnsvis pcDNA3 som koder for G α16 bestående av SEKV ID NR: 10;
b) fylle cellene med et kalsiumfølsomt fluorescerende fargestoff fortrinnsvis FLUO-4;
c) inkubere cellene med testforbindelsen;
d) måle virkningen av testforbindelsen på hDRR7-reseptoraktiviteten som endringen i relative fluorescensenheter av det kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoff; og
e) sammenligne virkningen med aktiviteten av hDRR7-reseptor etter binding av EPF eller EPF-beslektede peptider.
I en annen foretrukken utførelse omfatter fremgangsmåten å identifisere og erholde en forbindelse som har evnen til å modulere aktiviteten av hDRR7-reseptor ved å:
a) kotransfisere vertsceller, fortrinnsvis HEK293-celler, med en pattedyrekspresjonsvektor, fortrinnsvis pcDNA3, som koder for hDRR7-reseptorprotein bestående av SEKV ID NR: 12;
b) fylle cellene med et kalsiumfølsomt fluorescerende fargestoff fortrinnsvis FLUO-4;
c) inkubere cellene med testforbindelsen;
d) måle virkningen av testforbindelsen på hDRR7-reseptoraktiviteten som endringen i relative fluorescensenheter av det kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoff; og
e) sammenligne virkningen med aktiviteten av hDRR7-reseptor etter binding av EPF eller EPF-beslektede peptider.
Fagmannen vil forstå at oppdagelsen av vekselvirkningen av EPF eller EPF-beslektede peptider med hDRR også kan brukes i en fremgangsmåte for strukturbasert eller rasjonell utvikling av en agonist eller antagonist av polypeptidet, ved å:
a) sondere strukturen av ligandbindingssetet på hDRR med EPF eller EPF-derivater;
b) identifisere berørende atomer i ligandbindingssetet av hDRR-reseptor som vekselvirker med EPF-liganden under bindingen;
c) utvikle testforbindelser som vekselvirker med atomene som ble identifisert i trinn (b), for å modulere aktiviteten av hDRR-reseptor; og
d) bringe den utviklede testforbindelse i berøring med en kilde som inneholder hDRR eller et funksjonelt fragment derav, for å måle forbindelsens evne til å modulere hDRR-aktiviteten.
Det vil dessuten forstås at dette vanligvis vil være en iterativ prosess.
Terapeutisk bruk
Generelt kan agonister eller antagonister brukes for terapeutiske og profylaktiske formål for sykdommer såsom de ovennevnte. Forbindelser kan identifiseres fra diverse kilder, f.eks. celler, cellefrie preparater, kjemiske biblioteker og naturlige produktblandinger. Slike agonister eller antagonister som er blitt identifisert på denne måte, kan være naturlige eller modifiserte peptider, ligander, enzymer osv., alt ettersom, av reseptorpolypeptidet; eller kan være strukturelle eller funksjonelle mimetika derav (se Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): kapittel 5 (1991)).
Derfor kan EPF, EPF-fragmenter eller de EPF-beslektede peptider anvendes som medisin og hvor EPF, EPF-fragmentene eller det EPF-beslektede peptid er en agonist av hDRR-reseptor, for bruk ved behandling av smerte eller ved behandling av autoimmune sykdommer så som reumatoid artritt, multippel sklerose eller andre tilstander hvor det er ønskelig med immunosuppressive virkninger, så som i IBD eller for å forebygge transplantatutstøtning. I en foretrukken utførelse består EPF'et, EPF-fragmentene eller det EPF-beslektede peptid av det hDRR-bindende fragment som kodes for av SEKV ID NR: 8, eller et EPF-beslektet peptid ifølge oppfinnelsen, dvs. bestående av et polypeptid valgt fra gruppen omfattende SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20 eller SEKV ID NR: 21.
Dessuten tilveiebringes anvendelse av en forbindelse som er blitt identifisert i et assay ifølge oppfinnelsen, hvor forbindelsen har evnen til å binde og/eller modulere hDRR4-reseptoraktiviteten og hvor forbindelsen er enten en agonist eller antagonist av reseptoren, bestemt i hvilket som helst av de ovennevnte assayer. Dette gjør det mulig å anvende de hDRR4-spesifikke forbindelser som legemiddel, og når forbindelsen er en agonist, for bruk ved behandling av smerte.
Likeledes muliggjør foreliggende oppfinnelse anvendelse av en forbindelse som er blitt identifisert i et assay ifølge oppfinnelsen, hvor forbindelsen har evnen til å binde og/eller modulere hDRR7-reseptoraktiviteten og hvor forbindelsen er enten en agonist eller antagonist av reseptoren, bestemt i hvilket som helst av de ovenfor beskrevne assayer. Den muliggjør dessuten anvendelse av forbindelsene som legemiddel, og når forbindelsen er en agonist, for bruk ved behandling av autoimmune sykdommer så som reumatoid artritt, multippel sklerose eller andre tilstander hvor det er ønskelig med immunosuppressive virkninger, såsom i IBD eller for å forhindre transplantatutstøtning. Når forbindelsen er en antagonist av hDRR7-reseptorpolypeptidet, kan forbindelsen brukes som prevensjonsmiddel, for å forebygge tap av føtus eller ved behandling av celleproliferative forstyrrelser så som kreft.
Bærere som kan anvendes i de aktuelle legemidler omfatter salin, bufret salin, dekstrose, vann, glycerol, etanol og kombinasjoner derav.
Det er et ytterligere formål for oppfinnelsen å tilveiebringe en mulighet for å forebygge, behandle eller lindre overføringen, modulasjonen og fornemmelsen av smerte, omfattende å administrere en virksom mengde av en hDRR4-reseptoragonist som er blitt identifisert ved bruk av et av de ovenfor beskrevne assayer, til et pattedyrindivid.
