JPH11169187A - 新規化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 推定アドレノメジュリン受容体(Putative Ad
renomedullin Receptor)ポリペプチドおよびポリヌクレ
オチド、ならびに組換え法による該ポリペプチドの産生
方法を提供する。 【解決手段】 配列番号２の推定アドレノメジュリン受
容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
単離されたポリヌクレオチド、またはこの単離されたポ
リヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列。 【効果】 推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチド
およびポリヌクレオチドは感染症、疼痛、癌、糖尿病、
肥満症、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性
心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心
症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精
神および神経障害、ならびに子癇前症などの治療と、こ
れらの診断アッセイに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より
詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドはＧタンパク質共役受容体ファミリーに関係してお
り、以後これを推定アドレノメジュリン受容体(Putativ
e Adrenomedullin Receptor)と記す。本発明はまた、こ
のようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用を
阻害または活性化することに関する。

【０００２】

【従来の技術】医学的に重要な生物学的プロセスの多く
が、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝達経路に関与して
いるタンパク質および／または第二メッセンジャー（例
えば、ｃＡＭＰ）により媒介されることはよく知られて
いる (Lefkowitz, Nature, 1991, 351:353-354) 。ここ
では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含む経路に
関与しているタンパク質つまりＰＰＧタンパク質と称さ
れる。こうしたタンパク質の例として、アドレナリン作
動薬やドーパミンの受容体(Kobilka, B.K.ら, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:46-50; Kobilka, B.K.
ら, Science, 1987, 238:650-656; Bunzow, J.R.ら, Na
ture, 1988, 336:783-787)、Ｇタンパク質それ自体、エ
フェクタータンパク質（例：ホスホリパーゼＣ、アデニ
ルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ）、およびアクチ
ュエータータンパク質（例：プロテインキナーゼＡ、プ
ロテインキナーゼＣ）(Simon, M.I.ら, Science, 1991,
252:802-8) の受容体のようなＧＰＣ受容体を挙げるこ
とができる。

【０００３】例えば、シグナル伝達の一つのタイプで
は、ホルモンの結合の結果として細胞内で酵素アデニル
酸シクラーゼが活性化される。この酵素のホルモンによ
る活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、このＧ
ＴＰもホルモンの結合に影響を及ぼす。Ｇタンパク質は
ホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけてい
る。ホルモン受容体により活性化されると、Ｇタンパク
質は結合していたＧＤＰをＧＴＰと交換することが見い
だされた。その後、ＧＴＰ担持形態が活性化されたアデ
ニル酸シクラーゼと結合する。ＧＴＰがＧＤＰへ加水分
解されると（この加水分解はＧタンパク質自体により触
媒される）、Ｇタンパク質はその不活性な基底形態へと
戻る。こうして、Ｇタンパク質は二重の役割を果たして
おり、すなわち、受容体からのシグナルをエフェクター
に中継する中間体として、さらにシグナルの持続時間を
制御する時計として機能している。

【０００４】Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺
伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫通ドメ
インを有すると特性付けられた。これらのドメインは細
胞外または細胞質ループにより接続された膜貫通αヘリ
ックスに相当すると考えられる。Ｇタンパク質共役受容
体には、ホルモン、ウイルス、増殖因子、神経の受容体
などの多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。Ｇタ
ンパク質共役受容体（７ＴＭ受容体としても知られる）
は、少なくとも８つの異なる親水性ループをつなぐ、約
２０〜３０個のアミノ酸からなる７つの保存された疎水
性領域を含むと特性付けられてきた。Ｇタンパク質共役
受容体のファミリーには、精神疾患および神経疾患の治
療に用いられる神経弛緩薬と結合するドーパミン受容体
が含まれる。このファミリーに含まれるメンバーのその
他の例としては、カルシトニン、アドレナリン、エンド
セリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチル
コリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニ
ン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺伝子
−１、ロドプシン、におい物質、サイトメガロウイルス
の受容体が挙げられるが、これらに限らない。大部分の
Ｇタンパク質共役受容体は、機能性タンパク質の構造を
安定化させると考えられるジスルフィド結合を形成する
保存されたシステイン残基を、最初の２つの細胞外ルー
プのそれぞれに１個もっている。７つの膜貫通領域はＴ
Ｍ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６および
ＴＭ７と称される。ＴＭ３がシグナル伝達に係わってい
る。

【０００５】システイン残基のリン酸化およびリピド化
（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかの
Ｇタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を与える
ことができる。Ｇタンパク質共役受容体はその第三細胞
質ループおよび／またはカルボキシ末端にリン酸化部位
を含むことが多い。β−アドレナリン受容体のような数
種のＧタンパク質共役受容体においては、プロテインキ
ナーゼＡおよび／または特異的な受容体キナーゼによる
リン酸化が受容体の脱感受性を媒介している。いくつか
の受容体では、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド結合
部位はＧタンパク質共役受容体の数個の膜貫通ドメイン
により形成される親水性ソケット(socket)を含み、この
ソケットがＧタンパク質共役受容体の疎水性残基により
とり囲まれていると考えられている。Ｇタンパク質共役
受容体のそれぞれの膜貫通ヘリックスの親水側は、内側
に面して極性のリガンド結合部位を形成していると仮定
される。一部のＧタンパク質共役受容体では、ＴＭ３が
ＴＭ３のアスパラギン酸残基のようなリガンド結合部位
をもつとしてリガンドの結合に関与してきた。ＴＭ５の
セリン、ＴＭ６のアスパラギン、さらにＴＭ６やＴＭ７
のフェニルアラニンまたはチロシンもリガンドの結合に
関与している。

【０００６】Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体
のＧタンパク質により、種々の細胞内酵素、イオンチャ
ンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合すること
ができる (Johnsonら, Endoc. Rev., 1989, 10:317-331
を参照のこと) 。個々のＧタンパク質のαサブユニッ
トが特定のエフェクターを優先的に刺激して細胞のさま
ざまな生物学的機能をモジュレートする。Ｇタンパク質
共役受容体の細胞質側の残基のリン酸化は、一部のＧタ
ンパク質共役受容体のＧタンパク質共役を調節するため
の重要な作用機構として同定された。Ｇタンパク質共役
受容体は哺乳動物宿主のいろいろな部位で見いだされて
いる。

【０００７】ここ１５年の間に、細胞膜を７回貫通する
（7 transmembrane:７ＴＭ）受容体をターゲットとする
３５０種類ほどの治療薬が市場に導入され、成功を収め
てきた。最近、Hataらは、アドレノメジュリンの産生が
妊娠中および分娩後に増加するが、子癇前症においては
減少することを明らかにした(T Hataら, Lancet, 1997,
350, 29 Nov 1997, 1600) 。したがって、アドレノメジ
ュリンは妊娠中の子癇前症の病因において何らかの役割
を果たしている可能性がある。

