JPH10201485A - 新規ｇ−蛋白質結合レセプターｈｕｖｃｔ３６ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ヒトＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドおよび
該ポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）が望まれ
ている。 【解決手段】 本発明は、（ａ）遺伝暗号の重複性によ
って、配列番号２のアミノ酸と同じアミノ酸をコードす
るポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド
に対して相補的であるポリヌクレオチド；および（ｃ）
（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも連
続した１５塩基からなるポリヌクレオチド；からなる群
より選択されるポリヌクレオチドからなる単離ポリヌク
レオチドを提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一部では、新規に
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその変種
および誘導体の製造方法；ポリペプチドのアゴニストお
よびアンタゴニスト；ならびにポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニ
ストの使用に関するものである。特に、これらのおよび
その他の点に関して、本発明は、以下、「ＨＵＶＣＴ３
６」と称するヒトＧ−タンパク質結合レセプターのポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明は新規に同定されたポリヌクレオ
チド、かかるポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチド
の使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポ
リペプチドは血小板活性化因子レセプターに類似するヒ
ト７−トランスメンブランレセプター（7-transmembran
e receptors）である。本発明はまたかかるポリペプチ
ドの作用の阻害または活性化にも関する。

【０００３】医学的に重要な生物学的過程が、Ｇ−タン
パク質および／または２次メッセンジャー例えばｃＡＭ
Ｐが関与するシグナル形質導入経路に関係しているタン
パク質により媒介されるということは立証されている
（Lefkowitz、Nature 351:353-354（1991））。本明細
書においてはこれらのタンパク質はＧ−タンパク質また
はＰＰＧ−タンパク質との経路に関係するタンパク質と
称する。これらのタンパク質の例としては、アドレナリ
ン産生物質およびドーパミンに対するレセプターのごと
きＧＰＣレセプター（Kobilka,B.K.ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.，USA 84:46-50（1987）；Kobilka,B.K.ら、Scie
nce 238:650-656（1987）；Bunzow,J.R.ら、Nature 33
6:783-787（1988））、Ｇ−タンパク質自体、エフェク
タータンパク質例えばホスフォリパーゼＣ、アデニレー
トシクラーゼ、およびホスフォジエステラーゼ、ならび
に発動タンパク質例えばプロテインキナーゼＡおよびプ
ロテインキナーゼＣ（Simon,M.I.ら、Science 252:802-
808（1991））を包含する。

【０００４】例えば、シグナル形質導入の一つの形態に
おいて、ホルモン結合の効果は細胞内の酵素、アデニレ
ートシクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の
活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存する。ＧＴＰ
もまたホルモン結合性に影響する。Ｇ−タンパク質はホ
ルモンレセプターをアデニレートシクラーゼに連結す
る。Ｇ−タンパク質がホルモンレセプターにより活性化
された場合、ＧＴＰを結合ＧＤＰと交換することが示さ
れている。次にＧＴＰ-担持形態は活性化アデニルシク
ラーゼに結合して活性化する。ＧＴＰのＧＤＰへの加水
分解はＧ−タンパク質自体に触媒され、Ｇ−タンパク質
を元の不活性形態に戻す。従って、Ｇ−タンパク質はシ
グナルをレセプターからエフェクターへ中継する中間体
として、およびシグナルの継続を調節する時計としての
二つの役割を呈する。

【０００５】Ｇ−タンパク質結合レセプターの膜タンパ
ク質遺伝子スーパーファミリーは７個の推定トランスメ
ンブランドメインを有するとして特徴づけられている。
このドメインは細胞外または細胞質係蹄により連結され
るトランスメンブランαらせんを呈すると考えられる。
Ｇ−タンパク質結合レセプターはホルモン、ウイルス
性、成長因子および神経レセプターのごとき広範な生物
学的に活性なレセプターを包含する。

【０００６】Ｇ−タンパク質結合レセプターはこれらの
７個の、アミノ酸約２０〜３０個の保存疎水性配列を含
み、少なくとも８個の分岐疎水性係蹄部で連結する特徴
を有する。結合レセプターのＧ−タンパク質ファミリー
は、精神病および神経障害の処置に用いられる神経弛緩
薬に結合するドーパミンレセプターを包含する。このフ
ァミリーのメンバーのその他の例としては、カルシトニ
ン、アドレナリン作動性物質、エンドセリン、ｃＡＭ
Ｐ、アデノシン、ムスカリン様物質、アセチルコリン、
セロトニン、ヒスタミン、スロンビン、キニン、小胞刺
激ホルモン、オプシン、内皮性分化遺伝子−１、ロドプ
シン、オドラント、およびサイトメガロウイルスレセプ
ターを包含する。

【０００７】ほとんどのＧ−タンパク質結合レセプター
は、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられるジ
スルフィド結合を形成する最初の2個の細胞外係蹄の各
々に、単一の保存システイン残基を有する。7個のトラ
ンスメンブラン領域をＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ
４、ＴＭ５、ＴＭ6、およびＴＭ７と称する。ＴＭ３は
シグナル形質導入に関与している。

【０００８】システイン残基のリン酸化および脂質化
（パルミチル化またはファルネシル化）はＧ−タンパク
質結合レセプターのシグナル形質導入に影響を及ぼし得
る。ほとんどのＧ−タンパク質結合レセプターは3番目
の細胞質係蹄および／またはカルボキシ末端内に潜在的
リン酸化部位を含有する。β−アドレナリンレセプター
のごときいくつかのＧ−タンパク質結合レセプターで
は、プロテインキナーゼＡおよび／または特異的レセプ
ターキナーゼによるリン酸化はレセプター脱感作を媒介
する。

【０００９】あるレセプターでは、Ｇ−タンパク質結合
レセプターのリガンド結合部位はいくつかのＧ−タンパ
ク質結合レセプタートランスメンブランドメインにより
形成される親水性ソケットを有してなると考えられてお
り、該ソケットはＧ−タンパク質結合レセプターの疎水
性残基により囲まれている。Ｇ−タンパク質結合レセプ
ターのトランスメンブランらせんの各々の親水性部位は
内側に向かって面し、極性を有するリガンド結合部位を
形成すると仮定される。ＴＭ３は、ＴＭ３アスパルテー
ト残基のごときリガンド結合部位を有するので、いくつ
かのＧ−タンパク質結合レセプターに関与している。Ｔ
Ｍ５セリン、ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６またはＴ
Ｍ７フェニルアラニンまたはチロシンもまたリガンド結
合に関与している。

【００１０】Ｇ−タンパク質結合レセプターはヘテロ三
量体Ｇ−タンパク質により、種々細胞内酵素、イオンチ
ャンネルおよび輸送因子に細胞内で結合できる（Johnso
nら、Endoc,Rev.10:317-331（1989）を参照のこと）。
異なるＧ−タンパク質α−サブユニットは特定のエファ
クターを優先的に刺激し、細胞における種々の生物学的
機能を変調する。Ｇ−タンパク質結合レセプターの細胞
質残基のリン酸化は、Ｇ−タンパク質結合レセプターに
おけるＧ−タンパク質結合の制御のための重要なメカニ
ズムとみなされた。Ｇ−タンパク質結合レセプターは哺
乳動物宿主において非常に多くの部位で見出されてい
る。

【００１１】この遺伝子ファミリーのメンバーの配列に
おいて部分的保存領域が存在することにより、相同体の
スクリーニングおよびポリメラーゼ連鎖反応増幅を用い
てレセプターを単離することが可能になる。これらの技
術を用いて、ＧＰＲ１２ＡおよびＧＰＲ６Ｃ．１と称す
る、ヒト肺組織に主に発現する２種の非常に相関したＧ
−タンパク質結合レセプター候補物質をクローン化し、
配列決定した（Anら、FEBS Letters 375:121-124（199
5））。ＧＰＲ１２Ａの最適なオープン・リーディング
・フレームは１０９５bpを有し、３６５個のアミノ酸の
推定されるレセプターをコードする。ＧＰＲ６Ｃ．１の
オープン・リーディング・フレームは１０８６bpであ
り、３６２個のアミノ酸のタンパク質をコードし、ＧＰ
Ｒ１２Ａに対する同一性は４６.１％である。ＧＰＲ１
２ＡおよびＧＰＲ６Ｃ．１間の類似性は、これらが化学
構造が類似したリガンドのレセプター、または同一のリ
ガンドのレセプターサブタイプであることを示してい
る。

【００１２】過去１５年にわたって、７種のトランスメ
ンブランレセプター（７ＴＭ）を標的とする約３５０種
の治療薬が市場に導入されて成功をおさめている。この
ことは、これらのレセプターが治療薬として確立され、
解明された経歴を有することを示している。限定はしな
いが、細菌、菌類、原生動物およびウイルス感染のごと
き感染、とりわけＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に引き起
こされる感染；疼痛；癌；食欲不振；大食；喘息；パー
キンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；残尿；骨粗
鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良
性前立腺肥大；並びに、不安、精神分裂病、躁鬱病、せ
ん妄、痴呆症、重篤な精神遅滞および運動障害を包含す
る、ハンティントン病またはジル・ドラ・ツレット症候
群のごとき精神病的および神経学的障害等を包含する機
能不全または疾病の防御、改善または治療において役割
を果たし得るさらなるレセプターの同定および特徴づけ
が必要とされているのは明らかである。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】これらのおよびその他
の目標のための、本発明の一つの目的は、ポリペプチド
とりわけ図１ないし３に示すアミノ酸配列およびヒト血
小板活性化因子レセプター、アンジオテンシン２型レセ
プター、およびピューリノセプターのごときその他のタ
ンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性により、新規Ｈ
ＵＶＣＴ３６として同定されたポリペプチドを提供する
ことである。本発明のさらなる目的は、ＨＵＶＣＴ３６
をコードするポリヌクレオチド、具体的には本明細書に
おいて配列番号：２と称するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【００１４】本発明のこの態様のとりわけ好ましい具体
例では、該ポリヌクレオチドは、図１ないし３に示す配
列における、ヒトＨＵＶＣＴ３６をコードする領域を含
んでなる。本発明のこの態様によれば、ＡＴＣＣ受託番
号９８１５６に含まれるヒトｃＤＮＡから成熟ポリペプ
チドを発現可能なようにコードする単離核酸分子が提供
される。本発明のこの態様によれば、ヒトＨＵＶＣＴ３
６をコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡお
よびフラグメント、ならびに本発明のこの態様のさらな
る具体例では、生物学的、診断学的、臨床的もしくは治
療的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体、およ
び変種、アナログもしくは誘導体のフラグメント等を包
含する単離核酸分子が提供される。本発明のこの態様の
特に好ましい具体例は、ヒトＨＵＶＣＴ３６の自然発生
対立遺伝子変種である。

【００１５】治療目的で、例えば、細菌、菌類、原生動
物およびウイルス感染のごとき感染、とりわけＨＩＶ−
１またはＨＩＶ−２に引き起こされる感染；疼痛；癌；
食欲不振；大食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；
低血圧；高血圧；残尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；
潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；並びに、不
安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆症、重篤な精神
遅滞および運動障害を包含する、ハンティントン病また
はジル・ドラ・ツレット症候群のごとき精神病的および
神経学的障害等の処置に用いることができるＨＵＶＣＴ
３６ポリペプチド、特にヒトＨＵＶＣＴ３６ポリペプチ
ドを提供することも本発明の目的である。本発明のこの
態様によれば、本明細書においてＨＵＶＣＴ３６と称す
るヒト由来の新規ポリペプチド、および生物学的、診断
学的または治療的に有用なそれのフラグメント、変種お
よび誘導体、そのフラグメントの変種および誘導体、並
びに前記の類似体が提供される。

【００１６】本発明のこの態様の特に好ましい具体例
は、ヒトＨＵＶＣＴ３６遺伝子の自然発生対立遺伝子に
よりコードされるヒトＨＵＶＣＴ３６の変種である。本
発明の別の態様によれば、本発明のレセプターポリペプ
チドに結合しその活性を活性化または阻害する化合物お
よびレセプターリガンドをスクリーニングする方法が提
供される。本発明の別の目的は、前記のポリペプチド、
ポリペプチドフラグメント、変種および誘導体、変種お
よび誘導体のフラグメント、並びに前記の類似体の製造
方法を提供することである。本発明のこの態様の好まし
い具体例において、外来性のＨＵＶＣＴ３６のコード化
ポリヌクレオチドを発現可能な様に挿入した宿主細胞
を、宿主においてヒトＨＵＶＣＴ３６を発現するような
条件下で培養し；ポリペプチドを発現し；次いで発現し
たポリペプチドを回収することからなる、前記したＨＵ
ＶＣＴ３６ポリペプチドの製造方法を提供する。

【００１７】本発明の別の目的によれば、とりわけ研
究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する生成物、組
成物、工程および方法が提供される。本発明のこの態様
の特定の好ましい具体例によれば、とりわけ：細胞を本
明細書に開示するＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドに曝露することにより、インビトロ、エ
クソビボまたはインビボで、細菌、菌類、原生動物およ
びウイルス感染のごとき感染、とりわけＨＩＶ−１また
はＨＩＶ−２に引き起こされる感染；疼痛；癌；食欲不
振；大食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血
圧；高血圧；残尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰
瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；並びに、不
安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆症、重篤な精神
遅滞および運動障害を包含する、ハンティントン病また
はジル・ドラ・ツレット症候群のごとき精神病的および
神経学的障害等を処置するためにＨＵＶＣＴ３６ポリペ
プチドまたはＨＵＶＣＴ３６コード化ｍＲＮＡを測定す
ることによる、細胞中のＨＵＶＣＴ３６発現の評価；Ｈ
ＵＶＣＴ３６遺伝子における遺伝的変化および異常例え
ば欠失の評価；並びにＨＵＶＣＴ３６機能を増強するた
めの、またはＨＵＶＣＴ３６機能不全を修復するため
の、ＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドの生体への投与のための、製品、組成物、および方法
を提供する。

【００１８】本発明のさらに別の具体例によれば、ＨＵ
ＶＣＴ３６の過少発現に関与する状態の処置のために本
発明のレセプターポリペプチドを刺激する、かかる活性
化物質の使用方法が提供される。本発明の別の態様によ
れば、ＨＵＶＣＴ３６の過剰発現に関与する状態の処置
のための、かかる阻害物質の使用方法が提供される。本
発明のまた別の態様によれば、本発明のＨＵＶＣＴ３６
の少なくとも一つのドメインの保存アミノ酸置換体を有
するフラグメント、コンセンサスフラグメントおよび／
または配列である自然発生でなく合成による、単離され
たおよび／または組換えＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドが
提供され、該レセプターはＨＵＶＣＴ３６リガンドに結
合できるか、またはＨＵＶＣＴ３６リガンド結合を定性
的または定量的に変調できる。

【００１９】本発明のさらに別の態様によれば、期待さ
れる生物学的特性のために、リガンドに結合することに
より、またはリガンド結合を変調することにより、ＨＵ
ＶＣＴ３６機能の潜在的モデュレーターとして有用な、
合成または組換えＨＵＶＣＴ３６ポリペプチド、それの
保存置換体および誘導体、それに対する抗体、抗イディ
オタイプ抗体、組成物ならびに方法が提供され、これら
は診断学的、治療的および／または研究的な適用に用い
ることができる。レセプター型またはサブタイプとして
種々ＨＵＶＣＴ３６またはそのフラグメントを阻害また
は擬似するように設計した合成、単離または組換えポリ
ペプチドを提供することも本発明のさらに別の目的であ
る。本発明のこのおよびその他の態様の特定の好ましい
具体例では、ヒトＨＵＶＣＴ３６配列にハイブリダイゼ
ーションするプローブを提供する。

【００２０】本発明のこの態様の特定のさらに好ましい
具体例では、ＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドに対する抗体
を提供する。この点に関するとりわけ好ましい具体例で
は、抗体はヒトＨＵＶＣＴ３６に対して高度に選択的で
ある。本発明の別の態様によれば、ＨＵＶＣＴ３６アゴ
ニストが提供される。とりわけ好ましいアゴニストは、
ＨＵＶＣＴ３６結合分子、またはレセプター分子に結合
し、ＨＵＶＣＴ３６誘起反応を引き出すまたは増強する
ＨＵＶＣＴ３６に擬似する分子である。また、とりわけ
好ましいアゴニストは、ＨＵＶＣＴ３６もしくはＨＵＶ
ＣＴ３６ポリペプチド、またはその他のＨＵＶＣＴ３６
作用のモデュレーターと相互作用し、それにより１また
はそれ以上のＨＵＶＣＴ３６の効果を可能にするかまた
は増強する分子である。