Sammensetningen vil tilpasses administrasjonsruten, f.eks. via systemisk eller oral rute. Foretrukne former for systemisk administrasjon omfatter injeksjon, vanligvis ved intravenøs injeksjon. Andre injeksjonsruter, såsom subkutan, intramuskulær eller intraperitoneal, kan brukes. Alternative måter å utføre systemisk administrasjon på omfatter transmukosal og transdermal administrasjon ved bruk av penetrasjonsmidler såsom gallesalter eller "fusidic acids" eller andre rensemidler. I tillegg, hvis et polypeptid eller andre forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres i en enterisk eller innkapslet formulering, kan en oral administrasjon også være mulig. Administrasjonen av disse forbindelser kan også foregå topisk og/eller lokalisert, i form av plastre, salver, pastaer, geler og lignende.
Det nødvendige doseringsområde avhenger av valget av peptid eller andre forbindelser, administrasjonsruten, naturen av formuleringen, naturen av individets tilstand og den behandlende leges skjønn. Egnede doseringer ligger imidlertid i området 0,1-100 μg/kg individ. Brede variasjoner i den nødvendige dose er imidlertid å forvente i betraktning av de forskjellige forbindelser som er tilgjengelige og de forskjellige virkninger av forskjellige administrasjonsruter. F.eks. ville man forvente at en oral administrasjon ville kreve høyere doseringer enn administrasjon ved intravenøs injeksjon. Variasjoner i disse dosenivåer kan justeres ved bruk av standard empiriske rutiner for optimering, slik det er velkjent innen faget.
Oppfinnelsen vil kunne forstås bedre under henvisning til de følgende eksperimentelle detaljer,
EKSEMPEL 1: KLONING OG FUNKSJONELL KARAKTERISERING AV GPCR'en HDRR4
Materialer og metoder
Materialer
"Expand high fidelity" polymerase, PCR-buffer, T4-DNA-ligase og restriksjonsendonukleaser ble ervervet fra Boehringer (Mannheim, Tyskland). Oligonukleotider ble ervervet fra Eurogentec (Seraing, Belgia). Plasmidprepareringssett og Qiaquick PCR-amplifikasjonssettet var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle-sekvenseringssettene og ABI 377- eller 373A-sekvenseringsmaskinene var fra Applied Biosystems (Foster City, CA, U.S.A.). Geneamp PCR System 9600 var fra Perkin-Elmer (Norwalk, CT, U.S.A.). Pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3 ble ervervet fra Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.). Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), føtalt kalveserum og dialysert føtalt kalveserum var fra Life Technologies (Gaithersburg, MD, U.S.A.).
DNA-sekvensering
DNA-sekvensering ble utført med reagensmidler fra ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems) på PTC-200-PCR-maskiner (MJ Research). Reaksjonsprodukter ble renset på SEQueaky Kleen 96-brønners Terminator Removal Kit-kolonner (BioRad) og ble adskilt på ABI377 DNA-sekvenseringsmaskiner. For sekvensanalyse brukte vi Sequencher-programvaren fra GeneCodes (Ann Harbor, MI).
Kloning av hDRR4
PCR ble utført på et humant genomisk bibliotek (Clontech, Palo Alto, CA, USA) ved bruk av en fremadprimer (GGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG) og en revers-primer (GTCTCGAGTCACTGCTCCAATCTGCTTCCC). De dannede PCRprodukter ble klonet ved hjelp av "TOPO" TA Cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.). Hellengdes leseramme ble innføyd i pattedyr-ekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.) og ble brukt i påfølgende utsiktingseksperimenter.
Kloning av hDRR7
PCR ble utført på et humant genomisk bibliotek (Clontech, Palo Alto, CA, USA) ved bruk av hDRR7-fremadprimer (CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG) (SEKV ID NR: 13) og hDRR7-revers-primer (GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACAC-CAGACTGC) (SEKV ID NR: 14). Det dannede PCR-produkt ble innføyd i pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.) og ble brukt i påfølgende utsiktingseksperimenter.
Forbigående ekspresjon i pattedyrceller og FLIPR-assay
hDRR4-ekspresjonsplasmidet på hDRR7-ekspresjonsplasmidet ble forbigående kotransfisert med en G α16-pcDNA3-konstruksjon ved bruk av FuGENE 6-reagensmidlet (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) inn i HEK293-celler. Cellene ble fylt med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.) i henhold til leverandørens anbefalinger. Deretter ble cellene testet i FLIPR-instrumentet (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.) for Ca2+-transienter.
Preparering av vevekstrakter og ekstraktfraksjonering
5 kg grise-hypothalamus ble homogenisert og ekstrahert i metanol/vann/eddiksyre, 90/9/1, vol/vol/vol. Etter sentrifugering ble supernatanten delipidert ved n-heksanekstrahering, og det vandige sjikt ble fraksjonert ved Megabondelute-fraksjonering. Materialet som ble eluert med 50% acetonitril/H2O, ble ytterligere fraksjonert på en HPLC C18-kolonne. Fraksjonene som var avledet derfra, ble testet for aktivering av hDRR4-GPCR i FLIPR-assayet. Megabondelute-fraksjonen som ble eluert med fra 0 til 60% acetonitril i vandig trifluoreddiksyre (0,1%), ble ytterligere fraksjonert på en preparativ DeltaPak C18-kolonne (Waters Ass., 25 x 100 mm, 15 μm, 300 Å). Fraksjonene som ble avledet derfra, ble testet for sin aktivering av hDRR4-GPCR i FLIPR-assayet. Påfølgende rensetrinn på en preparativ Hypersil C18, en analytisk Symmetry C18-kolonne (4,6 x 250 mm), en Xterra C8-kolonne med trang boring (2,1 x 250 mm), en Xterra C18-kolonne med trang boring (2,1 x 250 mm) og til slutt en Symmetry C18-kolonne med trang boring (2,1 x 150 mm) ble også etterfulgt av det FLIPR-baserte aktivitetsassay for fraksjoner som aktiverte hDRR4-transfiserte celler.
