JP7025041B2 - 変異が導入された甲状腺刺激ホルモン受容体 - Google Patents
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Description
本発明は、変異が導入された甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Thyroid Stimulating Hormone）受容体に関する。
ＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）は、甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨの受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。脳下垂体から分泌されたＴＳＨがＴＳＨＲに結合すると、その刺激により細胞中のアデニレートシクラーゼが活性化されて環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生され、ｃＡＭＰシグナルを受けてＴＳＨの分泌及び合成が行われる。
甲状腺疾患の代表例であるバセドウ病（Basedow病；グレーブス病［Graves' disease］ともいう）は、ＴＳＨＲに対して刺激活性を有する自己抗体（Thyroid Stimulation Antibody；ＴＳＡｂ）が原因となって発症する疾患である。バセドウ病患者においては、ＴＳＡｂがＴＳＨＲを過剰に刺激することにより、甲状腺機能が亢進する。ＴＳＨＲ刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患としては、バセドウ病の他に、ＴＳＨ産生腫瘍、妊娠甲状腺中毒症、甲状腺機能低下症、橋本病等が知られている。
甲状腺疾患患者に適切な治療を提供するためには、患者の疾患を鑑別することが重要である。たとえばバセドウ病においては、患者血液試料中のＴＳＡｂ活性を測定することで、バセドウ病の診断、病勢把握、病因解析ができることが知られている。このように、ＴＳＨＲに対する自己抗体活性の測定法は産業上有用であり、開発が進められている。
ＴＳＨＲに対する自己抗体活性の測定法は、その測定原理から２つに大別される。１つは、ＴＳＨのＴＳＨＲへの結合阻害率から自己抗体活性を測定する方法である。具体的な方法として、可溶化ブタ甲状腺細胞膜画分に患者血清とアイソトープ標識したＴＳＨを加えて反応させ、被検血清中のＴＳＨＲ自己抗体による標識化ＴＳＨのＴＳＨＲへの結合阻害率をＴＳＨＲ自己抗体値として測定する方法（非特許文献１）が知られている。
もう１つは、産生されるｃＡＭＰ量を測定するものである。ｃＡＭＰ量の測定という技術思想は共通であるが、ｃＡＭＰの定量法の違いから、いくつかの方法が知られている。代表的なものを、以下に示す。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を被験試料存在下でインキュベートし、被験試料中に含まれるＴＳＡｂがＣＨＯ細胞膜上に存在するＴＳＨ受容体を刺激することにより産生されるｃＡＭＰの量を、レポーター遺伝子の酵素活性を介して測定する方法（特許文献１）。ブタ甲状腺細胞を、当該患者由来の血清存在下でインキュベートし、血清中に含まれるＴＳＡｂが、ブタ甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨＲを刺激することにより産生されるｃＡＭＰの量を、細胞を溶解させて測定する方法（特許文献２）。ブタ甲状腺細胞を、当該患者由来の血清存在下でインキュベートし、血清中に含まれるＴＳＡｂが、ブタ甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨＲを刺激することにより産生されるｃＡＭＰの量を、カルシウムイオンを介した発光によって検出するバイオアッセイ系を利用したＴＳＡｂの測定法（特許文献３）。
特許文献１～３に記載の方法においては、測定までに時間がかかる、前処理が必要であるなどの問題が存在していた。そこで、試料中のＴＳＨＲに対する自己抗体活性を迅速に測定できる方法の１つとして、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨＲの両方が発現する哺乳動物細胞を用いてｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する方法が検討されている（特許文献４）。当該方法においては、以下の工程（ａ）～（ｃ）を行うことにより、被験者試料のＴＳＨＲに対する自己抗体活性を算定することができる。
（ａ）ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨＲの両方が発現する動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、ＴＳＨＲ活性化レベルを算定する工程；
（ａ）ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨＲの両方が発現する動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、ＴＳＨＲ活性化レベルを算定する工程；
特許文献１～４に記載の方法で用いるため、ヒトＴＳＨＲ（特許文献５）、イヌＴＳＨＲ（特許文献６）、ブタＴＳＨＲ（特許文献７）の生産方法が確立されている。しかし、これらの検討は、野生型ＴＳＨＲと同等の性能のＴＳＨＲを簡便かつ大量に製造するためのものであり、野生型ＴＳＨＲよりも高い性能を有するＴＳＨＲを提供するものではなかった。
ＴＳＨＲに関しては、変異によって引き起こされる病態等について、多くの先行研究が存在している（非特許文献２～７）。しかし、これらはいずれも疾病の機序等を解明するための研究であり、ＴＳＨＲに対する自己抗体活性の測定法に応用するための研究ないし検討は一切行われてこなかった。
Methods in Enzymology，74，405～420(1981)、Endocr.Rev.,9,106-120,(1988)
Xiuyan Feng et al. Endocrinology 149(4):1705-1717
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本発明者らは、ＴＳＨＲに対する自己抗体活性の測定法の検討を行う中で、野生型ＴＳＨＲは恒常活性を有しており、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が低く、結果として測定の感度低下が引き起こされることを発見した。特に、ｃＡＭＰバイオセンサーを用いる測定法の一態様においては、ＴＳＨＲ刺激物質存在時と非存在時におけるｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルの比によってＴＳＨＲ活性化レベルを評価するため、ＴＳＨＲのＳ／Ｎ比が低いことに起因する感度低下の影響が顕著であった。
