JP2005503543A - Ｅｐｆ受容体アッセイ、化合物および治療用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＥＰＦおよびそのＥＰＦ関連ペプチドとｈＤＲＲ受容体の相互作用を研究するためのアッセイを提供する。このアッセイはＥＰＦまたは関連ペプチドが受容体に結合できる条件下で、試験化合物がｈＤＲＲ受容体に結合できるかどうかを同定するために有用である。またアッセイは試験化合物がｈＤＲＲのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するためにも有用である。上記のアッセイは、ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとｈＤＲＲの相互作用が、正または負の対照として評価されるか、または試験化合物を用いて得られる結果と比較される競合的、非−競合的および比較アッセイを含む種々の形式で行うことができる。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明はシャペロニン（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）１０としても知られている早期妊娠因子（Ｅａｒｌｙ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ Ｆａｃｔｏｒ：ＥＰＦ）の受容体と相互作用する化合物のアッセイ、ＥＰＦ関連ペプチドならびにそれらの治療的使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＥＰＦおよびミトコンドリアのシャペロニン１０は同一のアミノ酸配列（配列番号４）を有するが、それらは異なる遺伝子によりコードされることができ（非特許文献１）、そして大変異なる生理学的機能を有する。さらにＥＰＦは分泌ペプチドであるが、シャペロニン１０は分泌経路に沿った細胞内小胞に見いだされる。
【０００３】
シャペロニン１０は熱ショックタンパク質のファミリーに属する。ミトコンドリアではこれはミトコンドリアのタンパク質の折り畳みおよび機能に重要な熱ショックタンパク質６０とシャペロニンの複合体を形成する。虚血で、これら２つのタンパク質のアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は脳組織ならびに心筋細胞（非特許文献２）を虚血／再潅流損傷に対して保護することができる（非特許文献３）。
【０００４】
今日までＥＰＦは着床前期ならびに同着床期において、主に胚の発生において重要な因子として知られている（非特許文献４）。これら２つの期におけるその重要性は、その成長調節および免疫調節特性に基づく。これらＥＰＦの作用は、これがインビトロおよびインビボの両方で自己分泌成長因子として機能する初代および腫瘍細胞を増殖させることにより生産されることからも明らかである（非特許文献５）。
【０００５】
ＥＰＦの存在は成功裏の妊娠には欠くことができないと繰り返し確認されてきた。最近Ｃｈｅｎｇ ＳＪ ｅｔ ａｌ．（非特許文献６）は、ＥＰＦレベルが外科的中絶後に急激に低下することを示し、そしてそれ自体、ＥＰＦ活性を監視することが胚のケアおよび正常妊娠の発生に有用な指数であることを示唆している。したがってＥＰＦ活性の抑制は避妊の目的を有することができ、一方ＥＰＦ活性を強化することは流産（ｆｏｅｔａｌ ｌｏｓｓ）を防止することができる。
【０００６】
ＥＰＦは受精後６〜１２時間以内に母体血にすでに分泌され、そしてＥＰＦまたはＥＰＦ−由来または−関連ペプチドはそれゆえに妊娠を診断するための有用な早期マーカーであり得る。そのような診断はヒトの医薬品に有用となるが、獣医学用の応用にも有用である。現在使用されているＥＰＦアッセイ（例えばロゼッタ試験）は煩わしく、しかも信頼性がない。さらにそれらは種々の形態間のＥＰＦを識別しない。したがってＥＰＦ活性を有する（ポリ）ペプチドに対して特異的な抗体に基づく試験、または種々の形態の生物活性ＥＰＦを識別するアッセイ（例えばクロマトグラフィーおよび／または質量分析に基づく）は有意な利点を提供する。ＥＰＦ活性は成功裏の妊娠に欠くことができないと繰り返し確認されてきた。最近Ｃｈｅｎｇ ＳＪ ｅｔ ａｌ．（非特許文献６）は、ＥＰＦレベルが外科的中絶後に急激に低下することを示し、そしてそれ自体、ＥＰＦ活性を監視することが胚の安定（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）および正常妊娠の発生に有用な指数であることを示唆している。したがってＥＰＦ活性の抑制は避妊の目的を有することができ、同時に生理学的ＥＰＦ活性の強化または異常なＥＰＦ活性の矯正は流産を防止することができる。
【０００７】
妊娠は妊娠中に再発率が低下することにより多発性硬化症の発生に正の影響を有することが見いだされた（非特許文献７）。Ｍｏｒｔｏｎ（非特許文献５）により指摘されたように、ＥＰＦは「妊娠中に観察される多発性硬化症の修飾に関与する主要な因子の１つであると考えられている」。妊娠中のＥＰＦの免疫抑制作用の正の効果は、別の自己−免疫疾患である慢性関節リウマチ（非特許文献８）でも観察することができた。
【０００８】
ヒトの系におけるＥＰＦおよびシャペロニン１０の潜在的活性により、ペプチドはペプチドの生物学的効果を強化または消失する化合物を同定することを目的とする実験で標的とされる。しかしＥＰＦおよびシャペロニン１０に関する結合部位が存在することは示されたが、これらペプチドに関する受容体は同定されなかった。既知の受容体の欠如はアッセイの設計を妨げ、そしてＥＰＦまたはシャペロニン１０の生物学的効果を模する、または改変する化合物を見いだし、そして研究する努力を遅らせた。
【０００９】
本発明は、ＥＰＦまたはシャペロニン１０の受容体タンパク質としてヒト後根受容体（ｈｕｍａｎ Ｄｏｒｓａｌ Ｒｏｏｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｈＤＲＲｓ）の同定を導いた逆薬理学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）として当該技術分野におけるこの問題を解決する。この知見を用いて本発明者はさらに、ｈＤＲＲ受容体がリンパ節で発現することが示され、そして染色体１１ｐ１５へのｈＤＲＲの染色体マッピングによりそれらが多数のリンパ芽球性白血病に関係したので、ＥＰＦの免疫抑制特性を実証する。さらにＥＰＦまたはシャペロニン１０生物学的効果を模する、または改変する化合物を同定するためのアッセイならびにそれらの薬理学的使用を提供する。
【００１０】
ｈＤＲＲｓは、細胞外Ｎ−末端、膜貫通ドメインを推定上構成する７個の疎水性アルファヘリックスおよび細胞内Ｃ−末端ドメインを特徴とする共通の構造的組織を共有するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）のファミリーに属する。ＧＰＣＲｓは伝達Ｇタンパク質の活性化を介して細胞内シグナルを誘起する種々のリガンドに結合する（非特許文献９；１０）。
【００１１】
最近の総説（非特許文献１１；１２）は、市販されている有用な薬剤の標的として使用されているＧＰＣＲｓの数を２５も数え、これは１４０種の特性決定されたクローン化ヒトＧＰＣＲｓの１８％を構成する。完全に配列決定されたゲノム（酵母、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅ））からの外挿により、期待される３０，０００個のヒト遺伝子から５０００個のヒトＧＰＣＲｓがこの３年間の間に見いだされるであろうという予測が導かれる。この数に準じて、これら新規オーファンＧＰＣＲｓの１５０個が、次の１０年間に経済的に興味深い薬剤の標的に開発されるはずである。この計算は現在、開発中のものの基礎になっているさらに特性決定されるＧＰＣＲｓは考慮していない。
【００１２】
一般にオーファンＧＰＣＲｓに関する逆薬理学は種々の疾患の処置に関する新規な取り組みをもたらし、これは現行法では競争にならないか（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）、または現在の手段によっては処置することができない状態の処置を可能とする。これはオーファンＧＰＣＲリガンド同定（オーファニンＦＱ（非特許文献１３）、オレキシン（非特許文献１４）、プロラクチン−放出ペプチド（非特許文献１５）、アペリン（非特許文献１６）に関する最近の報告により実証されたので、製薬産業ではすでに認識されている。
【００１３】
ヒト後根受容体１〜６の核酸およびポリペプチド配列は、１９９９年７月１日に公開された特許文献１に記載された。ラット後根受容体に対するそれらの相同性に基づき、この文書は知覚脱失および痛覚脱失用の新規薬剤を同定するためのアッセイにそれらの使用を含め、ｈＤＲＲ受容体が疼痛の伝達、モジュレーションおよび知覚に関与することを記載している。この特許文献１では、後根神経節の位置が胎児後根神経節においてｈＤＲＲ５について確認された。しかし後根神経節を含めこれまで調査されたヒト成人組織に関しては、ｈＤＲＲ特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出することができなかった。さらにこの出願（特許文献１）に開示されたｈＤＲＲ受容体のいずれについても、自然のリガンドは同定できなかった。この受容体のアンギオテンシンＩＩおよびＩＩＩを用いた刺激に基づく、前記出願（特許文献１）でのアンギオテンシン受容体としてのｈＤＲＲ４の特性決定は、本発明者により確認できなかった。
【００１４】
別のヒト後根受容体、ｈＤＲＲ７について、核酸およびポリペプチド配列が２００１年３月８日に公開された特許文献２および２００１年３月２２日に公開された特許文献３に記載された。これらいずれの明細書においても、ｈＤＲＲ７受容体に関するリガンドは同定されなかった。特許文献２ではｈＤＲＲ７受容体はＴｈｅＡｎｔと呼ばれ、該ポリペプチドに関係する多数の条件を開示する。しかしこの受容体が挙げたいずれかの疾患状態に関連する実質的証拠は提供されていない。特許文献３ではｈＤＲＲ７受容体はソマトスタチン３受容体と低い配列類似性を持つＧＰＣＲとして一般に記載されている。
【００１５】
したがってｈＤＲＲｓに関する自然なリガンドを用いた競合を使用する、またはｈＤＲＲｓと自然なリガンドとの相互作用の比較を使用するアッセイは記載されていない。後者は受容体の機能および疾患状態との関連を解明するための薬理学的ツールとしてｈＤＲＲｓを使用するためには必須である。本発明は当該技術分野におけるこの問題を解決し、そしてｈＤＲＲｓとＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとの相互作用を使用するアッセイを提供して、候補化合物がｈＤＲＲｓのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する。
【００１６】
最近になってＬｅｍｂｏ ｅｔ ａｌ（非特許文献１７）は、知覚ニューロン−特異的Ｇタンパク質共役−受容体４（Ｓｅｎｓｏｒｙ−Ｎｅｕｒｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇタンパク質共役−受容体４：ＳＮＳＲ４）またはＭａｓ関連遺伝子受容体１（Ｍａｓ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １：ｈＭｒｇＸ１）としても知られているｈＤＲＲｓ４受容体が、オピオイドペプチド前駆体プロエンケファリンＡの遺伝子産物により強力に活性化されることを示しただけである。特に侵害受容（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）の制御に関与することが知られているＢＡＭ２２およびＢＡＭ２２断片は、ＦＬＩＰＲに基づくカルシウムアッセイでｈＤＲＲを活性化することが示された。
【００１７】
本発明はＥＰＦおよびＥＰＦ関連ペプチドがｈＤＲＲ４およびｈＤＲＲ７受容体の両方を活性化することを示した。さらにｈＤＲＲ４は主に後根および三叉神経節で発現することが示された（非特許文献１７）が、ｈＤＲＲ７については今、この受容体が主にリンパ節で発現することが示された。この受容体の特異的発現パターンはリガンド活性化に応答する異なる機能性を示唆している。
【００１８】
したがって受容体が関連する障害を処置するために有用な受容体−特異的化合物を設計することができれば有益であろう。ｈＤＲＲ４およびｈＤＲＲ７のリガンドとしてＥＰＦおよびＥＰＦ関連ペプチドの同定は今、疼痛の伝達、モジュレーションおよび知覚に関与するｈＤＲＲをモジュレートすることができる化合物を同定するためのインビトロスクリーニング法の開発の基礎を提供する。さらに化合物は避妊薬（ａｎｔｉｃｏｎｃｅｐｔｉｖｅ）として、知覚脱失および痛覚脱失に、および慢性関節リウマチ、多発性硬化症または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような免疫抑制作用が望まれる他の状態のようなｈＤＲＲ媒介障害をモジュレートすることができるか、または移植拒絶を防止するための化合物の同定に有用である。
【００１９】
本発明のこれらのおよび他の観点を本明細書で以下に記載する。
【特許文献１】
国際公開第９９／３２５１９号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第０１／１６１５９号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第０１／１９９８３号パンフレット
【非特許文献１】
Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｋ．Ｍ．， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ， Ｂ．Ｈ．， Ｍａｃａｒａｎａｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｏｍｏｄｅｖｉｌｌａ−Ｔｏｒｒｅｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｍ．，Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｐｕｒｒ，Ｎ．Ｋ．，Ｃａｓｓａｄｙ，Ａ．Ｉ．，ａｎｄ Ｃａｖａｎａｇｈ，Ａ．Ｃ．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４（６），１９９８，３１５−３２６
【非特許文献２】
Ｌａｕ，Ｓ．，Ｐａｔｎａｉｋ，Ｎ．，Ｓａｙｅｎ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍｅｓｔｒｉｌ， Ｒ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９６（７），１９９７，２２８７−２２９４．
【非特許文献３】
Ｈｉｃｋｅｙ，Ｒ．Ｗ．，Ｚｈｕ，Ｒ．Ｌ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｊｉｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｓｔｅｔｌｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｐ．Ｍ．，，ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｓ．Ｈ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９（１−２），２０００，１６９−１７３．
【非特許文献４】
Ａｔｈａｎａｓａｓ−Ｐｌａｔｓｉｓ，Ｓ．，Ｃｏｒｃｏｒａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｋａｙｅ，Ｐ．Ｌ．，Ｃａｖａｎａｇｈ，Ａ．Ｃ．，ａｎｄ Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４３（４），２０００，２２３−２３３
【非特許文献５】
Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７６（６），１９９８，４８３−４９６
【非特許文献６】
Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｏｃｔ；４４（４）：２１１−３
【非特許文献７】
Ｃｏｎｆａｖｒｅｕｘ，Ｃ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｍ．，Ｈｏｕｒｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｏｒｔｉｎｏｖｉｓ−Ｔｏｕｒｎｉａｉｒｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍｏｒｅａｕ，Ｔ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３９（５），１９９８，２８５−２９１
【非特許文献８】
Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ Ｍａｓｌｏｗ，Ａ．Ｓ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃａｌ ＆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｖｅｙ ４７（５） １９９２， ２９０−２９６
【非特許文献９】
Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．４８：２７７−２９０（１９９３）；Ｆｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５１：３１９−３５３（１９９６）
【非特許文献１０】
Ｆｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５１：３１９−３５３（１９９６）
【非特許文献１１】
Ｓｔａｄｅｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｍａ，Ｄ．Ｊ．（１９９７） ＴＩＰＳ １８，４３０−４３７
【非特許文献１２】
Ｗｉｌｓｏｎ Ｓ．， Ｂｅｒｇｓｍａ Ｄ．Ｊ．，Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｊ．Ｋ．，Ｍｕｉｒ Ａ．Ｉ．，Ｆａｎｔｏｍ Ｋ．Ｇ．，Ｅｌｌｉｓ Ｃ．，Ｍｕｒｄｏｃｋ Ｐ．Ｒ，，Ｈｅｒｒｉｔｙ Ｎ．Ｃ．，Ｓｔａｄｅｌ Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２５，１３８７−１３９２