Massespektrometri og Edman-degraderings-basert sekvensering
Elektrospray-ionisering (ESI) dobbelt kvardupol (Qq) ortogonal aksellerasjon (oa) flyvetid (Time-of-flight, Tof)-massespektrometri ble utført på et Q-Tof-system (Micromass UK). Det aktive molekyl ble identifisert ved analyse av fragmentioner ved bruk av kollisjons-indusert dissosiasjon (CID). 1 μl acetonitril/vann/maursyre (50/49,9/0,1, vol/vol/vol) som inneholdt den aktive fraksjon, ble fylt i en gullbelagt kapillær (Protana L/Q nål). Nålens spenning ble justert til 900 V, og prøvekjeglen til 25 V. Prøven ble sprøytet med en strømningshastighet på ca. 25 nl/min, hvilket gav en forlenget analysetid under hvilken man kunne innhente både MS- og MS/MS-spektra. Under MS/MS- eller tandem-massespektrometrien genereres fragmentioner fra et utvalgt forløper-ion ved kollisjonsindusert dissosiasjon (CID), og kollisjonsenergien varieres vanligvis mellom 20 og 35 V. Argon ble brukt som kollisjonsgass. N-terminal aminosyresekvensering av det rensede peptid ble utført på en Perkin Elmer/Applied Biosystems Procise 492 mikro-sekvenseringsanordning som kjørte i pulsmodus.
Membranpreparering
Membranene ble preparert som samlede partikkelformede fraksjoner. Cellelinjene ble dyrket til 90% konfluens på 145 mm petriskåler og behandlet med 5 mM natriumbutyrat, 24 timer før samlingen. Kulturmediet ble fjernet, og cellene ble vasket to ganger med iskaldt fosfat-bufret salin (PBS uten Ca2+ og Mg2+), skrapt fra platene i 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og samlet ved sentrifugering (10 minutter ved 16.000 rpm ved 4 ºC). Cellepelleten ble gjensuspendert i hypotonisk 5 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og homogenisert med en Ultra Turrax-homogeniseringsanordning. Homogenatet ble sentrifugert ved 18.000 rpm i 20 minutter ved 4 ºC. Den endelige pellet ble gjensuspendert i 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og lagret i alikvoter ved -70 ºC. En proteinbestemmelse ble utført ved bruk av Bradford-proteinassayet (Biorad) ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som standard.
[3H]Adenin-binding
[3H]Adenin-bindingseksperimenter ble utført for å karakterisere forbigående transfiserte cellelinjer. Membraner ble tint på is og fortynnet i 50 mM HEPES-buffer, pH 7,4, som var supplementert med 10 mM MgCl2og 1 mM EGTA. Den ikke-spesifikke binding ble definert i nærvær av 1 μM adenin, og en 1-times inkubasjon ved 25 ºC med [3H]adenin (spesifikk aktivitet 30,4 Ci/mmol) viste seg å være optimal for konkurransebindingsassayer. Assayer ble utført i et endelig volum på 500 μl ved bruk av 20 μg membranprotein for både de transfiserte celler og villtype-COS-cellene. Reaksjonen ble avbrutt ved rask filtrering gjennom Whatman GF/B-filtre ved bruk av en Brandel flerkanals celleinnsamler (96 brønner). Filtrene ble vasket tre ganger med 3 ml iskald 50 mM HEPES-buffer, pH 7,4, og overført til væskescintillasjonsglass, og 3 ml scintillasjonsvæske (Ultima Gold MV) ble tilsatt. Prøvene ble telt i en β-scintillasjonsteller etter minst 6 timer for å la glassfiberfiltrene bli enhetlig gjennomskinnelige.
Kompetitiv inhibering av [3H]adenin med adenin ble utført med 15 nM [3H]adenin.
Den spesifikke binding ble beregnet som differansen mellom tellinger i nærvær og fravær av 1 μM umerket adenin.
Verifisere ekspresjonsnivået av gener ved sanntids kvantifikasjons-PCR
RNA fra forskjellige vev ble ervervet fra Clontech, unntatt dorsalrotganglia-RNA, som ble ervervet fra Analytical Biological Services. SDS-primere og TaqMan-prober for hDRR4-gen er blitt utviklet ved bruk av PrimerExpress 1.0-programvaren (Perkin Elmer, MA, U.S.A.). SDS-fremad- og revers-primerne for hDRR4-gen var henholdsvis 5'-GCGCAGGAACGCCTTCT-3' (SEKV ID NR: 22) og 5'-CGGCCGCTGAGGAAGAG-3' (SEKV ID NR: 23). TaqMan-proben for hDRR4 (5’-TCCTCAACTTGGCCGCAGCAGA-3’, SEKV ID NR: 24) er blitt utviklet ved bruk av PrimerExpress 1.0-programvare (Perkin Elmer, MA, USA), og kan velges enten fra den øvre kjede eller den nedre kjede av målsekvensen. TaqMan-hDRR4-proben er blitt merket med et fluorescerende reporter-fargestoff, 6-karboksyfluorescein (FAM), i 5'-ende.
cDNA ble fremstilt ved bruk av Superscript II Revers transkriptase. RT ble utført i 60 minutter ved 42 ºC i et vannbad. Reaksjonen ble avbrutt ved oppvarming til 70 ºC i 10 minutter. PCR-amplifikasjon ble deretter utført i MicroAmp Optical 96-brønners reaksjonsplater i 50 sykluser med hver syklus ved 95 ºC i 15 sekunder og 60 ºC i 1 minutt. Alle reaksjoner ble utført in triplo ved bruk av ABI Prism 7700 SDS. Den relative ekspresjon av hDRR4 i de testede vev ble sammenlignet med cyklofilin A-ekspresjonen.