本発明は、上記問題を解決することを課題とする。すなわち、Ｓ／Ｎ比が向上したＴＳＨＲを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＴＳＨＲに適切な変異を導入することによって、ＴＳＨＲの恒常活性を抑制し、Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能であることを見出した。さらに、検討を進めることにより、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］以下に記載するアミノ酸のうち、少なくとも１つに変異を有することを特徴とする、ＴＳＨＲ変異体。
Ｄ４６０、Ｌ４６９、Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｉ５６８、Ｍ５７２、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５
［２］以下に記載するアミノ酸のうち、少なくとも１つに変異を有することを特徴とする、ＴＳＨＲ変異体。
Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５
［３］変異が点変異であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載のＴＳＨＲ変異体。
［４］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［３］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｄ４６０（Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、
Ｌ４６９（Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、
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Ｙ５８２（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖ）、
Ｒ６２５（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、
Ｌ６６５（Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）。
［５］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［４］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｄ４６０（Ｎ、Ｅ、Ｑ）、
Ｌ４６９（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｐ）、
Ｓ４７９（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、
Ｎ４８３（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、
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Ｌ５５２（Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｐ）、
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Ｙ５８２（Ｆ、Ｗ）、
Ｒ６２５（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、
Ｌ６６５（Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｐ）。
［６］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［５］に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｄ４６０Ｎ、Ｌ４６９Ｐ、Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｉ５６８Ｌ、Ｍ５７２Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖ。
［７］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［６］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖ。
［８］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［７］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｓ５６７Ａ、Ｌ６６５Ｖ。
［９］［１］～［８］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体をコードするポリヌクレオチド。
［１０］［１］～［８］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体を発現する動物細胞。
［１１］［１０］に記載の動物細胞を含有する、甲状腺疾患診断キット。
［１２］前記動物細胞がｃＡＭＰバイオセンサーを発現することを特徴とする、［１１］に記載の甲状腺疾患診断キット。
［１３］前記甲状腺疾患がバセドウ病であることを特徴とする、［１１］又は［１２］に記載の甲状腺疾患診断キット。
［１］以下に記載するアミノ酸のうち、少なくとも１つに変異を有することを特徴とする、ＴＳＨＲ変異体。
Ｄ４６０、Ｌ４６９、Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｉ５６８、Ｍ５７２、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５
［２］以下に記載するアミノ酸のうち、少なくとも１つに変異を有することを特徴とする、ＴＳＨＲ変異体。
Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５
［３］変異が点変異であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載のＴＳＨＲ変異体。
［４］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［３］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