【非特許文献１３】
Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，７９２−７９４
【非特許文献１４】
Ｓａｋｕｒａｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｃｅｌｌ ９２，５７３−５８５
【非特許文献１５】
Ｈｉｎｕｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３，２７２−２７６．
【非特許文献１６】
Ｔａｔｅｍｏｔｏ Ｋ，Ｈｏｓｏｙａ Ｍ，Ｈａｂａｔａ Ｙ，Ｆｕｊｉｉ Ｒ，Ｋａｋｅｇａｗａ Ｔ，Ｚｏｕ ＭＸ，Ｋａｗａｍａｔａ Ｙ， Ｆｕｋｕｓｕｍｉ Ｓ，Ｈｉｎｕｍａ Ｓ，Ｋｉｔａｄａ Ｃ，Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｔ，Ｏｎｄａ Ｈ，Ｆｕｊｉｎｏ Ｍ．（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２５１，４７１−４７６
【非特許文献１７】
Ｌｅｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｉｓｃｉｅｎｃｅ ５，２０１−２０９（２００２）
【発明の開示】
【００２０】
発明の要約
本発明はＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドと、ｈＤＲＲ受容体の相互作用を研究するためのアッセイを提供する。このアッセイはＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドが受容体に結合できる条件下で、試験化合物がｈＤＲＲｓに結合できるかどうかを確認するために有用である。またこのアッセイは、試験化合物がｈＤＲＲｓのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するためにも有用である。上記アッセイはＥＰＦまたは関連ペプチドとｈＤＲＲｓとの相互作用を正または負の対照として評価するか、または試験化合物を用いて得られた結果を比較する競合、非競合および比較アッセイを含む種々の形式で行うことができる。
【００２１】
別の観点では、本発明はアミノ酸配列（ＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥＲＳＡ（配列番号８））を有するＥＰＦのｈＤＲＲ結合断片をコードする単離され、そして精製されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子、ならびにそれらの診断的および治療的使用に関する。
【００２２】
したがって本発明は、ｈＤＲＲ受容体に結合し、そして活性化する、アミノ酸配列（（ＬＧＫＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥ（配列番号１８））、（（ＬＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥ（配列番号１９））、（（ＬＧＫＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬ（配列番号２０））および（（ＬＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬ（配列番号２１））を有するＥＰＦ関連ペプチドをコードする単離され、そして精製されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子、ならびにそれらの診断的および治療的使用に関する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は本発明により提供されるアッセイで同定される化合物を含んでなる製薬学的組成物、ならびにそれらの避妊薬として、ならびに限定するわけではないが；移行性上皮ガン、脂肪肉腫、腺ガン、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄単球性白血病、骨肉腫のようなガンを含む特定の疾患の処置；該化合物の時、不応性貧血；慢性関節リウマチ、多発性硬化症のような自己免疫疾患、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような免疫抑制作用が望まれる他の状態の処置に関連した、または移植拒絶を防止するための治療的使用に関する。
【００２４】
さらなる観点では、本発明はｈＤＲＲを含む細胞画分からのｈＤＲＲの単離法を提供し、この方法は細胞画分を溶質支持体に固定化されたＥＰＦまたはそれらのｈＤＲＲ結合断片と接触させ、そしてそれらから溶出することを含んでなる。
詳細な説明
本発明はＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとｈＤＲＲ受容体との相互作用を利用するアッセイを提供する。シェペロニン１０としても知られているＥＰＦおよびＥＰＦ関連ペプチドは、受容体に結合した時に受容体を活性化し、そして膜中のイノシトール脂質を加水分解するホスホリパーゼＣの活性化を導いてイノシトールトリホスフェートを放出し、これが次に細胞内にカルシウムを動員する（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）ｈＤＲＲｓの高親和性リガンドである。このアッセイはｈＤＲＲｓのリガンドである、またはｈＤＲＲ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を同定する方法、ならびに患者の処置におけるそれらの使用を提供する。
【００２５】
本明細書で使用する「ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチド」とは配列番号４のアミノ酸配列を有するシェペロニン１０としても知られている早期妊娠因子、またはＥＰＦ関連ペプチドを称し、ここで該関連ペプチドは前述の配列からＥＰＦをコードするアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸の置換、削除および／または付加により派生し、そしてここで該ＥＰＦ関連ペプチドは本発明に従いｈＤＲＲ４受容体タンパク質に結合することができる。好適な態様では、該ＥＰＦ関連ペプチドは配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合領域を含んでなる。より好適な態様では、該ＥＰＦ関連ペプチドは配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合領域からなる。さらなる態様では、ＥＰＦ関連ペプチドは（（ＬＧＫＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥ（配列番号１８））、（（ＬＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥ（配列番号１９））、（（ＬＧＫＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬ（配列番号２０））および（（ＬＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬ（配列番号２１））からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。本発明の別の観点では、ＥＰＦ関連ペプチドは（配列番号１８）、（配列番号１９）、（配列番号２０）および（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる。
【００２６】
特別な態様では、本発明によるアッセイにおいてｈＤＲＲ受容体ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を含んでなるｈＤＲＲ４受容体タンパク質、あるいは配列番号１２のアミノ酸配列またはその断片を含んでなるｈＤＲＲ７受容体タンパク質のいずれかである。
【００２７】
用語「その断片」は、該断片がもとのタンパク質中で５以上の連続するアミノ酸を含んでなるような、配列が本明細書に開示されたタンパク質分子の一片（ａ ｐｉｅｃｅ）またはサブ−領域（ｓｕｂ−ｒｅｇｉｏｎ）を説明する。用語「その断片」は「機能的断片」を含むことを意図し、ここで単離された断片、片またはサブ−領域は、受容体タンパク質の活性部位、結合部位またはリン酸化部位のような機能的に明確な領域を含んでなる。機能的断片はクローニング技術により生成されるか、または交互スプライシング技術の天然産物でよい。
【００２８】
用語「由来する」とは一片またはサブ−領域が元の配列と高度な配列関連性を有するような、配列が本明細書に開示されたタンパク質分子の一片またはサブ−領域を説明する。該関連性は元の配列に対して配列同一性の程度を決定することにより定量することができ、ここで高度な配列関連性とは、ローカルな並列配置を使用して決定される、元の配列に対して少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を有する単離されたペプチドまたはポリペプチドを称する。
【００２９】
２以上の配列の同一性および類似性を比較するための方法は、当該技術分野では周知である。すなわち例えばウィンコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｎｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン９．１（Ｄｅｖｒｅｕｘ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３８７−３９５，１９８４）で入手可能なプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して２つのポリヌクレオチド間の％同一性および２つのペプチドまたはポリペプチド配列間の％同一性および％類似性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７，１９５−１９７，１９８１）の「部分的相同性（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」アルゴリズムを使用し、そして２つの配列間で最高の類似性の１つの領域を見いだす。ＢＥＳＴＦＩＴは長さが等しくない２つのポリヌクレオチドまたは２つのペプチドまたは２つのポリペプチド配列を比較するためにより適し、そのプログラムはより短い配列がより長いものの一部を表す。対照的にＧＡＰは２つの配列を並べ、Ｎｅｅｄｌｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに従い「最大類似性」を見いだす。ＧＡＰはおよそ同じ長さの配列を比較するためにより適し、そして整列は全長にわたると期待される。好ましくは各プログラムで使用するパラメーター「ギャップ加重値（Ｇａｐ Ｗｅｉｇｈｔ）」および「長さの加重値（Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ）」はそれぞれ、ポリヌクレオチド配列に関しては５０および３であり、そしてポリペプチド配列に関しては１２および４である。好ましくは％同一性および類似性は、比較される２つの配列が最適に並列配置された時に決定される。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも当該技術分野では知られており、例えばＢＬＡＳＴファミリーのプログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，１９９７）。
【００３０】
本明細書で使用する「化合物」は、任意のサイズの原子の有機的または無機的集成体であり、そして低分子（約２５００ダルトン未満）、またはより大きな分子、例えばペプチド、ポリペプチド、全タンパク質およびポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書で使用する「試験」化合物は、該試験化合物がｈＤＲＲ受容体ポリペプチドのリガンドとなるかどうかを試験で使用して評価される化合物である。試験化合物はｈＤＲＲ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストでもよい。試験化合物がｈＤＲＲの実際のリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうか、ポリペプチドを本発明に従いアッセイで決定する。
【００３２】
本明細書で使用する「リガンド」はｈＤＲＲ受容体に結合することができる化合物であり、ここで受容体に結合するとリガンド−受容体複合体の立体配置に可能な変化が、第２メッセンジャーを通して生物学的応答の伝達を生じる。該リガンドは受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであることができる。
【００３３】
本明細書で使用する「アゴニスト」は、ｈＤＲＲ受容体のポリペプチドと相互作用し、そして活性化する化合物である。活性化ｈＤＲＲ受容体ポリペプチドは受容体に連結した生化学的経路に変化を誘導し、例えばＧタンパク質によるＧＴＰの開裂を刺激するか、アデニル酸シクラーゼ経路を活性化するか、またはホスホリパーゼＣ経路を活性化することができる。
【００３４】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」はｈＤＲＲ受容体のポリペプチドと相互作用し、そして活性化を阻害または防止する化合物である。
ポリヌクレオチド
したがって第１の態様では、本発明はＥＰＦおよび関連ペプチドとｈＤＲＲ受容体との相互作用を利用するアッセイにおいて、ｈＤＲＲまたはその断片をコードする単離され、そして精製された核酸分子の使用に関し、ここで該核酸分子はＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかである。
【００３５】
第２の態様では、本発明はＥＰＦおよび関連ペプチドとｈＤＲＲ受容体との相互作用を利用するアッセイにおけるＥＰＦまたは関連ペプチドをコードする単離され、そして精製された核酸分子の使用に関し、ここで該核酸分子はＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかである。
【００３６】
本明細書で使用する「単離された」とは問題のポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチド、またはそれらの各断片が、それらのインビボ環境から取り出されたので、それらは限定するわけではないがシークエンシング、制限消化、部位特異的突然変異誘発法および核酸断片については発現ベクターへのサブクローニング、ならびに問題のタンパク質またはタンパク質断片がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を生成し、アミノ酸シークエンシングおよびペプチド消化する機会を可能とする量で得られるような、当業者が操作を行うことができるという事実に関する。したがって本明細書で請求する核酸は全細胞中または細胞溶解物中に、あるいは部分的に、実質的に、または全部が精製された状態で存在することができる。
【００３７】
ポリヌクレオチドは環境的混入物から精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｗａｙ）時、「精製された」と考えられる。すなわち細胞から単離されたポリヌクレオチドは標準的方法により細胞成分から精製された時に実質的に精製されたと考えられるが、化学的に合成した核酸配列はその化学的前駆体から精製された時に実質的に精製されたと考えられる。「実質的に純粋」なタンパク質または核酸は典型的には、サンプルの少なくとも８５％を構成し、より高い割合が好ましい。タンパク質または核酸分子の純度を決定するための１つの方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースのようなマトリックス中での調製物の電気泳動による。純度は染色後の単一バンドの出現により示される。純度を評価するための他の方法には、クロマトグラフィー、マススペクトロメトリーおよび分析的遠心を含む。
【００３８】
用語「その断片」は該断片がもとの核酸分子中で１５以上の連続するヌクレオチドを含んでなるような、配列が本明細書に開示され核酸分子の一片またはサブ−領域を説明する。用語「その断片」は「機能的断片」を含むことを意図し、ここで単離された断片、片またはサブ−領域は、受容体の活性部位、結合部位またはリン酸化部位のような機能的に明確な領域を含んでなる。機能的断片はクローニング技術により生成されるか、または選択的スプライシング技術の天然産物でよい。
【００３９】
特に本発明は本発明によるアッセイにおいて；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるｈＤＲＲ４をコードする核酸分子；
（ｂ）ｈＤＲＲ４をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的な核酸分子；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として、縮重したヌクレオチド配列を含んでなるｈＤＲＲ４タンパク質をコードする核酸分子、
からなる群から選択される員を含んでなるｈＤＲＲ４をコードする単離され、そして精製された核酸分子またはその断片の使用を包含する。
【００４０】
本発明のより好適な態様では、ｈＤＲＲ４をコードする核酸分子は配列番号１からなる。
【００４１】
したがって本発明は本発明によるアッセイにおいて：
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるｈＤＲＲ７をコードする核酸分子；
（ｂ）ｈＤＲＲ７をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的な核酸分子；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として、縮重したヌクレオチド配列を含んでなるｈＤＲＲ７タンパク質をコードする核酸分子、
からなる群から選択される員を含んでなるｈＤＲＲ７をコードする単離され、そして精製された核酸分子またはその断片の使用を包含する。