Resultater
Generering og cDNA-sekvens av hDRR4
Etter utføring av PCR på et humant genomisk kosmid-bibliotek, erholdt man ett enkelt PCR-produkt. Sekvensering av PCR-produktet viste en nær likhet med sekvensene av hDRR3 (97% aminosyreidentitet) og hDRR4 (99% aminosyreidentitet) (patent W9932519). Imidlertid var sekvensen identisk med en sekvensstrekning i en post i EMBL-databasen (AC023078). Vi kom frem til nukleotid- og aminosyresekvensen som vises på fig. 1.
Sekvensen som beskrives på fig. 1, ble analysert ved BLAST-søk (Altschul et al., 1997) for å bestemme om man kunne finne beslektede GPCR'er med kjente ligander. Den nærmeste homolog av denne "orphan"-GPCR som ble funnet, var GPCR RC56.3.1, som nylig var blitt identifisert som adenin-reseptor i vårt laboratorium. Ingen ligander er blitt rapportert for andre reseptorer forbundet med hDRR4. Dette er en familie av humane GPCR'er (Derwent-sekvens-database-tilgangsnumre Z10067, Z10068, Z10069, Z10070, Z10071 og Z10072) klonet fra dorsalrotganglier som har mellom 79% og 99% residuer til felles med GPCR hDRR4. En annen velkjent homolog er mas-protoonkogenet, som har 38% residuer til felles med hDRR4.
Vår første fremgangsmåte var å teste adenin og andre strukturelt beslektede forbindelser, spesielt puriner, på hDRR4 i et FLIPR-basert cellulært assay. Dette ble utført ved forbigående transfeksjoner i HEK293-celler med og uten kotransfeksjon av kimære G-proteiner eller det tilfeldige G α16-G-protein. I disse assayer observerte man ingen spesifikk respons. I et bindingseksperiment ved bruk av tritiert adenin, kunne man ikke påvise noen spesifikk adeninbinding til hDRR4, mens RC56.1.3-transfiserte celler oppviste en tydelig spesifikk adeninbinding. Ettersom denne fremgangsmåte ikke gav oss noen antydning om den naturlige ligand for denne reseptor, brukte vi "revers farmakologi"-strategien for å identifisere den naturlige ligand.
Rensing av den naturlige agonist av hDRR4 fra grise-hypothalamus
Kort sagt preparerte man et ekstrakt fra vevet som er kjent for å være en rik kilde for utsondrede peptider, f.eks. hypothalamus, og rensingen av den naturlige ligand ble etterfulgt av et cellulært assay på grunnlag av aktiveringen av "orphan"-GPCR som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
Testingen av grise-hypothalamus-ekstraktet etter den første fraksjonering på en C18-kolonne gav en rekke fraksjoner som førte til en forbigående Ca2+-frigivning for celler som var blitt forbigående transfisert med hDRR4-ekspresjonskonstruksjonen. Dette var tilfellet for HEK293-celler som var blitt forbigående kotransfisert med en G α16-ekspresjonskonstruksjon (fig. 2), men ikke for villtype-HEK293-celler (data ikke vist). To av disse fraksjoner, nemlig nr. 65 og 66, som gav den sterkeste stimulering, ble valgt for ytterligere delfraksjonering og behandlet slik det ble beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Rensingen ble styrt av det FLIPR-baserte aktivitetsassay, og fraksjonen som oppviste aktivitet fra det forrige kolonne-gjennomløp, ble underkastet massespektrometri for å bestemme renheten samt strukturen av forbindelsene som den inneholdt.
Identifikasjon av hDRR4-aktiverende substans ved massespektrometri
Masseanalyse av den aktive rensede fraksjon fra Symmetry C18-reversfasekolonnen (4,6 x 250 mm; 5 μm, Waters), gav én hoved-massetopp ved 2.163 Da (2.164,7 M+H+). Elueringsprofilen av den aktive fraksjon på forskjellige HPLC-kolonner tydet på at den reseptoraktiverende forbindelse var et peptid. Derfor ble denne masse deretter analysert ved Edman-degraderings-basert sekvensering. Sekvensen viste seg å være:
AFRKFLPLFDRVLVERSA
(med 1-bokstavs aminosyrebenevnelse).
Virkning av den hDRR4-aktiverende substans på det celle-baserte FLIPR-assay
Aktivering av "orphan"-GPCR-hDRR4 (SEKV ID NR: 2) med det hDRR-bindende fragment av EPF (SEKV ID NR: 8) ved testkonsentrasjonen 150 nM ble målt i Hek293-celler som var blitt kotransfisert med G α16-pcDNA. Relative fluorescensenheter (RFU) ble bestemt ved å fylle cellene med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.). Hek293-celler som kun var transfisert med G α16-pcDNA-ekspresjonsvektoren, viste ingen respons på det hDRR-bindende fragment, slik det fremgår fra fig. 3. Ved bruk av dette FLIPR-assay ved forskjellige testkonsentrasjoner av det hDRR-aktiverende peptid som bestod av SEKV ID NR: 8, bestemte man at EC50-verdien var 12 nM (fig. 7).
Ekspresjon av hDRR4-gen
Sanntids kvantifikasjons-PCR oppviste hDRR4-ekspresjon i dorsalrotganglier (DRG) og trigerminale ganglier. Dette funn bekrefter den potensielle rolle som denne reseptor spiller ved fornemmelse av smerte. Av de testede vev, ble hDRR4 nesten utelukkende uttrykt i dorsalrotganglier og trigeminale ganglier, slik det fremgår fra fig. 6. Her sammenlignes ekspresjonsnivået i de øvrige vev med ekspresjonsnivået som ble observert i dorsalrotganglier og trigeminale ganglier.