【０００８】このことは、こうした受容体に治療ターゲ
ットとしての確立され実証された歴史があることを示し
ている。明らかに、感染症（例えば、細菌、真菌、原生
動物およびウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１また
はＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿
病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、
急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、
精神および神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん
妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハン
チントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を
含む）および子癇前症を含むがこれらに限らない、機能
障害または疾病を予防し、改善し、治療する上である種
の役割を果たす新たな受容体を同定して特性付ける必要
性が存在している。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、一つの態様
において、推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチド
および組換え物質、並びにその生産方法に関する。本発
明のもう一つの態様は推定アドレノメジュリン受容体ポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関す
る。こうした使用には、とりわけ、感染症（例えば、細
菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特に
ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼
痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パー
キンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗
しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性
前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そ
ううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異
常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツ
レット症候群を含む）および子癇前症の治療が含まれ
る。他の態様では、本発明は、本発明により提供される
物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定す
る方法、並びに同定された化合物を用いて推定アドレノ
メジュリン受容体の平衡異常と関連した症状を治療する
ことに関する。本発明のさらに他の態様は、不適当な推
定アドレノメジュリン受容体の活性またはレベルと関連
した疾病を検出するための診断アッセイに関する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】定義 下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「推定アドレノメジ
ュリン受容体」とは、特に、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのアレル変異体
を意味する。

【００１１】「受容体活性」または「受容体の生物学的
活性」とは、類似の活性、向上した活性、または望まし
くない副作用が低下したこれらの活性を含めて、推定ア
ドレノメジュリン受容体の代謝的または生理的機能を意
味する。さらに、前記推定アドレノメジュリン受容体の
抗原的および免疫原的活性も含まれる。「推定アドレノ
メジュリン受容体遺伝子」とは、配列番号１で表される
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその
アレル変異体および／またはそれらの相補体を意味す
る。

【００１２】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。

【００１３】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。
「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修
飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性ま
たは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、ト
リチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基
がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が
行われてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自
然界に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスお
よび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を
包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオ
リゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチ
ドも包含する。

【００１４】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチ
ドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所
定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさ
まざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、
分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝
した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天
然プロセスから生じることがあり、また、合成法によっ
て製造することもできる。修飾としては、アセチル化、
アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの
共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架
橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有
架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、
ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転
移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、
PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,第２
版, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New
York, 1993; POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION
OF PROTEINS, B.C. Johnson 編, Academic Press, New
York, 1983中のWold, F., Posttranslational Protein
Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1
-12; Seifter ら, "Analysis for protein modificatio
nsand nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 1
82:626-646; および Rattan ら, "Protein Synthesis:
Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY
Acad Sci (1992) 663:48-62を参照のこと。

【００１５】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、欠
くことのできない性質を保持しているポリヌクレオチド
またはポリペプチドのことである。典型的なポリヌクレ
オチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド
配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の
変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよ
い。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準
配列によりコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸
の置換、付加、欠失、融合および末端切断（トランケー
ション）を生じさせることができる。典型的なポリペプ
チドの変異体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で
相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異
体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同
一となるような差異に限られる。変異体と基準ポリペプ
チドは任意に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失に
よりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入
されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされる
ものであっても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変異体はアレル変異体のように天然に
存在するものでも、天然に存在することが知られていな
い変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法
または直接合成により調製することができる。

【００１６】当技術分野で知られた「同一性」とは、ポ
リペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の比較によ
り決定された、２以上のかかる配列間の関係のことであ
る。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配
列またはポリヌクレオチド配列の鎖間のマッチ(match)
により決定された、このような配列間の配列関係の程度
を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法
により難なく算出することができ、こうした方法とし
て、例えば Computational Molecular Biology,Lesk,
A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; B
iocomputing: Informatics and Genome Projects, Smit
h, D.W. 編, Academic Press, New York,1993; Compute
r Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.
and Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1
994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von H
einje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis
Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stock
ton Press, New York, 1991; および Carillo, H. and
Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)
に記載された方法があるが、これらに限らない。同一
性を決定するための好ましい方法は、検討する配列間で
最大級のマッチが得られるように設計される。さらに、
同一性および類似性を決定する方法は一般に入手可能な
コンピュータプログラムに編集されている。２配列間の
同一性および類似性を決定する好適なコンピュータプロ
グラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ (Deve
reux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (198
4))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ (A
tschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (199
0))があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログ
ラムはＮＣＢＩおよび他のソースから一般に入手可能で
ある (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI NLM NIH B
ethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 2
15: 403-410 (1990))。公知のSmith Watermanアルゴリ
ズムも同一性の決定に使用することができる。

【００１７】ポリペプチド配列を比較するための好適な
パラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Bi
ol. 48: 443-453 (1970)； 比較マトリックス：BLOSSU
M62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Gen
etics Computer Group(Madison WI)から「ｇａｐ」プロ
グラムとして一般に入手可能である。前記のパラメータ
ーはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(def
ault parameter) である（末端ギャップのペナルティー
は無し）。

【００１８】ポリヌクレオチド配列を比較するための好
適なパラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Bi
ol. 48: 443-453 (1970)； 比較マトリックス：マッチ
＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Gen
etics Computer Group(Madison WI)から「ｇａｐ」プロ
グラムとして入手可能である。前記のパラメーターはポ
リヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメーターで
ある。

【００１９】例として、本発明のポリヌクレオチド配列
は配列番号１の基準配列と同一、すなわち１００％同一
であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのヌ
クレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なく
とも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジション
およびトランスバージョンを含む）または付加よりなる
群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列
の5'もしくは3'末端位置、またはこれらの末端位置の間
のどこに存在してもよく、基準配列中のヌクレオチドの
間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグル
ープとして介在することができる。ヌクレオチド変異の
数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に、それぞれの
（１００で割った）同一性％値を掛け、その積を配列番
号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、す
なわち、次式： ｎ_n ≦ｘ_n −（ｘ_n・ｙ） により求めることができる。式中、ｎ_nはヌクレオチド
変異の数であり、ｘ_nは配列番号１のヌクレオチドの総
数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％につい
ては0.80、85％については0.85、90％については0.90、
95％については0.95などであり、ｘ_nとｙの非整数の積
は、その積をｘ_nから引く前に、最も近似する整数に切
り下げる。配列番号２のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列の改変は、そのコード配列にナンセン
ス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさ
せ、それにより、こうした変異後に該ポリヌクレオチド
によりコードされたポリペプチドを改変させることがで
きる。