【００４２】
本発明のさらに好適な態様では、ｈＤＲＲ７をコードする核酸分子は配列番号１１からなる。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は本発明によるアッセイにおいて：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるＥＰＦをコードする核酸分子；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的な核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド分子によりコードされるアミノ酸配列に７０、８０、９０、９５または９９％の配列同一性を有するＥＰＦ関連ペプチドをコードする核酸分子；
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）の任意のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として、縮重したヌクレオチド配列を含んでなるＥＰＦポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される員を含んでなるＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドをコードする単離され、そして精製された核酸分子の使用に関する。
【００４４】
本発明のより好適な態様では、ＥＰＦコーディング核酸分子は配列番号３からなり、そしてＥＰＦ関連ペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片からなる群から選択される。
【００４５】
当業者は、遺伝暗号の縮重によりコードされるアミノ酸（１つまたは複数）またはタンパク質産物の同一性を改変することなく、ヌクレオチド塩基対の多数の「サイレント」置換を配列番号１、配列番号１１または配列番号３として確認される配列中に導入できること認識するだろう。すべてのそのような置換は本発明の範囲内にあるものとする。
【００４６】
本明細書で使用する用語「相補的」または「相補性」とは、プリンおよびピリミジンヌクレオチドが水素結合を通じて会合して二本鎖核酸分子を形成する能力を称する。以下の塩基対は相補性により関係している：グアニンおよびシトシン；アデニンおよびチミン；およびアデニンおよびウラシル。本明細書で使用する「相補的」とは上記関係が２つの一本鎖核酸分子を含んでなる実質的にすべての塩基対に、該分子の全長にわたり適用されることを意味する。「部分的に相補的」とは２つの一本鎖核酸分子の１つの長さがもう１つの分子よりも短いので、１つの分子の一部が一本鎖のままである前記関係を称する。
【００４７】
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対合を通して相補鎖と連結するプロセスを称する。
【００４８】
用語「ストリンジェンシー」とはハイブリダイゼーション条件を称する。高ストリンジェンシー条件は非−相同的塩基の対合を好まない。低ストリンジェンシー条件はこの反対の効果を有する。ストリンジェンシーは例えば温度および塩濃度により変えてもよい。「ストリンジェントな条件」は、４２℃で５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性、剪断サケ精巣ＤＮＡを含んでなる溶液中での一晩インキューベーション、続いてフィルターを０．１ｘＳＳＣ中で約６５℃にて洗浄することを称する。さらに適当なハイブリダイゼーション条件は実施例に記載する。
【００４９】
ｈＤＲＲｓをコードする核酸配列は好ましくは後根神経節で発現し（国際公開第９９／３２５１９号パンフレット）、そしてこれらの神経節は受容体をコードする核酸の単離のための供給源として役立ち得る。他の細胞および細胞系もｈＤＲＲ核酸を単離するための使用に適する。適当な細胞の選択は本明細書に記載するように、細胞抽出物中のまたは全細胞アッセイでｈＤＲＲ活性についてスクリーニングすることにより行うことができる。これらアッセイの１つで後根受容体活性を保有する細胞はｈＤＲＲ核酸の単離に適する。
【００５０】
当該技術分野で知られている任意の様々な手順を使用して、ｈＤＲＲ核酸を分子的にクローン化することができる。１つの方法ではｍＲＮＡを単離し、そして第１鎖ｃＤＮＡ合成を行う。２回目のＤＮＡ合成は第２鎖の生成のために行うことができる。続いて精製されたｈＤＲＲタンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を通した、またはゲノムＤＮＡ配列に由来する配列特異的プライマーを使用したＤＮＡ合成を通したｈＤＲＲ ＤＮＡ断片の特異的なＰＣＲ増幅により、単離されたｃＤＮＡを得ることができる。
【００５１】
好適な１組のプライマーはｈＤＲＲ４前方プライマー（ＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣ）（配列番号５）または配列番号５のヌクレオチド１５〜３４からなるその断片、ｈＤＲＲ４逆プライマー（ＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣ）（配列番号６）または配列番号６のヌクレオチド９〜３０からなるその断片、ｈＤＲＲ７前方プライマー（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＧ）（配列番号１３）およびｈＤＲＲ７逆プライマー（ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣ）（配列番号１４）からなる。
【００５２】
所望により二本鎖ｃＤＮＡは任意の適当なベクター、例えばプラスミドにクローン化することができ、これによりｃＤＮＡライブラリーを形成する。別の方法はバクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクターに構築したｃＤＮＡライブラリーを、配列番号１または配列番号１１の任意の適当な領域を標的とする標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることである。例えばＰＣＲ法：方法および応用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）：Ｍ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，編集、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）を参照にされたい。
【００５３】
原核または真核細胞で増殖させるためにプラスミドまたはファージのような適当なベクター中にｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当業者には周知である［例えばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、同上を参照にされたい］。適当なクローニングベクターは周知であり、そして広く利用することができる。
【００５４】
当業者には他の種類のライブラリー、ならびに他の細胞または細胞型から構築されたライブラリーが、本発明による核酸配列を単離するために有用となり得ることは容易に明白である。他の種類のライブラリーには限定するわけではないが、ヒトおよびマウス以外の他の生物からの他の細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー、およびＹＡＣ（酵母人工染色体）を含むゲノムＤＮＡライブラリーおよびコスミドライブラリーを含む。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野で周知な標準的技法により行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技法は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、第１４章（１９８９）に見いだすことができる。
【００５５】
当業者は多くの場合で単離されたｃＤＮＡ配列は不完全であり、ポリペプチドをコードする領域はｃＤＮＡの５’末端で短いと考えるだろう。これは逆転写酵素、本来低い「プロセッシビティ（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」（重合反応中に酵素が鋳型に付いたままである能力の尺度）を持つ酵素の結果であり、第１鎖のｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成することができない。
【００５６】
完全長ｃＤＮＡを得るために、または短いｃＤＮＡを延長するために当業者が利用でき、そして周知な方法が幾つかあり、例えばｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ）（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，８９９８−９００２）、またはこの技法の最近の修飾に基づくものである。
ポリペプチド
また本発明は、ＥＰＦおよび関連ペプチドとｈＤＲＲ受容体との相互作用を利用するアッセイにおいて、ｈＤＲＲ受容体タンパク質またはその断片の使用に関し、ここで該ポリペプチドは本発明に従い単離され、そして精製された核酸分子によりコードされる。
【００５７】
本発明のさらなる観点では、ｈＤＲＲ受容体タンパク質は：
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するｈＤＲＲ４をコードする単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片；
ｉｉ）表面に配列番号２のアミノ酸配列を有する受容体タンパク質またはその断片を発現する細胞；または
ｉｉｉ）表面に配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択されるｈＤＲＲ４受容体である。
【００５８】
好適な態様では、ｈＤＲＲ４受容体タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を含んでなる。より好適な態様では、ｈＤＲＲ４受容体タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列またはその断片からなる。
【００５９】
本発明のさらなる観点では、ｈＤＲＲ受容体タンパク質は：
ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するｈＤＲＲ７をコードする単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片；
ｉｉ）表面に配列番号１２のアミノ酸配列を有する受容体タンパク質またはその断片を発現する細胞；または
ｉｉｉ）表面に配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択されるｈＤＲＲ７受容体である。
【００６０】
好適な態様では、ｈＤＲＲ７受容体タンパク質は配列番号１２のアミノ酸配列またはその断片を含んでなる。より好適な態様では、ｈＤＲＲ７受容体タンパク質は配列番号１２のアミノ酸配列またはその断片からなる。
【００６１】
用語「その断片」は該断片がもとのタンパク質中の５以上の連続するアミノ酸を含んでなるような、配列が本明細書に開示されたタンパク質分子の一片またはサブ−領域を説明する。用語「その断片」は「機能的断片」を含むことを意図し、ここで単離された断片、片またはサブ−領域は、受容体タンパク質の活性部位、結合部位またはリン酸化部位のような機能的に明確な領域を含んでなる。機能的断片はクローニング技術により生成されるか、または選択的スプライシング技術の天然産物でよい。
【００６２】
さらなる観点では、本発明は本発明によるアッセイにおけるＥＰＦおよび関連ペプチドの使用に関する。好適な態様では、ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドは；
ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるＥＰＦをコードする単離されたポリペプチド；
ｉｉ）ＥＰＦに由来し、そしてｈＤＲＲ４に結合することができる単離されたポリペプチド；
ｉｉｉ）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるＥＰＦ関連ペプチドをコードする単離されたポリペプチド；または
ｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片を含んでなる単離されたポリペプチド、
からなる群から選択される。
【００６３】
本発明のより好適な態様では、ＥＰＦは配列番号４によりコードされるアミノ酸配列からなり、そしてＥＰＦ関連ペプチドは配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、または配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００６４】
本発明による受容体タンパク質およびペプチドは、すべての可能な保存的アミノ酸の変化を含み、ここで「保存的アミノ酸の変化」とは、特定のアミノ酸の認識されている置換性（例えばＭ．Ｄａｙｈｏｆｆ、タンパク質配列および構造の地図で（Ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、第５巻、追補３、３４５〜３５２頁、１９７８を参照にされたい）に基づき、元の分子の生物学的な活性に影響を及ぼさずに元の受容体タンパク質またはペプチドの１以上のアミノ酸残基（１つまたは複数）の置換を称する。
【００６５】
当業者は本発明によるポリペプチド、すなわちｈＤＲＲ４受容体タンパク質、ｈＤＲＲ７受容体タンパク質およびＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドが、例えばハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、またはデノボＤＮＡ合成を含む複数の組換えＤＮＡ技法により得ることができると認識している（例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１４章（１９８９）を参照にされたい）。
【００６６】
本発明のペプチドおよび誘導体は、十分に確立された標準的な液体、好ましくは固−相ペプチド合成法に従い容易に調製することができ、その一般的説明は広く入手可能であり、あるいはそれらは溶液中で液相法により、または固−相、液相および溶液化学の任意の組み合わせにより調製することができる。
【００６７】
例として本発明のポリペプチドはＲａｉｎｉｎＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘペプチド合成器を使用したＮ−ａ−９−フルオレニルメチルオキシカルボニルまたはＦｍｏｃ固相ペプチド合成化学を採用することにより合成することができる。
【００６８】
アミノ酸を、鎖を延ばすペプチド樹脂にカップリングするために使用する標準的サイクルは一般に以下を含む：（１）ペプチド−樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３０秒間、３回洗浄する；（２）アミノ末端上のＦｍｏｃ保護基は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて各１５分間、２回洗浄する脱保護により除去し、その工程間、ペプチド樹脂の沈降を防ぐために１０秒毎に１秒間、反応容器に窒素を通気することにより混合を行う；（３）ペプチド樹脂をＤＭＦで３０秒間、３回洗浄する；（４）等量の適当なアミノ酸のＦｍｏｃ誘導体の２５０ｍＭ溶液およびＤＭＦ中４００ｍＭ Ｎ−メチルモルホリンおよび２５０ｍＭ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−４））−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＨＴＵ）からなるアクチベーターミックスを加えることによりペプチド樹脂にアミノ酸をカップリングし；（５）溶液を４５分間混合し；そして（６）ペプチド−樹脂をＤＭＦで３０秒間、３回洗浄する。
【００６９】
このサイクルは必要に応じて、適当なアミノ酸を用いて順次に繰り返して所望するペプチドを生成することができる。このサイクルの例外は、それらの疎水性によりカップリングが難しいと予測されるアミノ酸、または合成中にヘリックス形成内に包含されることが予想されるアミノ酸である。これらの状況では、上記サイクルは最初の４５分のカップリング工程の完了で直ちに目的アミノ酸を「二重カップリング」させるために工程４を繰り返すことにより変更することができる。ペプチド合成の第１カップリング工程は最初のＤＭＦ洗浄で混合時間を３回の３０秒間の洗浄ではなく３回の１５分間の洗浄に増すことにより樹脂を膨潤させて、より効率的なカップリングとすることができる。
【００７０】
合成後、ペプチドは樹脂から以下のように開裂させることができる：（１）ペプチド−樹脂をＤＭＦで３０秒間、３回洗浄する；（２）アミノ末端上のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン中で１５分間、２回洗浄することにより除去する；（３）ペプチド−樹脂をＤＭＦで３０秒間、３回洗浄する；そして（４）９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．４％水、２．４％フェノールおよび０．２％トリイソプロピシランからなる開裂カクテルをペプチド−樹脂と２時間混合し、次いで開裂カクテル中のペプチドを樹脂から濾過し、そして２容量のエチルエーテルを加えることにより溶液のペプチドを沈殿させる。
【００７１】
ペプチドを単離するために、エーテルペプチド溶液を−２０℃で２０分間静置し、次いで６，０００ｘＧで５分間遠心してペプチドをペレットとすることができる。ペプチドをエチルエーテルで洗浄して残る開裂カクテル成分を除去する。最終的なペプチド生成物は逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により０．１％ＴＦＡからなる第１溶媒を用いて精製し、８０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡからなる溶出バッファーで溶出する。精製したペプチドは粉末に凍結乾燥することができる。