EKSEMPEL 2: KLONING OG FUNKSJONELL KARAKTERISERING AV GPCR'en HDRR7
Materialer og metoder
Materialer
Expand high fidelity-polymerase, PCR-buffer, T4-DNA-ligase og restriksjonsendonukleaser ble ervervet fra Boehringer (Mannheim, Tyskland). Oligonukleotider ble ervervet fra Eurogentec (Seraing, Belgia). Plasmidprepareringssett og Qiaquick PCR amplifikasjonssettet var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle-sekvenseringssettene og ABI 377- eller 373A-sekvenseringsmaskinene var fra Applied Biosystems (Foster City, CA, U.S.A.). Geneamp PCR System 9600 var fra Perkin-Elmer (Norwalk, CT, U.S.A.). Pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3 ble ervervet fra Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.). Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), føtalt kalveserum og dialysert føtalt kalveserum var fra Life Technologies (Gaithersburg, MD, U.S.A.).
DNA-sekvensering
DNA-sekvensering ble utført med reagensmidler fra ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems) på PTC-200 PCR-maskiner (MJ Research). Reaksjonsprodukter ble renset på SEQueaky Kleen 96-brønners Terminator Removal Kit-kolonner (BioRad) og ble adskilt på ABI377 DNA-sekvenseringsmaskiner. For sekvensanalyse brukte vi Sequencher-programvare fra GeneCodes (Ann Harbor, MI).
Kloning av hDRR7
PCR ble utført på et humant genomisk kosmidbibliotek (Clontech, Palo Alto, CA, USA) ved bruk av hDRR7-fremadprimer (CGAATTCCGCCACCATGGATCCAAC-CACCCCGG) (SEKV ID NR: 13) og hDRR7-revers primer (GCTCTAGAGGCTGTC-CATCTCTACACCAGACTGC) (SEKV ID NR: 14). Det dannede PCR-produkt ble innføyd i pattedyr-ekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.) og ble brukt i påfølgende utsiktingseksperimenter.
Forbigående ekspresjon i pattedyrceller og FLIPR-assay
hDRR7-ekspresjonsplasmidet ble forbigående kotransfisert med en G α16-pcDNA3-konstruksjon ved bruk av FuGENE 6-reagensmidlet (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) inn i HEK293-celler. Cellene ble fylt med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.) i henhold til leverandørens anbefalinger. Deretter ble cellene testet i FLIPR-instrumentet (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.) for Ca2+-transienter.
Membranpreparering
Membranene ble preparert som samlede partikkelformede preparater. Cellelinjene ble dyrket til 90% konfluens på 145 mm petriskåler og behandlet med 5 mM natriumbutyrat, 24 timer før samlingen. Kulturmediet ble fjernet, og cellene ble vasket to ganger med iskaldt fosfat-bufret salin (PBS uten Ca2+ og Mg2+), skrapt fra platene i 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og samlet ved sentrifugering (10 minutter ved 16.000 rpm ved 4 ºC). Cellepelleten ble gjensuspendert i hypotonisk 5 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og homogenisert med en Ultra Turrax-homogeniseringsanordning. Homogenatet ble sentrifugert ved 18.000 rpm i 20 minutter ved 4 ºC. Den endelige pellet ble gjensuspendert i 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og lagret i alikvoter ved -70 ºC. En proteinbestemmelse ble utført ved bruk av Bradford-proteinassayet (Biorad) ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som standard.
Verifisere ekspresjonsnivået av gener ved sanntids kvantifikasjons-PCR
RNA fra forskjellige vev ble ervervet fra Clontech, unntatt dorsalrotganglia-RNA, som ble ervervet fra Analytical Biological Services. SDS-primere og TaqMan-prober for hDRR7-gen er blitt utviklet ved bruk av PrimerExpress 1.0-programvaren (Perkin Elmer, MA, U.S.A.). SDS-fremad- og revers-primerne for hDRR7-gen var hen holdsvis 5'-TGGAAATGACCAAGCCCTTCT-3' (SEKV ID NR: 15) og 5'-GAAAAGGATCAGGAAGACCGG-3' (SEKV ID NR: 16). TaqMan-proben for hDRR7 (5’-ATCAGGGTCTCCTTGCCACAAAGCAGT-3’, SEKV ID NR: 17) er blitt utviklet ved bruk av PrimerExpress 1.0-programvare (Perkin Elmer, MA, USA), og kan velges enten fra den øvre kjede eller den nedre kjede av målsekvensen. TaqMan-hDRR7-proben er blitt merket med et fluorescerende reporter-fargestoff, 6-karboksyfluorescein (FAM), i 5'-ende.
cDNA ble fremstilt ved bruk av Superscript II Revers transkriptase. RT ble utført i 60 minutter ved 42 ºC i et vannbad. Reaksjonen ble avbrutt ved oppvarming til 70 ºC i 10 minutter. PCR-amplifikasjon ble deretter utført i MicroAmp Optical 96-brønners reaksjonsplater i 50 sykluser med hver syklus ved 95 ºC i 15 sekunder og 60 ºC i 1 minutt. Alle reaksjoner ble utført in triplo ved bruk av ABI Prism 7700 SDS. Den relative ekspresjon av hDRR7 i de testede vev ble sammenlignet med β-aktinekspresjonen.
Resultater
Generering og cDNA-sekvens av hDRR7
Etter utføring av PCR på et humant genomisk kosmidbibliotek erholdt man enkelte PCR-produkter. Sekvensering av PCR-produktet viste at sekvensen var identisk med en sekvensstrekning i en post i EMBL-databasen (AX099247). Vi kom frem til nukleotidsekvensen som vises i SEKV ID NR: 11.
Virkning av den hDRR4-aktiverende substans i det celle-baserte FLIPR-assay
Aktivering av "orphan"-GPCR'en hDRR7 (SEKV ID NR: 12) med det hDRR-bindende fragment av EPF (SEKV ID NR: 8) ved testkonsentrasjonen 150 nM etter forbigående kotransfeksjon med G α16-pcDNA inn i HEK293-celler. Relative fluorescens-enheter (RFU) ble bestemt ved å fylle cellene med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.). Hek293-celler som kun var transfisert med G α16-pcDNA-ekspresjonsvektoren, viste ingen respons på det hDRR-bindende fragment, slik det fremgår av fig. 4. Ved bruk av dette FLIPR-assay ved forskjellige testkonsentrasjoner av det hDRR-aktiverende peptid som bestod av SEKV ID NR: 8, bestemte man at EC50-verdien var 354 nM (fig. 8).