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［５］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［４］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
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［６］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［５］に記載のＴＳＨＲ変異体；
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［７］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［６］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
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［８］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］～［７］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｓ５６７Ａ、Ｌ６６５Ｖ。
［９］［１］～［８］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体をコードするポリヌクレオチド。
［１０］［１］～［８］のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体を発現する動物細胞。
［１１］［１０］に記載の動物細胞を含有する、甲状腺疾患診断キット。
［１２］前記動物細胞がｃＡＭＰバイオセンサーを発現することを特徴とする、［１１］に記載の甲状腺疾患診断キット。
［１３］前記甲状腺疾患がバセドウ病であることを特徴とする、［１１］又は［１２］に記載の甲状腺疾患診断キット。
本発明のＴＳＨＲは、少なくともある濃度域において、Ｓ／Ｎ比が向上している。この特性により、ＴＳＨＲに対する自己抗体活性の測定に、好適に用いることができる。
本明細書において、「野生型ＴＳＨＲ」とは、変異の導入されていないＴＳＨＲであることを意味する。本明細書において、変異の導入されていないＴＳＨＲアミノ酸配列とは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＴＳＨＲアミノ酸配列であることとする。本明細書において、ＴＳＨＲの由来はヒトに限定されないが、ＴＳＨＲの由来について特に記載のない場合、ＴＳＨＲはヒト由来（配列番号１）であることを意味する。また、本明細書中において、野生型ＴＳＨＲのことを「ＷＴ」と表記することがある。
本明細書において「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。特に限定されないが、例えばアラニン（Ａｌａ，Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、バリン（Ｖａｌ，Ｖ）を含む。なお、本明細書においては、それぞれのアミノ酸を上記のアルファベット一文字等で略記することがある。
本明細書において、「ＴＳＨＲ変異体」とは、前記野生型ＴＳＨＲからアミノ酸配列を欠失、置換、挿入もしくは付加する変異を有するＴＳＨＲを意味し、由来はヒトに限定されない。当該変異体を表すときに、アルファベット１文字と続く３桁の数字を用いる場合には、１文字目のアルファベットは変異が導入されるアミノ酸を示し、続く３桁の数字はヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列（配列番号１）における当該アミノ酸残基の位置を示している。例えば、「Ｌ６６５」であれば、ヒトＴＳＨＲの６６５番目のロイシンの位置に変異が導入された変異体であることを意味する。
本発明に用いるＴＳＨＲの由来がヒト以外である場合には、ヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列（配列番号１）と対象の野生型ＴＳＨＲの配列をＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴにおける相同性が最大となるようＣｌａｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍｅ.ｊｐ／ｔｏｏｌｓ-ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）にてアラインメントし、ヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列（配列番号１）における当該アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に変異が入っていることを意味する。
本明細書において、アルファベット１文字と３桁の数字の後に更にアルファベット１文字が続く文字列によって変異体を表す場合、左端のアルファベットは変異前のアミノ酸を、中央３桁の数字は野生型ヒトＴＳＨＲにおける当該アミノ酸残基の位置を、右端のアルファベットは変異後のアミノ酸をそれぞれ示し、左端のアミノ酸が右端のアミノ酸へ点変異した変異体であることを意味する。例えば「Ｌ６６５Ｖ」であれば、６６５番目のロイシンがバリンへと置換される点変異が導入された変異体であることを意味する。
本明細書において、アルファベット１文字と３桁の数字に続けて複数のアルファベットが括弧内に列挙されている場合、左端のアミノ酸が括弧内のアミノ酸のいずれかに点変異した変異体であることを意味する。例えばＬ６６５（Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｐ）の場合、６６５番目のロイシンがアラニン、バリン、イソロイシン、プロリンのいずれかに置換される点変異が導入された変異体であることを意味する。
本明細書において、上記変異箇所や変異点がスラッシュ（／）で連続して表されている場合、変異体がスラッシュの前後に記載されている変異をどちらも有する変異体であることを意味する。例えば「Ｒ５３１Ｑ／Ｌ６６５Ｖ」と記載されている場合であれば、５３１番目のアルギニンがグルタミンへと置換される点変異と、６６５番目のロイシンがバリンへと置換される点変異が導入された、二重変異体であることを意味する。
本明細書において、「ｃＡＭＰレベル」とは、ＴＳＨＲに起因して哺乳動物細胞内で産生されるｃＡＭＰ量を意味し、以下に記載の方法で測定した際のＲＬＵと定義する。
［使用動物細胞］ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）。