【００７２】
精製した生物学的に活性なｈＤＲＲタンパク質は、幾つかの異なる物理形態を有することができる。本発明のポリペプチドは完全長の新生（ｎａｓｃｅｎｔ）または未処理ポリペプチドとして、あるいは部分的に処理されたポリペプチドまたは処理されたポリペプチドの組み合わせとして存在してもよい。完全長の新生ポリペプチドは、中でもとりわけ完全長の新生ポリペプチドの断片の形成を生じる特異的なタンパク質溶解的開裂により翻訳後に修飾され得る。断片または断片の物理的会合は、ｈＤＲＲ４またはｈＤＲＲ７に付随する完全な生物学的活性を有することができる；しかし受容体活性の程度は個々の受容体断片および物理的に会合した受容体ポリペプチド断片の間で変動し得る。
【００７３】
したがって本発明の別の観点では、アミノ酸の削除、付加または置換を有するが、それでも実質的に同じ生物学的活性、すなわち天然のｈＤＲＲポリペプチドのようにＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドに結合する修飾ｈＤＲＲポリペプチドを提供する。ｈＤＲＲポリペプチドは、ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列によりコードされるＥＰＦ関連ペプチドに対して、同じリガンドに対する野生型ｈＤＲＲ受容体ポリペプチドのＥＣ_５０値の１０倍未満の、好ましくは５倍未満のＥＣ_５０値を有する場合、野生型と「実質的に同じ生物学的活性」を有する。ｈＤＲＲ４受容体に関して、１０，６〜１２ｎＭの範囲のＥＣ_５０値が、配列番号８からなるＥＰＦ関連ペプチドに対して決定された。ｈＤＲＲ７受容体に関して、３４５〜８２，９ｎＭの範囲のＥＣ_５０値が、配列番号８からなるＥＰＦ関連ペプチドに対して決定された。
【００７４】
また本発明は、本発明によるＥＰＦおよびＥＰＦ関連ペプチドのエピトープに対する抗体も提供し、抗血清およびそのような抗体のポリクローナルおよびモノクローナル態様の両方およびそのようなモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を含む。本発明のポリペプチドに対して生成された抗体は、ポリペプチドもしくはエピトープを持つ断片、または細胞を動物、好ましくは非−ヒト動物に日常的なプロトコールを使用して投与することにより得られる。
【００７５】
上記の抗体はアフィニティクロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドを精製するために、あるいは本発明の疾患を処置するために使用することができる。また本発明の目的は、ｈＤＲＲ活性に関連する障害に関係する個体の病理学的状態を診断する方法において上記抗体の使用を提供することであり、この方法は；抗体を試験サンプルと接触させ、ここで試験は好ましくは血液、唾液、精液、脳脊髄液、血漿またはリンパ液のような体液からなり；そして該抗体の試験サンプルに対する反応性を測定することを含んでなる。
【００７６】
サンプルに対する抗体の反応性は任意の適当な手段により測定することができる。個々のレポーター分子にタグを付すことも１つの可能性である。
【００７７】
該レポーター分子は直接的または間接的に検出可能な、そして好ましくは測定可能なシグナルを生成することができる。
【００７８】
このように別の観点では本発明は；
ｉ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、または配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片からなる群から選択されるポリペプチド；あるいは
ｉｉ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、または配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片からなる群から選択されるポリペプチドに対する抗体、
を含んでなる診断用キットに関する。
【００７９】
そのような任意のキットにおいて、ｉ）またはｉｉ）が実質的な成分を構成し得ると考えられる。そのようなキットは疾患または疾患に対する罹病性、特に本発明の疾患を診断することに用途がある。
ｈＤＲＲ受容体ポリペプチドの組換え発現
多くのアッセイの重要な観点は、表面に組換えｈＤＲＲ受容体を発現する宿主細胞を提供する工程である。したがってさらなる観点で本発明は、本発明によるアッセイに使用することができるｈＤＲＲ発現ベクターに関する。
【００８０】
本明細書で発現ベクターは適当な宿主中での遺伝子のクローン化コピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義する。そのようなベクターは大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）、シアノバクテリアを含む細菌、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、およびヒトの細胞を含む動物細胞のような種々の宿主中で真核遺伝子を発現するために使用することができる。
【００８１】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞または細胞−真菌細胞または細菌−無脊椎細胞のような宿主間でＤＮＡを運ぶことを可能とする。適当に構築された発現ベクターは：宿主細胞中での自律複製用の複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性および活性化プロモーターを含むことができる。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、そしてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義する。強力なプロモーターは高い頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。発現ベクターには限定するわけではないが、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを含む。
【００８２】
ｈＤＲＲ４またはｈＤＲＲ７をコードする本発明に従い単離され、そして精製された核酸分子は、組換え宿主細胞中で発現させるために発現ベクターにクローン化することができる。組換え宿主細胞は原核または真核細胞でよく、限定するわけではないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、および限定するわけではないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類起源の細胞系を含む哺乳動物細胞、および限定するわけではないがショウジョウバエ−およびカイコに由来する細胞系を含む昆虫細胞を含む。適当でしかも市販されている哺乳動物種に由来する細胞系には、限定するわけではないがＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、 ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、Ｌ−細胞、神経芽細胞腫、グリア細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）を含む。
【００８３】
したがってさらなる態様では、本発明は本発明によるアッセイにおいてｈＤＲＲタンパク質またはその断片をコードする組換え的にクローン化された核酸分子を含む組換え宿主細胞の使用に関する。さらなる観点では、組換え宿主細胞はゲノムＤＮＡであるか、または（配列番号１）およびその断片からなるヌクレオチド配列を有するいずれかの核酸分子を含む。
【００８４】
本発明のさらに好適な態様では、組換え宿主細胞は哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３に配列番号１またはその断片からなるヌクレオチド配列を含んでなるＨＥＫ２９３細胞からなる。
【００８５】
発現ベクターは、限定するわけではないが形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクションおよびエレクトロポレーションを含む多数の技法の１つを介して宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含む細胞はコロニーを増やし、そして分析してそれらがｈＤＲＲ４タンパク質を生産しているかどうかを決定する。受容体を発現している宿主細胞クローンの同定は、限定するわけではないが本発明によるポリペプチドに対する抗体との免疫学的反応性、および宿主細胞に付随するｈＤＲＲ４活性の存在を含む数種の手段により行うことができる。
【００８６】
本発明のタンパク質は、直接的な発現により、あるいは自身により、酵素的もしくは化学的開裂により除去できる別のタンパク質またはペプチドとの翻訳融合物として目的タンパク質を含んでなる融合タンパク質として合成することができる。したがって特定の態様では、本発明は該ポリペプチドが融合タンパク質の一部である本発明のタンパク質を提供する。
【００８７】
さらに例えば上記のＤＲＲポリペプチドをコードする核酸分子をゲノムにすでに含んでなるがそれを発現しないか、または例えば弱いプロモーターにより適当な様式で発現しない哺乳動物細胞を使用し、そして哺乳動物細胞に強力なプロモーターのような調節配列を該受容体ポリペプチドをコードする内因性核酸分子の近位に導入してその発現を誘導することができる。
【００８８】
ヘテロロガスな転写および／または調節配列またはタンパク質の制御下にあるＤＲＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞はそのまま本発明の別の態様である。
【００８９】
この内容において、用語「調節配列」はＤＲＲ受容体コード遺伝子の近位で細胞のゲノムに核酸が組み込まれることにより、ＤＤＲ受容体ポリペプチドの発現を上昇させるために使用することができる該核酸分子を示す。そのような調節配列はプロモーター、エンハンサー、不活性化サイレンサー イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲコード領域、タンパク質および／またはＲＮＡ安定化要素、調節タンパク質、例えばＤＲＲ受容体遺伝子の発現を誘導または誘発することができる転写因子をコードする核酸分子、あるいは遺伝子発現を活性化し、かつ／または遺伝子産物の量を上昇させることが知られている他の遺伝子発現制御因子を含んでなる。該調節配列の導入がＤＲＲ受容体ポリペプチドの発現の上昇および／または誘導を導き、最終的には細胞中のＤＲＲ受容体ポリペプチド量の上昇をもたらす。このように本発明はＤＲＲ受容体ポリペプチドのデノボおよび／または上昇発現を提供することを目的とする。
【００９０】
構築物を宿主細胞に導入することは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質−媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法により行うことができる。そのような方法は、Ｄａｖｉｓ、分子生物学の基本的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８６）のような多くの標準的な研究用マニュアルに記載されている。
【００９１】
さらに本発明によるポリヌクレオチドの発現は、インビトロで生成された合成ｍＲＮＡを使用して行うこともできる。合成ｍＲＮＡまたはｈＤＲＲ生産細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定するわけではないが小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系で効率的に翻訳され、ならびに限定するわけではないがカエルまたはヒキガエルの卵母細胞（アフリカツメガエル：Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）へのマイクロインジェクションを含む細胞に基づく系で効率的に翻訳されることができ、ヒキガエルの卵母細胞へのマイクロインジェクションが一般には好適である。
アッセイ
本発明のアッセイは、生物学的活性について、または結合受容体について化合物をスクリーニングするために一般的に当該技術分野で知られている多くの形式で設計することができる。
【００９２】
本発明のポリペプチドは１以上の疾患状態、特にこれから挙げる疾患を含む１以上の生物学的機能の原因である。したがってｈＤＲＲ受容体の機能を刺激または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング法を考案することが望ましい。
【００９３】
本発明のアッセイは、ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドがｈＤＲＲ受容体ポリペプチドの高親和性リガンドであり、それらに結合してｈＤＲＲ受容体を活性化するという事実を有利に活用する。
【００９４】
したがって本発明はｈＤＲＲ受容体ポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定する方法を含み、ここで該化合物はｈＤＲＲ受容体ポリペプチドのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストである。本発明のアッセイ法は、本アッセイがＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとｈＤＲＲ受容体との相互作用をアッセイに包含する少なくとも１つの工程を含むので、当該技術分野で記載されているアッセイとは異なる。結合の特異性は、ｈＤＲＲ受容体ポリペプチドを表面に発現している細胞に対する化合物の親和性、またはそのような細胞の膜に対する親和性を測定することにより示すことができる。
【００９５】
このように本発明はｈＤＲＲ受容体に結合することができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は；
ａ）ｈＤＲＲまたはその断片を含む供給源を；
ｉ）ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチド
ｉｉ）該試験化合物
とインキューベーションし、そして
ｂ）受容体に結合したＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【００９６】
好適な態様では、本発明はｈＤＲＲ４受容体に結合することができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は；
ａ）ｈＤＲＲ４またはその断片を含む供給源を；
ｉ）ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチド
ｉｉ）該試験化合物
とインキューベーションし、そして
ｂ）受容体に結合したＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【００９７】
本発明のさらなる態様では、ｈＤＲＲ４を含む供給源は；
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を有する単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉ）表面に配列番号２のアミノ酸配列またはその断片をを有するポリペプチド受容体発現する細胞；
ｉｉｉ）表面に配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を有するポリペプチド受容体を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される。
【００９８】
別の態様では、本発明はｈＤＲＲ７受容体に結合することができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は；
ａ）ｈＤＲＲ７またはその断片を含む供給源を；
ｉ）ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチド
ｉｉ）該試験化合物
とインキューベーションし、そして
ｂ）受容体に結合したＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定することを含んでなる。
【００９９】
本発明のさらなる態様では、ｈＤＲＲ７を含む供給源は；
ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列またはその断片を有する単離され、そして精製されたタンパク質；
ｉｉ）表面に配列番号１２のアミノ酸配列またはその断片を有するポリペプチド受容体を発現する細胞；
ｉｉｉ）表面に配列番号１２のアミノ酸配列またはその断片を有するポリペプチド受容体を発現する細胞の膜調製物、
からなる群から選択される。
【０１００】
スクリーニング法は、候補化合物のポリペプチドへの、またはポリペプチドを持つ細胞または膜への、またはそれらの融合タンパク質への結合を、候補化合物に直接的または間接的に結合した標識により単に測定することであり得る。あるいはスクリーニング法は標識した競合物との競合が関与するかもしれない。好適な態様では、この標識競合物は、シャペロニン１０としても知れられているＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドのようなｈＤＲＲへの結合が知られているリガンドである。さらなる態様では、該ＥＰＦ関連ペプチドは配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合断片、または配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１によりコードされるＥＰＦ関連ペプチドからなる。
【０１０１】
したがってより好適な態様では、スクリーニング法は標識ＥＰＦまたは標識ＥＰＦ関連ペプチドを含んでなり、ここで該標識は受容体に結合したＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定するために使用する。
【０１０２】
したがって本発明はｈＤＲＲ４受容体に結合することができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は；