【００２０】同様に、本発明のポリペプチド配列は配列
番号２の基準配列と同一、すなわち100％の同一性であ
っても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミノ
酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個
のアミノ酸の欠失、置換（同類および非同類アミノ酸置
換を含む）または付加よりなる群から選択され、こうし
た変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボ
キシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに
存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に、
または基準配列内に１以上の連続するグループとして介
在することができる。所定の同一性％についてのアミノ
酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞ
れの（１００で割った）同一性％値を掛け、その積を配
列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、す
なわち、次式： ｎ_a ≦ｘ_a −（ｘ_a・ｙ） により求めることができる。式中、ｎ_aはアミノ酸変異
の数であり、ｘ_aは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.
80、85％については0.85などであり、ｘ_aとｙの非整数
の積は、その積をｘ_aから引く前に、最も近似する整数
に切り下げる。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド 一つの態様において、本発明は推定アドレノメジュリン
受容体ポリペプチド（または推定アドレノメジュリン受
容体タンパク質）に関する。この推定アドレノメジュリ
ン受容体ポリペプチドには、配列番号２のポリペプチド
だけでなく、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、および配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
とも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペ
プチドも含まれる。また、配列番号２のアミノ酸配列に
対して、その全長において、少なくとも９９％の同一性
を有するポリペプチドも推定アドレノメジュリン受容体
ポリペプチドに含まれる。これらの推定アドレノメジュ
リン受容体ポリペプチドはこの受容体の少なくとも１つ
の生物学的活性を示すことが好ましい。推定アドレノメ
ジュリン受容体ポリペプチドは「成熟」タンパク質の形
であっても、融合タンパク質のような、より大きいタン
パク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミノ
酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸
配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、
多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または
組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などがあ
る。

【００２２】また、推定アドレノメジュリン受容体ポリ
ペプチドの断片も本発明に含まれる。こうした断片は全
体的に前記推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチド
のアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一で
ないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。推定ア
ドレノメジュリン受容体ポリペプチドと同様に、断片は
「フリースタンディング」（それ自体で独立）していて
も、より大きいポリペプチド内に含まれていてもよく、
つまりその大きいポリペプチドの一部または一領域、最
も好ましくは一つの連続領域、を断片が構成していても
よい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例として、
およその見当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４
１−６０、６１−８０、８１−１００、および１０１か
ら推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドの末端ま
での断片が挙げられる。ここで、「およそ」とは、上記
の範囲の一端または両端で数個、５個、４個、３個、２
個または１個のアミノ酸が増えたり減ったりした範囲を
含むものである。

【００２３】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除外すれ
ば、推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドのアミ
ノ酸配列を有する末端切断型(truncation)ポリペプチド
が含まれる。また、αヘリックスとαヘリックス形成領
域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成
領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領
域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表
面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含
む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づ
けられる断片も好適である。その他の好適な断片は生物
学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、同
様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または
望ましくない活性が減少した断片を含めて、受容体活性
を媒介するものである。さらに、動物、特にヒトにおい
て抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。

【００２４】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めた該受容体の生物学的活性を保持することが
好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明
の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換に
より対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の
性質の他の残基で置換されているものである。典型的な
こうした置換は、Ala, Val, Leu および Ileの間；Ser
とThr の間；酸性残基AspとGlu の間；Asn とGln の
間；塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 Phe
とTyr の間で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５
個または１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠
失または付加されている変異型が好適である。

【００２５】本発明の推定アドレノメジュリン受容体ポ
リペプチドは任意の適当な方法で製造することができ
る。このようなポリペプチドには、単離された天然のポ
リペプチド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成
的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組
合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。このよ
うなポリペプチドの製造のための手段は当業界でよく理
解されている。

【００２６】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つの態様は推定アドレノメジュリン受容
体ポリヌクレオチドに関する。推定アドレノメジュリン
受容体ポリヌクレオチドには、推定アドレノメジュリン
受容体ポリペプチドおよび断片をコードする単離された
ポリヌクレオチド、並びにこれらと密接に関連したポリ
ヌクレオチドが含まれる。さらに特定すると、本発明の
推定アドレノメジュリン受容体ポリヌクレオチドとして
は、配列番号２の推定アドレノメジュリン受容体ポリペ
プチドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１の特
定配列を有するポリヌクレオチドがある。本発明はま
た、このような推定アドレノメジュリン受容体ポリヌク
レオチドと相補的なポリヌクレオチドを提供する。

【００２７】本発明の推定アドレノメジュリン受容体
は、ヒト推定アドレノメジュリン受容体をコードするｃ
ＤＮＡ（配列番号１）の塩基配列決定の結果により示さ
れるように、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他の
タンパク質と構造的に関連している。配列番号１のｃＤ
ＮＡ配列は配列番号２の３６２個のアミノ酸からなるポ
リペプチドをコードするオープンリーディングフレーム
（ヌクレオチド番号１−１０８６）を含んでいる。配列
番号２のアミノ酸配列は３５６個のアミノ酸残基におい
てヒトＲＤＣ１受容体（S.P. Sreedharanら, Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 88:4986-90, 1991）と約９８％
同一である（Bestfit使用）。さらに、推定アドレノメ
ジュリン受容体（配列番号２）は３９５個のアミノ酸残
基においてラット・アドレノメジュリン受容体と３２％
同一である(S. Kapasら, J. Biol. Chem. 270:25344-7,
1995) 。配列番号１のヌクレオチド配列は１０７２個
のヌクレオチド残基においてヒトＲＤＣ１受容体（S.P.
Sreedharanら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:49
86-90, 1991）と約９９％同一である（BestFit使用）。
さらに、推定アドレノメジュリン受容体（配列番号１）
は８００個のヌクレオチド残基においてラットＡＤＭ−
Ｒと６０％同一であり(S. Kapasら, J. Biol. Chem. 27
0:25344-7, 1995) 、８５５個のヌクレオチド残基にお
いてＨＴＬＣＡ３２と５９％同一である（特許番号08/6
96,770、1996年８月14日付、Y. Liら）。したがって、
本発明の推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドお
よびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同ポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能
／特性をもつことが予測されるが、それらの有用性は当
業者には自明である。

【００２８】推定アドレノメジュリン受容体をコードす
る本発明の一つのポリヌクレオチドは、標準的なクロー
ニングおよびスクリーニングにより、ヒト滑膜I11/TNF
刺激した脂肪組織または全胚の細胞に含まれるｍＲＮＡ
から誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、エクスプレ
スド・シークエンス・タグ（expressed sequence tag:
EST)分析 (Adams, M.D.ら, Science (1991) 252:1651-1
656; Adams, M.D.ら,Nature (1992) 355:632-634; Adam
s, M.D.ら, Nature (1995) 377 Supp:3-174)を用いて得
ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲ
ノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることが
でき、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成する
こともできる。

【００２９】配列番号２の推定アドレノメジュリン受容
体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列
番号１中に含まれるポリペプチドコード配列（ヌクレオ
チド番号１−１０８６）と同一であっても、遺伝子コー
ドの重複性（縮重）のため、やはり配列番号２のポリペ
プチドをコードする配列であってもよい。