［使用ベクター］GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSensor-22F、Promega社製）と、ＴＳＨＲが発現するｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｐｃＤＮＡ３．１_ＴＳＨＲ）。なお、以下に記載の方法において、ｐｃＤＮＡ３．１_ＴＳＨＲの代わりに、適宜ＴＳＨＲ変異体が発現するｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用いることもある。
[細胞調製法]
〔１〕１．５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地に播種し、２４時間培養する。
〔２〕pGloSenso-22FとpcDNA3.1_TSHRを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションする。
〔３〕トランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、ＴＳＨＲ刺激物質（例えばＴＳＡｂ国際標準であるＮＩＢＳＣ０８／２０４やＴＳＡｂ陽性検体）の添加により蛍光強度の増加が見られるものを選抜する。
〔１〕１．５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地に播種し、２４時間培養する。
〔２〕pGloSenso-22FとpcDNA3.1_TSHRを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションする。
〔３〕トランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、ＴＳＨＲ刺激物質（例えばＴＳＡｂ国際標準であるＮＩＢＳＣ０８／２０４やＴＳＡｂ陽性検体）の添加により蛍光強度の増加が見られるものを選抜する。
[活性測定条件]
〔１〕細胞を２４時間培養した後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、室温で１時間平衡化処理を行う。
〔２〕ＴＳＨＲ刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後、ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定する。測定されたＲＬＵを、ｃＡＭＰレベルと定義する。
〔１〕細胞を２４時間培養した後、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、室温で１時間平衡化処理を行う。
〔２〕ＴＳＨＲ刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後、ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定する。測定されたＲＬＵを、ｃＡＭＰレベルと定義する。
なお、本明細書におけるｃＡＭＰレベルの測定法は、上記測定法と同等性が担保される範囲内で、適宜改変することもできる。
本明細書において、「恒常ｃＡＭＰレベル」とは、ＴＳＨＲ刺激物質非存在条件下で示すｃＡＭＰレベルのことを意味する。本明細書において恒常ｃＡＭＰレベルは、前記ｃＡＭＰレベル測定法の活性測定条件〔２〕で、ＴＳＨＲ刺激物質を添加しないことで測定することができる。
本明細書において、「ＴＳＨＲ活性化レベル」とは、ＴＳＨＲ刺激物質に対するＴＳＨＲの応答性を意味し、哺乳動物細胞中の恒常ｃＡＭＰレベルに対する、ＴＳＨＲ刺激物質存在下におけるｃＡＭＰレベルの比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）によって定義される。
本明細書において、「ＴＳＨＲ刺激物質」とは、ＴＳＨＲを刺激（活性化）するリガンドを意味し、ＴＳＨそのものや、ＴＳＨＲ刺激性自己抗体が例示される。
本明細書において、「ＴＳＨＲ刺激性自己抗体」とは、ＴＳＨＲを直接的又は間接的に刺激（活性化）できる自己抗体（すなわち、測定対象の被験者の体内で産生され、かつ、当該被験者の体内に存在するタンパク質等の物質を標的とする抗体）、例えば、ＴＳＨＲに結合できるアゴニスト（例えば、アゴニスト作用を有する抗ＴＳＨ抗体［ＴＳＡｂ］）を意味する。
本明細書において、「ＴＳＨＲ阻害性自己抗体」とは、ＴＳＨＲを直接的又は間接的に阻害（不活性化）できる自己抗体、例えば、ＴＳＨのＴＳＨＲへの結合を直接的又は間接的に阻害するアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト作用を有する抗ＴＳＨ抗体［ＴＳＢＡｂ］）を意味する。
本明細書において、「シグナル／ノイズ比」及び「Ｓ／Ｎ比」、「Ｓ／Ｎ ｒａｔｉｏ」とは、前記ｃＡＭＰレベル測定法に従いＴＳＨＲを一過性発現する株において、ＴＳＨＲ刺激物質であるＴＳＡｂ国際標準ＮＩＢＳＣ０８／２０４を添加したときの、ＴＳＨＲ活性化レベルを意味する。ある濃度Ｘ（ｍＩＵ／Ｌ）のＮＩＢＳＣ０８／２０４を添加したときのＴＳＨＲ活性化レベルをＸ（ｍＩＵ／Ｌ）におけるＳ／Ｎ比と定義する。
本明細書において、「Ｓ／Ｎ比が高い（低い）」とは、あるＮＩＢＳＣ０８／２０４濃度において、一方のＳ／Ｎ比が、他方の１．２倍以上高い（低い）ことを意味する。すなわち、ある濃度Ｘ（ｍＩＵ／Ｌ）において、ＴＳＨＲ変異体が野生型ヒトＴＨＳＲよりもＳ／Ｎ比が高いといったときには、Ｘ（ｍＩＵ／Ｌ）におけるＴＳＨＲ変異体のＳ／Ｎ比が、Ｘ（ｍＩＵ／Ｌ）における野生型ヒトＴＳＨＲのＳ／Ｎ比よりも１．２倍以上であることを意味する。ＴＳＨＲのＳ／Ｎ比が高いことは、そのＴＳＨＲをＴＳＨＲ刺激物質の測定系に用いた場合、感度及び鑑別能力に優れていることを意味する。
本明細書において「相同性」とは、一般的に２つもしくは複数間のアミノ酸配列において同一なアミノ酸数の割合を算定したものを意味する。本明細書において「相同性」は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴによって測定された値であると定義する。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのＡｌｇｏｒｉｔｈｍには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓ又はＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基を含む。上記の等価物は、例えばＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。
「ＤＮＡ鎖」とは、ＤＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「ＲＮＡ鎖」とは、ＲＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「ＤＮＡ鎖」とは、ＤＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「ＲＮＡ鎖」とは、ＲＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