Ekspresjon av hDRR7-gen
Sanntids kvantifikasjons-PCR oppviste hDRR7-ekspresjon i lymfeknuter. Dette funn, i kombinasjon med indentifiseringen av tidlig graviditetsfaktor som naturlig agonist av hDRR-reseptorer, bekrefter den potensielle rolle som denne reseptor spiller i den immunosuppressive virkning av EPF som observeres under graviditet (Davis og Maslow, 1992). Av de testede vev, ble hDRR7 overveiende uttrykt i lymfeknuter, slik det fremgår fra fig. 5. Her sammenlignes ekspresjonsnivået i de øvrige vev med ekspresjonsnivået som ble observert i lymfeknuter.
EKSEMPEL 3: RENSING OG IDENTIFIKASJON AV EPF-BESLEKTEDE PEPTIDER
Materialer og metoder
Materialer
"Expand high fidelity" polymerase, PCR-buffer, T4-DNA-ligase og restriksjonsendonukleaser ble ervervet fra Boehringer (Mannheim, Tyskland). Oligonukleotider ble ervervet fra Eurogentec (Seraing, Belgia). Plasmidprepareringssett og Qiaquick PCR-amplifikasjonssettet var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle-sekvenseringssettene og ABI 377- eller 373A-sekvenseringsmaskinene var fra Applied Biosystems (Foster City, CA, U.S.A.). Geneamp PCR System 9600 var fra Perkin-Elmer (Norwalk, CT, U.S.A.). Pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3 ble ervervet fra Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.). Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), føtalt kalveserum og dialysert føtalt kalveserum var fra Life Technologies (Gaithersburg, MD, U.S.A.).
DNA-sekvensering
DNA-sekvensering ble utført med reagensmidler fra ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems) på PTC-200-PCR-maskiner (MJ Research). Reaksjonsprodukter ble renset på SEQueaky Kleen 96-brønners Terminator Removal Kit-kolonner (BioRad) og ble adskilt på ABI377 DNA-sekvenseringsmaskiner. For sekvensanalyse brukte vi Sequencher-programvaren fra GeneCodes (Ann Harbor, MI).
Kloning av hDRR4
PCR ble utført på et humant genomisk kosmidbibliotek (Clontech, Palo Alto, CA, USA) ved bruk av en fremadprimer (GGAATTC-GCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG) og en revers-primer (GTCTCGAGTCAC-TGCTCCAATCTGCTTCCC). De dannede PCR-produkter ble klonet ved hjelp av "TO-PO" TA Cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.). Hellengdes leseramme ble innføyd i pattedyr-ekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.) og ble brukt i påfølgende utsiktingseksperimenter.
Kloning av hDRR7
PCR ble utført på et humant genomisk bibliotek (Clontech, Palo Alto, CA, USA) ved bruk av hDRR7-fremadprimer (CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG) (SEKV ID NR: 13) og hDRR7-revers-primer (GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACAC-CAGACTGC) (SEKV ID NR: 14). Det dannede PCR-produkt ble innføyd i pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.) og ble brukt i påfølgende utsiktingseksperimenter.
Forbigående ekspresjon i pattedyrceller og FLIPR-assay
hDRR4-ekspresjonsplasmidet på hDRR7-ekspresjonsplasmidet ble forbigående kotransfisert med en G α16-pcDNA3-konstruksjon ved bruk av FuGENE 6-reagensmidlet (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) inn i HEK293-celler. Cellene ble fylt med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.) i henhold til leverandørens anbefalinger. Deretter ble cellene testet i FLIPR-instrumentet (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.) for Ca2+-transienter.
Rensing fra et skjoldbruskkjertel-ekstrakt
2,5 kg grise-skjoldbruskkjertel ble homogenisert og ekstrahert i metanol/vann/eddiksyre (90/9/1 vol/vol/vol). Etter sentrifugering ble supernatanten delipidert ved n-heksan-ekstrahering, og det vandige sjikt ble fraksjonert med en MegabondElute-fastfase-ektrahering. Materialet som ble eluert med fra 0 til 50% acetonitril i vandig trifluoreddiksyre (0,1%), ble ytterligere fraksjonert ved reversfase-HPLC på en preparativ DeltaPak C18-kolonne (40 x 100 mm). Fraksjonene avledet derav ble testet for aktivering av hDRR4-GPCR i FLIPR-assayet. Påfølgende rensetrinn på en preparativ Deltapak C4-kolonne (25 x 10 mm), en analytisk C18 kolonne (4,6 x 250 mm), en X-terra C18-kolonne med trang boring (2,1 x 250 mm) og til slutt en kapillær Symmetry C18-kolonne (0,32 x 150 mm) ble også etterfulgt av det FLIPR-baserte aktivitetsassay for fraksjoner som aktiverer hDRR4-transfiserte celler.
Resultater
Rensing av den naturlige agonist av hDRR4 fra grise-skjoldbruskkjertel
Kort sagt preparerte man et ekstrakt fra vevet som er kjent for å være en rik kilde for utsondrede peptider, f.eks. skjoldbruskkjertel, og rensingen av den naturlige ligand ble etterfulgt av et cellulært assay på grunnlag av aktiveringen av "orphan"-GPCR som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
Testingen av grise-skjoldbruskkjertelekstraktet etter den første fraksjonering på en C18-kolonne gav en rekke fraksjoner som førte til en forbigående intracelulær Ca2+-frigivning for celler som var blitt forbigående transfisert med hDRR4-ekspresjonskonstruksjonen.