【００３０】本発明のポリヌクレオチドを推定アドレノ
メジュリン受容体ポリペプチドの組換え生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチ
ドのコード配列またはその断片単独、他のコード配列
（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−
もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペ
プチド部分をコードするもの）と同じリーディングフレ
ームにある成熟ポリペプチドのコード配列またはその断
片が含まれる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易
にするマーカー配列がコードされ得る。本発明のこの態
様の好ましい具体例として、マーカー配列は、ｐＱＥベ
クター(Qiagen, Inc.)により提供されかつGentz ら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821-824に記載さ
れるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタ
グである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非
コード配列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、
スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソ
ーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいて
もよい。

【００３１】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、配列番号２の推定アドレノメジュリン受容体ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を含む推定アドレノメジュリン
受容体変異型をコードするポリヌクレオチドである。

【００３２】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性が存在すると
きだけハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００３３】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片と同一であるか十分に同一である本発明
のポリヌクレオチドは、推定アドレノメジュリン受容体
ポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムク
ローンを単離するために、また、推定アドレノメジュリ
ン受容体遺伝子との配列類似性が高い他の遺伝子（ヒト
以外の種に由来する相同体およびオーソログ体(ortholo
g)をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノム
クローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮ
Ａのハイブリダイゼーションプローブとして用いること
ができる。このようなハイブリダイゼーション技法は当
業者には公知である。一般的に、これらのヌクレオチド
配列は対象物のヌクレオチド配列に対して８０％、好ま
しくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を有す
る。プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含
み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレ
オチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３
０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。

【００３４】一実施態様において、推定アドレノメジュ
リン受容体ポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同
体およびオーソログ体を含む）をコードするポリヌクレ
オチドを得ることは、配列番号１のヌクレオチド配列ま
たはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライ
ブラリーをスクリーニングし、前記のポリヌクレオチド
配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離す
る各工程を含んでなる。かくして、他の態様において、
本発明の推定アドレノメジュリン受容体ポリヌクレオチ
ドは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片に
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。また、
推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドには、上記
のハイブリダイゼーション条件により得られたヌクレオ
チド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペ
プチドが含まれる。このようなハイブリダイゼーション
技法は当業者に公知である。ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件は上で定義したとおりであるか、
または、50% ホルムアミド、５×SSC (150mM NaCl, 15m
M クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH
7.6)、５×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸および
20μg/mlの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶
液中で４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルタ
ーを 0.1×SSC 中約６５℃で洗浄する条件である。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診
断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利
用することができる。

【００３６】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。

【００３７】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み入れるため
に、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davisら, BASIC METHODS IN MOLE
CULAR BIOLOGY (1986) およびSambrookら, MOLECULAR C
LONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版, Cold SpringHa
rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1
989)などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載され
る方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、トランスベクション(transvection)、マイクロイン
ジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクショ
ン、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープロ
ーディング(scrape loading)、射出導入(ballistic int
roduction)または感染により行うことができる。

【００３８】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。

【００３９】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、公知の技法のいずれかに
より、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入すること
ができる。

【００４０】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。

【００４１】スクリーニングアッセイで使用するため推
定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドを発現させよ
うとする場合、そのポリペプチドを細胞の表面に産生さ
せることが好適である。この場合は、スクリーニングア
ッセイでの使用に先立って細胞を回収する。推定アドレ
ノメジュリン受容体ポリペプチドが培地に分泌される場
合は、そのポリペプチドを回収し精製するために培地を
回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず
溶解し、その後にポリペプチドを回収する必要がある。

【００４２】組換え細胞培養物から推定アドレノメジュ
リン受容体ポリペプチドを回収し精製するには、硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンま
たはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマ
トグラフィーを含めた公知の方法を用いることができ
る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精
製に用いられる。ポリペプチドが単離および／または精
製中に変性されるときは、タンパク質を再生させるため
の公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーション
を復元することが可能である。

【００４３】診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としての推定アドレノメジュリン
受容体ポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害と関
連した推定アドレノメジュリン受容体遺伝子の変異型の
検出は、推定アドレノメジュリン受容体の過少発現、過
剰発現または変化した発現により生ずる疾病または該疾
病への罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断
を下しうる診断用ツールを提供するだろう。推定アドレ
ノメジュリン受容体遺伝子に変異がある個体を、さまざ
まな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すことができ
る。

【００４４】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様のやり方でＲＮＡまたはｃＤＮＡ
を使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常
な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化に
より検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識した推
定アドレノメジュリン受容体ヌクレオチド配列とハイブ
リダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配
列とミスマッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化により、ま
たは融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配
列の差異は、変性剤を用いるまたは用いないゲルでのＤ
ＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接
ＤＮＡ配列決定によっても検出できる（例えば、Myers
ら, Science (1985) 230:1242 を参照のこと）。特定位
置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ
（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）また
は化学的開裂法によっても確認できる（Cottonら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照
のこと）。別の実施態様では、例えば、遺伝子変異の効
率のよいスクリーニングを行うため、推定アドレノメジ
ュリン受容体ヌクレオチド配列またはその断片を含むオ
リゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することがで
きる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有
し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含め
た分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用い
られている（例えば、M. Cheeら, Science, Vol.274, p
p.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００４５】診断アッセイは、前記の方法により推定ア
ドレノメジュリン受容体遺伝子の変異を検出すること
で、感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルスによる感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が
引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食
症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血
圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、
潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障
害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の
精神遅滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病ま
たはジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）、および子
癇前症への罹りやすさを診断または判定する方法を提供
する。

【００４６】さらに、被験者から得られたサンプルから
推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドまたは推定
アドレノメジュリン受容体ｍＲＮＡのレベルの異常な低
下または増加を測定する方法により、感染症（例えば、
細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特
にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、
疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パ
ーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨
粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良
性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、
そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異
常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツ
レット症候群を含む）および子癇前症の診断を下すこと
ができる。発現の低下または増加は、当技術分野で公知
のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブ
ロット、その他のハイブリダイゼーション法によりＲＮ
Ａレベルで測定することができる。宿主から得られたサ
ンプル中の推定アドレノメジュリン受容体のようなタン
パク質のレベルを測定するためのアッセイ法は当業者に
よく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオ
イムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロッ
ト分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。

【００４７】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、特に感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およ
びウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ
−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満
症、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不
全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心
筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神およ
び神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴
呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハンチント
ン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）
および子癇前症などの疾病または疾病への罹りやすさを
診断するためのキットに関し、このキットは、(a) 推定
アドレノメジュリン受容体ポリヌクレオチド（好ましく
は、配列番号１のヌクレオチド配列）またはその断片、
(b) (a) のポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配
列、(c) 推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチド
（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）またはその
断片、または(d) 推定アドレノメジュリン受容体ポリペ
プチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対
する抗体、を含んでなる。このようなキットにおいて、
(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分である
ことが理解されよう。