ｉ）表面に配列番号２のアミノ酸配列を有する受容体ポリペプチドを発現する細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞の膜調製物；
ｉｉ）該膜と、配列番号８、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる標識されたＥＰＦ関連ペプチド、好ましくは配列番号８からなるヨウ素化ＥＰＦ関連ペプチドとをインキューベーションし；
ｉｉｉ）試験化合物をインキューベーション混合物に加え；そして
ｉｖ）ｈＤＲＲ４受容体に結合した標識されたＥＰＦ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる。
【０１０３】
同時に本発明はｈＤＲＲ７受容体に結合することができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は；
ｉ）表面に配列番号１２のアミノ酸配列を有する受容体ポリペプチドを発現する細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞の膜調製物；
ｉｉ）該膜と、配列番号８、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２によりコードされるアミノ酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる標識されたＥＰＦ関連ペプチド、好ましくは配列番号８からなるヨウ素化ＥＰＦ関連ペプチドとをインキューベーションし；
ｉｉｉ）試験化合物をインキューベーション混合物に加え；そして
ｉｖ）ｈＤＲＲ７受容体に結合した標識されたＥＰＦ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、
ことを含んでなる。
【０１０４】
さらにこれらのスクリーニング法は候補化合物が、ポリペプチドを持つ細胞に適する検出系を使用してポリペプチドの活性化または阻害により生成するシグナルを生じるかどうかを試験することができる。活性化の阻害は一般に既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在によりアゴニストによる活性化に及ぼす効果が観察される。構成的に活性な受容体ポリペプチドは、逆アゴニストまたはインヒビター用のスクリーニング法において、アゴニストまたはインヒビターの不存在下で候補化合物がポリペプチドの阻害または活性化を生じるかどうかを試験することによりスクリーニング法に使用して、もよい。
【０１０５】
したがって本発明はｈＤＲＲ受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は：
ａ）ｈＤＲＲまたはそれらの機能的断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし；
ｂ）ｈＤＲＲ受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し；そして
ｃ）この効果を、ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドの結合によるｈＤＲＲ受容体の活性と比較する、
ことを含んでなる。
【０１０６】
本発明のさらなる態様では、ｈＤＲＲ受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法におけるｈＤＲＲを含有する供給源が、表面に配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド受容体を発現する細胞である。好適な態様では、該細胞は上記方法で提供されるようなｈＤＲＲ４またはｈＤＲＲ７タンパク質またはその断片をコードする組換え的にクローン化された核酸分子を含む組換え宿主細胞であることができる。ｈＤＲＲ受容体に及ぼすモジュレーターの効果は、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰまたはレポーター遺伝子産物のようなｈＤＲＲ受容体により媒介される細胞内第２メッセンジャー形成のモジュレーションであり得る。ｈＤＲＲはＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）として知られている種類のタンパク質に属する。ＧＰＣＲｓはリガンドに結合すると細胞膜をわたってシグナルを伝達する。リガンドに結合したＧＰＣＲはヘテロ三量体Ｇタンパク質により媒介される、アデニル酸シクラーゼ経路の活性化またはホスホリパーゼＣ−β経路の活性化のような細胞内シグナル発信反応を活性化する。前記の細胞内シグナル伝達反応の活性化を評価するためのアッセイは当該技術分野では一般的に知られており、そして中でもキメラリガンドが誘導する転写因子を含んでなるシグナル伝達に関する細胞に基づくアッセイ、蛍光強度分布分析を使用したＧ−タンパク質共役受容体に関する結合アッセイ、ルミノホアに結合したサイクリックヌクレオチドを使用した細胞−シグナル発信アッセイまたは多応答要素またはｃＡＭＰ応答要素に向けられたレポーターアッセイを使用したＧタンパク質共役受容体からの応答の測定を含む。
【０１０７】
したがって本発明は、ｈＤＲＲ４受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法であって、この方法は：
ａ）ｈＤＲＲ４またはそれらの機能的断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし；
ｂ）ｈＤＲＲ４受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し；そして
ｃ）この効果を、ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとの結合によるｈＤＲＲ４受容体の活性と比較する、
ことを含んでなる。
【０１０８】
好適な態様では本発明は、ｈＤＲＲ４受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法であって、この方法は：
ａ）配列番号２からなるｈＤＲＲ４受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ３および配列番号１０からなるＧα１６をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ３で同時トランスフェクトした（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）宿主細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞；
ｂ）細胞にＦｕｒａ−２、ＦＬＵＯ−３またはＦＬＵＯ−４、好ましくはＦＬＵＯ−３またはＦＬＵＯ−４のようなカルシウム感受性蛍光色素を乗せ；
ｃ）細胞と試験化合物をインキューベーションし；
ｄ）ｈＤＲＲ４受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し；そして
ｅ）この効果をＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとの結合によるｈＤＲＲ４受容体の活性と比較する、ことからなる。
【０１０９】
別の好適な態様では、この方法はｈＤＲＲ４受容体の活性をモジュレートすることができる化合物を同定し、そして得る方法であって：
ａ）配列番号２からなるｈＤＲＲ４受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトした宿主細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞；
ｂ）細胞にＦｕｒａ−２、ＦＬＵＯ−３またはＦＬＵＯ−４、好ましくはＦＬＵＯ−３またはＦＬＵＯ−４、好ましくはＦＬＵＯ−４のようなカルシウム感受性蛍光色素を乗せ；ｃ）細胞と試験化合物をインキューベーションし；
ｄ）ｈＤＲＲ４受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し；そして
ｅ）この効果をＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとの結合によるｈＤＲＲ４受容体の活性と比較する、ことからなる。
【０１１０】
したがって本発明は、ｈＤＲＲ７受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は：
ａ）ｈＤＲＲ７またはそれらの機能的断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし；
ｂ）ｈＤＲＲ７受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し；そして
ｃ）この効果を、ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとの結合によるｈＤＲＲ７受容体の活性と比較する、
ことを含んでなる。
【０１１１】
好適な態様では本発明は、ｈＤＲＲ７受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法を提供し、この方法は：
ａ）配列番号１２からなるｈＤＲＲ７受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ３および配列番号１０からなるＧα１６をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ３で同時トランスフェクトした（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）宿主細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞；
ｂ）細胞にカルシウム感受性蛍光色素、好ましくはＦＬＵＯ−４を乗せ；
ｃ）細胞と試験化合物をインキューベーションし；
ｄ）ｈＤＲＲ７受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し；そして
ｅ）この効果をＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとの結合によるｈＤＲＲ７受容体の活性と比較する、ことからなる。
【０１１２】
別の好適な態様では、ｈＤＲＲ７受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法は：
ａ）配列番号１２からなるｈＤＲＲ７受容体タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトした宿主細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞；
ｂ）細胞にカルシウム感受性蛍光色素、好ましくはＦＬＵＯ−４を乗せ；
ｃ）細胞と試験化合物をインキューベーションし；
ｄ）ｈＤＲＲ７受容体活性に及ぼす試験化合物の効果を、カルシウム感受性蛍光色素の相対的蛍光単位の変化として測定し；そして
ｅ）この効果をＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとの結合によるｈＤＲＲ７受容体の活性と比較する、ことからなる。
【０１１３】
当業者はＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとｈＤＲＲとの相互作用の知見が：
ａ）ｈＤＲＲ上のＥＰＦまたはＥＰＦ誘導体とのリガンド結合部位の構造をプロービングし；
ｂ）結合中にＥＰＦリガンドと相互作用するｈＤＲＲ受容体のリガンド結合部位中の接触原子を同定し；
ｃ）ｈＤＲＲ受容体の活性モジュレートするために、（ｂ）で同定した原子と相互作用する試験化合物を設計し；そして
ｄ）該設計した試験化合物とｈＤＲＲまたはそれらの機能的断片を含む供給源を接触させて、該化合物がｈＤＲＲ活性をモジュレートする能力を測定する、
ことによりポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの構造に基づく、または合理的な設計法にも使用できると考えるだろう。
【０１１４】
さらにこれは通常、反復法になると考えられる。
治療的使用
一般にアゴニストまたはアンタゴニストは、これまでに挙げたような疾患の治療的および予防的目的に使用することができる。化合物は種々の供給源、例えば細胞、無細胞調製物、化学品ライブラリーおよび天然産物の混合物から同定することができる。そのように同定されたアゴニストまたはアンタゴニストは、場合により受容体ポリペプチドの天然または修飾ペプチド、リガンド、酵素等でよく；あるいはそれらの構造的もしくは機能的模造物でもよい（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，免疫学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） １（２）；第５章（１９９１）を参照にされたい）。
【０１１５】
したがって本発明は薬剤としてのＥＰＦ、ＥＰＦ断片またはＥＰＦ関連ペプチドの使用に関し、そしてここで該ＥＰＦ、ＥＰＦ断片またはＥＰＦ関連ペプチドは、疼痛の処置または慢性関節リウマチ、多発性硬化症のような自己免疫疾患、またはＩＢＤのような免疫抑制作用が望まれる他の状態の処置に、あるいは移植拒絶の防止に使用するためのｈＤＲＲ受容体のアゴニストである。好適な態様では、該ＥＰＦ、ＥＰＦ断片またはＥＰＦ関連ペプチドは配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合断片からなリ、あるいは本発明のＥＰＦ関連ペプチドはすなわち配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１からなる群から選択されるポリペプチドからなる。
【０１１６】
したがって本発明はさらに本発明によるアッセイで同定される化合物に関し、ここで該化合物はｈＤＲＲ受容体活性に結合し、かつ／またはモジュレートすることができ、そしてここで該化合物は上記のいずれかのアッセイで決定された受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。さらに本発明は薬剤としての該化合物の使用に関し、そしてここで該化合物は疼痛、または慢性関節リウマチ、多発性硬化症のような自己免疫疾患、またはＩＢＤのような免疫抑制作用が望まれる他の状態の処置に、あるいは移植拒絶の防止に使用するためのアゴニストである。該化合物がｈＤＲＲ受容体ポリペプチドのアンタゴニストである場合、化合物は避妊薬として、流産の防止に、またはガンのような細胞−増殖性疾患の処置に使用することができる。
【０１１７】
また本発明によるアッセイで同定される化合物の使用も提供され、ここで該化合物はｈＤＲＲ受容体活性に結合し、かつ／またはモジュレートすることができ、そしてここで該化合物は上記アッセイのいずれかで決定される受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。さらに本発明は薬剤としての該化合物ｈＤＲＲ特異的化合物の使用に関し、そしてここで該化合物は疼痛の処置に使用するためのアゴニストである。
【０１１８】
同様に本発明は本発明によるアッセイで同定される化合物の使用を提供し、ここで該化合物はｈＤＲＲ７受容体活性に結合し、かつ／またはモジュレートすることができ、そしてここで該化合物は上記の任意のアッセイで同定される受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。さらに本発明は薬剤としての該化合物の使用に関し、そしてここで該化合物は慢性関節リウマチ、多発性硬化症のような自己免疫疾患、またはＩＢＤのような免疫抑制作用が望まれる他の状態の処置に、あるいは移植拒絶の防止に使用するためのアゴニストである。該化合物がｈＤＲＲ７受容体ポリペプチドのアンタゴニストである場合、化合物は避妊薬として、流産の防止に、またはガンのような細胞−増殖性疾患の処置に使用することができる。
【０１１９】
このようにさらなる観点では本発明はｈＤＲＲ活性の障害に関連する医学的状態を防止し、処置し、または改善するための方法を提供し、この方法は哺乳動物個体に治療に有効な量のＥＰＦ関連ペプチドを含む上記のｈＤＲＲモジュレーティング化合物を、場合によりｈＤＲＲ受容体活性をモジュレートするために有効な量の製薬学的に許容され得る担体と組み合わせて投与することを含んでなる。そのような担体は限定するわけではないが塩水、緩衝化塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせである。本発明はさらに本発明の前記組成物の１以上の材料で充填した１以上の容器を含んでなる製薬学的包装およびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独または治療用化合物のような他の化合物と組み合わせて使用することができる。
【０１２０】
このように本発明の目的は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症のような自己免疫疾患、またはＩＢＤのような免疫抑制作用が望まれるの他の状態を防止し、処置し、または改善するための、あるいは移植拒絶を防止するための方法を提供し、この方法は哺乳動物個体に上記のアッセイの１つを使用して同定した有効量のｈＤＲＲ７受容体アゴニストを投与することを含んでなる。したがって本発明は癌のような細胞増殖性障害を防止し、処置し、または改善するための方法を提供し、この方法は哺乳動物個体に上記のアッセイの１つを使用して同定した有効量のｈＤＲＲ７受容体アンタゴニストを投与することを含んでなる。本発明のさらなる目的は、疼痛の伝達、モジュレーションおよび感知を防止し、処置し、または改善する方法を提供することであり、この方法は哺乳動物個体に上記のアッセイの１つを使用して同定した有効量のｈＤＲＲ４受容体アゴニストを投与することを含んでなる。
【０１２１】
組成物は、例えば全身性または経口経路による投与経路に適合させる。好適な全身性投与の形態には注入、典型的には静脈内注入を含む。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路を使用することもできる。全身性投与のための別の手段には、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を使用した経粘膜的（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）および経皮的投与を含む。さらに本発明のポリペプチドまたは他の化合物を腸溶性もしくはカプセル化製剤に配合することができれば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与はパッチ、軟膏、ペースト、ゲル等の形態で局所的および／局部的でもよい。
【０１２２】
必要な投薬用量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、製剤の性質、個体の状態の性質および担当医の判断に依存する。しかし適当な投薬用量は個体あたり０．１〜１００μｇ／ｋｇの範囲である。しかし利用できる化合物の種類、および様々な投与経路で異なる効率といった観点から必要な投薬用量に広い変動が予想される。例えば経口投与は静脈内注入による投与よりもより高い投薬用量が予想される。これら投薬用量レベルの変動は、当該技術分野では十分に理解されている至適化のための標準的な経験的な日常的作業を使用して調整することができる。
【０１２３】
本発明は以下の実施例の詳細を参照にすることにより、より良く理解されるだろうが、当業者はこれらが請求の範囲をより完全に記載するような本発明の具体的説明のみであると容易に考えるだろう。さらに本出願を通して種々の刊行物を引用する。これら刊行物の開示は引用により本出願に編入し、本発明が関係する当該技術分野の状況をより完全に説明する。
【実施例１】
【０１２４】
ＧＣＰＲ ＨＤＤＲ４のクローニングおよび機能的特性決定
材料および方法
材料
拡張高フィデリティ（ｅｘｐａｎｄ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼはベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（マンハイム、ドイツ）から得た。オリゴヌクレオチドはユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（シェーリング、ベルギー）から購入した。プラスミド調製キットおよびＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キットは、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）（ヒルデン、ドイツ）からであった。ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットおよびＡＢＩ３７７または３７３Ａシークエンシング機はアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ホスター市、カリフォルニア州、米国）からであった。Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲシステム９６００はパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（ノーウォーク、コネチカット州、米国）からであった。哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３はインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールスバッド、カリフォルニア州、米国）から得た。ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清および透析ウシ胎児血清はライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ゲチスバーグ、メリーランド州、米国）からであった。
ＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡシークエンシングはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥバイオシステムズ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からの試薬を用いてＰＴＣ−２００ＰＣＲ機（ＭＪリサーチ（Ｒｅｓｅｒｃｈ））で行った。反応生成物はＳＥＱｕｅａｋｙ Ｋｌｅｅｎ ９６ウェルＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌキットカラム（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）で精製し、そしてＡＢＩ３７７ ＤＮＡシークエンシング機で解像した。配列分析に我々はＧｅｎｅＣｏｄｅｓ（アンハーバー、ミシガン州）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを使用した。
ｈＤＲＲ４のクローニング
ＰＣＲはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、カリフォルニア州、米国）、フォワードプライマー（ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＧＧ）およびリバースプライマー（ＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣ）を使用して行った。生成したＰＣＲ産物はＴＯＰＯ（商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）でクローン化した。完全長の読み取り枠を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に挿入し、そして続いてスクリーニング実験に使用した。
ｈＤＲＲ７のクローニング
ＰＣＲはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国）、ｈＤＲＲ７フォワードプライマー（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＧ）（配列番号１３）およびｈＤＲＲ７リバースプライマー（ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣ）（配列番号１４）を使用して行った。生成したＰＣＲ産物は哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に挿入し、そして続いてスクリーニング実験に使用した。
哺乳動物細胞での一過性の発現およびＦＬＩＰＲアッセイ
ｈＤＲＲ４発現プラスミドまたはｈＤＲＲ７発現プラスミドは、Ｇα１６−ｐｃＤＮＡ３構築物を用いて、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、マンハイム、ドイツ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に一過性の同時−トランスフェクションを行った。細胞には供給元の推薦に従いＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せた。続いて細胞をＦＬＩＰＲ装置（モレキュラー デバイスイズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーバレ、カリフォルニア州、米国）でＣａ^２＋トランジェントについてアッセイした。
組織抽出物の調製および抽出物分画
５ｋｇのブタ視床下部を均一化し、そしてメタノール／水／酢酸、９０／９／１、（容量／容量／容量）で抽出した。遠心後、上清をｎ−ヘキサン抽出により脱脂し、そして水性層をＭｅｇａｂｏｎｄｅｌｕｔｅ分別により分画した。５０％アセトニトリル／Ｈ_２Ｏで溶出した材料をさらにＨＰＬＣ Ｃ１８カラムで分画した。それらの画分をｈＤＲＲ４ ＧＰＣＲの活性化についてＦＬＩＰＲアッセイで試験した。水性トリフルオロ酢酸（０．１％）中の０〜６０％アセトニトリルで溶出したＭｅｇａｂｏｎｄｅｌｕｔｅ画分をさらに調製用ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ１８カラム（ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓ）、２５ｘ１００ｍｍ、１５μｍ、３００Å）でさらに分画した。それらの画分をｈＤＲＲ４ ＧＰＣＲの活性化についてＦＬＩＰＲアッセイで試験した。ひき続き調製用Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ１８、分析用Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）、細孔Ｘｔｅｒｒａ Ｃ８カラム（２．１ｘ２５０ｍｍ）、細孔Ｘｔｅｒｒａ Ｃ８カラム（２．１ｘ２５０ｍｍ）カラム、そして最後に細孔Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（２．１ｘ１５０ｍｍ）での精製段階に続いて、ｈＤＲＲ４トランスフェクト細胞を活性化する画分についてＦＬＩＰＲに基づく活性のアッセイを行った。
質量分析およびエドマン分解に基づくシークエンシング
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）二連四重極型（Ｑｑ）直交加速（ｏａ）飛行時間（Ｔｏｆ）質量分析を、Ｑ−Ｔｏｆシステム（マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）、英国）で行った。活性分子は衝突誘起解離（ＣＩＤ）を使用してフラグメントイオンの分析により同定した。活性画分を含む１μｌのアセトニトリル／水／ギ酸（５０／４９．９／０．１、容量、容量、容量）を、金をコートした毛細管（プロタナ（Ｐｒｏｔａｎａ） Ｌ／Ｑ 針）に乗せた。この針の電圧を９００Ｖに、そしてサンプリングコーンを２５Ｖに設定した。サンプルは約２５ｎｌ／分の流速で噴霧し、その間にＭＳならびにＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる延長した分析時間を与えた。ＭＳ／ＭＳまたはタンデム質量分析中、フラグメントイオンが選択した前駆体イオンから衝突誘起解離（ＣＩＤ）により生じ、衝突エネルギーは典型的には２０から３５Ｖの間で変動し、アルゴンを衝突ガスとして使用した。精製したペプチドのＮ−末端アミノ酸シークエンシングは、パルスモードで流すパーキン−エルマー／アプライドバイオシステムズ Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２ミクロ−シークエンサーで行った。
膜の調製
膜は全粒子画分として調製した。細胞系は１４５ｍｍのペトリ皿上で９０％の集密度に培養し、そして５ｍＭ酪酸ナトリウムで回収２４時間前に処理した。培養基を除去し、そして細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋）で２回洗浄し、プレートから５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に掻き取り、そして遠心により集めた（４℃にて１６，０００ＲＰＭで１０分間）。細胞ペレットを低張５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に再懸濁し、そしてＵｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーで均一化した。均一物を４℃にて１８，０００ＲＰＭで２０分間遠心した。最後にペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に再懸濁し、そして−７０℃でアリコートにて保存した。タンパク質決定はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ（バイオラッド）を使用して、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して行った。
［ ^３ Ｈ］アデニン結合
［^３Ｈ］アデニン結合実験は一過性のトランスフェションを行った細胞系を特性決定するために行った。膜は氷上で解凍し、そして１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＥＧＴＡを補充した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中で希釈した。非−特異的結合は１μＭアデニンの存在下で定め、そして［^３Ｈ］アデニン（３０．４Ｃｉ／ミリモルの比活性）と２５℃で１時間のインキューベーションが競合結合アッセイに最適であることが分かった。アッセイは５００μｌの最終容量中で、トランスフェトした細胞ならびに野生型ＣＯＳ細胞用に２０μｇの膜タンパク質を使用して行った。反応はブランデル（Ｂｒａｎｄｅｌ）マルチ−チャンネル細胞回収器（９６ウェル）を使用してワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）のＧＦ／Ｂフィルターに急激に通すことにより止めた。フィルターは３ｍｌの氷冷５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４で３回洗浄し、液体シンチレーションバイアルに移し、そして３ｍｌのシンチレーション流体（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ ＭＶ）を加えた。サンプルはガラスファイバーフィルターを均一な透明とするために、β−シンチレーションカウンターで少なくとも６時間後にカウントした。
【０１２５】
アデニンによる［^３Ｈ］アデニンの競合的阻害は、１５ｎＭの［^３Ｈ］アデニンで行った。
【０１２６】
特異的結合は１μＭの非標識アデニンの存在と不存在との間のカウントの差異として算出した。
遺伝子発現レベルのリアルタイム定量ＰＣＲを介した証明
種々の組織からのＲＮＡは、アナリティカルバイオオジカルリサーチから得た後根神経節ＲＮＡを除きクローンテックから得た。ｈＤＲＲ４遺伝子用のＳＤＳプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ１．０ソフトウェア（パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国）を使用して設計した。ｈＤＲＲ４遺伝子用のフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ５’−ＧＣＧＣＡＧＧＡＡＣＧＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号２２）および５’−ＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号２３）であった。ｈＤＲＲ４用のＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡ−３’（配列番号２４）はＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ１．０ソフトウェア（パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国）を使用して設計し、そして標的配列の上鎖および下鎖のいずれかから選択することができる。ＴａｑＭａｎ ｈＤＲＲ４プローブはレポーター蛍光色素、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’末端を標識した。
【０１２７】
ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を使用して作成した。ＲＴは４２℃で６０分間、水浴中で行った。反応は７０℃で１０分間加熱することにより停止した。次いでＰＣＲ増幅はＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ９６−ウェル反応プレート中で５０サイクル行い、各サイクルは９５℃で１５秒間および６０℃で１分間であった。すべての反応はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００ＳＤＳを使用して３連で行った。試験した組織中のｈＤＲＲ４の相対的発現は、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）Ａの発現と比較した。
結果
ｈＤＲＲ４の生成およびｃＤＮＡ配列
ヒトゲノムコスミドライブラリーでＰＣＲを行った後、１つのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物のシークエンシングにより、ｈＤＲＲ３（９７％のａａ同一性）およびｈＤＲＲ４（９９％のａａ同一性）の配列と強い類似性が示された（Ｗ９９３２５１９特許）。しかし配列はＥＭＢＬデータベースに登録された配列の長さ（ｓｔｒｅｔｃｈ）と同一であった（ＡＣ０２３０７８）。我々は図１に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列にたどり着いた。
【０１２８】
図１に記載する配列はＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９７）調査により分析して、関連するＧＰＣＲｓが既知のリガンドを用いて見いだせるかどうかを調査した。検索したオーファンＧＰＣＲに最も近い相同体は、アデニン受容体として我々の研究室で最近同定されたＧＰＣＲ ＲＣ５６．３．１であった。ｈＤＲＲ４に関連する他の受容体に関するリガンドは報告されなかった。これらはＧＰＣＲ ｈＤＲＲ４と共通する７９％から９９％の間の残基を有する後根神経節からクローン化されたヒトＧＰＣＲｓのファミリーである（Ｄｅｒｗｅｎｔ配列データベース寄託番号Ｚ１００６７、Ｚ１００６８、Ｚ１００６９、Ｚ１００７０ Ｚ１００７１およびＺ１００７２）。別の周知相同体は、ｈＤＲＲ４と３８％の残基を共有するｍａｓ原がん遺伝子である。
【０１２９】
我々の最初の取り組みはアデニンおよび他の構造的に関連した化合物、特にプリンをｈＤＲＲ４についてＦＬＩＰＲに基づく細胞アッセイで試験することであった。これはキメラＧタンパク質または無差別Ｇα１６Ｇタンパク質の同時−トランスフェクションの有りまたは無しのＨＥＫ２９３細胞における一過性のトランスフェクションにより行った。これらのアッセイで、特異的応答は得られなかった。トリチル化アデニンを使用した結合実験では、ｈＤＲＲ４に結合する特異的アデニンは検出できなかったが、ＲＣ５６．１．３トランスフェクト細胞は明瞭な特異的アデニン結合を示した。この取り組みはこの受容体の自然なリガンドに関するヒントを我々に与えなかったので、自然なリガンドを同定するために「逆薬理学」法を応用した。
ブタの視床下部に由来するｈＤＲＲ４の自然なアゴニストの精製
本質的に、分泌されたペプチドが豊富な供給源である事が知られている組織、例えば視床下部に由来する抽出物を調製し、そして材料および方法に記載したように自然なリガンドの精製にオーファンＧＰＣＲの活性化に基づく細胞アッセイが続いた。
【０１３０】
Ｃ１８カラムでの最初の画分のブタ視床下部抽出物から、ｈＤＲＲ４発現構築物で一過性のトランスフェクションを行った細胞について、トランジェントな細胞内のＣａ２^＋放出をもたらす一連の画分が引き出された。これはＧα１６発現構築物で一過性の同時−トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３細胞の場合であり（図２）、野生型ＨＥＫ２９３細胞の場合（データは示さず）ではなかった。これらの画分の２つ、強力な刺激を生じる６５番および６６番をさらなる副分画のために選択し、そして材料および方法に記載したように処理した。精製はＦＬＩＰＲに基づく活性アッセイにより示され、そして最後のカラム実験からの活性を示した画分を質量分析にかけてそれに含まれる化合物の純度ならびに構造を決定した。
質量分析によるｈＤＲＲ４活性化物質の同定
ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８（４．６×２５０ｍｍ；５μｍ、ウォーターズ）逆相カラムからの活性精製画分の質量分析は、１つの主要な質量−ピークを２１６３Ｄａ（２１６４．７Ｍ＋Ｈ^＋）に与えた。異なるＨＰＬＣカラムでの活性画分の溶出プロフィールは、受容体活性化化合物がペプチドであることを示した。したがってこの質量をエドマン分解に基づくシークエンシングによりに引き続き分析した。配列は：
ＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥＲＳＡと決定した（１文字アミノ酸表記）。
ＦＬＩＰＲアッセイに基づく細胞に及ぼすｈＤＲＲ４活性化物質の効果
１５０ｎＭの試験濃度でＥＰＦ（配列番号８）のｈＤＲＲ結合断片によるオーファンＧＰＣＲ ｈＤＲＲ４（配列番号２）の活性化を、Ｇα１６−ｐｃＤＮＡで同時−トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞で測定した。相対的蛍光単位（ＲＦＵ）は、細胞にＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブス、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せることにより測定した。Ｇα１６−ｐｃＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトしただけのＨｅｋ２９３細胞は、図３に示すようにｈＤＲＲ結合断片に応答しなかった。異なる試験濃度の配列番号８からなるｈＤＲＲ活性化ペプチドでこのＦＬＩＰＲアッセイを使用して、１２ｎＭのＥＣ_５０−値が決定された（図７）。
ｈＤＲＲ４遺伝子の発現
リアル−タイム定量ＰＣＲでは、後根神経節（ＤＲＧ）および三叉神経節におけるｈＤＲＲ４発現が明らかにされた。この知見は疼痛の知覚またはモジュレーションにおけるこの受容体の潜在的役割を証明している。試験したすべての組織の中で、ｈＤＲＲ４は図６に示すように後根神経節および三叉神経節でほぼ排他的に発現され、ここで他の組織中の発現レベルを後根神経節および三叉神経節で観察された発現レベルと比較した。
【実施例２】
【０１３１】
ＧＰＣＲ ＨＤＲＲ７のクローニングおよび機能的特性決定
材料および方法
材料
拡張高フィデリティポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼはベーリンガー（マンハイム、ドイツ）から得た。オリゴヌクレオチドはユーロジェンテック（シェーリング、ベルギー）から購入した。プラスミド調製キットおよびＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キットは、キアジェン（ヒルデン、ドイツ）からであった。ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットおよびＡＢＩ３７７または３７３Ａシークエンシング機はアプライドバイオシステムズ（ホスター市、カリフォルニア州、米国）からであった。Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲシステム９６００はパーキン−エルマー（ノーウォーク、コネチカット州、米国）からであった。哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３はインビトロゲン（カールスバッド、カリフォルニア州、米国）から得た。ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清および透析ウシ胎児血清はライフテクノロジーズ（ゲチスバーグ、メリーランド州、米国）からであった。
ＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡシークエンシングはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥバイオシステムズ）からの試薬を用いてＰＴＣ−２００ＰＣＲ機（ＭＪリサーチ）で行った。反応生成物はＳＥＱｕｅａｋｙ Ｋｌｅｅｎ ９６ウェルＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌキットカラム（バイオラッド）で精製し、そしてＡＢＩ３７７ ＤＮＡシークエンシング機で解像した。配列分析に我々はＧｅｎｅＣｏｄｅｓ（アンハーバー、ミシガン州）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを使用した。
ｈＤＲＲ７のクローニング
ＰＣＲはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国）、ｈＤＲＲ７フォワードプライマー（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＧ）（配列番号１３）およびｈＤＲＲ７リバースプライマー（ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣ）（配列番号１４）を使用して行った。生成したＰＣＲ産物は哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に挿入し、そして続くスクリーニング実験に使用した。
哺乳動物細胞での一過性発現およびＦＬＩＰＲアッセイ
ｈＤＲＲ７発現プラスミドは、Ｇα１６−ｐｃＤＮＡ３構築物を用いて、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ（マンハイム、ドイツ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に一過性の同時−トランスフェクションを行った。細胞には供給元の推薦に従いＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブズ、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せた。続いて細胞をＦＬＩＰＲ装置（モレキュラー デバイスイズ、サニーバレ、カリフォルニア州、米国）でＣａ^２＋トランジェントについてアッセイした。
膜の調製
膜は全粒子画分として調製した。細胞系は１４５ｍｍのペトリ皿上で９０％の集密度に培養し、そして５ｍＭ酪酸ナトリウムで回収２４時間前に処理した。培養基を除去し、そして細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋）で２回洗浄し、プレートから５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に掻き取り、そして遠心により集めた（４℃にて１６，０００ＲＰＭで１０分間）。細胞ペレットを低張５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に再懸濁し、そしてＵｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーで均一化した。均一物を４℃にて１８，０００ＲＰＭで２０分間遠心した。最後にペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４に再懸濁し、そして−７０℃でアリコートにて保存した。タンパク質決定はブラッドフォードタンパク質アッセイ（バイオラッド）を使用して、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して行った。
遺伝子発現レベルのリアルタイム定量ＰＣＲを介した証明
種々の組織からのＲＮＡは、アナリティカルバイオオジカルリサーチから得た後根神経節ＲＮＡを除きクローンテックから得た。ｈＤＲＲ７遺伝子用のＳＤＳプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ１．０ソフトウェア（パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国）を使用して設計した。ｈＤＲＲ７遺伝子用のＳＤＳフォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ５’−ＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号１５）および５’−ＧＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＧＧ−３’（配列番号１６）であった。ｈＤＲＲ７用のＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＡＴＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１７）はＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ１．０ソフトウェア（パーキンエルマー、マサチューセッツ州、米国）を使用して設計し、そして標的配列の上鎖および下鎖のいずれかから選択することができる。ＴａｑＭａｎ ｈＤＲＲ７プローブはレポーター蛍光色素、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’末端を標識した。
【０１３２】
ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を使用して作成した。ＲＴは４２℃で６０分間、水浴中で行った。反応は７０℃で１０分間加熱することにより終了した。次いでＰＣＲ増幅はＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ９６−ウェル反応プレート中で５０サイクル行い、各サイクルは９５℃で１５秒間および６０℃で１分間であった。すべての反応はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００ＳＤＳを使用して３連で行った。試験した組織中のｈＤＲＲ７の相対的発現は、β−アクチン発現と比較した。
結果
ｈＤＲＲ７の生成およびｃＤＮＡ配列
ヒトゲノムコスミドライブラリーでＰＣＲを行った後、１つのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物のシークエンシングにより、配列はＥＭＢＬデータベースの配列に登録されている配列の長さ（ｓｔｒｅｔｃｈ）と同一であった（ＡＸ０９９２４７）。我々は配列番号１１に示すヌクレオチド配列にたどり着いた。
ＦＬＩＰＲアッセイに基づく細胞中のｈＤＲＲ４活性化物質の効果
ＨＥＫ２９３細胞にＧα１６−ｐｃＤＮＡで一過性の同時−トランスフェクションを行った後に、１５０ｎＭの試験濃度でＥＰＦ（配列番号８）のｈＤＲＲ結合断片によるオーファンＧＰＣＲ ｈＤＲＲ７（配列番号１２）の活性化。相対的蛍光単位（ＲＦＵ）は、細胞にＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブス、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せることにより測定した。Ｇα１６−ｐｃＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトしただけのＨｅｋ２９３細胞は、図４に示すようにｈＤＲＲ結合断片に応答しなかった。異なる試験濃度の配列番号８からなるｈＤＲＲ活性化ペプチドを用いたこのＦＬＩＰＲアッセイを使用して、３５４ｎＭのＥＣ_５０−値が決定された（図８）。
ｈＤＲＲ７遺伝子の発現
リアル−タイム定量ＰＣＲでは、リンパ節におけるｈＤＲＲ７発現が明らかになった。この知見はｈＤＲＲ受容体の自然なアゴニストとして早期妊娠因子の同定と組み合わせて、、妊娠中に観察されるＥＰＦの免疫抑制活性におけるこの受容体の潜在的役割を証明している（Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｍａｓｌｏｗ，１９９２）。試験したすべての組織の中で、ｈＤＲＲ７は図５に示すようにリンパ節で優勢に発現され、ここでは他の組織中の発現レベルをリンパ節で観察された発現レベルと比較した。
【実施例３】
【０１３３】
ＧＰＣＲ ＥＰＦ−関連ペプチドの精製および同定
材料および方法
材料
拡張高フィデリティポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼはベーリンガー（マンハイム、ドイツ）から得た。オリゴヌクレオチドはユーロジェンテック（シェーリング、ベルギー）から購入した。プラスミド調製キットおよびＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キットは、キアジェン（ヒルデン、ドイツ）からであった。ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットおよびＡＢＩ３７７または３７３Ａシークエンシング機はアプライドバイオシステムズ（ホスター市、カリフォルニア州、米国）からであった。Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲシステム９６００はパーキン−エルマー（ノーウォーク、コネチカット州、米国）からであった。哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３はインビトロゲン（カールスバッド、カリフォルニア州、米国）から得た。ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清および透析ウシ胎児血清はライフテクノロジーズ（ゲチスバーグ、メリーランド州、米国）からであった。
ＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡシークエンシングはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥバイオシステムズ）からの試薬を用いてＰＴＣ−２００ＰＣＲ機（ＭＪリサーチ（Ｒｅｓｅｒｃｈ））で行った。反応生成物はＳＥＱｕｅａｋｙ Ｋｌｅｅｎ ９６ウェルＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌキットカラム（バイオラッド）で精製し、そしてＡＢＩ３７７ ＤＮＡシークエンシング機で解像した。配列分析に我々はＧｅｎｅＣｏｄｅｓ（アンハーバー、ミシガン州）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを使用した。
ｈＤＲＲ４のクローニング
ＰＣＲはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国）、フォワードプライマー（ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＧＧ）およびリバースプライマー（ＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣ）を使用して行った。生成したＰＣＲ産物はＴＯＰＯ（商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）の援助でクローン化した。完全長の読み取り枠を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に挿入し、そして続いてスクリーニング実験に使用した。
ｈＤＲＲ７のクローニング
ＰＣＲはヒトゲノム コスミド ライブラリーについて（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州、米国）、ｈＤＲＲ７フォワードプライマー（ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＧ）（配列番号１３）およびｈＤＲＲ７リバースプライマー（ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣ）（配列番号１４）を使用して行った。生成したＰＣＲ産物は哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に挿入し、そして続いてスクリーニング実験いて使用した。
哺乳動物細胞での一過性発現およびＦＬＩＰＲアッセイ
ｈＤＲＲ４発現プラスミドまたはｈＤＲＲ７発現プラスミドは、Ｇα１６−ｐｃＤＮＡ３構築物を用いて、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ（、マンハイム、ドイツ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に一過性の同時−トランスフェクションを行った。細胞には供給元の推薦に従いＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブズ、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せた。続いて細胞をＦＬＩＰＲ装置（モレキュラー デバイスイズ、サニーバレ、カリフォルニア州、米国）でＣａ^２＋トランジェントについてアッセイした。
甲状腺抽出物からの精製
２．５ｋｇのブタ甲状腺を均一化し、そしてメタノール／水／酢酸（９０／９／１、容量／容量／容量）に抽出した。遠心後、上清はｎ−ヘキサン抽出により脱脂し、そして水性相をＭｅｇａｂｏｎｄＥｌｕｔｅ固相抽出により分画した。水性トリフルオロ酢酸（０．１％）中の０〜５０％アセトニトリルから溶出する材料を、調製用ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ１８カラム（４０ｘ１００ｍｍ）で逆相ＨＰＬＣによりさらに分画した。それらから派生した画分をｈＤＲＲ４ ＧＰＣＲの活性化についてＦＬＩＰＲアッセイで試験した。ｈＤＲＲ４トランスフェクト細胞を活性化する画分について、引き続き調製用ＤｅｌｔａＰａｋＣ４カラム（２５ｘ１０ｍｍ）、 Ｃ１８カラム（２５ｘ１０ｍｍ）、分析用Ｃ１８カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）、細孔Ｘ−ｔｅｒｒａ Ｃ１８カラム（２．１ｘ２５０ｍｍ）、そして最後に毛細管ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８カラム（０．３２ｘ１５０ｍｍ）での精製工程、続いてＦＬＩＰＲに基づくアッセイを行った。
結果
ブタ甲状腺に由来するｈＤＲＲ４の自然なアゴニストの精製
本質的に、分泌されたペプチドの豊富な供給源である事が知られている組織、例えば甲状腺に由来する抽出物を調製し、そして材料および方法に記載したように自然なリガンドの精製にオーファンＧＰＣＲの活性化に基づく細胞アッセイが続いた。
【０１３４】
Ｃ１８カラムで最初に分画した後のブタ甲状腺抽出物のスクリーニングは、ｈＤＲＲ４発現構築物で一過性のトランスフェクションを行った細胞について、一時的な細胞内Ｃａ^＋放出をもたらす画分の範囲が引き出された。
【０１３５】
２つの隣接する画分を均一になるまで精製し、そしてＥＳＩ−Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。両画分が２つの顕著な３重変化イオンピークを１９１８．７７Ｄａの質量に相当するｍ／ｚ６４０．５９および２１４６．８９Ｄａの質量に相当するｍ／ｚ７１６．６３に生じた。これらのピークは並列したＭＳ実験で選択され、そしてＱ−ＴＯＦ系での衝突−誘導解離により断片化された。４つの可能な配列が２１４６．８Ｄａの化合物について得られた：ＬＧＸ_１ＡＦＲＸ_２ＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥ、（Ｘ_１およびＸ_２はＫまたはＱである）、そして４つの可能な配列が１９１８．７７Ｄａのペプチドについて得られ、これは第１ペプチドのより短いアイソフォーム、ＬＧＸ_１ＡＦＲＸ_２ＦＬＰＬＦＤＲＶＬ（Ｘ_１およびＸ_２はＫまたはＱである）（配列番号１８〜２１）であった。
【０１３６】
これら配列のアミノ酸２〜１９および２〜１７は、シャペロニン１０（Ｈｓｐ１０）２〜１８およびシャペロニン１０（Ｈｓｐ１０）２〜１６にそれぞれ対応する。７位のアミノ酸残基は、これまでに研究されたすべての脊椎動物のシャペロニンではリシン（Ｋ）である。３位のアミノ酸残基はドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、すべての哺乳動物種ではＱであり、そしてニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）（鳥綱：Ａｖｅｓ）ではＫである。
ＦＬＩＰＲ測定
精製されたペプチドまたは乾燥組織画分はカルシウムバッファーに溶解し、そして通常のマルチ−ウェル９６プレートに乗せた。続いて細胞をＣａ^２＋トランジェントについてＦＬＩＰＲ装置（モレキュラーデバイス サニーバレ、カリフォルニア州、米国）でアッセイした。ＥＰＦ−関連ペプチドに関して、以下のｐＥＣ_５０を決定した：
【０１３７】
【表１】

【０１３８】
【表２】

【０１３９】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】１ＡはｈＤＲＲ４の配列（配列番号１）をコードするヌクレオチドを示す。（出発および終結コドンは太字である） １ＢはｈＤＲＲ４のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】Ｇα１６−ｐｃＤＮＡをＨｅｋ２９３へ一過性の同時−トランスフェクションを行った後、ブタの視床下部抽出物のＣ１８画分によるオーファンＧＰＣＲ ｈＤＲＲ４の活性化。相対的蛍光単位（ＲＦＵ）は細胞にＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブ、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せ、そしてＦＬＩＰＲ装置（モレキュラー デバイス、サニーバレ、カリフォルニア州、米国）中でＣａ^２＋トランジェントについて細胞をアッセイすることにより決定した。
【図３】Ｇα１６−ｐｃＤＮＡをＨｅｋ２９３へ一過性の同時−トランスフェクションを行った後、１５０ｎＭの試験濃度でＥＰＦ（配列番号８）のｈＤＲＲ結合断片によるオーファンＧＰＣＲ ｈＤＲＲ４（配列番号２）の活性化。相対的蛍光単位（ＲＦＵ）は細胞にＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブ、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せることにより決定した。
【図４】Ｇα１６−ｐｃＤＮＡをＨｅｋ２９３へ一過性の同時−トランスフェクションを行った後、１５０ｎＭの試験濃度でＥＰＦ（配列番号８）のｈＤＲＲ結合断片によるオーファンＧＰＣＲ ｈＤＲＲ７（配列番号１２）の活性化。相対的蛍光単位（ＲＦＵ）は細胞にＦｌｕｏ−４（モレキュラー プローブ、ユージーン、オレゴン州、米国）を乗せることにより決定した。
【図５】１００％としたリンパ節の発現に対して比べた多数の組織中でのｈＤＲＲ７の相対的発現。発現レベルはリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して測定した。
【図６】評価した組織のヒト シクロフィリンＡの相対的発現に関して比べた多数の組織中でのｈＤＲＲ４の相対的発現。発現レベルはリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して決定した。
【図７】ＦＬＩＰＲカルシウムアッセイを使用して測定したｈＤＲＲ４受容体に関するＥＰＦ（配列番号８）のｈＤＲＲ結合断片の用量応答曲線。
【図８】ＦＬＩＰＲカルシウムアッセイを使用して測定したｈＤＲＲ７受容体に関するＥＰＦ（配列番号８）のｈＤＲＲ結合断片の用量応答曲線。
【図９】ＦＬＩＰＲカルシウムアッセイを使用して測定したｈＤＲＲ４受容体に関するＥＰＦ−関連ペプチドＥＰＦ１−１６（配列番号１９）およびＥＰＦ１−１８（配列番号２１）の用量応答曲線。
【図１０】ＦＬＩＰＲカルシウムアッセイを使用して決定したｈＤＲＲ７受容体に関するＥＰＦ−関連ペプチドＥＰＦ１−１６（配列番号１９）およびＥＰＦ１−１８（配列番号２１）の用量応答曲線。

Claims (35)

1. ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとｈＤＲＲ受容体またはｈＤＲＲ関連受容体との相互作用を利用するアッセイ。
2. ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドが：
   ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるＥＰＦをコードする単離されたポリペプチド；
   ｉｉ）ＥＰＦに由来し、そしてｈＤＲＲ４に結合することができる単離されたポリペプチド；または
   ｉｉｉ）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるＥＰＦ関連ポリペプチドをコードする単離されたポリペプチド；または
   ｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片を含んでなる単離されたポリペプチド、
   からなる群から選択される請求項１に記載のアッセイ。
3. ｈＤＲＲ受容体ポリペプチドが；
   ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、ｈＤＲＲ４をコードする単離されたポリペプチドまたはその断片；あるいは
   ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなる、ｈＤＲＲ７をコードする単離されたポリペプチドまたはその断片、
   からなる群から選択される請求項１に記載のアッセイ。
4. 配列番号８のアミノ酸配列によりコードされるｈＤＲＲ結合断片を含んでなる、単離され、そして精製されたＥＰＦ関連ペプチド。
5. 配列番号７によりコードされるｈＤＲＲ結合断片を含んでなるＥＰＦ関連ペプチドをコードする、単離され、そして精製された核酸分子。
6. 配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離され、そして精製されたＥＰＦ関連ペプチド。
7. ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドをコードする単離され、そして精製された核酸分子の請求項１に記載のアッセイにおける使用。
8. ｈＤＲＲ４をコードする単離され、そして精製された核酸分子、またはその断片の請求項１に記載のアッセイにおける使用。
9. ｈＤＲＲ７をコードする単離され、そして精製された核酸分子、またはその断片の請求項１に記載のアッセイにおける使用。
10. ｈＤＲＲ受容体を結合することができる試験化合物を同定し、そして得る方法であって：
    ａ）ｈＤＲＲまたはその断片を含む供給源を；
    ｉ）ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチド
    ｉｉ）該試験化合物
    とインキューベーションし、そして
    ｂ）受容体に結合するＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の効果を測定する、ことを含んでなる方法。
11. ｈＤＲＲを含有する供給源が；
    ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有する単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片；
    ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する単離され、そして精製されたタンパク質またはその断片；
    ｉｉｉ）表面に配列番号２のアミノ酸配列を有するｈＤＲＲ４ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞；
    ｉｖ）表面に配列番号１２のアミノ酸配列を有するｈＤＲＲ７ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞；
    ｖ）表面に配列番号２のアミノ酸配列を有するｈＤＲＲ４ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物；または
    ｖｉ）表面に配列番号１２のアミノ酸配列を有するｈＤＲＲ７ポリペプチド受容体またはその断片を発現する細胞の膜調製物、
    からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
12. 単離され、そして精製されたタンパク質が固体支持体に結合している請求項１０に記載の方法。
13. ＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドが標識され、そして該標識が受容体に結合するＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドの量に影響を及ぼす試験化合物の効果を測定するために使用される、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 方法が：
    ａ）ｈＤＲＲ上のＥＰＦまたはＥＰＦ関連ペプチドとのリガンド結合部位の構造をプロービングし；
    ｂ）結合中にＥＰＦリガンドと相互作用するｈＤＲＲ受容体のリガンド結合部位中の接触原子を同定し；
    ｃ）ｈＤＲＲ受容体の活性をモジュレートするために、（ｂ）で同定した原子と相互作用する試験化合物を設計し；そして
    ｄ）該設計した試験化合物とｈＤＲＲまたはその機能的な断片を含む供給源を接触させて、該化合物がｈＤＲＲ活性をモジュレートする能力を測定する、
    工程を含んでなる、合理的な薬剤設計である請求項１０に記載の方法。
15. ｈＤＲＲ受容体の活性をモジュレートすることができる試験化合物を同定し、そして得る方法であって：
    ａ）ｈＤＲＲまたはその機能的な断片を含む供給源を、該試験化合物とインキューベーションし；
    ｂ）ｈＤＲＲ受容体の活性に及ぼす試験化合物の効果を測定し；そして
    ｃ）この効果を、ＥＰＦリガンドまたはＥＰＦ関連ペプチドの結合によるｈＤＲＲ受容体の活性と比較する、
    ことを含んでなる方法。
16. ｈＤＲＲを含有する供給源が、表面に配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド受容体を発現する細胞である、請求項１５に記載の方法。
17. ｈＤＲＲ受容体に及ぼすモジュレーターの効果が、ｈＤＲＲ受容体により媒介される細胞内第２メッセンジャー形成のモジュレーションである、請求項１５ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 細胞内第２メッセンジャーがｃＡＭＰ、カルシウムまたはレポーター遺伝子産物である、請求項１５に記載の方法。
19. 結合し、かつ／またはｈＤＲＲ受容体活性をモジュレートすることができる、請求項１０、１１または１５の方法により同定され、そして得られる化合物。
20. ｈＤＲＲのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項１０、１４または１５の方法により同定され、そして得られる化合物。
21. 薬剤として使用するための、請求項１０ないし１８のいずれか１項に記載のいずれか１つの方法により同定される化合物。
22. 請求項１０ないし１８のいずれか１項に記載のいずれか１つの方法により同定される化合物、および製薬学的に許容され得る賦形剤または担体を含んでなる製薬学的組成物。
23. 薬剤として使用するための配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合断片。
24. 薬剤として使用するための配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１から選択されるアミノ酸配列によりコードされるＥＰＦ関連ペプチド。
25. 避妊薬として使用するための組成物、ならびに限定するわけではないが；移行性上皮ガン、脂肪肉腫、腺ガン、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄単球性白血病、骨肉腫のようなガンを含む特定の疾患；上記と複合した場合の不応性貧血の処置方法に関連する組成物；慢性関節リウマチ、多発性硬化症のような自己免疫疾患、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような免疫抑制作用が望まれる他の状態の処置のための、または移植拒絶を防ぐための組成物の製造における、配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合断片または請求項２３に記載のＥＰＦ関連ペプチドの使用。
26. ｈＤＲＲ７アゴニストである請求項１０ないし１８のいずれか１項で同定される化合物の、慢性関節リウマチ、多発性硬化症のような自己免疫疾患、またはＩＢＤのような自己免疫抑制作用が望まれる他の状態を処置するための、あるいは移植拒絶を防ぐための組成物の製造における使用。
27. ｈＤＲＲ７アンタゴニストである請求項１０ないし１８のいずれか１項で同定される化合物の、避妊薬としての使用、流産の防止、またはガンの処置のための組成物の製造における使用。
28. ｈＤＲＲ４アゴニストである請求項１０ないし１８のいずれか１項で同定される化合物の、疼痛を処置する組成物の製造における使用。
29. ｈＤＲＲを含む細胞画分からｈＤＲＲを単離する方法であって、細胞画分を溶質支持体に固定化されたＥＰＦまたはそのｈＤＲＲ結合断片と接触させ、そしてそれらからｈＤＲＲを溶出することを含んでなる方法。
30. 配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合断片または請求項２３に記載のＥＰＦ関連ペプチド用の抗体。
31. ｈＤＲＲ活性に関連する障害に関連する個体の病理学的状態を診断する方法における請求項２９に記載の抗体の使用であって；抗体を試験サンプルと接触させ、ここで該試験は好ましくは血液、唾液、精液、脳脊髄液、血漿またはリンパ液のような体液からなり；そして試験サンプルに及ぼす該抗体の反応性を測定することを含んでなる上記使用。
32. ｉ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、または配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片からなる群から選択されるポリペプチド；あるいは
    ｉｉ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、または配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ４結合断片からなる群から選択されるポリペプチドに対する抗体、
    を含んでなる診断用キット。
33. ｈＤＲＲアンタゴニストである請求項１０ないし１８のいずれか１項で同定される化合物の、避妊薬として使用するための、またはガンの処置のための組成物の製造における使用。
34. ｈＤＲＲアゴニストである請求項１０ないし１８のいずれか１項で同定される化合物の、流産の防止に使用するための組成物の製造における使用。
35. 流産の防止に使用するための組成物の製造における、配列番号８によりコードされるｈＤＲＲ結合断片または請求項２３に記載のＥＰＦ関連ペプチドの使用。

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