To hosliggende fraksjoner ble renset til homogenisitet og analysert ved ESI-Qq-TOF-MS. Begge fraksjoner gav to fremragende trippeltladede iontopper ved m/z 640,59, som tilsvarte massen 1.918,77 Da, og ved m/z 716.63, som tilsvarte massen 2.146,89 Da. Disse topper ble valgt ut i et tandem-MS-eksperiment og fragmentert ved kollisjons-indusert dissosiasjon på et Q-TOF-system. Fire mulige sekvenser ble erholdt for den 2.146,8 Da tunge forbindelse: LGX1AFRX2FLPLFDRVLVE (hvor X1og X2er K eller Q), og fire mulige sekvenser for det 1.918,77 Da tunge peptid, som er en kortere isoform av det første peptid, LGX1AFRX2FLPLFDRVL (hvor X1og X2er K eller Q) (SEKV ID NR: 18-21).
Aminosyrene 2-19 og 2-17 av disse sekvenser tilsvarer henholdsvis chaperonin 10 (Hsp10) 2-18 og chaperonin 10 (Hsp10) 2-16. Aminosyreresiduet i posisjon 7 er et lysin (K) i chaperoninet fra alle de hittil undersøkte virveldyr. Aminosyreresiduet i posisjon 3 er et Q i Rattus norvegicus, Mus musculus og Homo sapiens, alle pattedyrarter, og et K i Gallus gallus (Aves).
FLIPR-måling
De rensede peptider eller tørkede vevfraksjoner ble løst opp i kalsiumbuffer og fylt i regulære 96-brønners plater. Deretter ble cellene testet i FLIPR-instrumentet (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.) for Ca2+-transienter. For de EPF-beslektede peptider bestemte man de følgende pEC50-verdier:
Litteraturhenvisninger
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. og Lipman, D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.
Athanasas-Platsis, S., Corcoran, C.M., Kaye, P.L., Cavanagh, A.C. og Morton, H. early pregnancy factor is required at two important stages of embryonic development in the mouse. American J. of Reproductive Immunology 43 (4), 2000, 223 – 233.
Confavreux, C., Hutchinson, M., Hours, M.M., Cortinovis-Tourniaire, P. og Moreau, T. Rate of pregnancy-related relapse in multiple sclerosis pregnancy in multiple sclerosis group. New England J. of Medicine 339 (5), 1998, 285 – 291.
Davis, R.K. og Maslow, A.S. Multiple sclerosis in pregnancy: a review. Obstetrical & Gynecological Survey 47 (5), 1992, 290 – 296.
Hickey, R.W., Zhu, R.L., Alexander, H.L., Jin, K.L., Stetler, R.A., Chen, J., Kochanek, P.M. og Graham, S.H. 10 kD mitochondrial matrix heat shock protein mRNA is induced following global brain ischemia in the rat. Brain Research. Molecular Brain Research 79 (1-2), 2000, 169 – 173.
Hinuma, S. et al (1998) A prolactin-releasing peptide in the brain. Nature 393, 272-276.
Lau, S., Patnaik, N., Sayen, M.R. og Mestril, R. Simultaneous overexpression of two stress proteins in rat cardiomyocytes and myogenic cells confers protection against ischemia – induced injury. Circulation 96 (7), 1997, 2287 – 2294.
Morton, H. Early pregnancy factor: an extracellular chaperonin 10 homologue. Immunology & Cell Biology 76 (6), 1998, 483 – 496.
Reinscheid R.K. et al., (1995) Orphanin FQ: A neuropeptide that activates an opioidlike G-protein-coupled receptor. Science 270, 792-794.
Sakurai T. et al., (1998) Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptide and G-protein-coupled receptors that regulate feeding behaviour. Cell 92, 573-585.
Stadel, J.M., Wilson, S. og Bergsma, D.J. (1997) Orphan G protein-coupled receptors: a neglected opportunity for pioneer drug discovery. TiPS 18, 430-437.
Summers, K.M., Fletcher, B.H., Macaranas, D.D., Somodevilla-Torres, M.J., Murphy, R.M., Osborne, M.J., Spurr, N.K., Cassady, A.I. og Cavanagh, A.C. Mapping and characterization of the eukaryotic early pregnancy factor/chaperonin 10 gene family. Somatic Cell & Molecular Genetics 24(6), 1998, 315 –326.
Tatemoto K., Hosoya M., Habata Y., Fujii R., Kakegawa T., Zou M.X., Kawamata Y., Fukusumi S., Hinuma S., Kitada C., Kurokawa T., Onda H., Fujino M. (1998) Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor. Biochem Biophys Res Commun. 251, 471-476.
Wilson S., Bergsma D.J., Chambers J.K., Muir A.I., Fantom K.G., Ellis C., Murdock P.R., Herrity N.C., Stadel J.M. (1998) Orphan G-protein-coupled receptors: the next generation of drug targets? Br. J. Pharmacol. 125, 1387-1392.