【００４８】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance in Man (Johns Hopkins Universit
yWelch Medical Library からオンラインで入手可能)
中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。

【００４９】罹患個体と非罹患個体とのｃＤＮＡまたは
ゲノム配列の差異も調べることができる。罹患個体の一
部または全部に変異が観察されるが、どの正常個体にも
観察されない場合は、その変異が疾病の原因である可能
性がある。推定アドレノメジュリン受容体の染色体位置
は2q36.3-qterで、マーカー WI-6310の隣にある。骨斑
紋症（オステオポイキリー）、脳腱黄色腫症（ＣＴ
Ｘ）、クライン-ワールデンブルヒ(Klein-Waardenburg)
症候群がこの染色体位置に関連している主な疾病であ
る。

【００５０】抗体 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、推定アドレノメジュリ
ン受容体ポリペプチドに免疫特異的な抗体を産生するた
めの免疫原としても使用することができる。「免疫特異
的」とは、その抗体が従来技術における他の関連ポリペ
プチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチド
に対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドに対する抗
体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくは
ヒト以外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断
片、類似体もしくは細胞を投与することにより得られ
る。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養
物により産生される抗体をもたらす任意の技法を用いる
ことができる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Ko
hler, G.およびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-
497)、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法
(Kozborら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ技法 (Coleら, MONOCLONAL ANTIB
ODIES AND CANCER THERAPY,pp.77-96, Alan R. Liss, I
nc., 1985) などがある。

【００５１】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドに対す
る抗体は、とりわけ、感染症（例えば、細菌、真菌、原
生動物およびウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１ま
たはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿
病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、
急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、
精神および神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん
妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハン
チントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を
含む）および子癇前症の治療に使用できる可能性があ
る。

【００５２】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特に感染症（例え
ば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染
症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘
息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギ
ー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神
分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および
運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・
ラ・ツレット症候群を含む）および子癇前症から前記動
物を防御するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答
を生ずるのに十分な推定アドレノメジュリン受容体ポリ
ペプチドまたはその断片を哺乳動物に接種することを含
んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を疾病
から防御する抗体を産生させるような免疫学的応答を引
き出すために、in vivoで推定アドレノメジュリン受容
体ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して
推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドを供給する
ことを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引
き出す方法に関する。

【００５３】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物において推定アドレノメジュ
リン受容体ポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出
す免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関し、この組成
物は推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドまたは
推定アドレノメジュリン受容体遺伝子を含有する。ワク
チン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。推定
アドレノメジュリン受容体ポリペプチドは胃の中で分解
されうるので、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内
等への注射を含む）に投与することが好ましい。非経口
投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌
剤およびこの製剤を受容者の血液と等張にする溶質を含
みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤
または増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性の無
菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容器または数回
量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供
することができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添
加するだけでよい凍結乾燥状態で保管することもでき
る。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するため
のアジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や
当技術分野で公知の他のアジュバント系を含んでいても
よい。投与量はワクチンの比活性で変化し、ルーチンな
実験操作により簡単に決定できる。

【００５４】スクリーニングアッセイ 本発明の推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチド
は、この受容体と結合して本発明の受容体ポリペプチド
を活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻
害する化合物（アンタゴニスト）のスクリーニング法に
おいて使用することができる。こうして、本発明のポリ
ペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ラ
イブラリーおよび天然産物の混合物中の小分子基質およ
びリガンドを評価するためにも用いられる。これらの基
質およびリガンドは天然の基質およびリガンドであって
よく、また、構造的もしくは機能的な模擬物であっても
よい（Coliganら, Current Protocols in Immunology 1
(2): Chapter 5 (1991)を参照のこと）。

【００５５】推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチ
ドは多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与して
いる。したがって、一方では推定アドレノメジュリン受
容体を刺激し、他方では推定アドレノメジュリン受容体
の機能を阻害し得る化合物および薬物を見つけ出すこと
が望まれる。一般的に、アゴニストは感染症（例えば、
細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特
にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、
疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パ
ーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨
粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良
性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、
そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異
常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツ
レット症候群を含む）および子癇前症のような症状の治
療および予防目的で用いられる。アンタゴニストは感染
症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによ
る感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こ
す感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食
症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血
圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ア
レルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不
安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅
滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジ
ル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）および子癇前症の
ような症状のさまざまな治療および予防目的で使用しう
る。

【００５６】一般に、こうしたスクリーニング法は細胞
表面に本発明の受容体ポリペプチドを発現する適当な細
胞を作製することを含む。この種の細胞には哺乳動物、
酵母、ショウジョウバエ由来の細胞または大腸菌細胞が
含まれる。次いで、この受容体を発現する細胞（もしく
は発現された受容体を含む細胞膜）を試験化合物と接触
させて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害
を観察する。

【００５７】一つのスクリーニング法は、受容体の活性
化により生じた細胞外ｐＨまたは細胞内カルシウムの変
化を測定する系において本発明の受容体を発現する細胞
（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用
するものである。この技法では、本発明の受容体ポリペ
プチドを発現する細胞を化合物と接触させる。その後、
第二メッセンジャーの応答、例えばシグナル伝達、ｐＨ
変化またはカルシウムレベルの変化を測定して、候補化
合物がこの受容体を活性化するか阻害するかを判定す
る。

【００５８】もう一つの方法は、受容体により媒介され
るｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の
阻害または刺激を調べることにより受容体阻害剤をスク
リーニングするものである。この種の方法は、本発明の
受容体を用いて真核細胞をトランスフェクトし、その細
胞表面に該受容体を発現させることを含む。次に、本発
明の受容体の存在下でこの細胞を候補アンタゴニストに
さらし、その後ｃＡＭＰの蓄積量を測定する。候補アン
タゴニストが該受容体と結合し、その結果受容体への結
合を阻害する場合は、受容体により媒介されるｃＡＭＰ
またはアデニル酸シクラーゼの活性レベルが低下または
増加するだろう。

【００５９】本発明の受容体のアゴニストまたはアンタ
ゴニストを検出するための別の方法は、米国特許第5,48
2,835 号に記載されるような酵母を主体とした方法であ
る。これらのアッセイでは候補化合物の結合を簡単に試
験することができ、そこでは候補化合物と直接または間
接に結合された標識により、または標識した競合物質と
の競合を用いるアッセイにより、該受容体を担持する細
胞への付着が検出される。さらに、これらのアッセイで
は、該受容体を表面に担持する細胞に適した検出系を用
いて、候補化合物が該受容体の活性化により生ずるシグ
ナルを結果的にもたらすか否かを試験することができ
る。一般的に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存
在下でアッセイされ、候補化合物の存在がアゴニストに
よる活性化に与える影響が調べられる。

【００６０】さらに、これらのアッセイは、候補化合物
と推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドを含む溶
液とを混ぜ合わせて混合物をつくり、この混合物中の推
定アドレノメジュリン受容体活性を測定し、そしてこの
混合物の推定アドレノメジュリン受容体活性を標準と比
較する各ステップを含むだけでよい。

【００６１】また、推定アドレノメジュリン受容体のｃ
ＤＮＡ、タンパク質またはこのタンパク質に対する抗体
を用いて、細胞内での推定アドレノメジュリン受容体ｍ
ＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加化合物の作
用を検出するためのアッセイを組み立てることができ
る。例えば、当技術分野で公知の標準方法によりモノク
ローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、推定アド
レノメジュリン受容体タンパク質の分泌レベルまたは細
胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡを構築するこ
とができ、これは適切に操作された細胞または組織から
の推定アドレノメジュリン受容体の生産を抑制または増
強する物質（それぞれアンタゴニストまたはアゴニスト
ともいう）の探索に用いることができる。スクリーニン
グアッセイを行うための標準的な方法は当技術分野でよ
く理解されている。

【００６２】推定アドレノメジュリン受容体の可能性の
あるアンタゴニストの例としては、抗体、ある場合に
は、推定アドレノメジュリン受容体のリガンドと密接な
関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例
えば、リガンドの断片）、または該受容体と結合するが
応答を誘導しない（それゆえ該受容体の活性を妨げる）
小分子などがある。

【００６３】かくして、他の態様において、本発明は、
推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドのアゴニス
ト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素な
ど、または推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチド
の生産を低下または増加させる化合物を同定するための
スクリーニングキットに関し、このキットは、(a) 推定
アドレノメジュリン受容体ポリペプチド（好ましくは、
配列番号２のポリペプチド）、(b) 推定アドレノメジュ
リン受容体ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポ
リペプチド）を発現する組換え細胞、(c) 推定アドレノ
メジュリン受容体ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）を発現している細胞膜、または(d)
推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチド（好ましく
は、配列番号２のポリペプチド）に対する抗体、を含ん
でなる。このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c)
または (d)が実質的な構成成分であることが理解されよ
う。

【００６４】予防法および治療法 本発明は、推定アドレノメジュリン受容体活性の過剰量
と不足量のどちらにも関係した、感染症（例えば、細
菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特に
ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼
痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パー
キンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗
しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性
前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そ
ううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異
常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツ
レット症候群を含む）および子癇前症などの異常な状態
の治療法を提供する。

【００６５】推定アドレノメジュリン受容体の活性が過
剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能であ
る。一つのアプローチは、リガンドの推定アドレノメジ
ュリン受容体への結合をブロックすることにより、また
は第二シグナルを抑制することで異常な状態を軽減する
ことにより活性化を阻害するのに有効な量で、前記の阻
害剤化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容される担
体とともに患者に投与することを含んでなる。もう一つ
のアプローチでは、リガンドと結合する能力がまだある
可溶性形態の推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチ
ドを、内因性の推定アドレノメジュリン受容体との競合
状態で投与することができる。このような競合剤の典型
的な例は推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドの
断片である。

【００６６】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性推定アドレノメジュリン受容体をコードす
る遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知
技術は、体内で生成されるか別個に投与されるアンチセ
ンス配列の使用を必要とする。例えば、Oligodeoxynucl
eotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor, J
Neurochem (1991) 56:560 を参照のこと。あるいはま
た、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌク
レオチドを供給することもできる。例えば、Leeら, Nuc
leic Acids Res (1979) 6:3073; Cooneyら, Science (1
988) 241:456; Dervanら, Science (1991)251:1360 を
参照のこと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与する
こともできるし、関連オリゴマーをin vivoで発現させ
ることもできる。

【００６７】推定アドレノメジュリン受容体およびその
活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合
も、いくつかのアプローチを取ることができる。一つの
アプローチは、治療上有効な量の推定アドレノメジュリ
ン受容体を活性化する化合物（すなわち、前記のアゴニ
スト）を製剤学上許容される担体とともに患者に投与し
て、異常な状態を緩和することを含んでなる。別法とし
て、患者の関連細胞において推定アドレノメジュリン受
容体を内因的に産生させるために遺伝子治療を用いるこ
とができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌク
レオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構
築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮ
Ａを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質
導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、
パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性の
ウイルス粒子を産生するようになる。in vivoでの細胞
操作およびin vivoでのポリペプチド発現のために、こ
れらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に
関しては、Human Molecular Genetics, T Strachanand
and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (199
6) 中のChapter 20, Gene Therapy and other Molecula
r Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその
中の引用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチ
は、治療量の推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチ
ドを適当な製剤学上の担体と共に投与することである。

【００６８】製剤および投与 可溶性形態の推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチ
ドのようなペプチド、アゴニストおよびアンタゴニスト
ペプチド、または小分子は適当な製剤学上の担体と組み
合わせて製剤化することができる。このような製剤は治
療上有効な量のポリペプチドまたは化合物と、製剤学上
許容される担体または賦形剤を含有する。この種の担体
としては、食塩水、生理食塩水、デキストロース、水、
グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあ
るが、これらに限らない。製剤は投与様式に適合させる
べきであり、これは当技術分野の技量の範囲内である。
本発明はさらに、前記の本発明組成物の１以上の成分を
充填した１以上の容器を含んでなる医薬用パックおよび
キットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合
物は単独で使用しても、他の化合物例えば治療用化合物
と一緒に使用してもよい。

【００６９】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、
筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用でき
る。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、そ
の他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経
皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能で
ある。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤
形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。

【００７０】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。

【００７１】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。

【００７２】

【実施例】実施例１： 哺乳動物細胞による発現 ヒト胚腎臓 293 (ＨＥＫ293)細胞または接着dhfrＣＨＯ
細胞のいずれかで本発明の受容体を発現させる。受容体
の発現を最大限高めるために、一般的には、ｐＣＤＮま
たはｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入する前に、受容体ｃＤ
ＮＡから全部の5'および3'非翻訳領域（ＵＴＲ）を除去
する。リポフェクションを用いて細胞を個々の受容体ｃ
ＤＮＡによりトランスフェクトし、400 mg/ml のＧ４１
８の存在下で選択する。３週間の選択後、個々のクロー
ンを取り上げ、更なる分析のため増殖させる。ベクター
のみでトランスフェクトしたＨＥＫ293 またはＣＨＯ細
胞を陰性対照として用いる。各受容体を安定して発現し
ている細胞系を分離するため、一般的には約２４個のク
ローンを選択し、ノーザンブロットにより分析する。受
容体ｍＲＮＡは、通常、分析したＧ４１８耐性クローン
の約５０％において検出可能である。

【００７３】実施例２： 結合および機能アッセイ用の
リガンドバンク スクリーニングのために２００以上の推定受容体リガン
ドを含むバンクが構成されている。このバンクには、ヒ
ト７回膜貫通（７ＴＭ）受容体を介して作用することが
知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイン；ヒ
ト７ＴＭ受容体の推定上のアゴニストでありうる天然の
化合物；哺乳動物の等価物がまだ同定されていない非哺
乳動物の生理活性ペプチド；および天然には見いだせな
いが未知の天然リガンドと共に７ＴＭ受容体を活性化す
る化合物が含まれる。このバンクは、結合アッセイと機
能（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオ
メーター(microphysiometer)、卵母細胞の電気生理学な
ど、下記参照）アッセイの両方を用いて、既知リガンド
について該受容体を最初にスクリーニングするために使
用される。

【００７４】実施例３： リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは受容体の薬理を確かめるための
直接的な方法を提供するもので、高処理量のフォーマッ
トに適応可能である。結合実験のために、受容体の精製
したリガンドを高比活性（50〜2000 Ci/mmol) に放射性
標識する。次に、この放射性標識化のプロセスが受容体
の方へ向かうリガンドの活性を弱めないことを確認す
る。膜受容体源と全細胞受容体源の両方に使用可能なシ
グナル対ノイズ比を確立するために、緩衝液、イオン、
ｐＨおよび他のモジュレーター（例えば、ヌクレオチ
ド）についてのアッセイ条件を最適化する。これらのア
ッセイでは、特異的な受容体結合を、過剰の未標識競合
リガンドの存在下で測定した放射能を全結合放射能から
引いた放射能値として規定する。可能な場合は、２以上
の競合リガンドを用いて残留非特異的結合を規定する。

【００７５】実施例４： ツメガエル卵母細胞による機
能アッセイ 本発明の受容体ｃＤＮＡをコードする線状プラスミド鋳
型からのキャップされたＲＮＡ転写物を、標準的な手法
に従ってＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitroで合成す
る。このin vitro転写物を0.2 mg/mlの最終濃度で水中
に懸濁する。成熟雌カエルから卵巣葉(ovarian lobes)
を摘出し、卵胞を取り除いた第Ｖ期の卵母細胞を得、マ
イクロインジェクション装置を使って50 nlボーラスで
ＲＮＡ転写物（卵母細胞につき10 ng)を注入する。２個
の電極電圧クランプを用いて、アゴニストへの暴露に応
答して発生した個々のツメガエル卵母細胞からの電流を
測定する。Ｃａ²⁺不含のBarth培地中で室温にて記録す
る。このツメガエル系は活性化用リガンドに関して既知
のリガンドおよび組織／細胞抽出物をスクリーニングす
るのに使用できる。

【００７６】実施例５： ミクロフィジオメトリックア
ッセイ さまざまな第二メッセンジャー系を活性化すると、細胞
から少量の酸が排出される。この酸は主に細胞内シグナ
ル伝達プロセスを刺激するのに必要とされる代謝活性の
増強の結果として生成される。この細胞の周辺培地のｐ
Ｈ変化はごくわずかであるが、CYTOSENSORミクロフィジ
オメーター (Molecular Devices Ltd.,Menlo Park, CA)
により検出可能である。かくして、このCYTOSENSOR
は、本発明のＧタンパク質共役受容体のような、細胞内
シグナル伝達経路を利用するエネルギーと共役する受容
体の活性化を検出することが可能である。

【００７７】実施例６： 抽出物／細胞上清スクリーニ
ング 多数の哺乳動物受容体は、コグネイト(cognate)活性化
用リガンド（アゴニスト）が今のところまだ見いだされ
ていない。それゆえ、これらの受容体の活性リガンドは
これまでに同定されたリガンドバンクに含まれていない
可能性がある。したがって、本発明の７ＴＭ受容体も、
天然リガンドを同定するために組織抽出物に対して機能
的に（カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメータ
ー、卵母細胞の電気生理学などの機能スクリーンを用い
て）スクリーニングされる。活性化用リガンドが単離・
同定されるまで、陽性の機能応答をもたらした抽出物を
順次サブ分画化する。

【００７８】実施例７： カルシウムおよびｃＡＭＰ機
能アッセイ ＨＥＫ293 細胞において発現された７ＴＭ受容体は、Ｐ
ＬＣおよびカルシウムの動員の活性化および／またはｃ
ＡＭＰの刺激または阻害に機能的に共役することが判明
した。受容体−トランスフェクト細胞またはベクター対
照細胞におけるＨＥＫ293 細胞での基底カルシウムレベ
ルは、正常な100 nM〜200 nMの範囲にあることが観察さ
れた。組換え受容体を発現しているＨＥＫ293 細胞にfu
ra 2を添加し、一日で150を超える選択したリガンドま
たは組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導カルシウム動員
に関して評価する。同様に、組換え受容体を発現してい
るＨＥＫ293 細胞を、標準的なｃＡＭＰ定量アッセイを
用いて、ｃＡＭＰ生成の刺激または阻害について評価す
る。カルシウムの一過性動員またはｃＡＭＰの変動を示
すアゴニストをベクター対照細胞において試験し、その
応答が受容体を発現しているトランスフェクト細胞に特
異なものであるかを調べる。さらに、推定アドレノメジ
ュリン受容体は、ノーザンブロット法でスクリーニング
したとき、心臓、骨格筋、胎盤および膵臓においてｍＲ
ＮＡの高発現を示した。

【００７９】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SmithKline Beecham Laboratoires Pharmaceutiques SmithKline Beecham Corp <120> Novel Compounds <130> PA98-310 <150> EP 97402960.5 <151> 1997-12-8 <150> US 60/070487 <151> 1998-1-5 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 1086 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggatctgc atctcttcga ctactcagag ccagggaact tctcggacat cagctggcca 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac ctgtgggttg tcctcaccat cccagtctgg 300 gtggtcagtc tcgtgcagca caaccagtgg cccatgggcg agctcacgtg caaagtcaca 360 cacctcatct tctccatcaa cctcttcggc agcattttct tcctcacgtg catgagcgtg 420 gaccgctacc tctccatcac ctacttcacc aacaccccca gcagcaggaa gaagatggta 480 cgccgtgtcg tctgcatcct ggtgtggctg ctggccttct gcgtgtctct gcctgacacc 540 tactacctga agaccgtcac gtctgcgtcc aacaatgaga cctactgccg gtccttctac 600 cccgagcaca gcatcaagga gtggctgatc ggcatggagc tggtctccgt tgtcttgggc 660 tttgccgttc ccttctccat tatcgctgtc ttctacttcc tgctggccag agccatctcg 720 gcgtccagtg accaggagaa gcacagcagc cggaagatca tcttctccta cgtggtggtc 780 ttccttgtct gctggttgcc ctaccacgtg gcggtgctgc tggacatctt ctccatcctg 840 cactacatcc ctttcacctg ccggctggag cacgccctct tcacggccct gtatgtcaca 900 cagtgcctgt cgctggtgca ctgctgcgtc aaccctgtcc tctacagctt catcaatcgc 960 aactacaggt acgagctgat gaaggccttc atcttcaagt actcggccaa aacagggctc 1020 accaagctca tcgatgcctc cagagtctca gagacggagt actctgcctt ggagcagagc 1080 accaaa 1086 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Leu His Leu Phe Asp Tyr Ser Glu Pro Gly Asn Phe Ser Asp 1 5 10 15 Ile Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Gly Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu Tyr Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９ Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９ ６０９Ａ ６０９Ｊ ６０９Ｇ ６１１ ６１１Ｃ ６１３ ６１３Ａ ６１３Ｅ ６１９ ６１９Ｅ ６２６ ６２６ ６２６Ｆ ６２６Ｋ ６２６Ｌ ６２６Ｎ ６２６Ｅ ６２６Ｂ ６３１ ６３１Ｃ ６３１Ｇ ６３１Ｈ ６３５ ６３５ ６３７ ６３７Ｅ ６４３ ６４３Ｄ 38/00 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 33/566 Ｎ // Ａ６１Ｋ 39/395 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョージ ヘンリー ポスト アメリカ合衆国 19103 ペンシルバニア 州，フィラデルフィア，キング オブ プ ラッシア，スウィードランド ロード709, スミスクライン ビーチャム (72)発明者 ミシェル ルイ スチェット フランス国 メイアンヌ セデックス 53101，ゼッド アイ ドュ ラ ペニエ ール−ビーピー ２，スミスクラインビー チャム ラボラトワール ファーマシュー ティック (72)発明者 フィリップ ロバート フランス国 メイアンヌ セデックス 53101，ゼッド アイ ドュ ラ ペニエ ール−ビーピー ２，スミスクラインビー チャム ラボラトワール ファーマシュー ティック (72)発明者 ステファン クレマン クリーフ フランス国 メイアンヌ セデックス 53101，ゼッド アイ ドュ ラ ペニエ ール−ビーピー ２，スミスクラインビー チャム ラボラトワール ファーマシュー ティック (72)発明者 ベルナルド エミール ジョセフ ゴウト フランス国 メイアンヌ セデックス 53101，ゼッド アイ ドュ ラ ペニエ ール−ビーピー ２，スミスクラインビー チャム ラボラトワール ファーマシュー ティック (72)発明者 イブ マヘ フランス国 メイアンヌ セデックス 53101，ゼッド アイ ドュ ラ ペニエ ール−ビーピー ２，スミスクラインビー チャム ラボラトワール ファーマシュー ティック

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２の推定アドレノメジュリン受
   容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含ん
   でなる単離されたポリヌクレオチド、またはこの単離さ
   れたポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配
   列。
2. 【請求項２】 前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
   の推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドをコード
   する配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列を含んで
   なる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列番号１のポリヌクレオチドである、
   請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に
   記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
   するとき、配列番号２のポリペプチドに対して少なくと
   も９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む推定アド
   レノメジュリン受容体ポリペプチドを産生することがで
   きる発現系を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現系を含有する宿主
   細胞。
7. 【請求項７】 推定アドレノメジュリン受容体ポリペプ
   チドを産生させるのに十分な条件下で請求項６に記載の
   宿主細胞を培養し、この培養物から該ポリペプチドを回
   収することを含んでなる、推定アドレノメジュリン受容
   体ポリペプチドの産生方法。
8. 【請求項８】 宿主細胞が適当な培養条件下で推定アド
   レノメジュリン受容体ポリペプチドを産生するように、
   請求項５に記載の発現系を用いて宿主細胞を形質転換ま
   たはトランスフェクションすることを含んでなる、推定
   アドレノメジュリン受容体ポリペプチドを産生する細胞
   の作製方法。
9. 【請求項９】 配列番号２のアミノ酸配列に対して、そ
   の全長にわたり、少なくとも９９％の同一性を有するア
   ミノ酸配列を含んでなる推定アドレノメジュリン受容体
   ポリペプチド。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請
    求項９に記載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項９に記載の推定アドレノメジュ
    リン受容体ポリペプチドに免疫特異的な抗体。
12. 【請求項１２】 請求項９に記載の推定アドレノメジュ
    リン受容体ポリペプチドの活性増加または発現増加を必
    要としている患者を治療するための医薬組成物であっ
    て、治療に有効な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアゴニスト、および／ま
    たは(b) 前記ポリペプチド活性のin vivo生産をもたら
    す形の、配列番号２の推定アドレノメジュリン受容体ポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、そ
    の全長にわたり、少なくとも９９％の同一性を有するヌ
    クレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に対して
    相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリ
    ヌクレオチド、を含んでなる医薬組成物。
13. 【請求項１３】 請求項９に記載の推定アドレノメジュ
    リン受容体ポリペプチドの活性または発現を抑制する必
    要がある患者を治療するための医薬組成物であって、治
    療に有効な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアンタゴニスト、および
    ／または(b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチ
    ド配列の発現を抑制する核酸分子、および／または(c)
    前記ポリペプチドのリガンドに関して前記ポリペプチド
    と競合するポリペプチド、を含んでなる医薬組成物。
14. 【請求項１４】 請求項９に記載の推定アドレノメジュ
    リン受容体ポリペプチドの発現または活性と関連した被
    験者の疾病または該疾病への罹りやすさを検出する方法
    であって、 (a) 該被験者由来のゲノム中の推定アドレノメジュリン
    受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に突
    然変異があるかどうかを調べること、および／または
    (b) 該被験者から得られたサンプル中の推定アドレノメ
    ジュリン受容体ポリペプチド発現の存在または量を分析
    すること、を含んでなる方法。
15. 【請求項１５】 請求項９に記載の推定アドレノメジュ
    リン受容体ポリペプチドに対するアゴニストの同定方法
    であって、 (a) 推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドを産生
    する細胞と候補化合物とを接触させること、および(b)
    該候補化合物が推定アドレノメジュリン受容体ポリペプ
    チドの活性化によるシグナルを生じさせるか否かを調べ
    ること、を含んでなる方法。
16. 【請求項１６】 請求項15に記載の方法により同定され
    たアゴニスト。
17. 【請求項１７】 請求項９に記載の推定アドレノメジュ
    リン受容体ポリペプチドに対するアンタゴニストの同定
    方法であって、 (a) 推定アドレノメジュリン受容体ポリペプチドを産生
    する細胞とアゴニストとを接触させること、および(b)
    該アゴニストにより生じたシグナルが候補化合物の存在
    下で消失するか否かを調べること、を含んでなる方法。
18. 【請求項１８】 請求項17に記載の方法により同定され
    たアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 請求項８に記載の方法により作製され
    た組換え宿主細胞、または推定アドレノメジュリン受容
    体ポリペプチドを発現しているその膜。