【００２１】本発明のさらに別の態様によれば、ＨＵＶ
ＣＴ３６アンタゴニストが提供される。とりわけ好まし
いアンタゴニストは、ＨＵＶＣＴ３６レセプターまたは
結合分子に結合するが、１またはそれ以上のＨＵＶＣＴ
３６誘起反応を引き出さないようなＨＵＶＣＴ３６に擬
似する分子である。また、とりわけ好ましいアンタゴニ
ストは、ＨＵＶＣＴ３６の１もしくはそれ以上の効果を
阻害するように、またはＨＵＶＣＴ３６の発現を阻止す
るように、ＨＵＶＣＴ３６と結合もしくは相互作用する
分子である。本発明のさらなる態様において、インビト
ロで細胞に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞
に、または多細胞生体に投与するための、ＨＵＶＣＴ３
６ポリヌクレオチドまたはＨＵＶＣＴ３６ポリペプチド
を含んでなる組成物を提供する。本発明のこの態様の特
に好ましい具体例において、該組成物は、疾患の処置の
ために宿主生体においてＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドを
発現するためのＨＵＶＣＴ３６ポリヌクレオチドを含ん
でなる。この点に関して、特に好ましくは、内在性ＨＵ
ＶＣＴ３６の異常活性に関連する機能不全の処置のため
に、ヒト患者において発現させることである。

【００２２】本発明のその他の目的、特徴、優越点およ
び態様は、以下の記載より当業者には明白であろう。し
かしながら、以下の記載および具体的な実施例は、本発
明の好ましい具体例を示すものであり、説明のためにの
み示すものであることを理解されたい。開示した本発明
の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下
の記載および本明細書のその他の部分を読むことによ
り、当業者に容易に明らかとなろう。

【００２３】

【発明の実施の形態】

定義 以下に例示する説明は、本明細書、特に実施例において
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。ＤＮＡの
「消化」は、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素
などの酵素を用いるＤＮＡの触媒的分裂をいうが、これ
に限定されるものではない。本明細書にいう種々の制限
酵素は市販されており、その反応条件、補酵素および使
用についての他の要件は知られており、当業者にとって
慣用的である。解析を目的とする場合、典型的には、１
μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。
プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
ことを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇの
ＤＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５
０ユニットの酵素で消化する。

【００２４】個々の制限酵素についての適当な緩衝液お
よび基質の量は、以下に述べるごとき標準的実験室マニ
ュアルに記載されており、それらは供給者によって特定
されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応の詳細に従って変えることができる。消
化後、当業者にとって日常的なよく知られた方法を用い
て反応物を解析し、フラグメントをアガロースまたはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製してもよ
い。

【００２５】「遺伝的因子」は、一般に、ポリペプチド
をコードする領域あるいは複写、転写もしくは翻訳また
は宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプ
ロセスを調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、
あるいはポリペプチドをコードする領域、およびそれに
作動可能に連結された発現を調節する領域の両方を含ん
でなるポリヌクレオチドを意味する。遺伝的因子は、エ
ピソーム因子、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立
した分子として複製されるベクター内に取り込まれてい
てもよい。それらは、真核細胞において、メトトレキセ
ート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の
間に生じるミニ染色体のごときものの中に取り込まれて
いてもよい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内に取り込
まれていてもよいが、それは天然の状態ではなく、むし
ろ、単離、クローニングおよび、とりわけ精製ＤＮＡの
形態の、またはベクターにて宿主細胞への導入といった
操作を受けている。

【００２６】「単離」とは、「人工的」に天然状態から
変化させられていること、すなわち、単離が天然におい
て起こる場合には、その本来の環境から変化させられ、
あるいはその環境から除去されること、あるいはその両
方を意味する。例えば、その天然状態の生物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離
されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、その語を本明細書で用いる場合の「単離」されてい
るである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離
という語は、それが天然に存在している染色体および細
胞から分離されていることを意味する。

【００２７】単離の一部として、あるいは単離後に、例
えば、融合タンパク質を形成するための突然変異誘発の
ために、および宿主中での増殖または発現のために、か
かるポリヌクレオチドをＤＮＡなどの他のポリヌクレオ
チドに結合させることができる。単離ポリヌクレオチド
は単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチド
と結合して、培養細胞または生物全体における宿主細胞
に導入されうる。培養または生物全体における宿主細胞
へ導入される場合、その語を本明細書において用いる場
合、かかるＤＮＡはやはり単離されている、というの
も、それらは天然に存在する形態でなく、あるいは天然
環境に存在するものでないからである。同様に、ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、培地、処方、ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への導入
のための溶液、化学反応または酵素反応のための組成物
または溶液のごとき組成物の中に存在してもよく、例え
ば、それらは天然には存在しない組成のものであり、そ
の中で単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは本明
細書にいう単離を意味する。

【００２８】「ライゲーション」とは、ほとんどの場
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチド間のホスホジエステル結合を形成するプロセス
をいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよく
知られており、ライゲーションについてのプロトコルは
標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrookら、
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed; Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har
bor, New York (1989) （以下、Sambrookらという）な
どの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチド」と
は比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばしば、その
用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいうが、同様
に、１本鎖または２本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：Ｄ
ＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮＡなどをいうことも
できる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなど
のオリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成
機の使用のごとき、化学的方法により合成されることが
よくある。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、イン
ビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞および生物におけるＤ
ＮＡ発現による方法を含め、他の種々の方法により製造
することができる。

【００２９】最初、化学的に合成されたＤＮＡは典型的
には５'リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリゴヌ
クレオチドの５'末端は、組換えＤＮＡ分子を形成する
ために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用するラ
イゲーション反応によるホスホジエステル結合形成の基
質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲーショ
ンが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いるよう
な標準的方法によりリン酸を付加することができる。化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３'末端は、一
般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオチドな
どの、別のポリヌクレオチドの５'リン酸とホスホジエ
ステル結合を容易に形成するであろう。よく知られてい
るように、要すれば、ライゲーションの前に他のポリヌ
クレオチド（複数でも可）の５'リン酸を除去すること
によって、この反応を選択的に阻害できる。

【００３０】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部ではない安定的に存在する遺伝的因子である。それら
はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなり、直鎖または環状で
あってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその複製お
よび安定な存在を確実にする分子をコードしており、医
学的、農学的、および環境学的に非常に重要な産物をコ
ードしているかもしれない。例えば、プラスミドは病原
菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プラス
ミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子をコー
ドすることができる。プラスミドは、組換え遺伝子をク
ローン化および発現するために用いられるベクターとし
て分子生物学において広く使用されている。プラスミド
は、一般に、本明細書中、当業者によく知られた標準的
命名法により、大文字および／または数字が前および／
または後に続く小文字の「ｐ」により命名される。本明
細書に開示の開始プラスミドは、市販のもの、公的に利
用可能なものであるか、またはよく知られた、公開され
た操作を慣用的に用いることにより利用可能なプラスミ
ドから構築可能なもののいずれかである。本発明に従っ
て使用可能な多くのプラスミドならびに他のクローニン
グおよび発現ベクターはよく知られており、当業者が容
易に入手できるものである。さらに、当業者は、本発明
における使用に適する数多くの他のプラスミドを慣用的
手段により構築することができる。本発明における、か
かるプラスミドならびに他のベクターの性質、構築およ
び使用は、本開示から当業者に容易に明らかとなろう。

【００３１】一般に、「ポリヌクレオチド（複数でも
可）」は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリ
ボヌクレオチドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡある
いは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。かくし
て、例えば、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、特
に、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領
域の混ざったＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、およ
び１本鎖および２本鎖領域の混ざったＲＮＡ、１本鎖で
あるＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子
をいい、より典型的には、２本鎖のものまたは１本鎖お
よび２本鎖領域の混ざったものをいう。加えて、本明細
書にて用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ
あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる３本鎖
領域をいう。かかる領域中の鎖は同じ分子由来であって
もよく、また異なる分子由来であってもよい。その領域
は１つまたはそれ以上の分子の全体を含んでいてもよい
が、より典型的には、分子のいくつかの領域のみを含
む。３本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリ
ゴヌクレオチドである。

【００３２】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
なる語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含む上記Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを包含する。かくして、安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡは、その用語を本明細書にて用いるところのポリ
ヌクレオチドである。さらに、例えば２つの例だけを挙
げると、イノシンのような普通でない塩基、またはトリ
チル化された塩基などの修飾塩基を含んでなるＤＮＡま
たはＲＮＡも、その用語を本明細書に用いるポリヌクレ
オチドである。多種な修飾が、当業者に公知の多くの有
用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡについて行われて
いることは明らかである。本明細書で用いるポリヌクレ
オチドなる用語は、かかる化学的、酵素的、または代謝
的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、特
に、ウイルスおよび単純型および複雑型細胞を含む、細
胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含す
る。

【００３３】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に説明するようなすべてのポリペプチドを包含する。
ポリペプチドの基本的構造はよく知られており、当該分
野の多数の教科書および他の刊行物に記載されている。
この点からすると、この用語は、本明細書にてペプチド
結合により互いに直鎖状に結合した２個またはそれ以上
のアミノ酸を含んでなるペプチドまたはタンパク質をい
う。本明細書において用いる場合、該用語は、当該分野
において、通常、例えば、ペプチド、オリゴペプチドお
よびオリゴマーともいわれる短い鎖、および、当該分野
において一般に、多くのタイプが存在するタンパク質と
いわれる長い鎖の両方をいう。

【００３４】ポリペプチドが、しばしば、一般に２０個
の天然アミノ酸といわれる２０個のアミノ酸以外のアミ
ノ酸を含んでいること、および、プロセッシングおよび
他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスにより、あるいは
当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても、末端
アミノ酸を含む多くのアミノ酸が所定のポリペプチド中
で修飾されていてもよいことが理解されよう。ポリペプ
チドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも膨大すぎ
てここに列挙できないが、それらは基本的な教科書およ
びさらに詳細な研究論文、ならびに膨大な研究文献にも
記載されており、それらは当業者によく知られている。
本発明のポリペプチドに行いうる公知修飾の例として、
アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド
化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレ
オチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質また
は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの
共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合の形成、
脱メチル化、共有交差結合の形成、システインの形成、
ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボ
キシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タ
ンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル
化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化な
どの転移ＲＮＡ介在のタンパク質へのアミノ酸付加、お
よびユビキチン化が挙げられる。かかる修飾は当業者に
よく知られており、科学文献に非常に詳細に記載されて
いる。いくつかの特に一般的な修飾、例えば糖鎖形成、
脂質形成、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボ
キシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化
は、例えば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPE
RTIES,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Compan
y, New York (1993) のごとき基本テキストに記載され
ている。この問題に関して、詳細な報文が利用可能であ
る。例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIO
N OF PROTEINS, B.C.Johnson編, Academic Press, New
York (1983) 中、Wold,F.、Posttranslational Protein
Modifications:Prespectives and Prospects, pgs.1-1
2； Seifterら、Meth.Enzymol. 182:626-646 (1990) お
よび Rattmanら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (19
92) を参照のこと。

【００３５】よく知られ、上記したごとく、ポリペプチ
ドは常に全体が直鎖状であるとは限らないことが理解さ
れよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果と
して分枝していてもよく、一般に、天然に起こるプロセ
ッシング事象および自然には起こらないヒトによりもた
らされる事象を含め、翻訳後の事象の結果として、それ
らは分枝の有無にかかわらず、環状であってもよい。環
状、分枝および分枝環状のポリペプチドは、非翻訳的天
然プロセスおよび完全な合成法によって合成されてもよ
い。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ
またはカルボキシル末端を含め、ポリペプチドのどこで
でも起こり得る。実際、ポリペプチドにおけるアミノま
たはカルボキシル基、あるいはそれら両方の共有結合の
修飾による遮断は、天然および合成ポリペプチドにおい
て共通であり、かかる修飾は本発明ポリペプチドにおい
ても同様に存在してもよい。例えば、プロセッシングの
前にエシェリキア・コリにおいて形成されるポリペプチ
ドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なくＮ−ホルミル
メチオニンである。

【００３６】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、ポリペプチドの形成の仕方と相関関係にある。例
えば、宿主中でクローン化された遺伝子を発現すること
により形成されるポリペプチドの場合、修飾の性質およ
び程度の大部分は、宿主細胞での翻訳後修飾能およびポ
リペプチドのアミノ酸配列に存在する修飾シグナルによ
って決定されるであろう。例えば、よく知られているよ
うに、糖鎖形成は、しばしば、エシェリキア・コリのご
とき細菌宿主では起こらない。従って、糖鎖形成が望ま
しい場合には、糖鎖形成宿主、一般には真核生物の細胞
中でポリペプチドを発現させるべきである。昆虫細胞
は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。
この理由のため、昆虫細胞発現系が、とりわけ、元来の
糖鎖形成のパターンを有する哺乳動物タンパク質を効率
よく発現するために開発された。同様の考え方が他の修
飾にも適用される。

【００３７】同じタイプの修飾が、所定のポリペプチド
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いる場合、ポリペプチドなる用語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。

【００３８】ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用いる場合、
それは、各々、対照のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとは異なる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
をいう。この意味における変種は、以下の部分および本
開示のいずれかの部分においてより詳細に記載されてい
る。変種は、ヌクレオチド配列にて、別の対照ポリヌク
レオチドと異なるポリヌクレオチドを包含する。一般
に、相違は対照と変種のヌクレオチド配列が全体的に極
めて類似し、多くの領域において同一であるようなもの
に限られる。

【００３９】下記のごとく、変種におけるヌクレオチド
配列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、そ
れらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸
を変えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化に
限定される場合、変種は対照のポリペプチドと同じアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするであろう。
また、下記のごとく、変種のヌクレオチド配列における
変化が、対照のポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよい。かかる
ヌクレオチドの変化は、下記のごとく、対照配列により
コードされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、欠
失、融合および切断をもたらすかもしれない。

【００４０】変種はまた、アミノ酸配列にて、別の対照
ポリペプチドと異なるポリペプチドを包含する。一般
に、相違は、対照と変種の配列が全体的に極めて類似
し、多くの領域において同一であるようなものに限られ
る。変種および対照のポリペプチドは、アミノ酸配列に
て、１個またはそれ以上の置換、付加および欠失により
異なっていてもよく、それらはいずれの組み合わせにて
存在してもよい。

【００４１】本明細書にて用いる場合、「融合タンパク
質」は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝子または
そのフラグメントでコードされる蛋白質である。ＥＰ-
Ａ-Ｏ４６４ ５３３（対応カナダ国特許2045869）は、
もう一つ別のヒトタンパク質またはそれの一部と共に免
疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を含んでなる
融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用いること
が、治療および診断における使用について有利であり、
例えば、改良された薬物動態学的性質が得られる（ＥＰ
-Ａ ０２３２ ２６２）。他方、いくつかの使用におい
ては、融合タンパク質が発現され、検出され、次いで精
製された後、Ｆｃ部分を検出できることが望まれる。し
たがって、融合タンパク質の２つの成分を、化学的また
は酵素的切断しうる結合領域で連結させることが望まし
い。これは、治療および診断における使用に対して妨害
となるようにＦｃ部分を改良する場合であり、例えば、
融合タンパク質を免疫化のための抗原として使用すべき
場合である。例えば、薬物の発見において、ｓｈＩＬ５
-αのごときヒトタンパク質は、ｈＩＬ-５のアンタゴニ
ストを同定するための高処理量のスクリーニングアッセ
イにて用いるためにＦｃ部分と融合されている（D.Benn
ettら、Journal of Molecular Recognition, 8:52-58(1
995) およびK.Johansonら、The Journal of Biological
Chemistry, 270:16, pp9459-9471（1995）を参照のこ
と）。

【００４２】かくして、本発明は、ＨＵＶＣＴ３６、ま
たはその部分、および、種々のサブクラスの免疫グロブ
リン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または
軽鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる遺伝子操作さ
れた可溶性融合タンパク質にも関する。免疫グロブリン
として好ましいのは、融合がヒンジ領域でおこったヒト
のＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の不変部分である。個々
の具体例において、血餅形成因子Ｘａで開裂できる開裂
配列の組み込みによってＦｃ部分が簡単な方法で除去さ
れうる。さらに、本発明は遺伝子操作によるこれらの融
合タンパク質の製造方法、および、診断および治療に対
するそれの使用に関する。本発明のさらなる態様は、か
かる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも
関する。

【００４３】膜結合レセプターは融合タンパク質の形成
において特に有用である。このようなレセプターは、一
般に、３種の異なる領域：細胞外ドメイン；トランスメ
ンブランドメイン；および細胞質ドメインを有すること
で特徴付けられる。本発明は融合タンパク質の成分とし
て１またはそれ以上のこれら領域を用いるものである。
このような融合タンパク質技術の例は、ＷＯ９４／２９
４５８およびＷＯ９４／２２９１４に見られる。「結合
分子」（そうでなければ「相互作用分子」または「レセ
プター成分因子」と称される）は、本発明のレセプター
ポリペプチドに特異的に結合または相互作用するリガン
ドを有してなる分子をいう。かかる結合分子は本発明の
一部である。結合分子はまた、本発明のポリペプチドに
特異的に結合する抗体および抗体誘導試薬などの非天然
物であってもよい。

【００４４】当該分野に知られているごとく、２つのポ
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその同類アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２つの鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に公開されている操作に従って容易
に計算できる（COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Les
k,A.M.編, OxfordUniversity Press, New York, 1988;
BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOMEPROJECTS, Smit
h,D.W.編, Academic Press, New York, 1993; COMPUTER
ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編, Humana Press, New Jersey, 199
4; SEQUENCE ANALTSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Hei
nje, G.,Academic Press, 1987; およびSEQUENCE ANALY
SIS PRIMER，Gribskov,M.およびDevereux,J.編, M Stoc
kton Press, New York, 1991）。２つのポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチド配列の間の同一性および類似性を
測定するための多くの方法が存在し、「同一性」および
「類似性」なる用語は当業者によく知られている（Cari
llo,H.およびLipton,D.、SIAM J.Applied Math. 48:107
3 (1988)）。通常、２つの配列間の同一性または類似性
を決定するために用いられる方法は、これに限定されな
いが、Guide to Huge Computers, Martin J.Bishop編,
Academic Press, San Diego, 1994 およびCarillo,H.お
よび Lipton，D.、SIAM J.Applied Math. 48:1073（198
8）に開示されている方法を包含する。同一性を測定す
る好ましい方法は、試験する２つの配列間に最大の対合
を与えるように設計される。同一性および類似性を測定
する方法はコンピュータープログラムに書き込まれてい
る。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ま
しいコンピュータープログラムは、これに限定されない
が、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Devereux,J.ら、N
ucleic Acids Research 12（1）：387（1984）,BLASTP,
BLASTN, FASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.，21
5:403（1990））を包含する。

【００４５】本発明は、とりわけ、以下にさらに詳細に
記載する、新規ＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ヒト血小板活
性化因子、アンジオテンシン２型レセプターおよびプリ
ノセプター（purinoceptor）に対するアミノ酸相同性に
より関連付けられる、新規ヒトＨＵＶＣＴ３６のポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特
に、図１ないし３に示すヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を有するＨＵＶＣＴ３６に、および本明細書中、
「寄託クローン」または「寄託クローンのｃＤＮＡ」と
称するＡＴＣＣ受託番号９８１５６のヒトｃＤＮＡのＨ
ＵＶＣＴ３６ヌクレオチド配列およびそれによりコード
されるアミノ酸配列に関する。図１ないし３に示すヌク
レオチド配列およびアミノ酸配列は、寄託クローンのｃ
ＤＮＡを配列決定することにより得られる。これゆえ、
寄託クローンの配列は２者の間の不一致を調整してお
り、図１ないし３の配列に関するものは寄託クローンの
ヒトｃＤＮＡの配列に関するものを包含する。

【００４６】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図１ないし３（配列番号
２）の推定アミノ酸配列を有するＨＵＶＣＴ３６ポリペ
プチドをコードする単離ポリヌクレオチドが得られる。
図１ないし３（配列番号１）に示すポリヌクレオチド配
列のごとき本明細書に示す情報を用いて、ヒトＨＵＶＣ
Ｔ３６をコードする本発明のポリヌクレオチドを、出発
物質として胎盤組織からの細胞由来のｍＲＮＡを用いて
ｃＤＮＡをクローニングする方法などの、標準的クロー
ニングおよびスクリーニング法を用いて得ることができ
る。本発明の代表例である、図１ないし３に示すポリヌ
クレオチドは、ヒト胎盤組織の細胞由来のｃＤＮＡライ
ブラリーにて見つかった。さらに詳しくは、胎盤組織よ
り調製したヒトゲノムライブラリーを、ハイブリッド形
成プローブとして５ＨＴ７レセプターｃＤＮＡおよびα
１Ｃ−アドレノセプターの部分を用いて、低ストリンジ
ェントなハイブリッド形成条件下、スクリーンに付し
た。１５個の強くハイブリッド形成したゲノムクローン
をプラーク希釈精製法により単離した。ＳａｃＩを用い
る制限酵素消化により、ＤＮＡを単離し、分析した。Ｓ
ａｃＩ消化ＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳動法を用
いてサイズ分画に付した。ついで、ＤＮＡフラグメント
を、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするため
に用いられるのと同じｃＤＮＡでハイブリッド形成し
た、ニトロセルロース膜に移した。略３キロ塩基の大き
さの強くハイブリッド形成したフラグメントをサブクロ
ーンし、ＤＮＡ配列決定により特徴づけした。このクロ
ーンをＨＵＶＣＴ３６と称する。

【００４７】本発明のヒトＨＵＶＣＴ３６は、構造的
に、寄託クローン中のヒトＨＵＶＣＴ３６をコードする
ｃＤＮＡを配列決定した結果より明らかなように、Ｇ結
合タンパク質レセプターファミリーの他のタンパク質に
関連付けられる。例えば、ＨＵＶＣＴ３６は、各々、約
２０−３０個のアミノ酸の７つの疎水領域を含有し、そ
れは、Ｇ−タンパク質結合したレセプターのスーパーフ
ァミリーの間に見られる７トランスメンブランの構造的
トポロジーを付与する膜スパンニングドメインであると
考えられる。得られたｃＤＮＡ配列を図１ないし３にて
配列番号１として示す。それは推定分子量約４２ｋＤａ
の３７５アミノ酸のタンパク質をコードするオープン・
リーディング・フレームを有する。図１ないし３のＨＵ
ＶＣＴ３６はヒト血小板活性化因子とその全体にわたっ
て約３０.８％の同一性を有する。該タンパク質はま
た、限定するものではないが、アンジオテンシン２型レ
セプターおよびプリノセプターを含め、他の７トランス
メンブランＧ−タンパク質結合レセプターと著しい相同
性を共有する。ＨＵＶＣＴ３６のヌクレオチド配列をＧ
enbankの配列と比べた場合、ＨＵＶ３６ＣＴは、提案さ
れているＧ−タンパク質結合レセプター（Ａnら、FEBS
Letter、375：121−125（1995））、クローンＧＰＲ１
２Ａと９９.４％の相同性を共有することがわかった。
ＧＰＲ１２Ａを逆翻訳に付した。ＨＵＶＣＴ３６と対照
的に、ＧＰＲ１２Ａのオープン・リーディング・フレー
ムは３６５アミノ酸である。ＨＵＶＣＴ３６の推定アミ
ノ酸配列とＧＰＲ１２Ａのそれとの比較を図４に示す。
これら２つのタンパク質の間の違いは強調されている。
さらには、ＨＵＶＣＴ３６はこの遺伝子の間違いのない
開始部位であると考えられる、上流方向にメチオニンを
有する。Ｇenbank配列との比較でまた、ＨＵＶＣＴ３６
とＧＰＲ４（公開されているオーファンＧ−タンパク質
結合レセプター）の間で６３.７％の相同性が明らかに
なった。

【００４８】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られるコーディング鎖であっても
よく、または、アンチセンス鎖とも称される非コーディ
ング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコー
ディング配列は、図１ないし３（配列番号１）に示すポ
リヌクレオチドのコーディング配列と同じであってもよ
い。そのコーディング配列はまた、遺伝コードの重複性
（縮重性）の結果として、図１ないし３（配列番号２）
のポリペプチドをもコードする、別の配列を有するポリ
ヌクレオチドであってもよい。

【００４９】図１ないし３のポリペプチドをコードして
いる本発明ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドそれ
自体に関するコーディング配列；成熟ポリペプチドのコ
ーディング配列、および、プレ−またはプロ−またはプ
レプロ−タンパク質配列のごとき、リーダー配列または
分泌配列をコードするごとき、付加的コーディング配
列；転写、例えば、スプライシングおよびポリアデニル
化シグナルを包含するｍＲＮＡプロセッシング、例え
ば、リボソーム結合およびｍＲＮＡ安定性において役割
を果たす、転写されるが翻訳されない配列のごとき、イ
ントロンおよび非コーディング５’および３’配列を包
含するがこれに限定されない付加的非コーディング配列
を有する、前述の付加的コーディング配列ありまたはな
しの成熟ポリペプチドのコーディング配列を包含しても
よいが、これに限定されない。かくして、例えば、ポリ
ペプチドが、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチ
ドのごときマーカー配列に融合していてもよい。本発明
のこの態様のある好ましい具体例において、マーカー配
列は、特にｐＱＥベクター（Qiagen,Inc）中のタグのご
ときヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くが
市販されている。例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA 86,821-824(1989)に記載のごとく、ヘキサヒス
チジンは融合タンパク質の精製を便利にする。インフル
エンザ・赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対
応するＨＡタグ（Wilsonら、Cell 37:767(1984)）もま
た有用である。

【００５０】前記によれば、本明細書にて用いる場合の
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図１ないし３に示すアミノ酸配列を有するヒトＨ
ＵＶＣＴ３６をコードするいずれの配列をも含むポリヌ
クレオチドを包含する。該用語はまた、コーディングお
よび／または非コーディング配列を含んでいてもよいさ
らなる領域と共に、該ポリペプチドをコードする単一の
連続または不連続領域（例えば、イントロンにより分断
されている）を含むポリヌクレオチドも包含する。さら
に本発明は、図１ないし３の推定アミノ酸配列を有する
ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体を
コードする、本明細書にて前記したポリヌクレオチドの
変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立
遺伝子変種などの天然に存在する変種であってもよく、
あるいは、天然に存在することが知られていない変種で
あってもよい。かかるポリヌクレオチドの天然に存在し
ない変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に用い
る方法を含め、突然変異誘発法により製造してもよい。

【００５１】この点で変種の中には、ヌクレオチド置
換、欠失または付加により前記したポリヌクレオチドと
異なる変種がある。置換、欠失または付加には１個また
はそれ以上のヌクレオチドが関与しているかもしれな
い。変種は、コーディング配列または非コーディング配
列あるいはそれらの両方において変化していてもよい。
コーディング配列の変化により、同類または非同類アミ
ノ酸置換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本
発明の特に好ましい具体例は、図１ないし３に示すＨＵ
ＶＣＴ３６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド；その変種、アナログ、誘導体
およびフラグメント、ならびにその変種、アナログおよ
び誘導体のフラグメントである。

【００５２】さらに、この点において、数個、わずか
な、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されている、図１ないし３のＨＵ
ＶＣＴ３６ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ＨＵ
ＶＣＴ３６変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
これらのうち特に好ましいのは、ＨＵＶＣＴ３６の特性
および活性を変化させないサイレント置換、付加および
欠失である。またこの点において、同類置換が特に好ま
しい。置換されていない、図１ないし３（配列番号２）
のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドが最も好ましい。

【００５３】さらに、この点において特に好ましい具体
例は、図１ないし３の遺伝子によりコードされる成熟ポ
リペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保
持しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドである。本発明はさらに本明細書にて前記した配列
とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条
件下、本明細書にて前記したポリヌクレオチドとハイブ
リッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に
て用いる場合、「ストリンジェントな条件」なる用語
は、ハイブリッド形成が、配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一である場合にのみ生じ
ることを意味する。

【００５４】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てさらに検討するように、例えば、前記した本発明のポ
リヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイ
ブリダイゼーションプローブとして用いて、ＨＵＶＣＴ
３６をコードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノムクロー
ンを単離し、ヒトＨＵＶＣＴ３６遺伝子に対して高度の
配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム
クローンを単離してもよい。かかるプローブは、一般
に、少なくとも１５個のヌクレオチドを有してなる。好
ましくは、かかるプローブは少なくとも３０個のヌクレ
オチドを有するであろうし、少なくとも５０個のヌクレ
オチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３
０と５０個の範囲にあるヌクレオチドを有するであろ
う。

【００５５】例えば、ＨＵＶＣＴ３６遺伝子のコーディ
ング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニング
し、オリゴヌクレオチドプローブを合成することにより
単離することができる。ついで、本発明の遺伝子の配列
に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを
用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの
ライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどの
メンバーがプローブとハイブリッド形成するかを決定す
る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、
ポリヌクレオチドアッセイに関してさらに説明するよう
に、ヒトの疾患に対する治療および診断の発見のための
研究試薬および材料として用いることができる。

【００５６】ポリヌクレオチドは、当該成熟タンパク質
およびさらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ
酸、あるいは成熟ポリペプチドに対する内部アミノ酸
（例えば、成熟形態が１種よりも多いポリペプチド鎖を
有する場合）であるポリペプチドをコードしていてもよ
い。かかる配列は前駆体から成熟形態へのタンパク質の
プロセッシングにおいて役割を果たしており、タンパク
質輸送を促進し、タンパク質半減期を延長または短縮
し、あるいは特に、アッセイまたは製造のためのタンパ
ク質の取り扱いを容易にするかもしれない。in situに
おける一般的な場合には、細胞酵素によりさらなるアミ
ノ酸がプロセッシングにより成熟タンパク質から除去さ
れてもよい。

【００５７】１つまたはそれ以上のプロ配列に融合した
成熟形態のポリペプチドを有する前駆体タンパク質は、
そのポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配
列が除去されると、一般的にはかかる不活性前駆体が活
性化される。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化
前に除去されるかもしれない。一般に、かかる前駆体は
プロタンパク質と呼ばれる。要約すれば、本発明のポリ
ヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質＋リ
ーダー配列（プレタンパク質と呼んでもよい）、プレタ
ンパク質のリーダー配列でない１個またはそれ以上のプ
ロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、あるいは、一
般にポリペプチドの活性および成熟形態を生じるプロセ
ッシング工程の間に除去されるリーダー配列および１個
またはそれ以上のプロ配列を有する、プロタンパク質に
対する前駆体であるプレプロタンパク質をコードしてい
てもよい。

【００５８】寄託材料 ヒトＨＵＶＣＴ３６ｃＤＮＡを含む寄託株を、１９９６
年８月２４日に、アメリカ合衆国、メリーランド２０８
５２、ロックビル、パーク・ローン・ドライブ１２３０
１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８１５６が付された。その
ヒトｃＤＮＡ寄託株を、本明細書にて「寄託クローン」
または「寄託クローンのｃＤＮＡ］という。寄託株は、
完全長ＨＵＶＣＴ３６ ｃＤＮＡを含有するエシェリキ
ア・コリＤＨ５αＨＵＶＣＴ３６ｐＢluscript（Ｓtrat
agene，Ｌa Ｊolla，ＣＡ）である。

【００５９】寄託は特許手続き上の微生物寄託の国際承
認に関するブタペスト条約の条件下で行われている。特
許が発行されると何ら制限または条件もなく、最終的に
株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提
供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条の下に要求されるよう
な、寄託が実施可能要件であることを承認するものでは
ない。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配列、なら
びにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列は、本明細書における配列の記載とのいずれの不一致
をも調節するものである。寄託株を製造、使用または販
売するには、ライセンスが必要である。そのようなライ
センスはここで付与されるものではない。

【００６０】ポリペプチド 本発明は、さらに図１ないし３（配列番号２）の推定ア
ミノ酸配列を有するヒトＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドに
関する。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグ
メント、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグメ
ント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、図
１および２のポリペプチドについて言う場合、かかるポ
リペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保
持している、すなわち、ＨＵＶＣＴ３６のごとく機能す
るポリペプチド、または、たとえそのポリペプチドがＨ
ＵＶＣＴ３６として機能しなくてもリガンドまたは結合
分子に結合する能力を保持している、例えばレセプター
の可溶性形態である、ポリペプチドを意味する。かくし
て、アナログは、プロタンパク質部分の開裂により活性
化され、活性成熟ポリペプチドを産生しうるプロタンパ
ク質を包含する。

【００６１】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てもよい。ある種の好ましい具体例において、本発明の
ポリペプチドは組換えポリペプチドである。図１ないし
３のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナロ
グは、（ｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が同類
または非同類アミノ酸残基（好ましくは、同類アミノ酸
残基）で置換されており、かかる置換アミノ酸残基は遺
伝暗号によりコードされているものであっても、なくて
もよいもの；（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残
基が置換基を含むもの；（ｉｉｉ）ポリペプチドの半減
期を延長させる化合物（例えばポリエチレングリコー
ル）のごときもう一つの化合物に成熟ポリペプチドが融
合しているもの、あるいは（ｉｖ）リーダーまたは分泌
配列、または成熟ポリペプチドの精製に用いられる配
列、またはプロタンパク質配列のごとき、さらなるアミ
ノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであっても
よい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは、
本明細書の教示から当業者の観点の範囲内であると考え
られる。

【００６２】この点において、本発明の特に好ましい具
体例は、図１ないし３に示すＨＵＶＣＴ３６のアミノ酸
配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導
体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。さらに、この点にお
いて本発明の特に好ましい具体例は、ＨＵＶＣＴ３６の
活性／機能を保持している、ＨＵＶＣＴ３６のアミノ酸
配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導
体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。

【００６３】同類アミノ酸置換によって対照から変化し
ている変種も好ましい変種である。かかる置換は、ポリ
ペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ
酸で置換したものである。同類アミノ酸置換として認め
られる典型的なものは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での相互置換；ヒドロ
キシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互置換、酸性
残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であ
るＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基であるＬ
ｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基であるＰ
ｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。

【００６４】さらにこの点において特に好ましいのは、
数個、わずかな、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１個または０個のアミノ酸残基が、いずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている、図１な
いし３のＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドのアミノ酸配列を
有する変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、な
らびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体で
ある。これらのうち特に好ましいのは、ＨＵＶＣＴ３６
の性質および活性を変化させないサイレント置換、付加
および欠失である。またこの点において、同類アミノ酸
置換が特に好ましい。最も好ましいのは、置換されてい
ない図１ないし３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
である。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
は、好ましくは、単離された形態で提供され、等質性に
まで精製されていることが好ましい。

【００６５】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分を、ペプチド合成による対応する完全長のポリペ
プチドの合成に使用してもよく；従って、フラグメント
を完全長のポリペプチドの製造のための中間体として使
用してもよい。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチ
ドを合成してもよい。フラグメントは、「自立している
（free-standing）」、すなわち、他のアミノ酸または
ポリペプチドの一部でなく、または、それらに融合して
おらず、あるいは、かかるフラグメントが大きなポリペ
プチド中に含まれていてその一部分または領域となって
いてもよい。大きなポリペプチド中に含まれている場
合、現在議論中のフラグメントは、最も好ましくは単一
の連続した領域を形成する。しかしながら、いくつかの
フラグメントが、単一のより大きなポリペプチド中に含
まれていてもよい。例えば、特定の好ましい具体例は、
宿主中での発現のために設計された前駆体ポリペプチド
中に含まれていて、ＨＵＶＣＴ３６フラグメントのアミ
ノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポリペプチド領
域、および、該フラグメントのカルボキシル末端に融合
したさらなる領域を有している、本発明のＨＵＶＣＴ３
６ポリペプチドのフラグメントに関する。従って、本明
細書における意味の１つの態様において、断片は、ＨＵ
ＶＣＴ３６由来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク
質の一部または部分をいう。

【００６６】本発明のポリペプチドフラグメントの典型
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。

【００６７】本明細書の内容において、「約」とは、特
に列挙した範囲、ならびに数個、少数、５、４、３、
２、１個のアミノ酸残基の分だけ大きいまたは小さい範
囲であって、上限または下限、あるいはそれらの両方の
範囲を包含する。例えば、この内容において、約４０な
いし９０個のアミノ酸は、４０プラスマイナス数個、少
数、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基から、９０プ
ラスマイナス数個、少数、５、４、３、２、１個のアミ
ノ酸残基までのポリペプチドフラグメントを意味し、す
なわち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プラ
ス数個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸から
９０マイナス数個のアミノ酸の範囲である。

【００６８】この点において好ましくは、上限または下
限、あるいはそれらの両方の範囲において、列挙した範
囲プラスまたはマイナス５個程度のアミノ酸である。上
限または下限、あるいはそれらの両方の範囲において、
列挙した範囲プラスまたはマイナス３個程度のアミノ酸
が特に非常に好ましい。上限または下限、あるいはそれ
らの両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマ
イナス１個程度のアミノ酸、または列挙した範囲に付加
または欠失のないものが特に非常に好ましい。この点に
おいて、約５ないし１５個、１０ないし２０個、１５な
いし４０個、３０ないし５５個、４１ないし７５個、４
１ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし１００
個、７５ないし１００個、９０ないし１１５個、１００
ないし１２５個、および１１０ないし１１３個のアミノ
酸の長さのフラグメントが、すべてのうちで最も好まし
い。

【００６９】本発明のこの態様において、ＨＵＶＣＴ３
６の構造的または機能的属性によって特徴づけられるフ
ラグメントも好ましい。この点において本発明の好まし
い具体例は、ＨＵＶＣＴ３６のアルファ−ヘリックスお
よびアルファ−ヘリックス形成領域（「アルファ−領
域」）、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領域
（「ベータ−領域」）、ターンおよびターン形成領域
（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、アル
ファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可動性領域、
表面形成領域および高抗原性インデックス領域を含んで
なるフラグメントを包含する。

【００７０】これらの点において、前記するいくつかの
特徴のごとき、いくつかの構造的特徴を組み合わせたＨ
ＵＶＣＴ３６の領域を含んでなるフラグメントが大変好
ましい。この点において、図１ないし３の約１０ないし
約２０個、約４０ないし約５０個、約７０ないし約９０
個、および約１１０ないし約１１３個の残基によって定
義される領域が特に好ましい領域であり、それらはすべ
て、ターン領域、親水性領域、可動性領域、表面形成領
域および高抗原性インデックス領域の高度に特徴的なア
ミノ酸組成物によって特徴づけられる。かかる領域はよ
り大きなポリペプチド中に含まれていてもよく、あるい
は前記のごとくそれら自体本発明の好ましいフラグメン
トでありうる。この段落の「約」なる語は、一般的なフ
ラグメントに関して前記した意味を有することが理解さ
れよう。

【００７１】さらに好ましい領域はＨＵＶＣＴ３６の活
性を媒介する領域である。この点において、ＨＵＶＣＴ
３６の化学的、生物学的活性または他の活性を有し、類
似活性または改善された活性を包含、望ましくない活性
は減じられているフラグメントが最も好ましい。この点
において、血小板活性化因子レセプター、アンジオテン
シン２型レセプターおよびプリノセプターなどの、関連
するポリペプチドの活性領域に対して配列または位置、
あるいは両方が相同的である領域を含むフラグメントが
非常に好ましい。細胞質、トランスメンブランおよび細
胞外ドメインを有してなるフラグメントが特に好まし
い。

【００７２】本発明のフラグメント中には、トランスメ
ンブラン領域だけの欠失しているもの、少なくとも細胞
質ドメインその物の部分を保持しているものまたはＷＯ
９６／０４３８２に記載されているような少なくとも代
わりの細胞質ドメインの部分と融合しているものも含ま
れる。本発明は、特に、前記したフラグメントをコード
しているポリヌクレオチド、該フラグメントをコードし
ているポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする
ポリヌクレオチド、詳細には厳密な条件下でハイブリダ
イゼーションするもの、および該フラグメントをコード
しているポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲプラ
イマーのごときポリヌクレオチドにも関することが理解
されよう。これらの点において、好ましいポリヌクレオ
チドは、前記のような好ましいフラグメントに対応する
ポリヌクレオチドである。

【００７３】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよび形質転換といっ
たよく知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主
細胞中に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独また
は他のポリヌクレオチドと一緒に導入してもよい。かか
る他のポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドと
は別個に導入するか、同時に導入するか、あるいは結合
させて導入してもよい。

【００７４】かくして、例えば、本発明のポリヌクレオ
チドを、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフ
ェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、選
択可能マーカーをコードするもう１つ別のポリペプチド
で宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この
場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に
安定に取り込まれるであろう。別法として、ポリヌクレ
オチドを、宿主における増殖用の選択可能マーカーを有
するベクターに結合させてもよい。前記した方法によ
り、ベクター構築物を宿主細胞中に導入してもよい。一
般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物
のごとき沈殿物中、あるいは荷電脂質との複合体中のＤ
ＮＡとして導入される。エレクトロポレーションを用い
てポリヌクレオチドを宿主に導入してもよい。ベクター
がウイルスである場合、それをインビトロでパッケージ
し、またはパッケージ細胞中に導入し、そのパッケージ
ウイルスを細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの
態様によれば、ポリヌクレオチドを製造し、ポリヌクレ
オチドを細胞に導入するのに適した種々の方法は当業者
によく知られた、慣用的なものである。かかる方法は、
詳細に、Sambrookらの報文に記載されており、それはこ
れらの方法を詳述する多くの実験室マニュアルを説明し
ている。

【００７５】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションのた
めのよく知られた方法によって、ベクターはまた、パッ
ケージされ、または封入されたウイルスとして細胞中に
導入されてもよく、好ましくは導入される。ウイルスベ
クターは複製可能であってもよく、複製欠損であっても
よい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿
主細胞においてのみ起こるであろう。ベクターの中で
も、特定の態様において、本発明のポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの発現用ベクターが好ましい。一般
に、かかるベクターは、発現されるべきポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結された宿主中での発現に効果的なシ
ス−作用性制御領域を含んでなる。適当なトランス−作
用性因子は、宿主により供給されるか、相補的ベクター
により供給されるか、または宿主中に導入した後のベク
ター自身によって供給されるかである。

【００７６】この点におけるある種の好ましい具体例に
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、またはある型
の細胞においてのみ起こる発現であってもよく、または
誘導可能および細胞特異的の両方であってもよい。誘導
可能なベクターの中でも、温度および栄養添加物などの
操作容易な環境因子によって発現を誘導することのでき
るベクターが、特に好ましい。原核細胞および真核細胞
宿主において使用される構成的および誘導可能な発現ベ
クターを含め、本発明のこの態様に適する種々のベクタ
ーは当業者によく知られており、慣用的に使用されてい
る。遺伝子操作された宿主細胞は通常の栄養培地で培養
することができ、そのような培地は、特にプロモーター
の活性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関
して、適宜修飾されていてもよい。温度、ｐＨなどの、
発現のために選択される宿主細胞で予め使用された培養
条件は、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適して
おり、それは当業者に明らかであろう。

【００７７】非常に多種の発現ベクターを用いて、本発
明のポリペプチドを発現させることができる。かかるベ
クターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベ
クター、例えば、細菌プラスミド由来の、バクテリオフ
ァージ由来の、酵母エピソーム由来の、酵母染色体エレ
メント由来の、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポ
ーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレ
トロウイルスなどのウイルス由来のベクター、およびそ
のウイルスの組み合わせに由来の、例えばプラスミドと
バクテリオファージ遺伝的因子、例えばコスミドおよび
ファージミドに由来のベクターを包含する。この点にお
ける発現のために、一般に、宿主中でポリペプチドを発
現するためのポリヌクレオチドを維持、増殖または発現
するのに適したベクターを用いることができる。

【００７８】種々のよく知られた慣用的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いる発現ベクターの構
築のための適当な操作も当業者によく知られており、慣
用的なものであり、Sambrookらにて非常に詳細に説明さ
れている。

【００７９】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含む、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ファージラムダＰＬプロモ
ーター、エシェリキア・コリｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａ
ｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター
ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを包含す
るが、それらは周知プロモーターのほんの例示に過ぎな
い。本発明のこの態様にて有用な多数の他の有用なプロ
モーターはよく知られており、本明細書の記載および実
施例で説明されるようにして当業者であれば慣用的に使
用することができる。一般に、発現構築物は、転写開始
部位および停止部位、および、転写領域に翻訳のための
リボソーム結合部位を有するであろう。構築物により発
現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳される
べきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、お
よび終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含むであ
ろう。

【００８０】加えて、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域、例えば、とりわけ、レセプター結合
部位およびエンハンサーなどの領域を含んでいてもよ
い。一般に、多くの通常なされる操作に従って、かかる
領域は、転写を調節することにより、すなわち、エンハ
ンサーとして作動するであろう。

【００８１】一般に、増殖および発現のためのベクター
は選択可能マーカーを含むであろう。かかるマーカーは
増幅に適していてもよく、または、そのベクターはこの
目的のためにさらなるマーカーを含んでいてもよい。こ
の点において、好ましくは、発現ベクターは１個または
それ以上の選択可能マーカー遺伝子を有しており、形質
転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供
するものである。好ましいマーカーは、真核培養細胞用
のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、エシ
ェリキア・コリおよび他の細菌培養用のテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性遺伝子を包含する。

【００８２】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の既知方法を用いて、本明細書のいずれかで記載
したように、適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモー
ター、さらに他の適当な制御配列を含むベクターを適当
な宿主中に導入してもよい。適当な宿主の代表例は、E.
coli、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞
のごとき細菌細胞；酵母細胞のごとき真菌細胞；Drosop
hila S2およびSpodoptera Sf9細胞のごとき昆虫細胞；
ＣＨＯ、ＣＯＳおよびBowesメラノーマ細胞のごとき動
物細胞；ならびに植物細胞を包含する。多種の発現構築
物用宿主がよく知られており、当業者は本開示により本
発明のこの態様によるポリペプチドの発現のための宿主
を容易に選択することができよう。

【００８３】より詳細には、本発明は、発現構築物のご
とき組み換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の前記した配列を含んでなる。構築物は、本発明の
かかる配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベク
ターのごときベクターを含んでなる。その配列を順方向
または逆方向に挿入することができる。この点におい
て、特定の好ましい具体例において、構築物はさらに、
例えば、該配列に作動可能に連結されたプロモーターを
包含する調節配列を含んでなる。多数の適当なベクター
およびプロモーターが当業者に知られており、本発明に
おける使用に適した多くのベクターが市販されている。

【００８４】市販されている後記のベクターを例示す
る。それらのうち、細菌での使用に適するベクターは、
Qiagenから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０お
よびｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、ｐＢ
Ｓベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクタ
ー、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ
４６Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されている、ｐ
ｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、
ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５、およびｐＣＤＮ、SmithKli
ne特許ベクターである。好ましい真核細胞ベクターに
は、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡ
Ｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびに、Ph
armaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧお
よびｐＳＶＬ；およびｐＣＤＮがある。これらのベクタ
ーは、多くの市販ベクター、および、本発明のこの態様
により使用するために当業者によく知られたベクターを
例示するためにのみ列挙する。例えば、宿主中における
本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維
持、増殖または発現に適する他のプラスミドまたはベク
ターを本発明のこの態様に使用してもよいことが理解さ
れよう。

【００８５】制限部位、または、候補プロモーター断
片；すなわち、プロモーターを含んでいるかもしれない
断片を導入するための部位の下流の、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニッ
トのごとき、プロモーター領域を欠くレポーター転写ユ
ニットを含むベクターを用いて、プロモーター領域をい
ずれの所望遺伝子からも選択できる。よく知られている
ごとく、プロモーター含有断片をベクター中のｃａｔ遺
伝子上流の制限部位へ導入することにより、ＣＡＴ活性
を生じさせ、それを標準的ＣＡＴアッセイにより検出す
ることができる。この目的に適するベクターはよく知ら
れており、容易に入手できる。２種のかかるベクターは
ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。かくして、本
発明ポリヌクレオチドの発現用のプロモーターはよく知
られていて容易に入手できるプロモーターだけでなく、
レポーター遺伝子を用いて上記方法により容易に得るこ
とのできるプロモーターも包含する。

【００８６】E.coli lacIおよびlacZプロモーターおよ
びT3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダP
R、PLプロモーター、ならびにtrpプロモーターは、本発
明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に
適した既知細菌プロモーターに属する。この点において
適する知られている真核細胞プロモーターには、ＣＭＶ
即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモ
ーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、Rousサ
ルコーマウイルス（ＲＳＶ）のごときレトロウイルスＬ
ＴＲｓのプロモーター、ならびにマウス・メタロチオネ
イン−Ｉプロモーターのごときメタロチオネインプロモ
ーターがある。宿主細胞中での発現に適するベクターお
よびプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発
現ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿
主における発現に関する精妙な方法は、当業者にとって
日常的なものである。本発明は、前記の構築物を含む宿
主細胞にも関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のごとき
高等真核細胞、または、酵母細胞のごとき下等真核細胞
であってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごとき原
核細胞であってもよい。

【００８７】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェ
クション、陽イオン性脂質により媒介されるトランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染
または他の方法により、宿主細胞中への構築物の導入を
行うことができる。かかる方法は、Davisら、BASIC MET
HODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)のごとき多くの標準
的研究室マニュアルに記載されている。宿主中の構築物
を慣用的方法で使用して、組換え配列によりコードされ
た遺伝子産物を製造することができる。別法として、慣
用的ペプチド合成装置により本発明ポリペプチドを合成
的に製造することもできる。

【００８８】適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において成熟蛋白を
発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物由来の
ＲＮＡを用いて、かかるタンパク質を製造するために無
細胞翻訳系を用いることもできる。原核宿主および真核
宿主とともに使用に適するクローニングおよび発現ベク
ターは、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATOR
Y MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989)により記載さ
れている。一般に、組換え発現ベクターは、複製開始
点、下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来
のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクタ
ー含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含む
であろう。特に、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐ
ＧＫ）のごとき糖分解酵素、ａ−ファクター、酸ホスフ
ァターゼ、および熱ショックタンパク質をコードしてい
る遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーターであ
る。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐性遺
伝子およびS.cerevisiaeのｔｒｐ１遺伝子を包含する。

【００８９】ベクター中にエンハンサー配列を挿入する
ことにより、高等真核細胞による本発明のポリペプチド
をコードしているＤＮＡの転写を増大させることができ
る。エンハンサーは、普通、約１０ないし３００ｂｐの
ＤＮＡのシス−作用性エレメントであり、特定の宿主細
胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増大するよ
うに作用する。エンハンサーの例は、複製開始点の後期
側１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハン
サー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン
サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーを包含する。

【００９０】一般に、本発明のポリペプチドの異種構造
配列をコードしている本発明のポリヌクレオチドを、発
現用プロモーターに作動可能に連結されるように標準的
方法を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリ
ボソーム結合部位の５'付近に位置するようにポリヌク
レオチドを配置する。リボソーム結合部位は、発現され
るポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５'にある。
一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始まる他の
読み枠、および、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧとの
間に位置する読み枠は存在しないであろう。また、一般
に、ポリペプチド末端に翻訳終止コドンが存在し、転写
される領域の３'末端に適当に散在するポリアデニル化
シグナルおよび転写終止シグナルが存在するであろう。

【００９１】小胞体ルーメン、周辺腔または細胞外環境
中への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適当な分
泌シグナルを発現されるポリペプチド中に取り込ませて
もよい。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性のも
のであってもよく、あるいは異種シグナルであってもよ
い。ポリペプチドを、融合タンパク質のごとき修飾形態
で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみならずさ
らなる異種機能領域を含んでいてもよい。かくして、例
えば、付加的アミノ酸の領域、詳細には荷電アミノ酸の
領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、宿主細胞にお
ける精製中またはさらなる取り扱いおよび保存中の安定
性および維持性を改善してもよい。また、精製を容易に
する領域をポリペプチド付加してもよい。最終的なポリ
ペプチドの調製の前にかかる領域を除去してもよい。特
に、分泌または外分泌を引き起こすための、安定性を改
善するための、そして精製を容易にするためのペプチド
部分のポリペプチドへの付加は当業者によく知られてい
る日常的方法である。

【００９２】本発明によるポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、
Escherichia coli、Bacillus subtilisおよびSalmonell
a typhimuriumを包含する。Pseudomonas、Streptomyces
およびStaphylococcusの種々の種は、この点において適
当な宿主である。さらに、この点において、当業者に知
られている他の多くの宿主も使用可能である。典型的で
あるが限定的でないものとして、例えば、細菌用途の有
用な発現ベクターは、選択可能マーカー、および、よく
知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）の遺伝学的エレメントを含んでなる市販プ
ラスミド由来の細菌の複製開始点を含んでなる。かかる
市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmaci
a Fine Chemicals, Uppsala,Sweden）およびＧＥＭ１
（Promega Biotec, Madison,WI,USA）を包含する。これ
らのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモーターお
よび発現すべき構造配列と組み合わせる。

【００９３】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが
誘導可能である場合には、適当な手段（例えば、温度シ
フトまたは化学誘導剤に曝露）によりそれを誘導し、さ
らに適当時間細胞を培養する。次いで、典型的には、細
胞を遠心分離により集め、物理的または化学的手段によ
り破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製に供する。
凍結−融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を包含する慣用的方法により、タン
パク質発現に使用する微生物細胞を破壊することがで
き、かかる方法は当業者によく知られている。同様に、
種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用することができ
る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman et al.,Cell 23:1
75(1981)に記載されたサル・腎臓線維芽細胞ＣＯＳ−７
細胞系を包含する。適合するベクターを発現させうる他
の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅ
ｌａ、ヒト・腎臓２９３およびＢＨＫ細胞系を包含す
る。

【００９４】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、および、必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、およ
び、発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んでな
るであろう。この点における特定の好ましい具体例にお
いて、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、およ
びＳＶ４０ポリアデニル化部位が、これらのタイプの所
望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。

【００９５】硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られ
た方法により、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドを組換え
細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好
ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を精製に用いる。単離または精製中にポリペプチドが変
性している場合には、タンパク質の再折り畳みのための
よく知られた方法を用いて活性コンフォメーションを再
生することができる。

【００９６】本発明のポリペプチドは、天然の精製産
物、化学合成法による産物、および、例えば細菌、酵
母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する原核
細胞または真核細胞宿主から組換え技術により得られた
産物を包含する。組換え体製造法に使用する宿主によっ
ては、本発明のポリペプチドはグリコシレーションされ
ているかもしれないし、されていないかもしれない。さ
らに、本発明のポリペプチドは、いくつかの場合、宿主
によるプロセスの結果として最初の修飾されたメチオニ
ン残基を含みうる。本発明によれば、ＨＵＶＣＴ３６ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳
細にはＨＵＶＣＴ３６の化学的および生物学的特性を用
いる適用例に使用することができる。さらなる適用例
は、細胞、組織および器官の疾病の診断および治療に関
する。本発明のこれらの態様を以下の議論によってさら
に説明する。

【００９７】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬としてのごとき相補的ポリヌ
クレオチドの検出のためのＨＵＶＣＴ３６ポリヌクレオ
チドの使用にも関する。機能不全に関連した変異形態の
ＨＵＶＣＴ３６の検出は、ＨＵＶＣＴ３６の発現低下、
発現過剰または変化した発現から生じる疾病の診断、ま
たは疾病に対する感受性を付加および定義することがで
きる診断道具を提供するであろう。ＨＵＶＣＴ３６遺伝
子に変異を有する個体を、種々の方法により、ＤＮＡレ
ベルにおいて検出することができる。診断のための核酸
を、血液、尿、唾液、生検および剖検材料のごとき患者
の細胞から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使
用してもよく、または、分析前にＰＣＲを用いることに
より酵素的に増幅してもよい。ＰＣＲ（Saikiら、Natur
e,324:163-166(1986)）。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じ
ように使用してもよい。一例として、ＨＵＶＣＴ３６を
コードしている核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用い
て、ＨＵＶＣＴ３６の発現および変異を同定および分析
するために使用することができる。例えば、正常遺伝子
型との比較における増幅生成物のサイズの変化により、
欠失および挿入を検出することができる。増幅したＤＮ
Ａを放射性ラベルされたＨＵＶＣＴ３６ ＲＮＡとハイ
ブリダイゼーションさせることにより、あるいは別法と
して放射性ラベルされたＨＵＶＣＴ３６アンチセンスＤ
ＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせることにより、
点突然変異を同定することができる。好ましくは、ＲＮ
ａｓｅ Ａ消化または融点温度の相違により、マッチし
た配列とミスマッチ２本鎖とを識別することができる。

【００９８】直接ＤＮＡ配列決定により、もとの遺伝子
と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとな
りうる。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメントを
プローブとして用いて特定のＤＮＡセグメントを検出し
てもよい。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適当に用いるこ
とにより、かかる方法の感度を非常に向上させることが
できる。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖ＰＣ
Ｒ生成物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型分
子とともに使用する。放射性ラベルヌクレオチドを用い
る慣用的手順により、または、蛍光タグを用いる自動配
列決定法により配列決定を行う。

【００９９】変性剤と共にまたは無しでゲル中のＤＮＡ
断片の電気泳動度の変化を検出することにより、ＤＮＡ
配列の相違に基づく遺伝的試験を行うことができる。高
分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠失および
挿入を可視化することができる。特異的融点または部分
的に融解する温度によって、異なるＤＮＡ断片の移動が
ゲル中の異なる位置において遅延される、変性ホルムア
ミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡ断片を識
別することができる（例えば、Myersら,Science,230:12
42(1985)参照）。

【０１００】ＲＮaseおよびＳ１保護のごときヌクレア
ーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の位
置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cotton
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-44-1(1985)）。
かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化
学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限断片長多型性（ＲＦＬＰ））およびゲノ
ムＤＮＡのサザンブロッティングのごとき方法により、
特定のＤＮＡ配列の検出を行うことができる。

【０１０１】本発明のさらなる態様によれば、偏頭痛；
細菌、菌類、原生動物およびウイルス感染のごとき感
染、とりわけＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に引き起こさ
れる感染；疼痛；癌；食欲不振；大食；喘息；パーキン
ソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；残尿；骨粗鬆
症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺
肥大；並びに、不安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、痴
呆症、重篤な精神遅滞および運動障害を包含する、ハン
ティントン病またはジル・ドラ・ツレット症候群のごと
き精神病的および神経学的障害等に対する感受性を診断
または測定する方法を提供する。ＨＵＶＣＴ３６遺伝子
の突然変異は、細菌、菌類、原生動物およびウイルス感
染のごとき感染、とりわけＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２
に引き起こされる感染；疼痛；癌；食欲不振；大食；喘
息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；残
尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；
良性前立腺肥大；並びに、不安、精神分裂病、躁鬱病、
せん妄、痴呆症、重篤な精神遅滞および運動障害を包含
する、ハンティントン病またはジル・ドラ・ツレット症
候群のごとき精神病的および神経学的障害等に対する感
受性を示し、前記した核酸配列をかかる感受性を確認す
るためのアッセイにおいて用いてもよい。かくして、例
えば、前記したように、ヒトＨＵＶＣＴ３６における、
欠失、切断、挿入、フレームシフト等の突然変異を検出
するために該アッセイを使用してもよく、かかる突然変
異は、細菌、菌類、原生動物およびウイルス感染のごと
き感染、とりわけＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に引き起
こされる感染；疼痛；癌；食欲不振；大食；喘息；パー
キンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；残尿；骨粗
鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立
腺肥大；並びに、不安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、
痴呆症、重篤な精神遅滞および運動障害を包含する、ハ
ンティントン病またはジル・ドラ・ツレット症候群のご
とき精神病的および神経学的障害等に対する感受性の指
標となる。

【０１０２】本発明は、図１ないし３（配列番号１）の
配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルが異常に減
少または増加している患者由来の試料から決定すること
を含んでなる、特に、細菌、菌類、原生動物およびウイ
ルス感染のごとき感染、とりわけＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２に引き起こされる感染；疼痛；癌；食欲不振；大
食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血
圧；残尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレル
ギー；良性前立腺肥大；並びに、不安、精神分裂病、躁
鬱病、せん妄、痴呆症、重篤な精神遅滞および運動障害
を包含する、ハンティントン病またはジル・ドラ・ツレ
ット症候群のごとき精神病的および神経学的障害等の疾
患の診断方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現の減
少または増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮ
ase保護、ノザンブロッティングおよび他のハイブリダ
イゼーション法のごときポリヌクレオチド定量のための
当該分野でよく知られた方法のいくつかを用いて測定で
きる。より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定
以外にも、in situ分析により変異を検出することがで
きる。

【０１０３】染色体アッセイ 本発明配列は染色体同定についても価値がある。該配列
を、個々のヒト染色体上の特別な位置に対して特異的に
標的化し、ハイブリダイゼーションさせることができ
る。さらに、染色体上の特別な部位を同定するために、
現在必要とされている、染色体位置をマーキングするた
めの実際の配列データ（繰り返し多型性）に基づいた染
色体マーキング試薬は、現在ほとんど手に入らない。本
発明による染色体へのＤＮＡマッピングは、疾患に関係
した遺伝子とその配列との関連付けにおいて重要な最初
の工程である。

【０１０４】簡単にいえば、ｃＤＮＡからＰＣＲプライ
マー（好ましくは１５−２５ｂｐ）を調製することによ
って配列を染色体に対してマッピングできる。一つ以上
のエクソンをスパンするプライマーは増幅工程を混乱さ
せる可能性があるので、３'非翻訳領域のコンピュータ
ー解析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の一つ以上のエクソン
をスパンしないプライマーを迅速に選択する。次いで、
これらのプライマーを個々のヒト染色体を含む体細胞雑
種のＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対
応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅断片を
有するであろう。

【０１０５】体細胞雑種のＰＣＲマッピングは、特定の
ＤＮＡを特定の染色体に振り分けるための迅速な方法で
ある。同じオリゴヌクレオチドプライマーとともに本発
明を用いて、特定の染色体からの断片のパネル、または
同様の様式での大きなゲノムクローンのプールで、大体
の位置づけをすることができる。同様に染色体へのマッ
ピングに用いることができる他のマッピング法は、in s
ituハイブリダイゼーション、ラベルされたフロー−ソ
ーティド（flow-sorted）染色体でのプレスクリーニン
グ、および、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築
するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包
含する。

【０１０６】中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡク
ローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）を用いて正確な染色体位置を１工程で知ることがで
きる。この方法は、５０または６０塩基の短いｃＤＮＡ
とともに用いられる。この方法の総説として、Verma
ら、Human Chromosomes: A Manual of Basic Technique
s, Pergamon Press, New York (1988)を参照のこと。

【０１０７】これをいかにして行うのかという一例とし
て、QIAEX II ＤＮＡ精製キット（QIAGEN,Inc.,Chastwo
rth,CA）を用いてＨＵＶＣＴ３６ ＤＮＡを消化し、精
製し、Super CosI コスミドベクター（STRATAGENE,LaJo
lla,CA）に連結する。QiagenPlasmid Purification Kit
（QIAGEN,Inc.,Chastworth,CA）を用いてＤＮＡを精製
し、BioNick Labeling Kit（GibcoBRL,Life Technologi
es Inc.,Gauthersburg,MD）を用いてビオチン−ｄＡＴ
Ｐの存在下でニックトランスレーションにより１ｍｇを
標識する。GENE-TECT Detection System（CLONTECH Lab
oratories,Inc.Palo Alto,CA）を用いてビオチン化を検
出する。ONCOR Light Hybridization Kit（ONCOR,Gaith
ersburg,MD）を用いてin situハイブリダイゼーション
をスライドガラス上で行って、中期染色体上の単一コピ
ー配列を検出する。２０％ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよび
ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ
１６４０中で正常ドナーの末梢血を３日間培養し、１０
^-7Ｍメトトレキセートで１７時間同調させ、補足物不含
ＲＰＭＩで２回洗浄する。細胞を１０^-3Ｍチミジンとと
もに７時間インキュベーションする。コルセミド（０.
５μｇ／ｍｌ）とともに２０分のインキュベーション
後、細胞を中期で捕捉し、次いで、７５ｍＭ ＫＣｌ中
３７℃で１５分低張溶解を行う。次いで、細胞ペレット
を遠心分離し、Carnoy'sの固定液（３：１ メタノール
／酢酸）中で固定する。

【０１０８】１滴の懸濁液をスライドガラス上に滴下
し、風乾することにより中期スプレッドを調製する。ブ
ロッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を添加
した１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０％
ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）中
に懸濁された１００ｎｇのプローブを添加することによ
りハイブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を７
０℃の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間インキ
ュベーションし、次いで、あらかじめ暖めておいた（３
７℃）スライドガラス上に置き、それは、あらかじめ７
０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０℃で変性させ、エ
タノールシリーズ中で脱水し、４℃に冷却しておいたも
のである。

【０１０９】スライドガラスを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドガラスを５
０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄
し、次いで、２ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製
造者のプロトコールに従ってスライドガラスをＦＩＴＣ
−アビジン（ONCOR,Gaithersburg,MD）とともにインキ
ュベーションすることによりハイブリダイゼーションプ
ローブを検出する。マウンティングメディウム中に懸濁
されたヨウ化プロプリディウムで染色体を対照染色す
る。Leitz ORTHOPLAN 2エピ蛍光顕微鏡を用いてスライ
ドガラスを可視化し、Imagenetics ComputerおよびMacI
ntoshプリンターを用いて５つのコンピューター映像を
得る。

【０１１０】いったん、配列が正確な染色体位置にマッ
ピングされたら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体
上の配列の物理的位置を修正することができる。かかる
データは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritan
ce in Man（Johns Hopkins University Welch Medical
Libraryからオンラインで利用可能）に見いだされる。
次いで、連関分析（物理的に近接した遺伝子の同時遺
伝）により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子
と疾病との関連を同定する。

【０１１１】疾病にかかっている個体および疾病にかか
っていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を
決定することが必要である。疾病にかかっている個体の
一部または全部において変異が観察されるが、正常個体
においては変異が観察されない場合には、その変異がそ
の疾病の病因である可能性がある。物理的マッピングお
よび遺伝学的マッピング法の現在の分離能によれば、疾
病に関連した染色体領域に正確に位置決めされるｃＤＮ
Ａは５０ないし５００個の潜在的病因遺伝子につき１つ
であろう（これは１メガベースのマッピング分離能、お
よび、２０ｋｂあたり１個の遺伝子と仮定している）。

【０１１２】ポリペプチドアッセイ 本発明は、正常および異常なレベルの決定を含め、細胞
および組織中のＨＵＶＣＴ３６タンパク質レベルの検出
のための定量および診断アッセイのごとき診断アッセイ
にも関する。かくして、例えば、正常対照組織試料と比
較してＨＵＶＣＴ３６タンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明の診断アッセイを用いて、例えば細菌、菌
類、原生動物およびウイルス感染のごとき感染、とりわ
けＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に引き起こされる感染；
疼痛；癌；食欲不振；大食；喘息；パーキンソン病；急
性心不全；低血圧；高血圧；残尿；骨粗鬆症；狭心症；
心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；並び
に、不安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆症、重篤
な精神遅滞および運動障害を包含する、ハンティントン
病またはジル・ドラ・ツレット症候群のごとき精神病的
および神経学的障害等の疾患／障害の存在を検出するこ
とができる。宿主由来の試料中の本発明のＨＵＶＣＴ３
６タンパク質のごときタンパク質のレベルを決定するの
に用いることのできるアッセイ法は当業者によく知られ
ている。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、
競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬ
ＩＳＡアッセイを包含する。これらのうち、ＥＬＩＳＡ
がしばしば好ましい。ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にＨ
ＵＶＣＴ３６に対して特異的な抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体を調製することを含んでなる。加えて、一
般に、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体を
調製する。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬ま
たは酵素試薬のごとき検出可能試薬に結合しているが、
この実施例ではセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ酵素
に結合している。

【０１１３】ＥＬＩＳＡを行うために、試料を宿主から
取り、試料中のタンパク質に結合する固体支持体、例え
ば、ポリスチレンディッシュ上でインキュベーションす
る。次いで、ウシ・血清アルブミンのごとき非特異的タ
ンパク質とともにインキュベーションすることにより、
ディッシュ上の遊離タンパク質結合部位を被覆する。次
に、モノクローナル抗体をディッシュ中でインキュベー
ションし、その間にモノクローナル抗体は、ポリスチレ
ンディッシュに結合しているＨＵＶＣＴ３６タンパク質
に結合する。未結合モノクローナル抗体をバッファーで
洗浄除去する。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに連
結されたレポーター抗体をディッシュ中に入れ、レポー
ター抗体とＨＵＶＣＴ３６に結合しているモノクローナ
ル抗体との結合を生じさせる。次いで、未結合レポータ
ー抗体を洗浄除去する。次いで、発色基質を包含するペ
ルオキシダーゼ活性のための試薬をディッシュに添加す
る。１次抗体および２次抗体でＨＵＶＣＴ３６に結合
し、固定化されているペルオキシダーゼは着色反応生成
物を生じる。一定時間の発色量は試料中のＨＵＶＣＴ３
６タンパク質量を示す。典型的には、標準曲線に対して
参照することにより定量的結果が得られる。固体支持体
に結合したＨＵＶＣＴ３６特異的抗体および標識ＨＵＶ
ＣＴ３６および宿主由来の試料が固体支持体上に通さ
れ、固体支持体に結合した検出標識量と試料中のＨＵＶ
ＣＴ３６量とが相関関係を有するものである、競合アッ
セイを用いてもよい。

【０１１４】抗体 ポリペプチド、それの断片または他の誘導体、またはそ
れのアナログ、またはそれらを発現する細胞を、それら
に対する抗体を製造するための免疫原として使用するこ
とができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル
またはモノクローナル抗体であってよい。本発明は、キ
メラ、１本鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂ断片、ま
たはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も包含する。当該
分野で知られた種々の手順をかかる抗体および断片の製
造に用いてもよい。

【０１１５】ポリペプチドを動物中に直接注射すること
により、あるいはポリペプチドを動物、好ましくは非ヒ
ト動物に投与することにより、本発明配列に対応したポ
リペプチドに対して生成した抗体を得ることができる。
次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチド自
体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチド
の断片のみをコードする配列を用いて、無傷のポリペプ
チド全体に結合する抗体を得ることさえできる。次い
で、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織
からそのポリペプチドを単離することができる。

【０１１６】モノクローナル抗体の調製のために、連続
細胞培養系により製造される抗体を提供する方法を用い
ることができる。例えば、ハイブリドーマ法（Kohler,
G.およびMilstein,C.、Nature 256:495-497(1975)）、
トリオーマ法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor
et al.,Immunology Today 4:72(1983)）およびヒト・
モノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Cole et al., pg.77-96 in Monoclonal Anti
bodies and Cancer Therapy.Alan R.Liss,Inc,(1985)）
が挙げられる。

【０１１７】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明
の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を製
造することができる。また、トランスジェニックマウ
ス、または他の哺乳動物のごとき他の生物を用いて、本
発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体
を発現させてもよい。

【０１１８】前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発
現するクローンを単離または同定してもよく、あるいは
アフィニティークロマトグラフィーによる単離および／
または精製のための固体支持体への抗体の結合により、
本発明ポリペプチドを精製してもよい。かくして、特に
ＨＵＶＣＴ３６に対する抗体は、細菌、菌類、原生動物
およびウイルス感染のごとき感染、とりわけＨＩＶ−１
またはＨＩＶ−２に引き起こされる感染；疼痛；癌；食
欲不振；大食；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低
血圧；高血圧；残尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰
瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；並びに、不安、精神
分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆症、重篤な精神遅滞およ
び運動障害を包含する、ハンティントン病またはジル・
ドラ・ツレット症候群のごとき精神病的および神経学的
障害等の阻害に用いることができる。

【０１１９】ＨＵＶＣＴ３６結合分子およびアッセイ ＨＵＶＣＴ３６をこれに相互作用するタンパク質を単離
するために使用することができ、この相互作用は阻害の
ための標的となり得る。ＨＵＶＣＴ３６および他の因子
の間のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害により、
ＨＵＶＣＴ３６活性の修飾のための医薬品が開発できる
であろう。

【０１２０】かくして、本発明は、ＨＵＶＣＴ３６に結
合する分子の同定方法も提供する。当業者に知られた多
くの方法、例えば、リガンドパニング（panning）およ
びＦＡＣＳソーティングにより、ＨＵＶＣＴ３６に結合
するタンパク質をコードしている遺伝子を同定すること
ができる。かかる方法は多くの研究室用マニュアル、例
えば、Coligan et al.,Current Protocoles in Immunol
ogy 1（Rivett, A.、J.Biochem.J. 291, 1-10 8199
3)）：第５章（１９９１年）に記載されている。

【０１２１】ＨＵＶＣＴ３６レセプターは哺乳動物細
胞、低級真核および／または酵母細胞にて発現させ、複
合的生物学的混合物、化合物バンク、およびコンビナト
リアル・ペプチドおよび／または有機ライブラリーを、
アゴニストおよび／またはアンタゴニストである天然お
よび代替リガンドについてスクリーンするのに用いるこ
とができる。利用するスクリーニングアッセイは、放射
性標識結合アッセイおよび／または機能アッセイ、例え
ば、カルシウム動態化、化学走性、ｃＡＭＰ蓄積、アデ
ニルシクラーゼターンオーバー、ＧＴＰγ結合、ホスホ
リパーゼ、Ｃターンオーバー、およびイノシトール１，
４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）およびジアシルグ
リセロールターンオーバーを包含するが、これに限定さ
れるものではない。

【０１２２】例えば、転写活性化因子の活性の再構成を
用いた、酵母２ハイブリッドシステムがin vivoでの最
初の試験タンパク質および２番目の試験タンパク質の間
の相互作用を検出するための方法を提供する。この方法
は、米国特許第５,２８３,１７３号に開示されており、
試薬はClontechおよびStratageneから市販されている。
簡潔にいえば、ＨＵＶＣＴ３６ｃＤＮＡをＧａｌ４転写
因子ＤＮＡ結合ドメインに融合し、酵母細胞中で発現さ
せる。目的の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーメ
ンバーをＧａｌ４のトランス活性化ドメインに融合す
る。ＨＵＶＣＴ３６と相互作用できるタンパク質を発現
するｃＤＮＡクローンを用いて、Ｇａｌ４活性の再構成
およびＧａｌ１−ｌａｃＺのごときレポーター遺伝子発
現のトランス活性化を行う。

【０１２３】組換えＨＵＶＣＴ３６でλgt１１、λＺＡ
Ｐ（Stratagene）または同等のｃＤＮＡ発現ライブラリ
ーをスクリーニングする別法がある。組換えＨＵＶＣＴ
３６タンパク質またはそれの断片をＦＬＡＧ、ＨＳＶま
たはＧＳＴのごとき小さなペプチドタグに融合する。ペ
プチドタグは心筋クレアチンキナーゼのごときキナーゼ
の簡便なリン酸化部位を有しており、あるいはそれらを
ビオチン化できる。組換えＨＵＶＣＴ３６を³²［Ｐ］で
リン酸化、またはラベルされていないＰでリン酸化し、
次いで、ストレプトアビジンまたはそのタグに対する抗
体で検出することができる。λgt１１ｃＤＮＡ発現ライ
ブラリーを目的の細胞から作成し、組換えＨＵＶＣＴ３
６とともにインキュベートし、洗浄し、次いで、ＨＵＶ
ＣＴ３６と相互作用するｃＤＮＡクローンを単離する。
かかる方法は当業者に慣用的なものである。例えば、Sa
mbrookらを参照のこと。

【０１２４】もう一つの方法は、哺乳動物発現ライブラ
リーをスクリーニングすることである。この方法におい
ては、ｃＤＮＡを哺乳動物プロモーターとポリアデニル
化部位の間のベクターに挿入し、ＣＯＳまたは２９３細
胞にて一時的にトランスフェクションされる。４８時間
後、結合タンパク質を、固定し、洗浄した細胞を標識し
たＨＵＶＣＴ３６と一緒に、インキュベーションするこ
とで検出する。好ましい具体例においては、ＨＵＶＣＴ
３６をよう素化し、結合ＨＵＶＣＴ３６の検出をオート
ラジオグラフィーを介して検出する。Simsら、Science
241,585-589(1988)およびMcMahanら、EMBO J. 10, 2821
-2832（1991）を参照のこと。このようにして、目的の
結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプ
ールを選択し、各プールをさらに分割し、その後、一時
的なトランスフェクション、結合およびオートラジオグ
ラフィーの繰り返しにより目的のｃＤＮＡを単離するこ
とができる。別法として、ｃＤＮＡライブラリー全体を
哺乳動物細胞にトランスフェクションし、プレートに結
合したＨＵＶＣＴ３６を含むデイッシュ上で細胞をパニ
ングすることによって目的のｃＤＮＡを単離できる。洗
浄後、結合している細胞を溶解し、プラスミドＤＮＡを
単離し、細菌中で増幅し、単一のｃＤＮＡクローンが得
られるまでトランスフェクションおよびパニングを繰り
返す。Seedら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365
(1987) およびAruffoら、EMBOJ. 6, 3313（1987）を参
照のこと。結合タンパク質が分泌される場合、いった
ん、一時的にトランスフェクションされた細胞からの上
清をアッセイするために結合アッセイまたは中和アッセ
イが確立されたならば、類似のプール方法によりｃＤＮ
Ａを得ることができる。上清をスクリーニングする一般
的方法は、Wongら、Science228, 810-815(1985)に開示
されている。

【０１２５】もう一つの別法は、細胞から直接ＨＵＶＣ
Ｔ３６と相互作用するタンパク質を単離することであ
る。ＨＵＶＣＴ３６のＧＳＴまたは小さいペプチドタグ
との融合タンパク質を製造し、ビーズ上に固定化する。
目的の細胞からの生合成的にラベルされた、またはされ
ていないタンパク質抽出物を調製し、ビーズとインキュ
ベートし、緩衝液で洗浄する。ＨＵＶＣＴ３６と相互作
用するタンパク質をビーズから特異的に溶出し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって解析する。結合相手のアミノ酸の一
次配列データをマイクロシークエンシングによって得
る。所望により、細胞性タンパク質のチロシンリン酸化
のごとき機能的応答を引き起こす因子で細胞を処理でき
る。かかる因子の例は、成長因子またはインターロイキ
ン−２のごときサイトカインであろう。

【０１２６】もう一つの別の方法はイムノアフィニティ
ー精製である。組換えＨＵＶＣＴ３６をラベルまたはラ
ベルされていない細胞抽出物とインキュベートし、抗Ｈ
ＵＶＣＴ３６抗体で免疫沈降する。その免疫沈降物をプ
ロテインＡセファロースで回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
解析する。ラベルされていないタンパク質をビオチン化
によりラベルし、ストレプトアビジンを含むＳＤＳゲル
上で検出する。結合相手のタンパク質をマイクロシーク
エンシングにより解析する。さらに、当業者に知られて
いる標準的生化学的精製法をマイクロシークエンシング
の前に使用してもよい。

【０１２７】さらにもう一つの別法は、結合相手につい
てのペプチドライブラリーのスクリーニングである。組
換えタグ付きまたはラベルされたＨＵＶＣＴ３６を用い
て、ＨＵＶＣＴ３６と相互作用するペプチドまたはリン
酸化ペプチドライブラリーからペプチドを選択する。そ
のペプチドの配列決定から、相互作用するタンパク質に
おいて見いだされるコンセンサスペプチド配列を同定す
る。

【０１２８】前記の推定結合相手と同様、当業者に知ら
れているこれらの方法または他の方法のいくつかによっ
て同定されたＨＵＶＣＴ３６の結合相手を、本発明のア
ッセイ方法において用いることができる。ＨＵＶＣＴ３
６／結合相手の複合体の存在を、例えば、酵母２ハイブ
リッドシステム、ＥＬＩＳＡ、またはその複合体に特異
的な抗体を用いたイムノアッセイによってアッセイす
る。ＨＵＶＣＴ３６／結合相手の相互作用の形成を妨害
または阻害する試験物質の存在下、複合体の量の減少を
試験物質を欠いている対照と比較して測定する。

【０１２９】遊離ＨＵＶＣＴ３６または結合相手に関す
るアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは特異的抗体を
用いたイムノアッセイによって、または、放射標識され
たＨＵＶＣＴ３６を細胞または細胞膜とインキュベーシ
ョンし、その後遠心またはフィルター分離工程を行うこ
とによって行われる。ＨＵＶＣＴ３６／結合相手相互作
用の形成を妨害または阻害する試験物質の存在下、遊離
のＨＵＶＣＴ３６または遊離の結合相手の量の増加を、
試験物質を欠いている対照と比較して測定する。本発明
のポリペプチドを用いて、細胞中または無細胞調製物中
のＨＵＶＣＴ３６結合分子のＨＵＶＣＴ３６結合許容量
を評価することもできる。

【０１３０】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明のポリペプチドの活性化を作用を促進（アゴニス
ト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物のスクリ
ーニングに本発明のＨＵＶＣＴ３６を使用してもよい。
一般に、かかるスクリーニング法は、本発明のレセプタ
ーポリペプチドをその表面に発現する適当な細胞を得る
ことからなる。かかる細胞は、哺乳動物、酵母、ドロソ
フィラまたはエシェリキア・コリを包含する。特に、本
発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを用い
て細胞をトランスフェクションし、それによりＨＵＶＣ
Ｔ３６を発現させる。ついで、その発現したレセプター
を試験化合物と接触させて結合、機能応答の刺激または
阻害を観察する。試験化合物は、例えば、複合的生物学
的混合物、コンビナトリアルペプチドおよび／または有
機ライブラリー、有機化合物、ペプチド、組織または細
胞抽出物である。かかるスクリーニング法の一は、トラ
ンスフェクションされる黒色素胞を用いて、本発明のＨ
ＵＶＣＴ３６を発現させる。かかるスクリーニング法は
ＰＣＴＷＯ９２／０１８１０（１９９２年２月６日公
開）に記載されている。

【０１３１】かかる方法を用いて、レセプターをコード
する黒色素因胞細胞をレセプターリガンドおよびスクリ
ーニングすべき化合物の両方と接触させることで、本発
明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物
をスクリーニングするのに用いる。そのリガンドにより
得られるシグナルが阻害されるということは、化合物が
そのレセプターの潜在的アンタゴニストであり、すなわ
ち、該レセプターの活性化を阻害することを示す。その
方法はまた、かかる細胞をスクリーニングすべき化合物
と接触させ、そのような化合物がシグナルを発するかど
うかどうか、すなわち、該レセプターを活性化するかど
うかを測定することにより、レセプターを活性化する化
合物をスクリーニングするのに用いることができる。

【０１３２】他のスクリーニング法は、レセプターの活
性化により誘起される細胞外ｐＨ変化を測定するシステ
ムにて、マウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現する細胞（例え
ば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞）を使用す
ることからなる。この方法においては、化合物を本発明
のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触させて
もよい。ついで、別のメッセンジャー応答、例えば、シ
グナル・トランスダクションまたはｐＨ変化を測定し、
その潜在的化合物がレセプターを活性化するか阻害する
かを測定する。もう一つ別のスクリーニング法は、ＨＵ
ＶＣＴ３６をコードするＲＮＡをＸenopus 卵母細胞に
導入し、そのレセプターを一時的に発現させることから
なる。ついで、レセプター卵母細胞をレセプターリガン
ドおよびスクリーニングすべき化合物と接触させる。つ
いで、該レセプターの活性化を阻害すると思われる化合
物をスクリーニングする場合、カルシウム、プロトンま
たは他のイオンなどのシグナルを検出することによっ
て、該レセプターの阻害または活性化を測定する。

【０１３３】別のスクリーニング法は、レセプターがホ
スホリパーゼＣまたはＤに結合しているＨＵＶＣＴ３６
を発現させることからなる。そのような細胞の代表例と
して、内皮細胞、平滑筋細胞および胚腎細胞が挙げられ
るが、これに限定されるものではない。スクリーニング
は、前記したように、レセプターの活性化またはホスホ
リパーゼ２次シグナルからのレセプターの活性化の阻害
を検出することによりなされる。別法は、標識されたリ
ガンドの、その細胞表面にレセプターを有する細胞への
結合の阻害を測定することにより、アンタゴニストであ
る、すなわちＨＵＶＣＴ３６の活性化を阻害する化合物
をスクリーニングすることからなる。そのような方法
は、細胞がその細胞表面でレセプターを発現するよう
に、真核細胞をＨＵＶＣＴ３６をコードするＤＮＡでト
ランスフェクションすることからなる。ついで、その細
胞を、標識された形態の既知リガンドの存在下で化合物
と接触させる。リガンドは、例えば、放射能により標識
化することができる。レセプターに結合した標識化リガ
ンドの量を、例えば、これらの細胞からの細胞または膜
のトランスフェクションに付随する放射活性を測定する
ことにより決定する。化合物がレセプターに結合する場
合、標識化リガンドのレセプターへの結合は、標識化リ
ガンドの減少により測定されるように阻害される。

【０１３４】別法は、ＨＵＶＣＴ３６介在ｃＡＭＰおよ
び／またはアデニレート・シクラーゼ蓄積の阻害または
刺激を測定することによりＨＵＶＣＴ３６阻害剤をスク
リーニングすることからなる。かかる方法は、真核細胞
をＨＵＶＣＴ３６レセプターでトランスフェクション
し、その細胞表面で該レセプターを発現させることから
なる。ついで、該細胞をＨＵＶＣＴ３６の存在下で潜在
的アンタゴニストに暴露する。ついで、ｃＡＭＰ蓄積量
を測定する。潜在的アンタゴニストがレセプターに結合
する場合、すなわちＨＵＶＣＴ３６結合を阻害する場
合、ＨＵＶＣＴ３６介在ｃＡＭＰまたはアデニレートシ
クラーゼのレベル、活性は減少するか、増加するであろ
う。レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを検
出する他の方法は、米国特許第５４８２８３５号に記載
の酵母に基づく技法である。

【０１３５】本発明はまた、ＨＵＶＣＴ３６レセプター
への結合能を有することが不明なリガンドが該レセプタ
ーに結合することができるかどうかを測定する方法を提
供する。この方法は、リガンドのＨＵＶＣＴ３６レセプ
ターへの結合を可能とする条件下、ＨＵＶＣＴ３６レセ
プターを発現する哺乳動物細胞をリガンドと接触させ、
マウスレセプターに結合するリガンドの存在を検出し、
それによりそのリガンドがＨＵＶＣＴ３６レセプターに
結合するかどうかを決定することからなる。アゴニスト
および／またはアンタゴニストを決定するために前記し
たシステムはまた、該レセプターに結合するリガンドを
決定するのに利用することもできる。

【０１３６】潜在的ＨＵＶＣＴ３６レセプターアンタゴ
ニストとして、例えば、抗体、またはある場合には、第
２メッセンジャー応答を誘起しないが、レセプターに結
合する、すなわち、該レセプターの活性を妨げる、オリ
ゴヌクレオチドが挙げられる。潜在的アンタゴニストは
また、ＨＵＶＣＴ３６レセプターのリガンドに密接に関
連付けられるタンパク質、すなわち、生物学的機能を失
っており、ＨＵＶＣＴ３６レセプターに結合した場合
に、何の応答も惹起しない、リガンドのフラグメントを
包含する。

【０１３７】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝
子発現を制御することができ、どちらの方法もポリヌク
レオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいてい
る。例えば、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング
部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしており、
それを用いて約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に相補的
であるように設計され（３重ヘリックス −Leeら、Nuc
l.Acids Res. 6：3073（1979）；Cooneyら、Science 24
1：456（1988）；およびDervanら、Science 251：1360
（1991）を参照のこと）、それによりＨＵＶＣＴ３６レ
セプターの転写および製造を阻害する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡ
にハイブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子のＨＵＶＣＴ３６
レセプターへの翻訳を遮断する（アンチセンス − Okan
o、J.Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CR
C Press, Boca Raton, FL（1988））。前記したオリゴ
ヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ
がインビボにおいて発現されてＨＵＶＣＴ３６レセプタ
ーの生成を阻害するように、細胞にデリバリーすること
もできる。

【０１３８】もう一つの潜在的アンタゴニストは、ＨＵ
ＶＣＴ３６レセプターに結合する小分子であり、正常な
生物学的活性が妨げられるように、それをリガンドに接
近させる。小分子の例として、小ペプチドまたはペプチ
ド様分子が挙げられるが、これに限定されるものではな
い。潜在的アンタゴニストはまた、可溶性形態のＨＵＶ
ＣＴ３６５レセプター、例えば、リガンドに結合し、リ
ガンドが膜結合ＨＵＶＣＴ３６レセプターと相互反応す
ることを妨げる、レセプターのフラグメントを包含す
る。

【０１３９】ＨＵＶＣＴ３６タンパク質は哺乳動物宿主
において普遍的に存在しており、多くの病因を含め、多
数の生物学的機能に関与している。従って、一方でＨＵ
ＶＣＴ３６を刺激し、他方でＨＵＶＣＴ３６の機能を阻
害しうる化合物および薬剤を見いだすことが望まれてい
る。

【０１４０】一般に、ＨＵＶＣＴ３６のアゴニストは、
細菌、菌類、原生動物およびウイルス感染のごとき感
染、とりわけＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に引き起こさ
れる感染；疼痛；癌；食欲不振；大食；喘息；パーキン
ソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；残尿；骨粗鬆
症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺
肥大；並びに、不安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、痴
呆症、重篤な精神遅滞および運動障害を包含する、ハン
ティントン病またはジル・ドラ・ツレット症候群のごと
き精神病的および神経学的障害等の疾患または障害の治
療および予防方法に用いられる。

【０１４１】ＨＵＶＣＴ３６のアンタゴニストは、細
菌、菌類、原生動物およびウイルス感染のごとき感染、
とりわけＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に引き起こされる
感染；疼痛；癌；食欲不振；大食；喘息；パーキンソン
病；急性心不全；低血圧；高血圧；残尿；骨粗鬆症；狭
心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；
並びに、不安、精神分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆症、
重篤な精神遅滞および運動障害を包含する、ハンティン
トン病またはジル・ドラ・ツレット症候群のごとき精神
病的および神経学的障害等の疾患または障害の治療およ
び予防方法に用いられる。

【０１４２】加えて、本発明は、過剰なＨＵＶＣＴ３６
活性に関係した異常な状態を治療する方法であって、前
記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容され
る担体と共にリガンドのＨＵＶＣＴ３６レセプターへの
結合を遮断することにより、または第２シグナルを阻害
することにより、活性化を阻害するのに効果的な量にて
対象に投与し、それにより異常な状態を緩和することか
らなる方法を提供する。また、本発明は、ＨＵＶＣＴ３
６およびその活性の過小発現に関係した異常な状態を治
療する方法であって、前記した本発明のレセプターポリ
ペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）を医薬上許
容される担体と組み合わせて治療上有効量を対象に投与
し、それにより異常な状態を緩和することからなる方法
を提供する。

【０１４３】組成物およびキット ＨＵＶＣＴ３６の可溶性形態およびかかるポリペプチド
を活性化または阻害する化合物を適切な医薬担体と共に
使用してもよい。かかる組成物は、治療上有効量のポリ
ペプチドまたは化合物、および医薬上許容される担体ま
たは賦形剤を含んでなる。かかる担体は、セライン、緩
衝化セライン、デキストロース、水、グリセロール、エ
タノールおよびそれらの混合物を包含するが、これらに
制限されない。処方は投与モードに適合すべきである。
さらに本発明は、上記本発明組成物の１種またはそれ以
上の成分を充填した１個またはそれ以上の容器を含んで
なる医薬パックおよびキットに関する。

【０１４４】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。効果的で便利な方法、例えば、特に、局所、
経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔
内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医薬組
成物を投与してもよい。

【０１４５】一般に、医薬組成物を、個々の徴候または
徴候（複数）の治療または予防のための有効な量で投与
する。一般的には、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の
量で組成物を投与する。大部分の場合、１日につき約８
ｍｇ／ｋｇ体重をこえない量で組成物が投与されるであ
ろう。好ましくは、大部分の場合、１日につき用量は約
１０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
症状、重症度、投与経路、合併症等を考慮して、各治療
様式についての標準的方法および症状により最適用量が
決定されることが理解されよう。

【０１４６】遺伝子治療 インビボにおいて、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる
治療様式において、かかるポリペプチドを発現させるこ
とにより、ＨＵＶＣＴ３６ポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニ
ストを本発明に従って使用することができる。

【０１４７】かくして、例えば、患者からの細胞をポリ
ペプチドをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡのごとき
ポリヌクレオチドでエクスビボで操作し、次いで、ポリ
ペプチドで治療すべき患者にその操作された細胞を与え
てもよい。例えば、本発明ポリペプチドをコードしてい
るＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使
用により細胞をエクスビボで操作してもよい。かかる方
法は当該分野においてよく知られており、本発明におけ
るそれらの使用は本明細書の教示から明らかである。

【０１４８】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、上記のようにレプ
リコン欠損レトロウイルスベクター中での発現のために
本発明ポリヌクレオチドを操作してもよい。次いで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞
中に導入し、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮ
Ａを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入
して、パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染
性ウイルス粒子を産生するようにすることができる。イ
ンビボでの細胞の操作およびインビボでのポリペプチド
の発現のためにこれらの産生細胞を患者に投与してもよ
い。かかる方法により本発明ポリペプチドを投与するた
めのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から
当業者に明らかであるはずである。

【０１４９】本明細書において前記したレトロウイルス
プラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロ
ニー・マウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラ
ウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ・白血
病ウイルス、ギボンサル・白血病ウイルス、ヒト・免疫
不全ウイルスのごときレトロウイルス、アデノウイル
ス、ミエロプロリファレイティブ肉腫ウイルス（Myelop
roliferative Sarcomavirus）、および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。１つの具
体例において、レトロウイルスプラスミドベクターはモ
ロニー・マウス・白血病ウイルス由来のものである。

【０１５０】かかるベクターは、ポリペプチド発現のた
めの１個またはそれ以上のプロモーターを十分に含む。
使用可能な適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴ
Ｒ；ＳＶ４０プロモーター；およびMillerら、Biotechn
iques 7:980-990(1989)に記載されたヒト・サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他のいずれ
かのプロモーター（例えば、ヒストン、ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを包含す
るが、これに限定されない真核細胞プロモーターのごと
き細胞プロモーター）を包含するが、これらに限定され
ない。使用できる他のウイルスのプロモーターは、アデ
ノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プ
ロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター
を包含するが、これらに限定されない。適当なプロモー
ターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明
らかであろう。

【０１５１】本発明のポリペプチドをコードしている核
酸配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろ
う。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス
主要後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモー
ター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモー
ターのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒト・グロビンプロモー
ター；単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモ
ーターのごときウイルスのチミジンキナーゼプロモータ
ー；レトロウイルスのＬＴＲｓ（本明細書で前記した修
飾レトロウイルスＬＴＲｓを包含）；β−アクチンプロ
モーター；およびヒト・成長ホルモンプロモーターを包
含するが、これらに限定されない。プロモーターは、ポ
リペプチドをコードしている遺伝子を制御する元来のプ
ロモーターであってもよい。

【０１５２】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入して産生細胞系を得
る。トランスフェクションされうるパッケージング細胞
の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、
ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、
ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖ
Ａｍ１２、およびMiller,A.、Human Gene Therapy 1:5-
14（1990）に記載されたＤＡＮ細胞系を包含するが、こ
れらに限定されない。当該分野で知られているいずれか
の手段によりベクターをパッケージング細胞中に形質導
入してもよい。かかる手段は、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、ＣａＰＯ₄沈殿を包含するが、
これらに限定されない。１つの別法において、レトロウ
イルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入し、あ
るいは脂質と結合させ、次いで、宿主に投与してもよ
い。

【０１５３】産生細胞系は感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を産生するであろうし、該粒子はポリペプチドを
コードする核酸配列（複数でも可）を含んでいる。次い
で、かかるレトロウイルスベクター粒子を用いて、イン
ビトロまたはインビボのいずれかにおいて真核細胞に形
質導入してもよい。形質導入された真核細胞はポリペプ
チドをコードする核酸配列（複数でも可）を発現するで
あろう。形質導入されうる真核細胞は、胚幹細胞、胚カ
ルシノーマ細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽
細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気
管支上皮細胞を包含するが、これらに限定されない。

【０１５４】

【実施例】本発明は以下の実施例によりさらに記載す
る。実施例は単に具体的な態様に対する参考として本発
明を説明するために提供するものである。これらの実例
提示は本発明の特定の具体的な態様を説明するものであ
るが、本発明に開示する請求の範囲の限定または規定を
表すものではない。本明細書で用いる特定の用語は前記
した用語説明で説明する。全ての実施例は、別に詳細に
記載するもの以外は、当業者に周知で慣用される標準法
を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学
的技術は、例えばSambrookら、のような標準的な研究室
マニュアルに記載されるように実施できる。

【０１５５】実施例１：哺乳動物細胞発現 本発明のレセプターをヒト胚腎２９３（ＨＥＫ２９３）
細胞または付着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞中に発現する。レ
セプター発現を最高にするするために、ＣＤＮまたはｐ
ＣＤＮＡ３ベクターに挿入する前に、全ての５’および
３’未翻訳領域（ＵＴＲ）をレセプターｃＤＮＡから除
去する。リポフェクチンにより、細胞を個々のレセプタ
ーｃＤＮＡでトランスフェクションし、４００μｇ／ｍ
ｌ Ｇ４１８の存在下で選別する。選別の３週間後、個
々のコロニーを採り、さらに分析する。ベクター単独で
トランスフェクションしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細
胞を陰性対照として提示する。個々のオルファンレセプ
ターを安定して発現する細胞系を単離するために、約２
４個のクローンを通常的に選別し、ノーザンブロット分
析により分析する。約５０％のＧ４１８抵抗性クローン
で、一般に検出可能なレセプターｍＲＮＡが分析され
た。

【０１５６】実施例２：リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイにより、レセプター機能を確認す
るための直接的な方法が提供され、これは高処理能力フ
ォーマットに適用できる。２００以上の推定オルファン
レセプターリガンドのバンクを、最初のスクリーニング
のために構築した。バンクは：伝達物質、ホルモンおよ
びヒトの７種のトランスメンブラン（７ＴＭ）レセプタ
ーを介して作用すると知られているケモカイン；ヒト７
ＴＭに対する推定アゴニストである自然発生化合物、哺
乳動物カウンターパートがまだ同定されていない、哺乳
動物以外の生物学的に活性なペプチド；天然に見出され
ていないが、未知天然リガンドで７ＴＭレセプターを活
性化する化合物を含んでなる。このバンクを、最初既知
リガンドに対するレセプターをスクリーニングするため
に用いる。信頼できる放射性リガンド結合アッセイを行
うための、リガンドのそのレセプターに対する最低分離
定数は約１０ｎＭである。

【０１５７】オルファンレセプターのための精製リガン
ドは結合実験用に特異的活性を高めるために放射性標識
化する（５０〜１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。次いで放射
性標識化の工程ではリガンドのレセプターに対する活性
は減じないことが測定された。緩衝液、イオン、ｐＨお
よびヌクレオチドのごときその他のモデュレーターのた
めのアッセイの条件を至適化し、膜および全細胞レセプ
ター供給源の両方で、ノイズの比率に対して作動可能な
シグナルを確立する。これらのアッセイでは、特異的な
レセプター結合は、トータルの関連放射活性マイナス過
剰の未標識競合リガンドの存在下で測定する放射活性と
して決定する。可能な場合、１以上の競合リガンドを用
いて、残余する非特異的結合を決定する。特異的結合の
約５０％が最適であると考えられる。

【０１５８】放射性リガンド結合部位のレセプターとし
ての適合性を以下の判定基準に従って決定する。これら
の判定基準により、結合相互作用により適当なアゴニス
トおよびアンタゴニストリガンドを特異的に認識し、規
定の生物学的応答を開始する部分としてのレセプターが
決定される。判定基準は：（１）生物学的応答に影響を
及ぼす物質の動力学に近似する放射性リガンド結合の動
力学；（２）放射性リガンド濃度が上昇し、従って飽和
し、限定されたレセプター集団に影響する特異的結合；
（３）放射活性が、リガンドが生物学的応答を活性化ま
たは阻害する濃度範囲に平行する濃度範囲；および
（４）放射性リガンドにより占領されるレセプター部位
が生物学的応答として適当な薬理学的特異性を示す。

【０１５９】実施例３：キセノパス・オーサイテス（Xe
nopus Oocytes）における機能アッセイ 本発明のオルファンレセプターｃＤＮＡをコードする線
状プラスミド鋳型からのキャプしたＲＮＡ転写物を、標
準法に準じてインビトロでＲＮＡポリメラーゼを用いて
合成する。インビトロ転写物を水中に懸濁し、最終濃度
0.2μg/μｌにする。成体の雌ヒキガエルから卵巣葉を
除去し、ステージＶデフォリキュレートしたオーサイト
（defoliculatd oocyts）を入手し、ＲＮＡ転写物（１
０ｎｇ／オーサイト）をDrummondマイクロインジェクシ
ョン装置を用いて５０ｎｌをボーラス注射する。二つの
電極ボルテージクランプを用いて個々のキセノパス・オ
ーサイテス（Xenopus Oocytes）からの電流を測定す
る。Ｃａ²⁺不含Barth培地中室温で記録する。

【０１６０】実施例４：マイクロフィジオメトリックア
ッセイ（Microphysiometric Assays） 広範な２次メッセンジャーシステムの活性化により、細
胞から少量の酸が駆逐される。酸形成は主に細胞内シグ
ナリング過程に燃料供給するのに必要な代謝活性が増強
された結果である。細胞を取り囲む培地におけるｐＨの
変化は非常に小さいが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲマイクロ
フィジオメーター（モレキュラー・デヴァイシズ・リミ
テッド、メンロ・パーク、カリフォルニア州）により検
出できる。従って、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、本発明の
Ｇ−タンパク質結合レセプターのごときエネルギー利用
する細胞内シグナリング経路に結合するレセプターの活
性化を検出できる。

【０１６１】実施例５：抽出／細胞上澄スクリーニング 多くの哺乳動物ペプチドが存在するが、今も哺乳動物の
等価物はない。従って、このレセプターのために活性な
リガンドは、現在までのところ同定されたリガンドバン
ク内に包含されない。従って、本発明のオルファンＴＭ
レセプターはまた組織抽出物に対してもスクリーニング
され、天然のリガンドを同定する。

【０１６２】実施例６：カルシウム機能的アッセイ ＨＥＫ２９３細胞に発現される７ＴＭレセプターはＰＬ
Ｃ活性化およびカルシウム動員に対して機能的に結合す
るすることが示された。レセプタートランスフェクショ
ンされたＨＥＫ２９３細胞またはベクター対照細胞にお
けるの基底カルシウムレベルが正常の１００ｎｍから２
００ｎｍの範囲内であることが観察された。組換えレセ
プターを発現するＨＥＫ２９３細胞をfura２で負荷し、
一日１５０以上の選択リガンドによりカルシウム動員に
誘起されるアゴニストが評価される。ベクター対照細胞
内で一過性のカルシウムを呈するアゴニストを試験し、
応答がトランスフェクションされたレセプター細胞に対
して独特であるかどうかを決定する。独特なアゴニスト
誘起応答が同定された場合、別の細胞群で再度応答さ
せ、次いで有効性および関連リガンドの濃度反応性曲線
で薬理学的に特徴づけする。

【０１６３】

【配列表】

（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ダーク・ジェイ・バーグスマ、キャサリ
ン・イー・エリス （ｉｉ）発明の名称： 新規Ｇ−タンパク質結合レセプ
ターＨＵＶＣＴ３６ （ｉｉｉ）配列の数：３ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： ピー・オー・ボックス１５３９、スウ
ェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット、３.５インチ、１.４４
Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウ・フォー
・ワークグループ （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ウィリアム・ティ・ハン （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴ ６５００２２ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０−５０２４ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ２７０−５０９０

【０１６４】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５９７ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： GAGCTCGAGC GATCCCCACC TCCCAAAGTG CTGGGCTTAC AGGTGTAAGC 50 CATCATGTCC AGCCGTTCAG ATATTCTAGT TGAATTGGAG TTGGTGGGCT 100 AGTACACCTT CTAAATTAAA TGAGTAAAGG ATTTAGAATG GTGCCTGACA 150 CACAGTAGGT GCTACATTCA TGTTAGCTAC TATTATAAAC CTTTCCTGCC 200 TCTGACTTTC AGGGTCTTGC CCACCACCAG CGATGCCCAG CCCTTGGTAG 250 AGCTTGAACC ACCTTCTATA AACAGGATGG CGGTGGAGAG ACAGGCCCAG 300 TCCCTGAGCC CATGAGGAGT GTGGCCCCTT CAGGCCCAAA GATGGGGAAC 350 ATCACTGCAG ACAACTCCTC GATGAGCTGT ACCATCGACC ATACCATCCA 400 CCAGACGCTG GCCCCGGTGG TCTATGTTAC CGTGCTGGTG GTGGGCTTCC 450 CGGCCAACTG CCTGTCCCTC TACTTCGGCT ACCTGCAGAT CAAGGCCCGG 500 AACGAGCTGG GCGTGTACCT GTGCAACCTG ACGGTGGCCG ACCTCTTCTA 550 CATCTGCTCG CTGCCCTTCT GGCTGCAGTA CGTGCTGCAG CACGACAACT 600 GGTCTCACGG CGACCTGTCC TGCCAGGTGT GCGGCATCCT CCTGTACGAG 650 AACATCTACA TCAGCGTGGG CTTCCTCTGC TGCATCTCCG TGGACCGCTA 700 CCTGGCTGTG GCCCATCCCT TCCGCTTCCA CCAGTTCCGG ACCCTGAAGG 750 CGGCCGTCGG CGTCAGCGTG GTCATCTGGG CCAAGGAGCT GCTGACCAGC 800 ATCTACTTCC TGATGCACGA GGAGGTCATC GAGGACGAGA ACCAGCACCG 850 CGTGTGCTTT GAGCACTACC CCATCCAGGC ATGGCAGCGC GCCATCAACT 900 ACTACCGCTT CCTGGTGGGC TTCCTCTTCC CCATCTGCCT GCTGCTGGCG 950 TCCTACCAGG GCATCCTGCG CGCCGTGCGC CGGAGCCACG GCACCCAGAA 1000 GAGCCGCAAG GACCAGATCC AGCGGCTGGT GCTCAGCACC GTGGTCATCT 1050 TCCTGGCCTG CTTCCTGCCC TACCACGTGT TGCTGCTGGT GCGCAGCGTC 1100 TGGGAGGCCA GCTGCGACTT CGCCAAGGGC GTTTTCAACG CCTACCACTT 1150 CTCCCTCCTG CTCACCAGCT TCAACTGCGT CGCCGACCCC GTGCTCTACT 1200 GCTTCGTCAG CGAGACCACC CACCGGGACC TGGCCCGCCT CCGCGGGGCC 1250 TGCCTGGCCT TCCTCACCTG CTCCAGGACC GGCCGGGCCA GGGAGGCCTA 1300 CCCGCTGGGT GCCCCCGAGG CCTCCGGGAA AAGCGGGGCC CAGGGTGAGG 1350 AGCCCGAGCT GTTGACCAAG CTCCACCCGG CCTTCCAGAC CCCTAACTCG 1400 CCAGGGTCGG GCGGGTTCCC CACGGGCAGG TTGGCCTAGC CTGGGTCCTC 1450 CGCGGGTGGC TCCACGTGAG GCCTGAGCCT TCAGCCCACG GGCCTCAGGG 1500 CCTGCCGCCT CCTGCTTCCC TCGCTGCGGA GGCAGGGAAG CCCCTGTAAC 1550 TCCGGAAGCC TGCTCTCGCT TGCTGAGCCC GCTGGGACCG CCGAGGT 1597

【０１６５】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５２６ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状

【０１６６】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６５ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＨＵＶＣＴ３６のヌクレオチド（配列番
号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図２】 ヒトＨＵＶＣＴ３６のヌクレオチド（配列番
号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図３】 ヒトＨＵＶＣＴ３６のヌクレオチド（配列番
号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図４】 ＧＰＲ１２Ａのアミノ酸配列（配列番号３）
とヒトＨＵＶＣＴ３６の推定アミノ酸配列（配列番号
２）の比較を示す。強調されているアミノ酸は配列中の
違いを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＳ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ＡＢＵ Ｃ１２Ｑ 1/02 ＡＢＶ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ ＡＢＸ 33/53 Ｄ ＡＣＤ 33/577 Ｂ ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ ＡＤＵ ＡＡＨ ＡＤＹ ＡＡＪ ＡＤＺ ＡＢＮ 45/00 ＡＢＳ 48/00 ＡＢＥ ＡＢＵ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＡＢＶ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＢＸ 9/00 ＡＣＤ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＣＶ Ｃ１２Ｑ 1/02 ＡＤＵ Ｇ０１Ｎ 33/50 ＡＤＹ 33/53 ＡＤＺ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 キャサリン・イー・エリス アメリカ合衆国08028ニュージャージー州 グラスボロー、フォーダム・プレイス831 番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）遺伝暗号の重複性によって、配列番
   号２のアミノ酸と同じアミノ酸をコードするポリヌクレ
   オチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的である
   ポリヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
   とも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチドからな
   る群より選択されるポリヌクレオチドからなる単離ポリ
   ヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載の単離ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載の単離ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチドからなる
   請求項２記載の単離ポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
   チドをコードする請求項２記載の単離ポリヌクレオチ
   ド。
6. 【請求項６】（ａ）遺伝暗号の重複性によって、ＡＴＣ
   Ｃ受託番号９８１５６に含まれるヒトｃＤＮＡにより発
   現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
   クレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的である
   ポリヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
   とも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチドからな
   る群より選択されるポリヌクレオチドからなる単離ポリ
   ヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項２記載のＤＮＡを含むベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載のベクターを含む宿主細
   胞。
9. 【請求項９】 請求項８記載の宿主細胞からそのＤＮＡ
   によってコードされるポリペプチドを発現させることを
   特徴とするポリペプチドの製造法。
10. 【請求項１０】 ポリペプチドを発現する細胞の製造法
    であって、細胞を請求項７記載のベクターで形質転換ま
    たはトランスフェクションし、該細胞がベクターに含ま
    れるＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現す
    ることからなる方法。
11. 【請求項１１】 配列番号２に示されるアミノ酸配列か
    らなるポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のポリペプチドについ
    てのアゴニスト。
13. 【請求項１３】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１１記載のポリペプチドについ
    てのアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 ＨＵＶＣＴ３６の必要な患者の治療方
    法であって、請求項１１記載のポリペプチドの治療上有
    効量を該患者に投与することからなる治療方法。
16. 【請求項１６】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを患
    者に付与し、インビボにて該ポリペプチドを発現させる
    ことにより、治療上有効量のポリペプチドを投与する請
    求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 ＨＵＶＣＴ３６ポリペプチドを阻害す
    ることを必要とする患者の治療方法であって、請求項１
    ４記載のアンタゴニストの治療上有効量を該患者に投与
    することからなる治療方法。
18. 【請求項１８】 請求項１１記載のポリペプチドの発現
    に関係する疾患または疾患に対する感受性の診断方法で
    あって、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の突然
    変異を測定することからなる方法。
19. 【請求項１９】 宿主由来のサンプル中の請求項１１記
    載のポリペプチドの存在について分析することからなる
    診断方法。
20. 【請求項２０】 請求項１１記載のポリペプチドについ
    てのレセプターと結合し、そのレセプターを阻害または
    活性化する化合物の同定方法であって、 レセプターへの結合を可能とする条件下、細胞表面で該
    ポリペプチドについてのレセプター（該レセプターは、
    スクリーニングすべき化合物と該レセプターとの結合に
    応答して検出可能なシグナルを発生する能力を有する第
    ２成分と結合する）を発現する細胞を、スクリーニング
    すべき化合物と接触させ；該化合物とポリペプチドとの
    相互反応より生じるシグナルの有無を検出して、該化合
    物が該レセプターと結合し、そのレセプターを活性化す
    るか、阻害するかを測定することからなる方法。