NO20035771A 2001-06-27 2003-12-22 Assays for EPF-reseptorforbindelser samt terapeutiske sammensetninger NO341778B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01202474 2001-06-27
PCT/EP2002/007263 WO2003005036A2 (en) 2001-06-27 2002-06-26 Epf receptor assays, compounds and therapeutic compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20035771L NO20035771L (no) 2004-02-26
NO341778B1 true NO341778B1 (no) 2018-01-15

Family

ID=8180549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20035771A NO341778B1 (no) 2001-06-27 2003-12-22 Assays for EPF-reseptorforbindelser samt terapeutiske sammensetninger

Country Status (17)

Country Link
US (2) US20040235722A1 (no)
EP (1) EP1399744B1 (no)
JP (1) JP4326326B2 (no)
KR (2) KR100977824B1 (no)
CN (1) CN100406891C (no)
AT (1) ATE397218T1 (no)
AU (1) AU2002317013B2 (no)
CA (1) CA2450502C (no)
DE (1) DE60226867D1 (no)
DK (1) DK1399744T3 (no)
ES (1) ES2307767T3 (no)
HK (1) HK1070694A1 (no)
IL (2) IL158817A0 (no)
NO (1) NO341778B1 (no)
NZ (1) NZ529714A (no)
WO (1) WO2003005036A2 (no)
ZA (1) ZA200309823B (no)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1340979A3 (en) * 2002-02-27 2004-02-04 Pfizer Limited Neuropeptide receptor and uses thereof
CA2526847C (en) 2003-06-20 2011-01-25 Ambit Biosciences Corporation Assay and kits for detecting protein binding
DK1937723T3 (en) 2005-08-31 2014-02-24 Invion Ltd Modified chaperonin 10
CN101514335B (zh) * 2008-02-22 2013-04-17 中国科学院生物物理研究所 流感病毒聚合酶亚基pa的表达纯化及pa氨基端及pa羧基端与pb1氨基端多肽复合体的晶体结构
CN102015757B (zh) * 2008-04-11 2015-12-02 悉生物有限公司 修饰的Cpn10以及PRR信号

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995015339A1 (en) * 1993-11-30 1995-06-08 The University Of Queensland Antagonists to chaperonin 10
WO1997018309A1 (en) * 1995-11-14 1997-05-22 New England Medical Center Hospitals, Inc. E6 binding proteins
WO2001036471A2 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9704836D0 (sv) * 1997-12-22 1997-12-22 Astra Pharma Inc Novel receptor
JP2002502036A (ja) * 1998-02-02 2002-01-22 コンセプト ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 受胎動物を検出する方法および装置
JP2004500039A (ja) * 1999-09-16 2004-01-08 ソルベイ・フアーマシユーチカルズ・ベー・ブイ ヒトｇ−タンパク質共役型受容体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995015339A1 (en) * 1993-11-30 1995-06-08 The University Of Queensland Antagonists to chaperonin 10
WO1997018309A1 (en) * 1995-11-14 1997-05-22 New England Medical Center Hospitals, Inc. E6 binding proteins
WO2001036471A2 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL [Online] 1 January 1998 (1998-01-01) "Heat shock protein 10 (Cpn10, groES)" Database accession no. O42283 XP002226464, Dated: 01.01.0001 *
JARVIS, J.A. ET AL, Solution structure of the acetylated and noncleavable mitochondrial targeting signal of rat chaperonin 10, The journal of biological chemistry, januar 1995, Vol 270, Nr 3,side 1323-1331, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1399744B1 (en) 2008-05-28
WO2003005036A3 (en) 2003-10-16
ATE397218T1 (de) 2008-06-15
IL158817A0 (en) 2004-05-12
ZA200309823B (en) 2005-05-25
ES2307767T3 (es) 2008-12-01
CA2450502A1 (en) 2003-01-16
WO2003005036A2 (en) 2003-01-16
IL158817A (en) 2012-01-31
KR100977824B1 (ko) 2010-08-25
HK1070694A1 (en) 2005-06-24
JP2005503543A (ja) 2005-02-03
US7402563B2 (en) 2008-07-22
CN100406891C (zh) 2008-07-30
CA2450502C (en) 2017-10-31
US20060160145A1 (en) 2006-07-20
DK1399744T3 (da) 2008-09-22
DE60226867D1 (de) 2008-07-10
NZ529714A (en) 2008-04-30
US20040235722A1 (en) 2004-11-25
KR20090111346A (ko) 2009-10-26
EP1399744A2 (en) 2004-03-24
JP4326326B2 (ja) 2009-09-02
AU2002317013B2 (en) 2007-11-01
KR100971270B1 (ko) 2010-07-20
NO20035771L (no) 2004-02-26
CN1541335A (zh) 2004-10-27
KR20040010644A (ko) 2004-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2625316T3 (es) Neuquinasa, una proteína corriente abajo de neuregulina
ES2252494T3 (es) Ligando natural de gprc chemr23 y usos del mismo.
JP2004121225A (ja) 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
WO1999046378A1 (fr) Nouvelles proteines receptrices couplees aux proteines g
EP1196572A1 (en) Axor21, a g-protein coupled receptor
US7402563B2 (en) EPF derived peptides and therapeutic compositions
JP2004500125A (ja) アンギオペプチンによって確認される機能性受容体としてのＧＰＣＲｘ１１を発現し、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングに役立つ組換え細胞系
JP2008507254A (ja) Ｎｋｇ２ｄおよびｕｌ１６受容体に対するタンパク質リガンドならびにその使用
Neill et al. Epitope-tagged gonadotropin-releasing hormone receptors heterologously-expressed in mammalian (COS-1) and insect (Sf9) cells
AU2002317013A1 (en) EPF receptor assays, compounds and therapeutic compositions
WO2005121356A1 (ja) 新規スクリーニング方法
WO2002026824A2 (en) A novel human g-protein coupled receptor, hgprbmy5, expressed highly in brain and ovarian tissues
US20040214317A1 (en) Novel human G-protein coupled receptor, HGPRBMY8, expressed highly in brain
JP2005505264A (ja) 新規ヒトプロトンゲート調節チャンネル
US20050142135A1 (en) Agents and methods for modulating interactions between gonadotropin hormones and receptors
JP2004500864A (ja) 新規ｇ−タンパク質共役型受容体
JP2005514931A (ja) 膵島細胞シグナル伝達に関与するｇタンパク質共役受容体をコードする核酸
WO2004000883A1 (en) Regulation of human growth hormone-releasing hormone receptor
JP2002238578A (ja) ラットｅｄｇ７受容体
Kumar Membrane protein interactions in angiotensin II signaling
US20040147732A1 (en) Novel human G-protein coupled receptor, HGPRBMY9, expressed highly in brain and testes
JP2001054389A (ja) 新規なｇ蛋白質共役型レセプター
Jordan Characterization of kappa opioid receptor internalization, down-regulation and dimerization
JP2004500882A (ja) Ｇ−タンパク質結合受容体
JP2005522992A (ja) ヒトバニロイド受容体タンパク質及び前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees