ES2307767T3 - Ensayos con el receptor epf, compuestos y composiciones terapeuticas. - Google Patents

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Abstract

Método para identificar un compuesto capaz de unirse y/o modular la actividad del polipéptido receptor de la raíz dorsal humana 4 (hDRR4) y/o del receptor de la raíz dorsal humana 7 (hDRR7), que comprende las etapas de: a) poner en contacto el factor precoz de embarazo (EPF) o un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF con un polipéptido hDRR4 y/o hDRR7; b) poner en contacto un compuesto de estudio con dichos polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7, y c) determinan el efecto de dicho compuesto de estudio con dichos polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 en un ensayo competitivo, no competitivo 0 comparativo con dicho péptido EPF o péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de EPF.

Description

Ensayos con el receptor EPF, compuestos y composiciones terapéuticas.
La presente invención se refiere al área de ensayos con compuestos que interaccionan con el receptor del Factor Temprano del Embarazo (EPF, por sus siglas en inglés) también conocido como Chaperonina 10, y péptidos relacionados con el EPF así como el uso terapéutico de los mismos.
Antecedentes de la invención
El EPF y la chaperonina mitocondrial 10 tienen secuencias aminoacídicas idénticas (Identificador de secuencia N° 4) aunque pueden codificar genes diferentes (Summers y otros, 1998) y tienen funciones fisiológicas muy diferentes. Asimismo, el EPF es un péptido de secreción, mientras que la chaperonina 10 se encuentra en las vesículas intracelulares durante toda la ruta de secreción. La chaperonina 10 pertenece a la familia de las proteínas de estrés térmico. En la mitocondria forma un complejo de chaperoninas con la proteína de estrés térmico 60, la cual es importante para el plegamiento y función de la proteína mitocondrial. En la isquemia, la regulación al alza de estas dos proteínas es capaz de proteger al tejido cerebral y a los miocitos cardiacos (Lau y otros, 1997) frente a la isquemia o la lesión por perfusión (Hickey y otros, 2000). Una secuencia de ARNm EST, descrita como similar en el extremo 3' de la proteína de estrés térmico mitocondrial de 10 kDa, es el clon de ADNc ok82f05.s1 NCI_CGAP_Kid3 de Homo sapiens (entrada número AA923068 de la base de datos EMBL).
Hasta ahora, el EPF ha sido principalmente conocido como un importante factor en el desarrollo embrionario, en la etapa de preimplantación, así como en la etapa de periimplantación (Athanasas-Platsis y otros, 2000). La importancia en estas dos fases radica en su capacidad de regulación del crecimiento y sus propiedades inmunomoduladoras. Estas acciones del EPF también son evidentes dado que se produce durante la proliferación primaria y por las células neoplásicas, en las que funciona como un factor de crecimiento autocrino in vivo e in vitro. (Morton, 1998).
La presencia de EPF se ha confirmado repetidamente como indispensable para que una mujer pueda quedarse embarazada. Recientemente, Cheng SJ y otros (Am.J.Reprod. Immunol. 2000 Oct; 44(4):211-3) demostraron que los niveles de EPF disminuían rápidamente después de un aborto quirúrgico y esto sugiere que el seguimiento de la actividad del EPF es un índice útil para el cuidado embrionario y el desarrollo de un embarazo normal. Consecuentemente, la supresión de la actividad del EPF podría tener una acción contraceptiva, mientras que el aumento de la actividad del EPF podría evitar la pérdida del feto.
El EPF se secreta en el suero materno entre las primeras 6 ó 12 horas después de la fecundación, y por lo tanto el EPF o péptidos derivados o relacionados con el EPF podrían ser un marcador precoz útil para diagnosticar el embarazo. Dicho diagnóstico sería útil en la medicina humana, pero también en aplicaciones veterinarias. Los ensayos de EPF actualmente empleados (p. ej., la prueba de rosetas) son engorrosas y poco fiables. Además, no distinguen entre las distintas formas de EPF. Las pruebas basadas en anticuerpos específicos de (poli)péptidos con actividad EPF o los ensayos que distinguen las distintas formas de EPF con actividad biológica (p. ej., basados en cromatografía y/o espectrometría de masas) pueden suponer, por lo tanto, ventajas significativas.
La actividad de EPF se ha confirmado repetidamente como indispensable para que una mujer pueda quedarse embarazada. Recientemente, Cheng SJ y otros (Am.J.Reprod. Immunol. 2000 Oct; 44(4):211-3) demostraron que los niveles de EPF disminuían rápidamente después de un aborto quirúrgico y esto sugiere que el seguimiento de la actividad del EPF es un índice útil para el bienestar del embrión y el desarrollo de un embarazo normal. Consecuentemente, la supresión de la actividad del EPF podría tener una acción anticonceptiva, mientras que el aumento fisiológico o la corrección anómala de la actividad del EPF podrían evitar la pérdida del feto.
Se ha observado que el embarazo tiene un efecto positivo sobre el desarrollo de la esclerosis múltiple al reducir la tasa de recaídas durante el embarazo (Confavreux y otros, 1998). Tal y como destacó Morton (1998), el EPF "está considerado como uno de los factores más importantes implicados en la modificación de la esclerosis múltiple observada durante el embarazo". El efecto positivo de la acción inmunosupresora del EPF durante el embarazo también podría observarse en otras enfermedades autoinmunitarias, como la artritis reumatoide (Davis y Maslow, 1992).
Las actividades potenciales del EPF y de la chaperonina 10 en sistemas humanos, hacen que los péptidos sean objeto de estudio para identificar compuestos que aumenten o disminuyan los efectos biológicos de los péptidos. Sin embargo, aunque los sitios de unión a EPF y chaperonina 10 parecen existir, no se han identificado receptores para estos péptidos. La falta de un receptor conocido ha dificultado el diseño de ensayos y obstaculizado los esfuerzos para descubrir y estudiar compuestos que mimetizaran o alteraran los efectos biológicos del EPF o de la chaperonina 10.
La presente invención resuelve este problema en la técnica, igual que la farmacología inversa ha conducido a la identificación de los receptores de la raíz dorsal humana (hDRR, por sus siglas en inglés) como proteínas receptoras de EPF o de la chaperonina 10. Con este descubrimiento, los presentes inventores vuelven a confirmar las propiedades inmunomoduladoras del EPF ya que parece que los hDRR se expresan en los ganglios o bultos linfáticos y el mapeo cromosómico del hDRR del cromosoma 11p15 los vinculaba a varias leucemia linfoblásticas. Además proporciona ensayos para identificar compuestos que mimeticen o alteren los efectos biológicos del EPF o de la chaperonina 10, así como el uso farmacológico de los mismos.
Los hDRR pertenecen a la familia de los receptores acoplados a proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) que comparten una organización estructural común caracterizada por un extremo N terminal extracelular, siete hélices alfa hidrófobas que constituyen putativamente dominios transmembrana y un dominio C terminal intracelular. Los GPCR se unen a una variedad de ligandos que activan señales intracelulares a través de la activación de las proteínas G transductoras (Caron y otros, Rec. Prog. Horm. Res. 48:277-290 (1993); Freed-man y otros, Rec. Prog. Horm. Res. 51:319-353 (1996)).
En recientes revisiones (Stadel y otros, 1997; Wilson y otros, 1998) contaron hasta 25 GPCR usados como diana para fármacos comercialmente útiles, esto constituye un 18% de los 140 GPCR humanos clonados caracterizados. La extrapolación de los genomas totalmente secuenciados (levadura, C. elegans) a los 30.000 teóricos genes humanos, conduce a la expectativa de que en los próximos 3 años se descubrirán 5000 GPCR humanos. En analogía con los números actuales, durante la próxima década deberían desarrollarse 150 de estos nuevos GPCR huérfanos en una diana de un fármaco con interés comercial. Este cálculo no tiene en cuenta que los GPCR adicionalmente caracterizados son, en la actualidad, la base de los compuestos en desarrollo.
En general, es justo decir que la farmacología inversa sobre GPCR huérfanos proporcionará nuevos enfoques para el tratamiento de varias enfermedades, que superan a las actuales estrategias, o permitirán el tratamiento de dolencias que no pueden ser tratadas con los medios actuales. La industria farmacéutica ha reconocido tal y como se refleja en recientes publicaciones sobre la identificación de ligandos de GPCR huérfanos (orfanina FQ (Reinscheid y otros, 1995.), orexina (Sakurai y otros, 1998), péptido liberador de prolactina (Hinuma y otros), apelina (Tatemoto y otros, 1998).
El documento WO 01 36471A se refiere a receptores acoplados a proteína G humana, y específicamente a GPCR humanos endógenos, con un énfasis particular en las versiones no endógenas de los GPCR que han sido alteradas para determinar o potenciar la actividad constitutiva del receptor. Esto sugiere el uso de estos GPCR modificados para la identificación directa de compuestos candidatos como agonistas de receptores, agonistas inversos o agonistas parciales y que dichos compuestos pueden tener una aplicación potencial como agentes terapéuticos.
El ácido nucleico y las secuencias polipeptídicas de los receptores de la raíz dorsal humana 1-6 se describieron en la solicitud PCT WO 99/32519 A1 publicada el 1 de julio de 1999. Según su homología, el receptor de la raíz dorsal de rata, este documento describe que los hDRR pudieran estar implicados en la transmisión, modulación y sensación del dolor, incluyendo el uso de los mismos en ensayos para la identificación de nuevos agentes como anestésicos y analgésicos. En esta solicitud PCT, la localización de los ganglios de la raíz dorsal fue confirmada para hDRR5 en los ganglios de la raíz dorsal fetal. Sin embargo, no se puedo encontrar una señal de hibridación específica para hDRR en ninguno de los tejidos adultos humanos examinados, incluyendo los ganglios de la raíz dorsal fetal. Además, en esta solicitud (WO 99/32519 A1), no se pudo identificar ningún ligando natural para ninguno de los hDRR descubiertos. La caracterización de hDRR4 como un receptor de angiotensina en la solicitud anterior (WO 99/32519-A1), basándose en que los presentes inventores no pudieron confirmar la estimulación de este receptor con angiotensina II y III.
Para otro receptor de la raíz dorsal humana, el hDRR7, los ácidos nucleicos y las secuencias polipeptídicas han sido descritas en las solicitudes PCT WO 01/16159-A1, publicada el 08 de marzo de 2001 y en la WO 01/19983-A1, publicada el 22 de marzo de 2001. En ninguno de estos documentos se logró identificar un ligando para el hDRR7. En la solicitud PCT WO 01/16159-A1, se hace referencia al hDRR7 como "TheAnt", describiendo un gran número de dolencias asociadas con dicho polipéptido. Sin embargo, no se aportan pruebas concluyentes para vincular este receptor a ninguna de las dolencias indicadas. En la solicitud PCT WO 01/19983, el hDRR7 se describe generalmente como un GPCR con una similitud de secuencia baja con el receptor de la somatostatina 3.
Por lo tanto, no se ha descrito ningún ensayo de competición con un ligando natural de los hDRR, o que emplee una comparación con la interacción de los hDRR con un ligando natural. Esto último es esencial para usar los hDRR como herramientas farmacológicas para explorar la función de los receptores y la relación con las dolencias. La presente invención resuelve este problema de la técnica y proporciona ensayos que emplean la interacción de hDRR y EPF o péptidos relacionados con EPF, para determinar si un compuesto candidato es un ligando, un agonista o un antagonista de los hDRR.
Sólo recientemente, Lembo y otros, (Nature Neuroscience 5, 201-209 (2002)) demostraron que el receptor hDRR 4, también conocido como Receptor 4 acoplado a proteína G específica de neuronas sensoriales (SNSNR4, por sus siglas en inglés), o el Receptor 1 del gen relacionado con Mas (hMrgX1), son fuertemente activados por productos génicos del precursor de péptidos opioides proencefalina A. En particular se demostró que BAM22 y fragmentos de BAM22, conocidos por estar implicados en el control de la nocicepción, activaban los hDRR en un ensayo FLIPR de flujo de calcio. En la presente invención, se demostró que el EPF y los péptidos relacionados con EPF activaban a hDRR4 y a hDRR7. Además, se demostró que hDRR4 se expresaba predominantemente en la raíz dorsal y en los ganglios trigéminos (Lembo y otros, Nature Neuroscience 5, 201-209 (2002)), mientras que recientemente se ha demostrado que el receptor hDRR7 se expresa predominantemente en los ganglios o bultos linfáticos. Este patrón de expresión específica de receptor sugiere una funcionalidad diferente en respuesta a la activación por ligando.
Consiguientemente, esto sería beneficioso si se pudieran diseñar compuestos específicos de receptor útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con receptores. La identificación de EPF y péptidos relacionados con EPF como ligandos de hDRR4 y hDRR7, nos proporciona ahora la base para el desarrollo de métodos de ensayo in vitro para identificar compuestos capaces de modular la implicación de un hDRR en la transmisión, modulación y sensación del dolor.
Además, son útiles como anticonceptivos, en anestesia y analgesia, y para identificar compuestos capaces de modular trastornos mediados por hDRR como por ejemplo la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple u otras dolencias en las que sería deseable adoptar medidas inmunosupresoras, como en la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, por sus siglas en inglés), o para prevenir el rechazo en los trasplantes. En este documento se explican con mayor detalle éstos y otros aspectos de la invención.
Características de la invención
La presente invención proporciona ensayos para el estudio de la interacción de EPF o de péptidos relacionados con EPF que tienen al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, con el receptor 4 de la raíz dorsal humana (hDRR4) y/o con los polipéptidos del receptor 7 de la raíz dorsal humana (hDRR7). Los ensayos son útiles para identificar si un compuesto de estudio se puede unir a los hDRR en las condiciones en las que EPF o los péptidos relacionados con EPF, pueden unirse al receptor. Los ensayos también son útiles para determinar si el compuesto de estudio es un agonista o un antagonista de los hDRR. Los ensayos anteriores se pueden realizar de diferentes formas incluyendo, ensayos competitivos, no competitivos y comparativos en los que se estudia la interacción de EPF o de los péptidos relacionados con los hDRR, como un control positivo o negativo o en comparación con los resultados obtenidos con el compuesto de estudio.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido aislado y purificado y a las moléculas polinucleotídicas que codifican el fragmento de EPF que se une al hDRR4 y que tiene la secuencia aminoacídica (AFRKFLPLF
DRVLVERSA (Identificador de secuencia N° 8)) así como el uso diagnóstico del mismo.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a los polipéptidos aislados y purificados y a las moléculas polinucleotídicas que codifican péptidos EPF con al menos un 70% de identidad de secuencia con el EPF, capaz de unirse y activar al hDRR4 y con las secuencias aminoacídicas ((LGKAFRKFLPLFDRVLVE (Identificador de secuencia N° 18)), ((LGQAFRKFLPLFDRVLVE (Identificador de secuencia N° 19)), ((LGKAFRKFLPLFDRVL (Identificador de secuencia N° 20)) y ((LGQAFRKFLPLFDRVL (Identificador de secuencia N° 21)) así como el uso diagnóstico de los mismos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para aislar el hDRR4 y/o el hDRR7 a partir de una fracción celular que los contiene, que comprende la puesta en contacto de la fracción celular con el EPF o un fragmento del mismo que se una a hDRR4 y/o hDRR7 inmovilizado en un sustrato sólido, y la elución posterior del hDRR.
En las reivindicaciones adjuntas, se describen formas de realización adicionales.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1A - Se muestra la secuencia nucleotídica codificadora de hDRR4 (Identificador de secuencia N° 1) (codones de inicio y parada en negrita)
Figura 1B - Se muestra la secuencia aminoacídica de hDRR4 (Identificador de secuencia N° 2)
Figura 2 - Activación del hDRR4 de GPCR huérfano por fracciones C18 de un extracto de hipotálamo porcino después de una cotransfección transitoria con pcDNA-G\alpha16 en Hek293. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR) se determinaron cargando las células con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) y analizando los aumentos transitorios del Ca^{2}+ intracelular en un equipo FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
Figura 3 - Activación del hDRR4 de GPCR huérfano (Identificador de secuencia N° 2) por un fragmento de EPF de unión a hDRR (Identificador de secuencia N° 8) a una concentración de prueba de 150 nM después de una cotransfección transitoria pcDNA-G\alpha16 en Hek293. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR) se determinaron cargando las células con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.).
Figura 4 - Activación del hDRR7 de GPCR huérfano (Identificador de secuencia N° 12) por un fragmento de EPF de unión a hDRR (Identificador de secuencia N° 8) a una concentración de prueba de 150 nM después de una cotransfección transitoria pcDNA-G\alpha16 en Hek293. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR) se determinaron cargando las células con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.).
Figura 5 - Expresión relativa de hDRR7 en varios tejidos, en comparación con las expresiones en ganglio o bulto linfático, que se toman como un 100% de expresión. Los niveles de expresión se determinaron usando una PCR cuantitativa en tiempo real.
Figura 6 - Expresión relativa de hDRR4 en varios tejidos, en comparación con la expresión relativa de citofilina A humana en los tejidos analizados. Los niveles de expresión se determinaron usando una PCR cuantitativa en tiempo real.
Figura 7 - Curva dosis-respuesta del fragmento de EPF de unión a hDRR (Identificador de secuencia N° 8) sobre el hDRR4 determinada usando el ensayo FLIPR de calcio.
Figura 8 - Curva dosis-respuesta del fragmento de EPF de unión a hDRR (Identificador de secuencia N° 8) sobre el hDRR7 determinada usando el ensayo FLIPR de calcio.
Figura 9 - Curva dosis-respuesta de los péptidos relacionados con EPF EPF1-16 (Identificador de secuencia N° 19) y EPF1-18 (Identificador de secuencia N° 21) sobre el hDRR4 determinada usando el ensayo FLIPR de calcio.
Figura 10 - Curva dosis-respuesta de los péptidos relacionados con EPF EPF1-16 (Identificador de secuencia N° 19) y EPF1-18 (Identificador de secuencia N° 21) sobre el hDRR7 determinada usando el ensayo FLIPR de calcio.
Descripción detallada
La presente invención proporciona ensayos que hacen uso de la interacción de EPF o un péptido relacionado con EPF con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, con el receptor 4 de la raíz dorsal humana (hDRR4) y o el polipéptido receptor 7 de la raíz dorsal humana (hDRR7). El EPF, también conocido como chaperonina 10 y los péptidos relacionados con EPF son ligandos de afinidad alta por los hDRR y que activan el receptor cuando se unen al mismo, provocando una activación de la fosfolipasa C que hidroliza los lípidos de inositol en las membranas para liberar inositol trifosfato, que a su vez moviliza el calcio intracelular. Los ensayos proporcionan métodos para identificar compuestos que sean ligandos de los hDRR o agonistas o antagonistas de los hDRR.
El término, "EPF o péptidos relacionados con EPF", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere al factor precoz de embarazo, también conocido como chaperonina 10 que tiene una secuencia aminoacídica con Identificador de secuencia N° 4 ó a los péptidos relacionados con EPF procediendo dichos péptidos de la secuencia antes mencionada mediante sustitución, deleción y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia aminoacídica que codifica el EPF y en la que dichos péptidos relacionados con EPF son capaces de unirse a la proteína hDRR4 según la invención. En una forma de realización preferente, dichos péptidos relacionados con EPF comprenden la región de unión a hDRR4 y/o hDRR7 compuesta por el Identificador de secuencia N° 8. En otra forma de realización, los péptidos relacionados con EPF comprenden una secuencia aminoacídica seleccionada entre el grupo formado por ((LGKAFRKFLPLFDRVLVE (Identificador de secuencia N° 18)), ((LGQAFRKFLPLFDRVLVE (Identificador de secuencia N° 19)), ((LGKAFRKFLPLFDRVL (Identificador de secuencia N° 20)) y ((LGQAFRKFLPLFDRVL (Identificador de secuencia N° 21)). En otro aspecto de la invención los péptidos relacionados con EPF están formados por péptidos con una secuencia aminoacídica seleccionada entre el grupo formado por (Identificador de secuencia N° 18), (Identificador de secuencia N° 19), (Identificador de secuencia N° 20) e (Identificador de secuencia N° 21).
En una forma de realización específica, el polipéptido de hDRR en un ensayo según la invención es la proteína hDRR4, que comprende la secuencia aminoacídica con Identificador de secuencia N° 2 o fragmentos funcionales de la misma, o de la proteína hDRR7, que comprende la secuencia aminoacídica con Identificador de secuencia N° 12 o fragmentos funcionales de la misma.
El término "fragmentos de la misma" describe una parte o subregión de la molécula de proteína cuya secuencia se describe en la presente memoria descriptiva, de modo que dicho fragmento comprenda 5 o más aminoácidos que estén contiguos en la proteína original. El término "fragmentos de la misma" pretende incluir "fragmentos funcionales" en los que el fragmento aislado, la parte o la subregión comprende una región distintiva desde un punto de vista funcional como un centro activo, un lugar de unión o un sitio de fosforilación de la proteína receptora. Los fragmentos funcionales se pueden producir con tecnología de clonación, o como productos naturales de técnicas de corte y empalme alternativas.
El término "derivado de" describe una parte o subregión de una molécula de proteína cuya secuencia se describe en la presente memoria descriptiva, de modo que dicha parte o subregión tenga un alto grado de coincidencia de secuencia con la secuencia original. Dicha coincidencia se puede cuantificar determinando el grado de identidad de secuencia con la secuencia original en la que un alto grado de coincidencia de secuencia se refiere a un péptido o polipéptido aislado con al menos 70, 80, 90, 95 ó 99% de identidad con la secuencia original determinado usando una alineación local.
Los métodos para comparar la identidad y similitud de dos o más secuencias son muy conocidos en la técnica. Así, por ejemplo, los programas disponibles en el Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devreux J. y otros, Nucleic Acid Res., 12, 387-395, 1984), por ejemplo, se pueden usar los programas BESTFIT y GAP para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad entre dos secuencias peptídicas o polipeptídicas. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (J. Mol. Biol., 147, 195-197, 1981) y encuentra la región única con más similitud entre dos secuencias. BESTFIT es más apropiado para comparar dos polinucleótidos o dos secuencias peptídicas o polipeptídicas de diferente longitud, asumiendo el programa que la secuencia más corta representa una parte de la más larga. En comparación, GAP alinea dos secuencias y encuentra una "similitud máxima", según el algoritmo de Needleman y Wunsch (J.Mol.Biol., 48, 443-453, 1970). GAP es más apropiado para comparar secuencias que tengan aproximadamente la misma longitud y se espera que la alineación se produzca a lo largo de toda la cadena. Preferentemente los parámetros "Gap Weight" y "Length Weight" usados en cada programa son 50 y 3, para secuencias polinucleotídicas y 12 y 4 para secuencias polipeptídicas, respectivamente. Preferentemente, el porcentaje de identidad y similitud se determina cuando se están comparando dos secuencias óptimamente alineadas. También hay otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias conocidos en la técnica, por ejemplo la familia de programas BLAST (Altschul S F y otros, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997).
Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, un "compuesto" es un conjunto orgánico o inorgánico de átomos de cualquier tamaño e incluye moléculas pequeñas (menos de aproximadamente 2500 Daltons) o moléculas mayores, p. ej., péptidos, polipéptidos, proteínas enteras y polinucleótidos.
El término compuesto "estudiado", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, es un compuesto usado en una prueba para valorar si dicho compuesto de estudio podría ser un ligandos de un polipéptido de hDRR. Un compuesto de estudio también puede ser un agonista o antagonista del hDRR. Si el compuesto de estudio es realmente un ligando, un agonista o un antagonista de un polipéptido de hDRR o no lo es, se determina en un ensayo según la invención.
El término "ligando", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, es un compuesto capaz de unirse a un hDRR, en el que tras la unión al receptor, puede producirse un cambio en la conformación del complejo ligando-receptor que resulta en una transducción de la respuesta biológica a través de un mensajero secundario. Dicho ligando puede ser un agonista o un antagonista del receptor.
El término, "agonista", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, es un compuesto que interacciona con un hDRR y que activa un polipéptido del hDRR. Un polipéptido de hDRR activado induce un cambio en una ruta bioquímica vinculada al receptor, p. ej., puede estimular el corte de GTP por una proteína G, activar la ruta de la adenilato ciclasa o activar la ruta de la fosfolipasa C.
El término, "antagonista", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, es un compuesto que interacciona con un hDRR y que inhibe o impide la activación de un polipéptido del hDRR.
Polinucleótidos
Por consiguiente, en una primera forma de realización, la presente invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica un hDRR4 y/o hDRR7, o un fragmento del mismo, en el que dicha molécula de ácido nucleico es ARN, ADN ADNc o ADN genómico, en un ensayo que hace uso de la interacción de EPF y un péptido relacionado con al menos un 70% de identidad de secuencia de EPF con un polipéptido de hDRR4 y/o hDRR7.
En una segunda forma de realización, la presente invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica el EPF o un péptido relacionado con EPF con al menos un 70% de identidad de secuencia al EPF, en el que dicha molécula de ácido nucleico es ARN, ADN ADNc o ADN genómico, en un ensayo que hace uso de la interacción de EPF y el péptido relacionado con al menos un 70% de identidad de secuencia de EPF con un polipéptido de hDRR4 y/o hDRR7.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "aisladas" se refiere al hecho de que los polinucleótidos, las proteínas y los polipéptidos, o sus fragmentos, han sido separados de su entorno in vivo, de modo que pueden ser manipuladas por expertos en la materia, para, pero sin pretender limitar, secuenciación, digestión por restricción, mutagénesis dirigida y subclonación en vectores de expresión de fragmentos de ácido nucleico así como para obtener la proteína o fragmentos de proteína en cantidades que puedan permitir generar anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, secuenciación aminoacídica y digestión peptídica. Por lo tanto, los ácidos nucleicos reivindicados en la presente memoria descriptiva pueden estar presentes en células completas o en lisados celulares o de forma parcial, sustancial o totalmente purificada.
Se considera que un polinucleótido está "purificado" cuando se purifica de los contaminantes que le rodean. Así, un polinucleótido aislado a partir de células se considera sustancialmente purificado cuando se purifica a partir de componentes celulares por métodos estándar mientras que la secuencia nucleotídica sintetizada químicamente se considera sustancialmente purificada cuando se purifica de sus precursores químicos. Una proteína o una molécula de ácido nucleico "sustancialmente pura" típicamente comprenden al menos un 85% de una muestra, prefiriéndose porcentajes superiores. Un método para determinar la pureza de una proteína o una molécula de ácido nucleico, es la separación electroforética de una preparación en una matriz de, por ejemplo, poliacrilamida o agarosa. La pureza se demuestra por la aparición de una sola banda después de la tinción. Existen otros métodos para valorar la pureza, como la cromatografía, la espectrometría de masas y la centrifugación analítica.
El término "fragmentos de la misma" describe una parte o subregión de la molécula de ácido nucleico cuya secuencia se describe en la presente memoria descriptiva, de modo que dicho fragmento comprenda 15 o más nucleótidos que estén contiguos en la molécula de ácido nucleico original. El término "fragmentos de la misma" pretende incluir "fragmentos funcionales" en los que el fragmento aislado, la parte o la subregión comprende una región distintiva desde un punto de vista funcional como un centro activo, un lugar de unión o un sitio de fosforilación del receptor. Los fragmentos funcionales se pueden producir con tecnología de clonación, o como productos naturales de técnicas de corte y empalme alternativas.
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En particular, la presente solicitud prevé el uso en un ensayo según la invención, de una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica hDRR4 o un fragmento del mismo, que comprende un miembro seleccionado entre un grupo formado por:
(a)
una molécula de ácido nucleico que codifica hDRR4 que comprende la secuencia aminoacídica con Identificador de secuencia N° 2;
(b)
una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotidica con Identificador de secuencia N° 1, que codifica hDRR4,
(c)
una molécula de ácido nucleico que es complementaria al polinucleótido de (a) o (b);
(d)
una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 15 bases secuenciales del polinucleótido de (a), (b) o (c);
(e)
una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas con la molécula de polinucleótido de (a), (b) o (c); o
(f)
una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína hDRR4 que comprende una secuencia nucleotídica degenerada como resultado del código genético a una secuencia nucleotídica de un polinucleótido de (a) a (e).
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En una forma de realización más preferente de estos ensayos, el hDRR4 que codifica una molécula de ácido nucleico está formado por el Identificador de secuencia N° 1.
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Por consiguiente, la solicitud describe el uso en un ensayo según la invención, de una molécula de ácido nucleico está aislada y purificada que codifica hDRR7 o un fragmento del mismo, que comprende un miembro seleccionado entre un grupo formado por:
(a)
una molécula de ácido nucleico que codifica hDRR7 que comprende la secuencia aminoacídica con Identificador de secuencia N° 12;
(b)
una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica con Identificador de secuencia N° 11, que codifica hDRR7;
(c)
una molécula de ácido nucleico que es complementaria al polinucleótido de (a) o (b);
(d)
una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 15 bases secuenciales del polinucleótido de (a), (b) o (c);
(e)
una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas con la molécula de polinucleótido de (a), (b) o (c); o
(f)
una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína hDRR7 que comprende una secuencia nucleotídica degenerada como resultado del código genético a una secuencia nucleotídica de un polinucleótido de (a) a (e).
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En una forma de realización más preferente de estos ensayos, el hDRR7 que codifica una molécula de ácido nucleico está formado por el Identificador de secuencia N° 11.
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En otra forma de realización, la presente solicitud describe el uso en un ensayo según la invención, de una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica el EPF o péptidos relacionados con EPF, que comprende un miembro seleccionado entre un grupo formado por:
(a)
una molécula de ácido nucleico que codifica el EPF que comprende la secuencia aminoacídica con Identificador de secuencia N° 4;
(b)
una molécula de ácido nucleico que es complementaria al polinucleótido de (a);
(c)
una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 15 bases secuenciales del polinucleótido de (a), o (b);
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(d)
una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas con la molécula de polinucleótido de (a) o (b);
(e)
una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido relacionado con EPF que tiene un 70, 80, 90, 95 ó 99% de identidad secuencia con la secuencia aminoacídica codificada por la molécula de polinucleótido de (a) o (b);
(f)
una molécula de ácido nucleico que codifica una polipéptido EPF que comprende una secuencia nucleotidica degenerada como resultado del código genético a una secuencia nucleotidica de un polinucleótido de (a) a (d).
En una forma de realización más preferente descrita en la presente memoria descriptiva, el EPF que codifica una molécula de ácido nucleico formado por el Identificador de secuencia N° 3 y el péptido relacionado con EPF está formado por un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica seleccionada entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, el Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 y el Identificador de secuencia N° 21, o del fragmento de unión a hDRR4 codificado por el Identificador de secuencia N° 8.
Los expertos en la materia reconocerán que debido a la degeneración del código genético, en la secuencia identificada por el Identificador de secuencia N° 1, Identificador de secuencia N° 11 o Identificador de secuencia N° 3, podrán introducirse numerosas sustituciones de pares de bases de nucleótidos "silenciosas" sin alterar la identidad del producto aminoacídico o proteico codificado. Dichas sustituciones deberá incluirse en el alcance de la invención.
Los términos "complementaria" "complementariedad", como se emplean en la presente memoria descriptiva, se refieren a la capacidad de los nucleótidos tipo purina y pirimidina de asociarse a través de puentes de hidrógeno para formar moléculas de cadena doble. Las pares de bases siguientes se relacionan por complementariedad: guanina y citosina, adenina y timina, y adenina y uracilo. El término "complementaria", como se emplean en la presente memoria descriptiva, significa que la anterior relación es válida para sustancialmente todas las pares de bases que comprenden dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla a lo largo de toda la molécula. "Parcialmente complementaria" se refiere a que la relación anterior en la que una de las dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla es más corta que la otra, de modo que una parte de una de las moléculas permanece de cadena sencilla.
El término "hibridación", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un proceso en el que una molécula de ácido nucleico se une a una hebra complementaria mediante apareamiento de bases nucleotídicas.
El término "restrictivo", se refiere a las condiciones de hibridación. Unas condiciones muy restrictivas desfavorecen apareamientos entre bases no homólogas. Unas condiciones poco restrictivas tienen el efecto contrario. El nivel de restricción se puede alterar, por ejemplo, mediante la temperatura y la concentración de sales. "Condiciones restrictivas" se refiere a una incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, seguido del lavado de los filtros en SSC 0,1X aproximadamente a 65°C. En los ejemplos se describen condiciones de hibridación más apropiadas.
Las secuencias nucleotídicas que codifican los hDRR se expresan preferentemente en ganglios de raíz dorsal (publicación PCT WO 99/32519-A1) y estos ganglios pueden servir como origen para aislar los ácidos nucleicos que codifican el receptor. Existen otras células y otras líneas celulares adecuadas para aislar los ácidos nucleicos de hDRR. La selección de células adecuadas se puede realizar analizando la actividad de hDRR en extractos celulares o con los ensayos con células enteras descritos en la presente memoria descriptiva. Las células que posean actividad de receptor de la raíz dorsal en cualquiera de estos ensayos pueden ser idóneas para aislar los ácidos nucleicos de hDRR.
Puede usarse cualquiera de la variedad de procedimientos conocidos en la técnica para clonar molecularmente los ácidos nucleicos de hDRR. En un método, el ARNm se aísla, y se realiza una síntesis de ADNC de la primera hebra. Se puede realizar un segundo ciclo de síntesis de ADN con la producción de la segunda hebra. Posteriormente, con una amplificación por PCR específica de los fragmentos de ADN de hDRR mediante el diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados, a partir de la secuencia aminoacídica de la proteína hDRR purificada o a través de síntesis de ADN usando cebadores específicos de secuencia derivados a partir de la secuencia de ADN genómico, se puede obtener un ADNc aislado.
Un juego de cebadores preferente está formado por el cebador directo de hDRR4 (CAGAATTCGCCACCATG
GATCCAACG-GTCTCAAC) (Identificador de secuencia N° 5) o un fragmento del mismo formado por los nucleótidos 15 a 34 del Identificador de secuencia N° 5, el cebador reverso de hDRR4 (GTCTCGAGTCACTGCT
CCAATCTGCTTCCC) (Identificador de secuencia N° 6) o un fragmento del mismo formado por los nucleótidos 9 a 30 del Identificador de secuencia N° 6, el cebador directo de hDRR7 (CGAATTCCGCCACCATGGATCCAAC
CACCCCGG) (Identificador de secuencia N° 13) y el cebador reverso de hDRR7 (GCTCTAGAGGCTGTCCATCTC
TACACCAGACTGC) (Identificador de secuencia N° 14). Si se desea, el ADNc de cadena doble se puede clonar en un vector adecuado, por ejemplo, un plásmido, originando así una genoteca de ADNC. Otro método es analizar la genoteca de ADNc construida en un bacteriófago o un vector plasmídico de transporte, con una sonda oligonucleotídica que se una a cualquier región adecuada del Identificador de secuencia N° 1 o Identificador de secuencia N° 11. Consulte, por ejemplo, PCR Protootros: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis y otros, Academic Press (1990).
Los métodos para construir genotecas de ADNc en un vector adecuado como un plásmido o un fago para su propagación en células procarióticas o eucarióticas son muy conocidos por los expertos en la materia. [Consulte p. ej., Maniatis y otros Supra]. Los vectores de clonación adecuados son muy conocidos y fácilmente disponibles.
Como pueden apreciar fácilmente aquéllos expertos en la materia, puede que otros tipos de genotecas, además de genotecas construidas a partir de otros tipos celulares, sean útiles para aislar las secuencias nucleotídicas según la invención. Otros tipos de genoteca incluyen, pero sin limitarse, genotecas de ADNc procedentes de otras células, otros organismos no humanos y ratón, y genotecas de ADN genómico que incluyen YAC (cromosoma artificial de levadura) y genotecas de cósmidos. La construcción de genotecas de ADN genómico se puede realizar mediante técnicas estándar muy conocidas en la técnica. Puede encontrar técnicas de construcción de ADN genómico muy conocidas en T. Maniatis y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. Chap. 14 (1989).
Los expertos en la materia apreciarán que, en muchos casos, una secuencia de ADNc aislada será incompleta, en la que la región codificadora del polipéptido se corta en el extremo 5' del ADNc. Se trata de una consecuencia de la transcriptasa inversa, un enzima que es de forma inherente muy poco procesativa (una medición de la capacidad del enzima de permanecer unida al molde durante la reacción de polimerización), que no puede completar una copia de ADN a partir del ARNm molde durante la síntesis de la primera hebra de ADNc.
Existen varios métodos disponibles y muy conocidos por los expertos en la materia para obtener ADNc de longitud completa, o ampliar las moléculas de ADNc cortas, por ejemplo, los basados en el método de Amplificación Rápida de Extremos de ADNc (RACE, por sus siglas en inglés) (Frohman y otros, 1988, PNAS USA 85, 8998-9002), o modificaciones más recientes de esta técnica.
Polipéptidos
La presente invención también se refiere al uso de las proteínas hDRR4 y/o hDRR7, o fragmentos funcionales de las mismas, en un ensayo que hace uso de la interacción de EPF o un péptido con al menos un 70% de identidad secuencia con EPF con un polipéptido hDRR4 y/o hDRR7. En formas de realización particulares, dicho polipéptido está codificado por las moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas descritas en la presente memoria descriptiva.
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En otro aspecto de la invención, la proteína hDRR es la hDRR4 seleccionada entre el grupo formado por:
i)
una proteína aislada y purificada que codifica hDRR4 que tiene la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma,
ii)
células que expresan en su superficie la proteína receptora con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma, o
iii)
preparaciones de membranas de células que expresan en su superficie el receptor polipeptídico con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma.
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En una forma de realización preferente, la proteína hDRR4 comprende la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o fragmentos funcionales de la misma. En una forma de realización más preferente, la proteína hDRR4 está formada por la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o fragmentos funcionales de la misma.
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En otro aspecto de la invención, la proteína hDRR es la hDRR7 seleccionada entre el grupo formado por:
i)
una proteína aislada y purificada que codifica hDRR7 con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma,
ii)
células que expresan en su superficie la proteína receptora con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma, o
iii)
preparaciones de membranas de células que expresan en su superficie el receptor polipeptídico con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma.
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En una forma de realización preferente, la proteína hDRR7 comprende la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o fragmentos funcionales de la misma. En una forma de realización más preferente, la proteína hDRR7 está formada por la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o fragmentos funcionales de la misma.
El término "fragmentos de la misma" describe una parte o subregión de la molécula de proteína cuya secuencia se describe en la presente memoria descriptiva, de modo que dicho fragmento comprenda 5 o más aminoácidos que estén contiguos en la proteína original. El término "fragmentos de la misma" pretende incluir "fragmentos funcionales" en los que el fragmento aislado, la parte o la subregión comprende una región distintiva desde un punto de vista funcional como un centro activo, un lugar de unión o un sitio de fosforilación de la proteína receptora. Los fragmentos funcionales se pueden producir con tecnología de clonación, o como productos naturales de técnicas de corte y empalme alternativas.
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En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de EPF o un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF en un ensayo según las reivindicaciones adjuntas. En una forma de realización preferente, el EPF o el péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF se seleccionan entre el grupo formado por:
i)
un polipéptido aislado que codifica el EPF, que comprende la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 4
ii)
un polipéptido aislado derivado de EPF y capaz de unirse a hDRR4;
iii)
un polipéptido aislado con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF que comprende la secuencia aminoacídica seleccionada entre el grupo formado por el entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, Identificador de secuencia N° 19, Identificador de secuencia N° 20 y Identificador de secuencia N° 21, o
iv)
un polipéptido aislado que comprende el fragmento de unión a hDRR4 y/o hDRR7 formado por la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 8.
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En una forma de realización más preferente de la presente invención, EPF está formado por la secuencia aminoacídica codificada por el Identificador de secuencia N°4 y un fragmento de EPF de unión a hDRR4 o un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF formado por que está formado por la secuencia aminoacídica seleccionada entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 Identificador de secuencia N° 21, o por un fragmento de unión a hDRR4 codificado por el Identificador de secuencia N° 8; y una secuencia de entre 16 y 21 aminoácidos con al menos un 70% de la identidad de secuencia con el Identificador de secuencia N° 8, Identificador de secuencia N° 18, Identificador de secuencia N° 19, identificador de secuencia N° 20 y/o Identificador de secuencia N° 21.
La proteína receptora y los péptidos según la invención incluyen todos los cambios aminoacídicos conservativos posibles, en donde "cambios aminoacídicos conservativos" se refiere a una sustitución de uno o más residuos aminoacídicos en una proteína receptora o péptido original sin que afecte a la actividad biológica de la molécula original basándose en la capacidad reconocida en la técnica de ciertos aminoácidos de ser sustituidos (véase p. ej., M. Dayhoff, In Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Supp 3, p. 345-352, 1978).
Los expertos en la materia podrán apreciar que los polipéptidos según la invención, es decir, la proteína hDRR4, la proteína hDRR7 y el EPF o los péptidos relacionados con EPF con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, pueden obtenerse con una variedad de técnicas del ADN recombinante, incluyendo, por ejemplo, hibridación, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), o síntesis de ADN de novo (véase T. Maniatis y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. Chap. 14 (1989)).
Los péptidos y derivados de la presente invención pueden prepararse fácilmente según los métodos de síntesis de péptidos, bien caracterizados, en fase líquida estándar o preferentemente, en fase sólida, dispone de muchas descripciones generales de dichos métodos, o pueden prepararse en solución, mediante el método en fase líquida o por cualquier combinación de química en fase sólida, fase líquida y solución.
A modo de ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden sintetizarse empleando N-a-9-fluoro-nilmetiloxicarbonilo o la química de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc usando un sintetizador peptídico Symphony Multiplex de Rainin.
El ciclo estándar usado para acoplar un aminoácido a la cadena creciente de péptido-resina generalmente incluye: (1) lavado del péptido-resina tres veces durante 30 segundos con N,N-dimetilformamida (DMF), (2) eliminación del grupo protector Fmoc del extremo amino, con desprotección con 20% de piperidina en DMF con dos lavados de 15 minutos cada uno, durante este proceso la mezcla se efectúa bombeando nitrógeno en el matraz de reacción un segundo durante 10 segundos para evitar que el péptido-resina sedimente, (3) lavado del péptido-resina tres veces durante 30 segundos con DMF, (4) acoplamiento del aminoácido al péptido-resina por la adición de volúmenes iguales de una solución 250 mM de derivado Fmoc del aminoácido apropiado y una mezcla de activación formada por N-metilmorfolino 400 mM y hexafluorofosfato de (2-(1H-benzotriazol-1-4))-1,1,3,3-tetrametiluronio (HHTU) 250 mM en DMF; (5) mezcla de la solución durante 45 minutos y (6) lavado del péptido-resina tres veces durante 30 segundos con DMF.
Este ciclo puede repetirse las veces necesarias con los aminoácidos apropiados en secuencia para producir el péptido deseado. Las excepciones a este ciclo son los acoplamientos de aminoácidos que teóricamente serán difíciles dada su naturaleza hidrófoba o la teórica inclusión en una formación helicoidal durante la síntesis. Para estas situaciones, el ciclo anterior puede modificarse repitiendo la etapa 4 una segunda vez inmediatamente después de haber completado el paso de acoplamiento de 45 minutos para un "acoplamiento doble" del aminoácido de interés. En la primera etapa de acoplamiento de la síntesis del péptido, la resina se deja hinchar para que permita un acoplamiento más eficiente al aumentar el tiempo de mezcla en los lavados con DMF iniciales hasta tres lavados de 15 minutos en lugar de tres lavados de 30 segundos.
Después de la síntesis, el péptido se puede cortar de la resina del siguiente modo: (1) lavado del péptido-resina tres veces durante 30 segundos con DMF, (2) eliminación del grupo protector Fmoc del extremo amino lavando dos veces durante 15 minutos en 20% de piperidina en DMF, (3) lavado del péptido-resina tres veces durante 30 segundos con DMF, y (4) mezclar un cóctel de corte formado por 95% de ácido trifluoroacético (TFA), 2,4% de agua, 2,4% de fenol, y 0,2% de triisopropilsilano con el péptido-resina durante dos horas, después filtrado del péptido en el cóctel de corte para separarlo de la resina y precipitación del péptido para aislarlo de la solución, agregando dos volúmenes de éter etílico.
Para aislar el péptido, puede dejar la solución de éter-péptido en reposo a -20°C durante 20 minutos, después la debe centrifugar a 6.000xG durante 5 minutos para precipitar el péptido. El péptido se puede lavar con éter etílico para eliminar los ingredientes del cóctel de corte residuales. El producto peptídico final se puede purificar por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa (RP-HPLC), consistiendo el disolvente primario en 0,1% de TFA y el tampón de elución en 80% de acetonitrilo y 0,1% de TFA. El péptido purificado se puede liofilizar en polvo.
Las proteínas hDRR biológicamente activas purificadas pueden tener diferentes formas físicas. Los polipéptidos según la invención pueden existir como polipéptidos nacientes de cadena completa o sin procesar, o como polipéptidos parcialmente procesados o combinaciones de polipéptidos procesados. Los polipéptidos nacientes de cadena completa pueden modificarse después de la traducción, entre otras formas, mediante cortes proteolíticos específicos que resultan en la formación de fragmentos del polipéptido naciente de cadena completa. Un fragmento, o asociación física de fragmentos puede tener una actividad biológica completa asociada con hDRR4 o hDRR7, sin embargo, el grado de actividad receptora puede variar entre los fragmentos de receptor individuales y fragmentos del polipéptido físicamente asociados.
Por lo tanto, la solicitud también proporciona polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 modificados que pueden contener deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos, pero que siguen conservando sustancialmente la misma actividad biológica, es decir, la capacidad de unión a EPF o péptidos relacionados con EPF, igual que el polipéptido hDRR nativo. Un polipéptido hDRR tiene "sustancialmente la misma actividad biológica" que el tipo natural si dicho polipéptido tiene una CE_{50} hacia el péptido relacionado con EPF codificado por la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 8, inferior a 10 veces, preferentemente 5 veces menor que el valor de CE50 del polipéptido hDRR para el mismo ligando. Para el hDRR4 se ha determinado un valor de CE50 que oscila entre 10,6 y 12 nM para el péptido relacionado con EPF formado por el Identificador de secuencia N° 8. Para el hDRR7 se ha determinado un valor de CE_{50} que oscila entre 345 y 82,9 nM para el péptido relacionado con EPF formado por el Identificador de secuencia N° 8.
La presente invención también proporciona anticuerpos monoclonales contra EPF y epítopos de EPF y péptidos relacionados con EPF que son fragmentos de EPF de unión a hDRR con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF según la invención, incluyendo, y enfocándose la solicitud a, líneas celulares de hibridomas que produzcan dichos anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos generados contra polipéptidos de la presente invención se pueden obtener administrando los polipéptidos o fragmentos que porten epítopos, o células a un animal, preferentemente un animal no humano usando los protocolos de rutina.
Los anticuerpos antes descritos se pueden emplear para purificar los polipéptidos según la invención por cromatografía de afinidad. Es también objeto de la presente invención proporcionar el uso de los anticuerpos antes mencionados en un método para diagnosticar un estado patológico en un sujeto con un trastorno relacionado con la actividad de hDRR4 y/o hDRR7 que comprende, la puesta en contacto de los anticuerpos con una muestra del ensayo en la que dicha muestra preferentemente son fluidos corporales como sangre, saliva, semen, líquido cefalorraquídeo, plasma o linfa, y la medición de la reactividad de dichos anticuerpos en la muestra del ensayo.
La reactividad de los anticuerpos en una muestra se puede determinar con los medios apropiados. Una posibilidad es etiquetar con moléculas indicadoras individuales. Dichas moléculas indicadoras puede generar directa o indirectamente señales detectables y preferentemente medibles.
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Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:
i) un polipéptido seleccionado entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, Identificador de secuencia N° 19, Identificador de secuencia N° 20 y el Identificador de secuencia N° 21, o el fragmento de unión a hDRR4 y/o hDRR7 codificado por el Identificador de secuencia N° 8, o una secuencia de entre 16 y 21 aminoácidos con al menos un 70% de identidad de secuencia con el Identificador de secuencia N° 8, 18, 19, 20 y 21; o
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ii) un anticuerpo contra un polipéptido seleccionado entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, el Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 y el Identificador de secuencia N° 21, o del fragmento de Identificador de secuencia N° 8 de unión a hDRR4 y/o hDRR7.
Puede apreciarse que dicho kit, i) o ii) puede comprender un componente sustancial. Dicho kit se usará para diagnosticar una enfermedad o la susceptibilidad de padecer una enfermedad, particularmente las enfermedades de la invención.
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Expresión recombinante de los polipéptidos hDRR
Un aspecto importante de muchos ensayos es la etapa de expresión de un hDRR recombinante en la superficie de una célula anfitriona. Por lo tanto, otro aspecto descrito en la presente memoria descriptiva se refiere a vectores de expresión de hDRR que pueden usarse en un ensayo según la invención.
Los vectores de expresión en la presente memoria descriptiva se definen como secuencias de ADN necesarias para la transcripción de copias de genes clonados y la traducción de su ARNm en la célula apropiada. Dichos vectores se pueden usar para expresar genes eucarióticos en una variedad de células anfitrionas como bacterias, incluyendo E. coli, cianobacterias, células vegetales, células de insecto, células fúngicas incluyendo células de levadura y células animales, incluyendo células humanas.
Los vectores específicamente diseñados permiten el transporte del ADN entre células anfitrionas como bacterias-levaduras o bacterias-células animales o bacterias-células fúngicas o bacterias-células de invertebrados. Un vector de expresión correctamente construido puede contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en las células anfitrionas, marcadores de selección, un número limitado de sitios de restricción útiles, un potencial para alcanzar un alto número de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige a la ARN polimerasa para que se una al ADN e inicie la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es uno que se el ARNm se inicie con una alta frecuencia. Los vectores de expresión puede incluir, pero si limitarse a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos o virus específicamente diseñados.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas que codifican hDRR4 o hDRR7 pueden clonarse en un vector de expresión para expresarlas en una célula anfitriona recombinante. Las células anfitrionas recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias como E. coli, células fúngicas, como levaduras, células de mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, líneas celulares humanas, bovinas, porcinas, de mono o de roedor, y células insecto, incluyendo, pero sin limitarse a, líneas celulares de Drosophila y gusano de seda. Las líneas celulares derivadas de especies de mamífero que pueden ser idóneas y que están comercializadas, incluyen, pero sin limitarse a, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, neuroblastoma, células gliales, y HEK-293 (ATCC CRL1573).
Por lo tanto, en otra forma de realización, la presente invención se refiere al uso de células anfitrionas recombinantes con una molécula de ácido nucleico clonada recombinantemente que codifica una proteína hDRR4 y/o hDRR7 o fragmentos de las mismas como se describe en las reivindicaciones adjuntas. En otro aspecto, la célula anfitriona recombinante contiene una molécula de ácido nucleico que es ADN genómico o tiene una secuencia nucleotídica formada por: (Identificador de secuencia N° 1), y fragmentos de la misma.
En una forma de realización más preferente de la presente invención, la célula anfitriona recombinante está formada por las células HEK293 que comprenden la secuencia nucleotídica de Identificador de secuencia N° 1 o fragmentos de la misma, en el vector de expresión en mamíferos pcDNA3.
El vector de expresión se puede introducir en las células anfitrionas utilizando varias técnicas, incluyendo, pero no se limitan a, transformación, transfección, fusión de protoplastos, lipofección y electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se propagan como clones y se analizan para determinar si producen la proteína hDRR4. La identificación de los clones celulares que expresan el receptor puede realizarse de diferentes formas, que incluyen, pero no se limitan a, reactividad inmunológica con anticuerpos dirigidos contra el polipéptido según la invención, y la presencia de actividad hDRR4 asociada a la célula anfitriona.
Las proteínas de la presente invención se pueden sintetizar por expresión directa o como una proteína de fusión que comprende la proteína de interés como fusión traduccional con otra proteína o péptido que pueda cortarse, enzimáticamente o químicamente. Por lo tanto, en una forma de realización particular, la presente invención proporciona las proteínas según la invención en la que dichos polipéptidos forman parte de una proteína de fusión.
Además, se podrían utilizar, p ej., una célula de mamífero que ya incluyera en su genoma una molécula de ácido nucleico que codificara un polipéptido DRR como se describe anteriormente, pero que no lo expresara o no de forma apropiada, debido, p. ej., a un promotor débil, e introducir en la células de mamífero una secuencia reguladora como un promotor fuerte muy cerca de la molécula de ácido nucleico endógena que codifica dicho polipéptido receptor de modo que se indujera la expresión del mismo.
En la presente memoria descriptiva también se describe dicha célula anfitriona recombinante que contiene un polinucleótido que codifica un polipéptido DRR bajo el control de una transcripción heteróloga o una secuencia o proteína regulador.
En este contexto, el término "secuencia reguladora" denota una molécula de ácido nucleico que se puede usar para aumentar la expresión del polipéptido receptor DRR, debido a su integración en el genoma de una célula muy cerca del gen que codifica el receptor DRR. Dichas secuencias reguladoras comprenden promotores, potenciadores, secuencias intrónicas silenciadoras inactivadas, regiones codificadoras 3'UTR y/o 5'UTR, elementos de estabilización de proteínas o ARN, moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína reguladora, p. ej., un factor de transcripción, capaz de inducir o activar la expresión del gen del receptor DRR u otros elementos de control de o la expresión génica que se sepa que activan la expresión génica y/o aumenta la cantidad de producto génico. La introducción de dicha secuencia reguladora deriva en el aumento y/o inducción de la expresión de polipéptidos receptores DRR, lo que finalmente supone un aumento de polipéptidos receptores DRR en la célula. De este modo, la presente invención tiene por objeto proporcionar de novo polipéptidos receptores DRR y/o un aumento de la expresión de dichos polipéptidos receptores.
La introducción de la construcción en la célula anfitriona puede alterarse con una transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transfección, infección u otros métodos. Dichos métodos están descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, como Davis, Basic Methods In Molecular Biology (1986).
Además, la expresión de polinucleótidos según la invención se puede realizar usando ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético o el ARNm aislado de células que produce hDRR, puede traducirse eficientemente en varios sistemas no celulares, incluyendo, pero si limitarse a, extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como puede traducirse eficientemente en sistemas celulares, incluyendo, pero si limitarse a, microinyección en ovocitos de rana o sapo, (Xenopus laevis), prefiriéndose generalmente la microinyección en ovocitos de sapo.
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Ensayos
Los ensayos de la presente invención pueden diseñarse de muchas formas, generalmente conocidas en la técnica de selección de compuestos por su actividad biológica o para unión a receptores.
Los polipéptidos de la presente invención son responsables de una o más funciones biológicas, incluyendo una o más patologías, en particular, las enfermedades antes mencionadas. Por lo tanto, es deseable idear métodos de análisis para identificar compuestos que estimulen o que inhiban la función de los hDRR.
Los ensayos de la presente invención aprovechan ventajosamente el hecho de que EPF o un péptido relacionado con EPF con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF sean ligandos de más afinidad por los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 y activen a hDRR4 y/o hDRR7 al unirse a hDRR4 y/o hDRR7.
Por lo tanto, la presente invención incluye métodos para identificar compuestos que se unan específicamente a los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7, en la que dichos compuestos pueden ser ligandos, agonistas o antagonistas de los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7. Los métodos de ensayo de la presente invención difieren de los descritos en la técnica debido a que los presentes ensayos incorporan al menos un paso en el que la interacción de EPF o de los péptidos relacionados con EPF con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, con hDRR4 y/o hDRR7 se incorpora en el ensayo. La especificidad de unión se puede demostrar midiendo la afinidad de los compuestos por células que expresan los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 en su superficie o la afinidad por las membranas de dichas células que expresan los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 en su superficie.
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De este modo, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de unirse a los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 que comprende:
a)
incubación de una fuente que contiene hDRR4 y/o hDRR7 o un fragmento funcional de los mismos, con
i)
EPF o un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF
ii)
dicho compuesto de estudio y
b)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de EPF o péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, unido al receptor, y
c)
selección del compuesto de estudio que en la etapa b) se haya descubierto que influye más en la cantidad de EPF o péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF unido al receptor.
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En una forma de realización preferente, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de unirse a hDRR4, que comprende:
a)
incubación de una fuente que contiene hDRR4 o un fragmento funcional del mismo, con
i)
EPF o un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF
ii)
dicho compuesto de estudio y
b)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de EPF o péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, unido al receptor, y
c)
selección del compuesto de estudio que en la etapa b) se haya descubierto que influye más en la cantidad de EPF o péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF unido al receptor.
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En otra forma de realización de la invención, la fuente que contiene hDRR4 está seleccionada entre el grupo formado por:
i)
una proteína aislada y purificada que tiene la secuencia aminoacídica del Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento de la misma.
ii)
células que expresan en su superficie el polipéptido receptor con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma, o
iii)
preparaciones de membrana de células que expresan en su superficie el polipéptido receptor con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma.
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En otra forma de realización preferente, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de unirse a hDRR7, que comprende:
a)
incubación de una fuente que contiene hDRR7 o un fragmento funcional del mismo, con
i)
EPF o un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF
ii)
dicho compuesto de estudio y
b)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de EPF o péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, unido al receptor, y
c)
selección del compuesto de estudio que en la etapa b) se haya descubierto que influye más en la cantidad de EPF o péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF unido al receptor.
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En otra forma de realización de la invención, la fuente que contiene hDRR7 está seleccionada entre el grupo formado por:
i)
una proteína aislada y purificada que tiene la secuencia aminoacídica del Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento de la misma.
ii)
células que expresan en su superficie el polipéptido receptor con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma, o
iii)
preparaciones de membrana de células que expresan en su superficie el polipéptido receptor con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma.
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El método de selección puede medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o a células o membrana que expresen el polipéptido, o una proteína de fusión de la misma por medio de una etiqueta directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Alternativamente, el método de selección puede implicar la competición con un competidor marcado. En una forma de realización preferente, este competidor marcado es un ligando que se sabe que se une a hDRR4 y/o hDRR7 como EPF, también conocido como chaperonina 10, o un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF. En otra forma de realización dicho péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF está formado por un fragmento de unión a hDRR4 formado por el Identificador de secuencia N° 8 o los péptidos con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF formados por el Identificador de secuencia N° 18, el Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 o el Identificador de secuencia N° 21, o de una secuencia de entre 16 y 21 aminoácidos con al menos un 70% de identidad de secuencia con los identificadores de secuencia N° 8, 18, 19, 20 y/o 21.
Por lo tanto, en una forma de realización más preferente, el método de selección comprende el EPF marcado o un péptido marcado, con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, en el que dicha etiqueta se usa para medir el efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de EPF o péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF que se une al receptor.
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Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de unirse a hDRR4, que comprende:
i)
preparaciones de membrana de células, preferentemente células HEK293, que expresan en su superficie el polipéptido receptor con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2;
ii)
incubación de dichas membranas con un péptido relacionado con EPF marcado, con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, que preferentemente comprende una secuencia aminoacídica codificada por el Identificador de secuencia N° 8, el Identificador de secuencia N° 18, el Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 o el Identificador de secuencia N° 21, preferentemente un péptido relacionado con EPF iodado formado por el Identificador de secuencia N° 8;
iii)
adición del compuesto de estudio a la mezcla de incubación; y
iv)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de péptido relacionado con EPF marcado, con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, unido al receptor hDRR4.
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Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de unirse a hDRR7, que comprende:
i)
preparaciones de membrana de células, preferentemente células HEK293, que expresan en su superficie el polipéptido receptor con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12;
ii)
incubación de dichas membranas con un péptido relacionado con EPF marcado, con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, que preferentemente comprende la secuencia aminoacídica codificada por las secuencias de Identificador de secuencia N° 8, el Identificador de secuencia N° 18, el Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 o el Identificador de secuencia N° 2, preferentemente un péptido relacionado con EPF iodado formado por el Identificador de secuencia N° 8;
iii)
adición del compuesto de estudio a la mezcla de incubación; y
iv)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de péptido relacionado con EPF marcado, con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, unido al receptor hDRR7.
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Además, estos métodos de selección pueden comprobar si el compuesto candidato produce una señal generada por activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para las células que expresan el polipéptido. Los inhibidores de la activación, generalmente se ensayan en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto de la activación por el agonista debido a la presencia del compuesto candidato. En los métodos de selección se pueden emplear polipéptidos receptores activados de forma constitutiva para agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o un inhibidor, comprobando si el compuesto candidato produce una inhibición o una activación del polipéptido.
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Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de modular la actividad hDRR4 y/o hDRR7, que comprende:
a)
incubación de una fuente que contiene hDRR4 y/o hDRR7 o fragmentos funcionales de los mismos, con dicho compuesto de estudio;
b)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR4 y/o hDRR7; y
c)
comparación de este efecto con la actividad de hDRR4 y/o hDRR7 al unirse a EPF o a un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF.
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En otra forma de realización de la presente invención, la fuente que contiene el hDRR4 y/o hDRR7 en un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de modular la actividad de los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7, es una célula que expresa en su superficie el receptor polipeptidico con la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o de Identificador de secuencia N° 12. En una forma de realización preferente, dicha célula puede ser una célula anfitriona con una molécula de ácido nucleico recombinante clonada que codifica una proteína hDRR4 o hDRR7 o fragmentos de las mismas tal y como se proporcionan en los métodos antes descritos. El efecto del modulador sobre los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 puede ser la modulación de un mensajero secundario intracelular, cuya formación, mediada por hDRR4 y/o hDRR7, como calcio intracelular, AMPc, o el producto de un gen indicador, perteneciendo hDRR4 y/o hDRR7 a la clase de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteínas G (GPCR, por sus siglas en inglés). Los GPCR transmiten señales por la membrana celular cuando se une el ligando. El ligando unido al GPCR activa una cascada de señales intracelular mediada por proteínas G heterotriméricas, como la activación de la ruta de la adenilato ciclasa o la activación de la ruta de la fosfolipasa C-\beta. Los ensayos para evaluar la activación de las cascadas de señales intracelulares antes mencionadas, normalmente se conocen en la técnica e incluyen entre otros, los ensayos celulares de transducción de señales que comprenden factores de transcripción inducibles por ligandos quiméricos, ensayos de unión de receptores acoplados a proteínas G usando análisis de distribución de intensidad de fluorescencia, ensayos de recuento celular usando nucleótidos cíclicos acoplados a luminóferos o medición de respuestas de receptores acoplados a proteína G usando un ensayo indicador dirigido por un elemento de respuesta múltiple o un elemento de respuesta a AMPc. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de modula la actividad de hDRR4, que comprende:
a)
incubación de una fuente que contiene hDRR4 o fragmentos funcionales del mismo, con dicho compuesto de estudio;
b)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR4 y
c)
comparación de este efecto con la actividad de hDRR4 al unirse a EPF o a un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF.
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En una forma de realización preferente, la presente solicitud describe un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de modular la actividad de hDRR4 formado por:
a)
células anfitrionas, preferentemente células 1 HEK293, cotransfectadas con un vector de expresión en mamífero, preferentemente pcDNA3, que codifique la proteína hDRR4, formado por el Identificador de secuencia N° 2 y un vector de expresión en mamífero, preferentemente pcDNA3, que codifique Gal16, formado por el Identificador de secuencia N° 10
b)
carga de las células con un colorante fluorescente sensible al calcio como Fura-2, FLUO-3 o FLUO-4, preferentemente FLUO-3 o FLUO-4;
c)
incubación de las células con el compuesto de estudio;
d)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR4 como un cambio en las unidades de fluorescencia relativas del colorante fluorescente sensible al calcio, y
e)
comparación del efecto con la actividad de hDRR4 al unirse al EPF o a péptidos relacionados con EPF.
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En otra forma de realización preferente descrita en la presente memoria descriptiva, el método para identificar y obtener un compuesto capaz de modular la actividad del hDRR4, está formado por:
a)
las células anfitrionas, preferentemente células HEK293 transfectadas con un vector de expresión en mamífero, preferentemente pcDNA3, que codifica la proteína hDRR4 formada por el Identificador de secuencia N° 2;
b)
carga de las células con un colorante fluorescente sensible al calcio como Fura-2, FLUO-3 o FLUO-4, preferentemente FLUO-3 o FLUO-4, preferentemente FLUO-4;
c)
incubación de las células con el compuesto de estudio;
d)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR4 como un cambio en las unidades de fluorescencia relativas del colorante fluorescente sensible al calcio, y
e)
comparación del efecto con la actividad de hDRR4 al unirse al EPF o a péptidos relacionados con EPF.
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Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de modular la actividad de hDRR7, que comprende:
a)
incubación de una fuente que contiene hDRR7 o fragmentos funcionales del mismo, con dicho compuesto de estudio;
b)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR7 y
c)
comparación de este efecto con la actividad de hDRR7 al unirse a EPF o a un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF.
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En una forma de realización preferente, la presente solicitud describe un método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de modula la actividad de hDRR7 formado por:
a)
células anfitrionas, preferentemente células HEK293, cotransfectadas con un vector de expresión en mamífero, preferentemente pcDNA3, que codifique la proteína hDRR7, formado por el Identificador de secuencia N° 12 y un vector de expresión en mamífero, preferentemente pcDNA3, que codifique G\alpha16, formado por el Identificador de secuencia N° 10
b)
carga de las células con un colorante fluorescente sensible al calcio, preferentemente FLUO-4;
c)
incubación de las células con el compuesto de estudio;
d)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR7 como un cambio en las unidades de fluorescencia relativas del colorante fluorescente sensible al calcio, y
e)
comparación del efecto con la actividad de hDRR7 al unirse al EPF o a péptidos relacionados con EPF.
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En otra forma de realización preferente descrita en la presente memoria descriptiva, el método para identificar y obtener un compuesto capaz de modular la actividad del hDRR7, está formado por:
a)
las células anfitrionas, preferentemente células HEK293 transfectadas con un vector de expresión en mamífero, preferentemente pcDNA3, que codifica la proteína hDRR7 formada por el Identificador de secuencia N° 12;
b)
carga de las células con un colorante fluorescente sensible al calcio, preferentemente FLUO-4;
c)
incubación de las células con el compuesto de estudio;
d)
medición del efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR7 como un cambio en las unidades de fluorescencia relativas del colorante fluorescente sensible al calcio, y
e)
comparación del efecto con la actividad de hDRR7 al unirse al EPF o a péptidos relacionados con EPF.
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Como podrán apreciar con claridad aquellos expertos en la materia, el descubrimiento de la interacción del EPF o un péptido con al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF con hDRR4 y/o hDRR7 también puede usarse en un método para la base estructural o el diseño racional de un agonista o antagonista del polipéptido:
a)
marcando la estructura del lugar de unión a ligandos de hDRR a EPF o derivados del EPF.
b)
identificación de los átomos de contacto del lugar de unión a ligando del hDRR que interaccionan con el ligando EPF durante la unión,
c)
diseño de compuestos de estudio que interaccionen con los átomos identificados en (b) para modular la actividad de hDRR, y
d)
puesta en contacto de dicho compuesto de estudio con una fuente que contiene hDRR o un fragmento funcional del mismo, para medir la capacidad de dicho compuesto de modular la actividad de hDRR.
Esto se observará mejor que si fuera normalmente un proceso iterativo.
Uso terapéutico
En general, pueden emplearse agonistas o antagonistas con fines terapéuticos y preventivos para dichas enfermedades como las antes mencionadas. Los compuestos se pueden identificar a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, células, preparaciones sin células, librerías químicas y mezclas de productos naturales. Dichos agonistas o antagonistas así identificados, pueden ser péptidos naturales o modificados, ligandos, enzimas, etc, como puede ser, del polipéptido receptor, puede ser una copia estructural o funcional del mismo (ver Coligan y otros, Current Protootros in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991)).
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Por lo tanto, la presente solicitud describe el uso de EPF, fragmentos de EPF o péptidos relacionados con EPF como medicamento y en el que dicho EPF, fragmento de EPF o péptido relacionado con EPF es un agonista del hDRR, para su uso en el tratamiento del dolor o en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias como artritis reumatoide, esclerosis múltiple u otras dolencias en las que es deseable adoptar medidas inmunosupresoras como en la enfermedad inflamatoria intestinal IBD o para prevenir el rechazo en transplantes, dicho EPF, fragmento de EPF o péptido relacionado con EPF puede estar formado el fragmento de unión a hDRR codificado por el Identificador de secuencia N° 8 o un péptido relacionado con EPF, es decir, formado por un polipéptido seleccionada entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, el Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 o el Identificador de secuencia N° 21. La composición para uso en métodos terapéuticos descrita en la presente memoria descriptiva se adaptará a la vía de administración, por ejemplo, por vía sistémica o vía oral. Las formas de administración sistémica preferentes incluyen la inyección, típicamente una inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de inyección, como la subcutánea, la intramuscular o la intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen la administración transmucosa y transdérmica usando penetrantes como sales biliares, ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención se pueden formular en una formulación entérica o encapsulada, la administración oral también puede ser una posibilidad. La administración de estos compuestos también puede se vía tópica y/o localizada, en forma de parches, ungüentos, cremas, geles y similares.
El intervalo de dosis necesaria depende de la elección del péptido u otros compuestos de la presente invención, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la dolencia del sujeto y la valoración de su médico. Sin embargo, las dosis idóneas, oscilan de 0,1 a 0,100 \mug/kg de sujeto. Sin embargo, pueden esperarse mayores variaciones en la dosis necesaria, en vista de la variedad de compuestos disponibles y de las diferentes eficiencias de las diferentes vías de administración. Por ejemplo, cabe esperar una dosis mayor en la administración por vía oral que en la inyección por vía intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas estándar de optimización, ya que son muy conocidas en la técnica.
La presente invención se comprenderá mejor gracias a los siguientes detalles experimentales, pero aquellos expertos en la materia apreciarán rápidamente que éstos son meramente ilustrativos de la invención, descrito esto con más detalle en las reivindicaciones que aparecen más adelante.
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Ejemplo 1 Clonación y caracterización funcional del hDRR4 GPCR Materiales y métodos Materiales
Polimerasa Expand de gran fidelidad, tampón para PCR, T4 ADN ligasa y endonucleasas de restricción de Boehringer (Mannheim, Alemania). Los oligonucleótidos se adquirieron a Eurogentec (Seraing, Bélgica). Los kits de preparación de plásmidos y el kit de amplificación de PCR Qiaquick son de Qiagen (Hilden, Alemania). Los kits de secuenciación PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing y los secuenciadores ABI 377 o 373A son de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). El sistema de PCR Geneamp PCR System 9600 es de Perkin-Elmer (Norwalk, CT, EE.UU.). El vector de expresión en mamífero pcDNA3 se compró a Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal de ternero y el suero fetal de ternero dializado son de Life Technologies (Gaithersburg, MD, EE.UU.).
Secuenciación del ADN
La secuenciación del ADN se realizó con los reactivos del kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Biosystems) en equipos PTC-200 PCR (MJ Research). Los productos de reacción se purificaron con las columnas del kit SEQueaky Kleen 96 well Terminator Removal (BioRad) y se resolvieron en un secuenciador de ADN ABI377. Para el análisis de las secuencias se utilizó el software Sequencher de GeneCodes (Ann Harbor, MI).
Clonación de hDRR4
Se realizó una PCR sobre una genoteca genómica humana en cósmidos (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) usando un cebador directo (GGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG) y un cebador reverso (GTCTC
GAGTCACTGCTC-CAATCTGCTTCCC). Los productos de PCR resultantes se clonaron con la ayuda del kit TOPO TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La cadena completa se insertó en pauta de lectura en el vector de expresión en mamífero pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se utilizó en los posteriores experimentos de selección.
Clonación de hDRR7
Se realizó una PCR sobre una genoteca genómica humana en cósmidos (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) usando un cebador directo para hDRR7 (CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG) (Identificador de secuencia N° 13) y el cebador reverso de hDRR7 (GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC) (Identificador de secuencia N° 14). El producto de PCR resultante se insertó en el vector de expresión en mamífero pcDNA3 EE.UU.) y se utilizó en los posteriores experimentos de selección.
Expresión transitoria en células de mamífero y ensayo FLIPR
El plásmido de expresión de hDRR4 o el plásmido de expresión de hDRR7 se contransfectaron transitoriamente con una construcción pcDNA3-G\alpha16 usando el reactivo FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) en células HEK293. Las células se cargaron con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) según las recomendaciones del proveedor. Posteriormente, se analizaron las células en el instrumento FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) para estudiar los aumentos transitorios del Ca2+ intracelular.
Preparación de extractos de tejido y fraccionamiento de los extractos
Se homogeneizaron cinco kilos de hipotálamo porcino y se extrajeron en metanol/agua/ácido acético, 90/9/1, v/v/v. Después de centrifugar, se eliminaron los lípidos del sobrenadante con una extracción con n-hexano y la fase acuosa se fraccionó con un fraccionador Megabondelute. El material que eluye con un 50% de acetonitrilo/H_{2}O se volvió a fraccionar en una columna de HPLC C18. Se analizó la capacidad de activación de hDRR4 GPCR de las fracciones derivadas en el ensayo FLIPR. La fracción Megabondelute que eluye con 0 a 60% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético acuoso (0,1%) se fraccionaron además en una columna C18 DeltaPak de preparación (Waters Ass., 25x100 mm, 15 \mum, 300). Se analizó la capacidad de activación de hDRR4 GPCR de las fracciones derivadas en el ensayo FLIPR. Los pasos posteriores de purificación en una C18 Hypersil de preparación, una columna C18 Symmetry analítica (4,6 x 250 mm), una columna C18 Xterra de calibre estrecho (2,1 x 250 mm), una columna C18 Xterra de calibre estrecho (2,1 x 250 mm) y finalmente, una columna C18 Symmetry de calibre estrecho (2,1 x 250 mm) se siguieron también por un ensayo de actividad FLIPR de las fracciones que activan a las células transfectadas con hDRR4.
Espectrometría de masas y secuenciación basada en la degradación de Edman
La espectrometría de masas de ionización por electronebulizacion (ESI, por sus siglas en inglés), de doble cuadrupolo (Qq), con aceleración ortogonal y tiempo de vuelo (Tof) se realizó en un sistema Q-Tof (Micromass Reino Unido). La molécula activa se identificó con un análisis de fragmentos usando disociación inducida por colisión (CID, por sus siglas en inglés). Se cargó un \mul de acetonitrilo/agua/ácido fórmico (50/49,9/0,1; v,v,v) con la fracción activa en un capilar recubierto de oro (aguja Protana L/Q). El voltaje de la aguja se ajustó a 900 V, el cono de muestreo a 25 V. La muestra se nebulizó a una velocidad de aproximadamente 25 nl/min dando tiempos de análisis ampliados durante la EM, además puede adquirirse un espectro EM/EM. Durante la EM/EM o la espectrometría de masas en tándem, se generan iones de fragmentos generados a partir de un ion precursor seleccionado por disociación inducida por colisión (CID), la energía de colisión típicamente varía de 20 a 35 V. El gas de colisión usado fue el argón. La secuencia aminoacídica del extremo N terminal del péptido purificado se obtuvo en un microsecuencaidor Procise 492 de Perkin Elmer/Applied Biosystems en modo pulsado.
Preparación de membranas
Las membranas se prepararon como fracciones de partículas totales. Las líneas celulares se cultivaron a 90% de confluencia en placas de petri de 145 mm y se trataron con butirato de sodio 5 mM, 24 horas antes de recogerlas. El medio de cultivo se retiró y se lavaron las células dos veces con solución salina con tampón fosfato enfriado en hielo (PBS sin Ca^{2+} y Mg^{2+}), se rasparon de las placas en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 y se recogieron por centrifugación (10 minutos a 16.000 rpm a 4°C). El sedimento celular se resuspendió en tampón Tris-HCl, hipotónico, pH 7,4 y se homogeneizaron con una homogeneizador Ultra Turrax. El homogeneizado se centrifugó a 18.000 rpm durante 20 minutos a 4°C. El sedimento final se resuspendió en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 y se guardó en alícuotas a -70°C. Se realizó una determinación de proteína usando el ensayo de proteínas Bradford (Biorad) usando seroalbúmina bovina (BSA).
Unión a adenina [H^{3}]
Los experimentos de unión a adenina[H^{3}] se realizaron para caracterizar las líneas celulares tansfectadas transitoriamente. Se congelaron las membranas en hielo y se diluyeron en tampón HEPES 50 mM, pH 7,4 complementado con MgCl_{2} 10 mM y EGTA 1 mM. La unión no específica se definió en presencia de adenina 1 \muM, y se descubrió que una hora de incubación a 25°C con adenina [H^{3}] (actividad específica de 30,4 Ci/mmol), era óptima para los ensayos de unión y competición. Los ensayos que se realizaron en un volumen final de 500 \mul, usando 20 \mug de proteína de membrana para las células COS transfectadas como para las naturales. La reacción se detuvo con una filtración rápida a través de filtros Whatman GF/B usando un recogedor de células multicanal Brandel (96 pocillos). Los filtros se lavaron tres veces con 3 ml de tampón HEPES 50 mM enfriado en hielo, pH 7,4, se transfirieron a viales de centelleo líquido y se agregaron 3 ml de líquido de centelleo (Ultima Gold MV). Se contaron las muestras en un contador de centelleo \beta después de al menos 6 horas para permitir que los filtros de fibra de vidrio se hicieran translúcidos uniformemente.
La inhibición competitiva de adenina[H^{3}] con adenina se realizó con 15 nM de adenina[H^{3}].
La unión específica se calculó como la diferencia entre los recuentos en presencia y ausencia de adenina 1 \muM sin marcar.
Verificación de los niveles de expresión a través de PCR cuantitativa en tiempo real
Se obtuvo ARN de varios tejidos de Clontech salvo el ARN de los ganglios de la raíz dorsal que se obtuvo de Analytical Biological Services. Los cebadores SDS y las sondas TaqMan para el gen hDRR4 se diseñaron usando el software PrimerExpress 1.0 (Perkin Elmer, MA, EE.UU.). Los cebadores SDS directo y reverso para el gen hDRR4 fueron respectivamente 5'-GCGCAGGAACGCCTTCT-3' (Identificador de secuencia N° 22) y 5'-CGGCCGCTGAG
GAAGAG-3' (Identificador de secuencia N° 23). La sonda TaqMan para hDRR4 (5'-TCCTCAACTTGGCCGCAG
CAGA-3') (Identificador de secuencia N° 24) se diseñó usando el software PrimerExpress 1.0 (Perkin Elmer, MA, EE.UU.) y se pueden escoger de la cadena superior o de la cadena inferior de la secuencia objetivo. La sonda TaqMan hDRR4 se marcó con un fluoróforo indicador, 6-carboxifluoresceina (FAM) en el extremo 5'.
El ADNc se sintetizó usando la transcriptasa inversa Superscript II. La RT se realizó durante 60 min a 42°C en un baño de agua. La reacción se detuvo calentando a 70°C durante 10 min. La amplificación por PCR se hizo después en placas de reacción de 96 pocillos de MicroAmp Optical durante 50 ciclos, siendo cada ciclo de 95°C durante 15 s; y 60°C durante 1 min. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado usando el ABI Prism 7700 SDS. La expresión relativa de hDRR4 en los tejidos analizados se comparó con la expresión de la ciclofilina A.
Resultados Generación y secuencia del ADNc de hDRR4
Después de realizar la PCR con la genoteca de cósmidos de genoma de humanos, sólo se obtuvo un producto de PCR. La secuenciación del producto de PCR demostró una fuerte similitud con la secuencia de hDRR3 (97% de identidad aminoacídica) y hDRR4 (99% de identidad aminoacídica) (Patente W9932519). Sin embargo, la secuencia era idéntica a una extensión de la secuencia en una entrada de la base de datos EMBL (AC023078). Llegamos a la secuencia nucleotídica y aminoacídica descrita en la figura 1.
La secuencia descrita en la figura 1 se analizó por búsqueda BLAST (Altschul y otros, 1997) para examinar si se podrían encontrar GPCR relacionados con ligandos conocidos. Los homólogos más próximos de este GPCR huérfano que se encontraron, fue el GPCR RC56.3.1 recientemente identificado en nuestro laboratorio como un receptor de adenina. No se describieron ligandos para otros receptores relacionados con hDRR4. Se trata de una familia de GPCR humanos (entrada números Z10067, Z10068, Z10069, Z10070 Z10071 y Z10072 de la base de datos de secuencias Derwent), clonados a partir de ganglio de raíz dorsal que tenían entre 79% y 99% de residuos en común con hDRR4 de GPCR. Otro homólogo muy conocido es el protooncogen mas que comparte un 38% de residuos con hDRR4.
Nuestro primer enfoque fue analizar la adenina y otros compuestos relacionados estructuralmente, especialmente purinas en hDRR4, en ensayos celulares tipo FLIPR. Esto se realizó con transfecciones transitorias en células HEK293 con y sin la transfección proteínas G quiméricas o la proteína G G\alpha16 heterogénea. En estos ensayos no se observó una respuesta específica. En un experimento de unión usando adenina tritiada no se pudo detectar una unión específica de la adenina a hDRR4, mientras que las células RC56.1.3 transfectadas demostraron una unión clara de la adenina. Dado que este enfoque no nos aportó ninguna pista sobre el ligando natural de este receptor, para identificar el ligando natural aplicamos la estrategia de la "farmacología inversa".
Purificación del agonista natural de hDRR4 a partir de hipotálamo porcino
En esencia, se preparó un extracto a partir de un tejido que se sabe es rico en péptidos de secreción, p. ej., hipotálamo y la purificación del ligando natural se siguió de un ensayo celular basado en la activación del GPCR huérfano como se describe en Materiales y métodos.
El estudio del extracto de hipotálamo porcino después del primer fraccionamiento en una columna C18 ofreció un intervalo de fracciones que resultó en una liberación intracelular transitoria de Ca^{2+} en las células transfectadas transitoriamente con la construcción de expresión de hDRR4. Éste fue el caso para las células HEK293 cotransfectadas transitoriamente con una construcción de expresión de G\alpha16 (figura 2), pero no el de las células HEK293 naturales (datos no mostrados). Se escogieron dos de estas fracciones, número 65 y 66, que produjeron la mayor estimulación, para realizar subfraccionamientos adicionales y procesarlas como se describe en Materiales y métodos. La purificación se guió por la el ensayo basado en la actividad FLIPR y la fracción que mostró actividad desde el último ciclo de columna se sometió a una espectrometría de masas para determinar la pureza así como la estructura de los compuestos que contenía.
Identificación de la sustancia de activación de hDRR4 mediante espectrometría de masas
En análisis de masas de la fracción purificada activa de la columna C18 Symmetry (4,6 x 250 mm; 5 \mum, Waters) de fase inversa proporcionó un pico de masa principal a 2163 Da (2164.7 M+H^{+}). El perfil de elución de la fracción activa en las diferentes columnas de HPLC indicó que el compuesto de activación del receptor era un péptido. Por lo tanto, esta masa se analizó posteriormente por secuenciación basada en degradación de Edman. Se demostró que la secuencia era:
AFRKFLPLFDRVLVERSA
(en anotación de aminoácidos con una sola letra).
Efecto de la sustancia activadora de hDRR4 en el ensayo celular tipo FLIPR
Se midió la activación del hDRR4 de GPCR huérfano (Identificador de secuencia N° 2) por el fragmento de EPF de unión a hDRR (Identificador de secuencia N° 8) en una concentración de prueba de 150 nM en células HEK293 cotransfectadas con pcDNA-G\alpha16. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR) se determinaron cargando las células con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.). Las células Hek 293 transfectadas sólo con el vector de expresión pcDNA-G\alpha16 no ofreció respuesta al fragmento de unión a hDRR como se muestra en la figura 3. Usando este ensayo FLIPR a diferentes concentraciones de prueba del péptido activador de hDRR formado por el Identificador de secuencia N° 8, se determinó un valor de CE_{50} de 2 nM (figura. 7).
Expresión del gen hDRR4
La PCR cuantitativa en tiempo real, reveló la expresión de hDRR4 en ganglios de raíz dorsal (DRG) y ganglios trigéminos. Este descubrimiento confirma el papel potencial de este receptor en la percepción o modulación del dolor. De todos los tejidos analizados, hDRR4 casi se expresaba exclusivamente en los ganglios de la raíz dorsal y ganglios trigéminos como aparece en la figura 6, en la que se compararon los niveles de expresión en otros tejidos con los niveles de expresión observados en ganglios de la raíz dorsal y ganglios trigéminos.
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Ejemplo 2 Clonación y caracterización funcional del hDRR7 de GPCR Materiales y métodos Materiales
Polimerasa Expand de gran fidelidad, tampón para PCR, T4 ADN ligasa y endonucleasas de restricción de Boehringer (Mannheim, Alemania). Los oligonucleótidos se adquirieron a Eurogentec (Seraing, Bélgica). Los kits de preparación de plásmidos y el kit de amplificación de PCR Qiaquick son de Qiagen (Hilden, Alemania). Los kits de secuenciación PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing y los secuenciadores ABI 377 o 373A son de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). El sistema de PCR Geneamp PCR System 9600 es de Perkin-Elmer (Norwalk, CT, EE.UU.). El vector de expresión en mamífero pcDNA3 se compró a Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal de ternero y el suero fetal de ternero dializado son de Life Technologies (Gaithersburg, MD, EE.UU.).
Secuenciación del ADN
La secuenciación del ADN se realizó con los reactivos del kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Biosystems) en equipos PTC-200 PCR (MJ Research). Los productos de reacción se purificaron con las columnas del kit SEQueaky Kleen 96 well Terminator Removal (BioRad) y se resolvieron en un secuenciador de ADN ABI377. Para el análisis de las secuencias se uso el software Sequencher de GeneCodes (Ann Harbor, MI).
Clonación de hDRR7
Se realizó una PCR sobre una genoteca genómica humana en cósmidos (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) usando un cebador directo para hDRR7 (CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG) (Identificador de secuencia N° 13) y el cebador reverso de hDRR7 (GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC) (Identificador de secuencia N° 14). El producto de PCR resultante se insertó en el vector de expresión en mamífero pcDNA3 EE.UU.) y se utilizó en los posteriores experimentos de selección.
Expresión transitoria en células de mamífero y ensayo FLIPR
El plásmido de expresión de hDRR7 se cotransfectó transitoriamente con una construcción pcDNA3-G\alpha16 usando el reactivo Fu-GENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) en células HEK293. Las células se cargaron con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) según las recomendaciones del proveedor. Posteriormente, se analizaron las células en el instrumento FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) para estudiar los aumentos transitorios del Ca2+ intracelular.
Preparación de membranas
Las membranas se prepararon como fracciones de partículas totales. Las líneas celulares se cultivaron a 90% de confluencia en placas de petri de 145 mm y se trataron con butirato de sodio 5 mM, 24 horas antes de recogerlas. El medio de cultivo se retiró y se lavaron las células dos veces con solución salina con tampón fosfato enfriado en hielo (PBS sin Ca^{2+} y Mg^{2+}), se rasparon de las placas en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 y se recogieron por centrifugación (10 minutos a 16.000 rpm a 4°C). El sedimento celular se resuspendió en tampón Tris-HCl, pH 7,4 y se homogeneizaron con una homogeneizador Ultra Turrax. El homogeneizado se centrifugó a 18.000 rpm durante 20 minutos a 4°C. El sedimento final se resuspendió en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 y se guardó en alícuotas a
-70°C. Se realizó una determinación de proteína usando el ensayo de proteínas Bradford (Biorad) usando seroalbúmina bovina (BSA).
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Verificación de los niveles de expresión a través de PCR cuantitativa en tiempo real
Se obtuvo ARN de varios tejidos de Clontech salvo el ARN de los ganglios de la raíz dorsal que se obtuvo de Analytical Biological Services. Los cebadores SDS y las sondas TaqMan para el gen hDRR7 se diseñaron usando el software PrimerExpress 1.0 (Perkin Elmer, MA, EE.UU.). Los cebadores SDS directo y reverso para el gen hDRR4 fueron respectivamente 5'-TGGAAATGACCAAGCCCTTCT-3' (Identificador de secuencia N° 15) y 5'-GAAAAGGATCAGGAAGACCGG-3' (Identificador de secuencia N° 16). La sonda TaqMan para hDRR7 (5'-AT
CAGGGTCTCCTTGCCACAAAGCAGT-3') (Identificador de secuencia N° 17) se diseñó usando el software Primer-
Express 1.0 (Perkin Elmer, MA, EE.UU.) y se pueden escoger de la cadena superior o de la cadena inferior de la secuencia objetivo. La sonda TaqMan hDRR7 se marcó con un fluoróforo indicador, 6-carboxifluoresceína (FAM) en el extremo 5'.
El ADNc se sintetizó usando la transcriptasa inversa Superscript II. La RT se realizó durante 60 min a 42°C en un baño de agua. La reacción se detuvo calentando a 70°C durante 10 min. La amplificación por PCR se hizo después en placas de reacción de 96 pocillos de MicroAmp Optical durante 50 ciclos, siendo cada ciclo de 95°C durante 15 s; y 60°C durante 1 min. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado usando el ABI Prism 7700 SDS. La expresión relativa de hDRR7 en los tejidos analizados se comparó con la expresión de la \beta-actina.
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Resultados Generación y secuencia del ADNc de hDRR7
Después de realizar la PCR sobre la genoteca de cósmidos de genoma de humanos, sólo se obtuvo un producto de PCR. La secuenciación del producto de PCR demostró que la secuencia era idéntica a una extensión de la secuencia en una entrada de la base de datos EMBL (AX099247). Llegamos a la secuencia nucleotídica descrita en el Identificador de secuencia N° 11.
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Efecto de la sustancia activadora de hDRR4 en el ensayo celular tipo FLIPR
Se midió la activación del hDRR7 de GPCR huérfano (Identificador de secuencia N° 12) por el fragmento de EPF de unión a hDRR (Identificador de secuencia N° 8) en una concentración de prueba de 150 nM en células HEK293 cotransfectadas transitoriamente con pcDNA-G\alpha16. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR) se determinaron cargando las células con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.). Las células Hek 293 transfectadas sólo con el vector de expresión pcDNA3-G\alpha16 no ofrecieron respuesta al fragmento de unión a hDRR como se muestra en la figura 4. Usando este ensayo FLIPR a diferentes concentraciones de prueba del péptido activador de hDRR formado por el Identificador de secuencia N° 8, se determinó un valor de CE50 de 354 nM (figura. 8).
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Expresión del gen hDRR7
La PCR cuantitativa en tiempo real, reveló la expresión de hDRR7 en ganglios o bultos linfáticos. Este descubrimiento junto con la identificación de cada factor precoz de embarazo como agonista natural de los hDRR, confirma el papel potencial de este receptor en la acción inmunosupresora del EPF observada durante el embarazo (Davis and Maslow, 1992). De todos los analizados, hDRR7 se expresó predominantemente en ganglios linfáticos como se muestra en la figura 5, en la que se compararon los niveles de expresión en otros tejidos con los niveles de expresión observados en ganglios linfáticos.
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Ejemplo 3 Purificación e identificación de péptidos relacionados con EPF Materiales y métodos Materiales
Polimerasa Expand de gran fidelidad, tampón para PCR, T4 ADN ligasa y endonucleasas de restricción de Boehringer (Mannheim, Alemania). Los oligonucleótidos se adquirieron a Eurogentec (Seraing, Bélgica). Los kits de preparación de plásmidos y el kit de amplificación de PCR Qiaquick son de Qiagen (Hilden, Alemania). Los kits de secuenciación PRISM Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing y los secuenciadores ABI 377 o 373A son de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). El sistema 9600 de PCR Geneamp es de Perkin-Elmer (Norwalk, CT, EE.UU.). El vector de expresión en mamífero pcDNA3 se compró a Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal de ternero y el suero fetal de ternero dializado son de Life Technologies (Gaithersburg, MD, EE.UU.).
Secuenciación del ADN
La secuenciación del ADN se realizó con los reactivos del kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Biosystems) en equipos PTC-200 PCR (MJ Research). Los productos de reacción se purificaron con las columnas del kit SEQueaky Kleen 96 well Terminator Removal (BioRad) y se resolvieron en un secuenciador de ADN ABI377. Para el análisis de las secuencias se utilizó el software Sequencher de GeneCodes (Ann Harbor, MI).
Clonación del hDRR4
Se realizó una PCR sobre una genoteca genómica humana en cósmidos (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) usando un cebador directo (GGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG) y un cebador inverso (GTCTC
GAGTCACTGCTC-CAATCTGCTTCCC). Los productos de PCR resultantes se clonaron con la ayuda del kit
TOPO^{TM} TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La cadena completa se insertó en pauta de lectura en el vector de expresión en mamífero pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se utilizó en los posteriores experimentos de selección.
Clonación de hDRR7
Se hizo una PCR una genoteca genómica humana en cósmidos (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) usando un cebador directo para hDRR7 (CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG) (Identificador de secuencia N° 13) y el cebador reverso de hDRR7 (GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC) (Identificador de secuencia N° 14). El producto de PCR resultante se insertó en el vector de expresión en mamífero pcDNA3 EE.UU.) y se utilizó en los posteriores experimentos de selección.
Expresión transitoria en células de mamífero y ensayo FLIPR
El plásmido de expresión de hDRR4 o el plásmido de expresión de hDRR7 se cotransfectaron transitoriamente con una construcción pcDNA3-Ga116 usando el reactivo FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) en células HEK293. Las células se cargaron con Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) según las recomendaciones del proveedor. Posteriormente, se analizaron las células en el instrumento FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) para estudiar los aumentos transitorios del Ca^{2}+ intracelular.
Purificación a partir de un extracto de glándula tiroides
Se homogeneizaron 2,5 kg de glándula tiroides porcina y se extrajeron en metanol/agua/ácido acético, 90/9/1, v/v/v. Después de centrifugar, se eliminaron los lípidos del sobrenadante con una extracción con n-hexano y la fase acuosa se fraccionó con un fraccionador MegabondElute. El material que eluye de 0 a 50% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético acuoso (0,1%) se fraccionó adicionalmente por HPLC en fase inversa en una columna de preparación DeltaPak C18 (40x100 mm). Se analizó la capacidad de activación del GPCR de hDRR4 de las fracciones derivadas en el ensayo FLIPR. Los pasos posteriores de purificación en una columna Deltapak C4 de preparación (25 x 10 mm), una columna C18 analítica (4,6 x 250 mm), una columna C18 Xterra de calibre estrecho (2,1 x 250 mm), y finalmente, una columna C18 Symmetry de calibre estrecho (0,32 x 150 mm) se siguieron también por un ensayo de actividad FLIPR de las fracciones que activan a las células transfectadas con hDRR4.
Resultados Purificación del agonista natural de hDRR4 a partir de glándula tiroides
En esencia, se preparó un extracto a partir de un tejido que se sabe es rico en péptidos de secreción, p. ej., glándula tiroides, y la purificación del ligando natural se siguió de un ensayo celular basado en la activación del GPCR huérfano como se describe en Materiales y métodos.
El estudio del extracto de glándula tiroides porcina después del primer fraccionamiento en una columna C18 ofreció un intervalo de fracciones que resultó en una liberación intracelular transitoria de Ca^{2+} en las células transfectadas transitoriamente con la construcción de expresión de hDRR4. Se purificaron dos fracciones adyacentes para homogeneizarlas y analizarlas con ESI-Qq-TOF MS. Ambas fracciones produjeron dos picos iónicos cargados triples muy prominentes a m/z 640,59 que corresponde a una masa de 1918,77 Da y a m/z 716,63 que corresponde a una masa de 2146,89 Da. Estos picos se seleccionaron en un experimento de EM en tándem y se fragmentaron por disociación inducida por colisión en un sistema Q-TOF. Se obtuvieron cuatro posibles secuencias para el compuesto de 2146,8 Da. LGX_{1}AFRX_{2}FLPLFDRVLVE, (X_{1} y X_{2} siendo K o Q), y cuatro posibles secuencias para el péptido de 1918,77 Da, que es una isoforma más corta del primer péptido, LGX_{1}AFRX_{2}FLPLFDRVL (X_{1} y X_{2} siendo K o Q). (Identificadores de secuencia N° 18-21).
Los aminoácidos 2-19 y 2-17 de estas secuencias corresponden a la chaperonina 10 (Hsp10) 2-18 y a la chaperonina 10 (Hsp10) 2-16, respectivamente. El residuo aminoacídico de la posición 7 es una lisina (K) en las chaperoninas de todos los vertebrados estudiados hasta ahora. El residuo aminoacídico de la posición 3 es una R en Rattus norvegicus, Mus musculus y Homo sapiens, todas las especies de mamífero y una K en Gallus gallos (Aves).
Medición FLIPR
Los péptidos purificados o las fracciones de tejido secas se disolvieron en tampón de calcio en placas de 96 pocillos normales. Posteriormente, se analizaron las células en el instrumento FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) para estudiar los aumentos transitorios del Ca^{2+} intracelular. Para los péptidos relacionados con EPF se determinaron los siguientes valores de pCE_{50};
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Referencias citadas en la descripción La lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Incluso aunque se ha dedicado un enorme tiempo para compilar las referencias, no puede excluirse algún error u omisión, y la OEP renuncia a cualquier responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción
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<110> Janssen Pharmaceutica NV
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<120> Ensayos con el receptor EPF, compuestos y composiciones terapéuticas
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<130> Jab1620
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<150> Solicitud de patente europea N° 01202474.1
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<151> 2001-06-27
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<170> PatentIn versión 3.1
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador directo de hDRR4
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador inverso de hDRR4
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<210> 18
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 18
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\hskip1cm27 
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<210> 19
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 19
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\hskip1cm28 
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<210> 20
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 20
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\hskip1cm29 
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<210> 21
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 21
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\hskip1cm30 
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<210> 22
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador directo de hDRR4 QPCR
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<400> 22
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\hskip1cm31 
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<210> 23
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador inverso de hDRR4 QPCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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\hskip1cm32 
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<210> 24
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: hDRR4 FAM-probe QPCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\hskip1cm33 
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Claims (18)

1. Método para identificar un compuesto capaz de unirse y/o modular la actividad del polipéptido receptor de la raíz dorsal humana 4 (hDRR4) y/o del receptor de la raíz dorsal humana 7 (hDRR7), que comprende las etapas de:
a)
poner en contacto el factor precoz de embarazo (EPF) o un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF con un polipéptido hDRR4 y/o hDRR7;
b)
poner en contacto un compuesto de estudio con dichos polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7, y
c)
determinan el efecto de dicho compuesto de estudio con dichos polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 en un ensayo competitivo, no competitivo 0 comparativo con dicho péptido EPF o péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de EPF.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1 en el que el EPF o el péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF se seleccionan entre el grupo formado por:
i)
un polipéptido aislado que codifica el EPF, que comprende la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 4;
ii)
un polipéptido aislado derivado de EPF y capaz de unirse a hDRR4;
iii)
un polipéptido aislado que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF que comprende la secuencia aminoacídica seleccionada del grupo formado por Identificador de secuencia N° 18, Identificador de secuencia N° 19, Identificador de secuencia N° 20 y Identificador de secuencia N° 21, y
iv)
un polipéptido aislado que comprende el fragmento de unión a hDRR4 y/o hDRR7 que consiste en la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 8.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 1 en el que:
i)
el polipéptido hDRR4 es un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma, o
ii)
el polipéptido hDRR7 es un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de unirse a los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 que comprende las etapas de:
a)
incubar una fuente que contiene hDRR4 y/o hDRR7 o un fragmento funcional de los mismos, con
i)
EPF o un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF
ii)
dicho compuesto de estudio, y
b)
medir el efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de EPF o péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, unido al receptor, y
c)
seleccionar el compuesto de estudio que en la etapa b) se ha encontrado que influye más en la cantidad de EPF o péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF unido al receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Método según la reivindicación 4, en el que la fuente que contiene hDRR4 y/o hDRR7 o un fragmento funcional de los mismos se selecciona del grupo formado por:
i)
una proteína aislada y purificada que tiene la secuencia aminoacídica del Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento de la misma,
ii)
una proteína aislada y purificada que tiene la secuencia aminoacídica del Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento de la misma,
iii)
células que expresan en su superficie el polipéptido hDRR4 que tiene la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma.
iv)
células que expresan en su superficie el polipéptido hDRR7 que tiene la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma;
v)
preparaciones de membrana de células que expresan en su superficie el polipéptido hDRR4 que tiene la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o un fragmento funcional de la misma, y
vi)
preparaciones de membrana de células que expresan en su superficie el polipéptido hDRR7 que tienen la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 12 o un fragmento funcional de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Método según la reivindicación 5, en el que la proteína aislada y purificada se une a un soporte sólido.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el EPF y/o el péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF, están etiquetados, y en el que dichas etiquetas se usan para medir el efecto del compuesto de estudio sobre la cantidad de EPF o péptido que tienen al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF que se une al receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método según la reivindicación 4, en el que el método es el diseño de un fármaco racional que comprende los pasos de:
a)
explorar de la estructura del lugar de unión al ligando en hDRR4 y/o hDRR7 a EPF o un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF.
b)
identificar los átomos de contacto del lugar de unión al ligando del hDRR4 y/o hDRR7 que interaccionan con el ligando EPF durante la unión,
c)
diseñar los compuestos de estudio que interaccionan con los átomos identificados en (b) para modular la actividad de hDRR4 y/o hDRR7, y
d)
poner en contacto dicho compuesto de estudio diseñado con una fuente que contiene hDRR4 y/o hDRR7 o un fragmento funcional de los mismos, para medir la capacidad de dicho compuesto de modular la actividad de hDRR4 y/o hDRR7.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Método para identificar y obtener un compuesto de estudio capaz de modular la actividad de los polipéptidos hDRR4 y/o hDRR7 que comprende las etapas de:
a)
incubar de una fuente que contiene hDRR4 y/o hDRR7 o un fragmento funcional de los mismos, con dicho compuesto de estudio;
b)
medir el efecto del compuesto de estudio sobre la actividad de hDRR4 y/o hDRR7; y
c)
comparar este efecto con la actividad de hDRR4 y/o hDRR7 al unirse al ligando EPF o a un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Método según la reivindicación 9, en el que la fuente que contiene hDRR4 y/o hDRR7 es una célula que expresa en su superficie el receptor polipeptídico que tiene la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 2 o Identificador de secuencia N° 12.
11. Método según las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el efecto del modulador sobre hDRR4 y/o hDRR7 es una modulación de la formación del mensajero secundario intracelular.
12. Método según la reivindicación 11, en el que el mensajero secundario intracelular es AMPc, calcio o un producto génico indicador.
13. Método según la reivindicación 1 para identificar compuestos que puedan mimetizar o alterar los efectos biológicos del EPF.
14. Método para aislar el hDRR4 y/o el hDRR7 a partir de una fracción celular que los contiene, que comprende poner en contacto la fracción celular con el EPF o un fragmento del mismo que se una a hDRR4 y/o hDRR7 inmovilizado en un sustrato sólido, y eluir el hDRR4 y/o hDRR7.
15. Fragmento de EPF unido a hDRR4 aislado y purificado o de un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con el EPF, habiéndose seleccionado dicho fragmento del grupo formado por:
-
el fragmento de unión a hDRR4 formado por la secuencia aminoacídica de Identificador de secuencia N° 8, o
-
Identificador de secuencia N° 18, Identificador de secuencia N° 19, Identificador de secuencia N° 20 o Identificador de secuencia N° 21, y
-
una secuencia de entre 16 y 21 aminoácidos que tienen al menos un 70% de identidad de secuencia con el Identificador de secuencia N° 8, 18, 19, 20 y/o 21.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica un fragmento de EPF unido a hDRR4 o un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con EPF según la reivindicación 15.
17. Anticuerpo monoclonal para el fragmento de unión a hDRR4 según la reivindicación 15.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Kit de diagnóstico que comprende:
i)
un polipéptido seleccionado entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, Identificador de secuencia N° 19, Identificador de secuencia N° 20 y el Identificador de secuencia N° 21, o el fragmento de unión a hDRR4 y/o hDRR7 codificado por el Identificador de secuencia N° 8, o una secuencia de entre 16 y 21 aminoácidos que tienen al menos un 70% de identidad de secuencia con el Identificador de secuencia N° 8, 18, 19, 20 y/o 21 o
ii)
un anticuerpo contra un polipéptido seleccionado entre el grupo formado por el Identificador de secuencia N° 18, el Identificador de secuencia N° 19, el Identificador de secuencia N° 20 y el Identificador de secuencia N° 21, o del fragmento de unión a hDRR4 y/o hDRR7 con Identificador de secuencia N° 8.
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