本明細書において「ベクター」は、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＥＴ－Ｂｌｕｅ－２）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１－１１、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。
本明細書において「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。
本発明の一態様は、以下の変異のうち少なくとも１つが導入されたヒトＴＳＨＲ変異体である。
Ｄ４６０、Ｌ４６９、Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｉ５６８、Ｍ５７２、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５
本発明の一態様は、上記変異に対応する変異のうち少なくとも１つが導入された、非ヒトＴＳＨＲ変異体である。
本発明のＴＳＨＲ変異体は、上記変異を有することから、極低濃度域（１～５０ｍＩＵ／Ｌ）、低濃度域（５０～３００ｍＩＵ／Ｌ）、中濃度域（３００～１０００ｍＩＵ／Ｌ）、高濃度域（１０００～５０００ｍＩＵ／Ｌ）の少なくとも１つの濃度域において、Ｓ／Ｎ比が向上している。当該ＴＳＨＲ変異体は、Ｓ／Ｎ比が向上している濃度域において感度よくＴＳＨＲ活性化レベルを測定できるため、好適にＴＳＨＲ刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の判定に用いることができる。
Ｄ４６０、Ｌ４６９、Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｉ５６８、Ｍ５７２、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５
本発明の一態様は、上記変異に対応する変異のうち少なくとも１つが導入された、非ヒトＴＳＨＲ変異体である。
本発明のＴＳＨＲ変異体は、上記変異を有することから、極低濃度域（１～５０ｍＩＵ／Ｌ）、低濃度域（５０～３００ｍＩＵ／Ｌ）、中濃度域（３００～１０００ｍＩＵ／Ｌ）、高濃度域（１０００～５０００ｍＩＵ／Ｌ）の少なくとも１つの濃度域において、Ｓ／Ｎ比が向上している。当該ＴＳＨＲ変異体は、Ｓ／Ｎ比が向上している濃度域において感度よくＴＳＨＲ活性化レベルを測定できるため、好適にＴＳＨＲ刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の判定に用いることができる。
前記変異の中でも、より広い濃度範囲でＳ／Ｎ比が向上することから、Ｌ４６９、Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５のうち少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましく、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５のうち少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましい。さらに、後述する実施例にて実証されているように、バセドウ病の診断に好適に用いることができることから、Ｓ５６７、Ｌ６６５のうち少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましい。
本発明に用いることができるＴＳＨＲは、ヒトＴＳＡｂなどの測定対象に反応を示す限りにおいて、その由来に制限はない。動物細胞にて発現した際にヒトのＴＳＨＲと近い反応性を示すことから、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができる。中でも、過去にＴＳＡｂ活性測定に用いられてきた細胞の由来である点から、ヒト（配列番号１）、マウス（配列番号２）、ラット（配列番号３）、ブタ（配列番号４）であることが好ましく、生体内のＴＳＨＲに対するＴＳＡｂ活性をそのまま反映できる点から、ヒト（配列番号１）であることがより好ましい。
本発明のＴＳＨＲは、前記変異を有していることを特徴とするが、必ずしも前記変異のうち１つのみを有する必要はなく、前記変異のうち複数の変異を有していてもよい。
本発明のＴＳＨＲに導入される変異は、アミノ酸配列を欠失、置換、挿入もしくは付加する変異であるが、中でもアミノ酸を置換する変異が好ましい。これは、アミノ酸を置換する変異は、アミノ酸欠失や挿入に比してＧＰＣＲの基本的な立体構造を保持したまま構成アミノ酸を変化させることができ、機能改変に適しているためである。
アミノ酸側鎖の性質より、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、及び芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）等の分類が知られている（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸同士の置換は保存的置換と総称され、一般にはタンパク質の機能等に影響が少ないことが知られている。また、アミノ酸の上記性質の中でも、アミノ酸の疎水性／親水性がタンパク質の性質に大きな影響を与えることが知られている。
後述する実施例にて効果の実証されている置換変異と、前記側鎖の性質によるアミノ酸群の分類を照らして勘案すると、Ｄ４６０においては、同じく疎水性アミノ酸であるＲ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔに置換されていることが好ましく、中でもカルボン酸を有しているＮ、Ｅ、Ｑに置換されていることが好ましい。
Ｌ４６９においては、同じく疎水性アミノ酸であるＡ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖに置換されていることが好ましく、中でも脂肪族側鎖を有するアミノ酸であるＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｐに置換されることがより好ましい。
Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｓ５６７、Ｒ６２５においては、疎水性アミノ酸であるＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖに置換されていることが好ましく、中でも脂肪族側鎖を有するＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐに置換されることが好ましい。
Ｒ５３１においては、同じく親水性アミノ酸であるＤ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔに置換されていることが好ましく、中でもカルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸であるＤ、Ｎ、Ｅ、Ｑに置換されることがより好ましい。
Ｌ５５２、Ｌ６６５においては、同じく疎水性アミノ酸のＡ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖに置換されていることが好ましく、中でも脂肪族側鎖も有するアミノ酸のＡ、Ｖ、Ｉ、Ｐに置換されることが好ましい。
Ｉ５６８においては、同じ疎水性アミノ酸であるＡ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖに置換されていることが好ましく、中でも脂肪族側鎖を有するアミノ酸であるＡ、Ｖ、Ｌ、Ｐに置換されることがより好ましい。
Ｍ５７２においては、同じく疎水性アミノ酸であるＡ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖに置換されることが好ましく、中でも脂肪族側鎖を有するＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐに置換されることがより好ましい。
Ｙ５８２においては、同じく疎水性アミノ酸であるＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖに置換されることが好ましく、中でも芳香族含有側鎖を有するＦ、Ｗに置換されていることがより好ましい。
上記変異点における変異の中でも、恒常活性抑制効果を示すことが実施例にて実証されていることから、前記変異が以下に示すアミノ酸置換、ないしは対応するアミノ酸置換のうち少なくとも１つであることが好ましい。
Ｄ４６０Ｎ、Ｌ４６９Ｐ、Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｉ５６８Ｌ、Ｍ５７２Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖ
中でも、広い濃度範囲でＳ／Ｎ比が向上することから、Ｌ４６９Ｐ、Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖのうち少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましく、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖのうち少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましい。中でも、強い恒常ｃＡＭＰレベル抑制効果を示し、後述する実施例にて実証されているようにバセドウ病の診断に好適に用いることができることから、Ｓ５６７Ａ、Ｌ６６５Ｖの少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましい。
Ｄ４６０Ｎ、Ｌ４６９Ｐ、Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｉ５６８Ｌ、Ｍ５７２Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖ
中でも、広い濃度範囲でＳ／Ｎ比が向上することから、Ｌ４６９Ｐ、Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖのうち少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましく、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖのうち少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましい。中でも、強い恒常ｃＡＭＰレベル抑制効果を示し、後述する実施例にて実証されているようにバセドウ病の診断に好適に用いることができることから、Ｓ５６７Ａ、Ｌ６６５Ｖの少なくとも１つに変異が導入されていることがより好ましい。
本発明のＴＳＨＲ変異体は、これまで記載した変異の他に、ＴＳＨＲ活性の顕著な低下やＳ／Ｎ比の顕著な低下を引き起こさない範囲内で、さらにアミノ酸配列を欠失、置換、挿入もしくは付加する変異を有していても良い。一般に、特に活性と直接的に関与しない部位において、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、又は他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持しうる(Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)ことが知られている。
本発明のＴＳＨＲ変異体が更なる変異を有している場合、この数は少ないほど好ましい。本発明のＴＳＨＲ変異体を野生型ヒトＴＳＨＲ（配列番号１）と比較した際の相同性は、９０％以上の同一性を有することが好ましく、９５％以上の相同性を有することがより好ましい。
これは、アミノ酸配列の変異が少ないほど、野生型ヒトＴＳＨＲに近い特性を有しており、生体内のＴＳＨＲに対するＴＳＡｂ活性をそのまま反映できると考えられるためである。
これは、アミノ酸配列の変異が少ないほど、野生型ヒトＴＳＨＲに近い特性を有しており、生体内のＴＳＨＲに対するＴＳＡｂ活性をそのまま反映できると考えられるためである。
本発明の実施形態に係るＴＳＨＲが特定のアミノ酸配列を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係るＴＳＨＲは、特定のアミノ酸配列を含むといえる。一般的に、タンパク質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばＮ末端修飾（例えば、アセチル化 、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、又は側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。
本発明の一態様は、前記ＴＳＨＲ変異体をコードするポリヌクレオチドである。本発明の一態様は、前記ＴＳＨＲ変異体を発現する、動物細胞である。
本発明の一態様であるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成可能である。その他、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のＴＳＨＲ変異体のアミノ酸配列と、遺伝暗号表から、適宜設計することができる。
前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、一般に知られている分子生物学的手法によって調製することができ、その調製方法として、例えばＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法、ライゲーション法、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング法、アッセンブリ―法等が例示される。
本発明の一態様である動物細胞は、前記ベクターの導入により、前記ＴＳＨＲ変異体が一過的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）又は安定的（ｓｔａｂｌｅ）に発現する動物細胞であればよい。使用される細胞株に特に限定は無いが、購入や実験のし易さの点から、哺乳類甲状腺細胞株[FRTL-5等]、ヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］、ヒト骨肉腫細胞株［Ｕ２ＯＳ細胞］が好ましく、中でも遺伝子導入効率や安定増殖の点からヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］がより好ましい。
本発明の動物細胞は、ＴＳＨＲ変異体を発現することにより、恒常活性が抑制され、Ｓ／Ｎ比が改善されていることから、ＴＳＨＲに対する自己抗体活性の測定法に好適に用いることができる。適用される自己抗体活性の測定法に特に限定はなく、特許文献２～４に記載された方法を例示することができるが、前処理が不要かつ短時間で測定が完了するという点で、中でも特許文献４に記載された方法が好ましい。
本発明の動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］のＩＥ［immediate early］遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０［Simian virus 40］の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているＴＳＨ受容体をコードする遺伝子を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。自己抗体活性の測定に用いられるために、適宜ＴＳＨＲ変異体をコードする遺伝子以外の遺伝子が導入されていても良く、例えばｃＡＭＰバイオセンサーを用いる特許文献４に記載の方法であれば、ｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子が導入されていても良い。
本発明に用いることのできるｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（文献「Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.」参照）を挙げることができ、本実施例において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。
本発明の一態様は、前記ＴＳＨＲ変異体を発現する動物細胞を含む、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患診断キットである。
本明細書において、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患としては、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体又はＴＳＨ受容体阻害性自己抗体によりＴＳＨ受容体が刺激又は阻害され、血液中の遊離型甲状腺ホルモン濃度の上昇又は低下に起因する甲状腺疾患であればよく、例えば、バセドウ病、ＴＳＨ産生腫瘍、妊娠甲状腺中毒症、甲状腺機能低下症、橋本病等を挙げることができ、バセドウ病を好適に例示することができる。
本発明の一態様である甲状腺疾患測定キットは、常用されている試薬を適宜用いることができる。一例として、動物細胞液、発光基質液、反応プレート、標準液、希釈液のようなキット構成が考えられる。
なお、本発明に関するｃＡＭＰレベル測定法、動物細胞調製法、自己抗体の測定キットの詳細については、本明細書に記載された内容の他に、本明細書に記載された文献、特に特許文献４、及び特許文献４に記載された文献の内容を適宜参照することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１．ＴＳＨＲ変異体の調製
以下に示す方法に従い、野生型ＴＳＨＲから１アミノ酸が置換されたＴＳＨＲ変異体を調製した。
以下に示す方法に従い、野生型ＴＳＨＲから１アミノ酸が置換されたＴＳＨＲ変異体を調製した。
１－１．ＴＳＨＲ変異体の設計
ＴＳＨＲの活性に影響があると推測される変異として、非特許文献２～７に記載された、以下の変異を検討した。
Ｒ５３１Ｑ：非特許文献２
Ｌ５５２Ｖ、Ｙ５８２Ｆ、Ｌ６６５Ｖ：非特許文献３
Ｓ５６７Ａ、Ｉ５６８Ｌ、Ｍ５７２Ａ：非特許文献４
Ｄ４６０Ｎ、Ｒ６２５Ａ：非特許文献５
Ｌ４６９Ｐ：非特許文献６
Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ：非特許文献７
ヒトＴＳＨＲのタンパク質構造中の各変異点の位置を、図１に模式的に示す。
ＴＳＨＲの活性に影響があると推測される変異として、非特許文献２～７に記載された、以下の変異を検討した。
Ｒ５３１Ｑ：非特許文献２
Ｌ５５２Ｖ、Ｙ５８２Ｆ、Ｌ６６５Ｖ：非特許文献３
Ｓ５６７Ａ、Ｉ５６８Ｌ、Ｍ５７２Ａ：非特許文献４
Ｄ４６０Ｎ、Ｒ６２５Ａ：非特許文献５
Ｌ４６９Ｐ：非特許文献６
Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ：非特許文献７
ヒトＴＳＨＲのタンパク質構造中の各変異点の位置を、図１に模式的に示す。
１－２．変異ＴＳＨＲの発現ベクター調製
１－１．に記載した変異に対応するよう、変異点に相当するヌクレオチドを挟んで３’側と５’側に２０～３０ｍｅｒの人工プライマーを設計し、野生型ｈＴＳＨＲの３’側プライマーと変異導入するための１～３塩基を追加した５’側プライマーと、野生型ｈＴＳＨＲを発現するベクターｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＴＳＨＲ用いて、東洋紡社ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ＳＭＫ-１０１）によるｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法で、ＴＳＨＲ配列への点変異導入を行った。点変異導入プラスミドを形質転換した大腸菌シングルコロニーからプラスミドを精製、シーケンス解析により点変異の導入を確認した。
１－１．に記載した変異に対応するよう、変異点に相当するヌクレオチドを挟んで３’側と５’側に２０～３０ｍｅｒの人工プライマーを設計し、野生型ｈＴＳＨＲの３’側プライマーと変異導入するための１～３塩基を追加した５’側プライマーと、野生型ｈＴＳＨＲを発現するベクターｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＴＳＨＲ用いて、東洋紡社ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ＳＭＫ-１０１）によるｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法で、ＴＳＨＲ配列への点変異導入を行った。点変異導入プラスミドを形質転換した大腸菌シングルコロニーからプラスミドを精製、シーケンス解析により点変異の導入を確認した。
１－３．ＴＳＨＲ変異体一過性発現細胞株の取得
１．５×１０４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地とともに６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
１－２．にて取得したＴＳＨＲ変異体ベクター０.０５μｇと、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）２μｇを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。上記操作によって、ＴＳＨＲ変異体を一過性発現する、ＨＥＫ２９３細胞を取得した。
１．５×１０４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地とともに６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
１－２．にて取得したＴＳＨＲ変異体ベクター０.０５μｇと、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）２μｇを、FuGENE HD Transfection Reagent（Promega社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。上記操作によって、ＴＳＨＲ変異体を一過性発現する、ＨＥＫ２９３細胞を取得した。
ＴＳＨＲ変異体の一過性発現株に対する対照として用いるため、１－２記載の野生型ヒトＴＳＨＲの発現ベクターにより、野生型ヒトＴＳＨＲ一過性発現株も取得した。
実施例２．ＴＳＨＲ変異体のＮＩＢＳＣ０８／２０４に対する活性測定
実施例１にて得られたＴＳＨＲ変異体ないし野生型ＴＳＨＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＴＳＡｂの国際標準であるＮＩＢＳＣ０８／２０４を添加して、各ＴＳＨＲのＳ／Ｎ比を測定した。
実施例１にて得られたＴＳＨＲ変異体ないし野生型ＴＳＨＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、ＴＳＡｂの国際標準であるＮＩＢＳＣ０８／２０４を添加して、各ＴＳＨＲのＳ／Ｎ比を測定した。
測定法は以下の通りである。
[測定条件]
ＴＳＨＲ変異体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞及び野生型ＴＳＨＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞を２４時間培養後、細胞を回収、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、ＴＳＡｂの国際標準ＮＩＢＳＣ０８／２０４を０、３１．２５、１２５、５００、２０００ｍＩＵ／Ｌとなるよう添加、２０分間インキュベーションした後のＲＬＵ値を９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）で測定した。ＴＳＨＲ変異体の恒常活性の指標として、０８／２０４の０ｍＩＵ／Ｌ濃度、つまり緩衝液のみ添加の条件のＲＬＵ値を比較した。
[測定条件]
ＴＳＨＲ変異体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞及び野生型ＴＳＨＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞を２４時間培養後、細胞を回収、２％（ｖ／ｖ）のGloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）を含むpolyethylene glycol含有インキュベート用液に交換し、ＴＳＡｂの国際標準ＮＩＢＳＣ０８／２０４を０、３１．２５、１２５、５００、２０００ｍＩＵ／Ｌとなるよう添加、２０分間インキュベーションした後のＲＬＵ値を９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）で測定した。ＴＳＨＲ変異体の恒常活性の指標として、０８／２０４の０ｍＩＵ／Ｌ濃度、つまり緩衝液のみ添加の条件のＲＬＵ値を比較した。
各ＴＳＨＲ変異体の国際標準ＮＩＢＳＣ０８／２０４未添加におけるＲＬＵを、図２に示す。いずれの変異体においても、恒常活性は抑制されていることが読み取れる。
各ＴＳＨＲ変異体の各濃度におけるＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を、図３及び表１に示す。なお、表１中の各行は添加したＮＩＢＳＣ０８／２０４濃度を示し、各列は導入された変異を表す。「ＷＴ」は野生型であることを示す。「Ｓ／Ｎ ｒａｔｉｏ」と記載されている上段は野生型ＴＳＨＲ及び各ＴＳＨＲ変異体においてＮＩＢＳＣ０８／２０４を０、３１．２５、１２５、５００、２０００ｍＩＵ／Ｌとなるよう添加、２０分間インキュベーションした後のＳ／Ｎ比を示し、「対ＷＴ Ｓ／Ｎ ｒａｔｉｏ」と記載されている下段は各ＴＳＨＲ変異体のＳ／Ｎ比を野生型ＴＳＨＲのＳ／Ｎ比で除したものを表す。
上記結果より、Ｄ４６０、Ｌ４６９、Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｉ５６８、Ｍ５７２、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５に変異を有する変異体において、野生型ＴＳＨＲよりも２０００ｍＩＵ／ＬにおけるＳ／Ｎ比が向上していることが読み取れる。
上記変異点の中でも、Ｌ４６９、Ｓ４７９、Ｎ４８３、Ｄ４８７、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５に変異を有する変異体において、野生型ＴＳＨＲよりも５００ｍＩＵ／ＬにおけるＳ／Ｎ比及び２０００ｍＩＵ／ＬにおけるＳ／Ｎ比が向上していることが読み取れる。
上記変異点の中でも、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５に変異を有する変異体においては、４濃度全てにおいてＳ／Ｎ比が向上していることから、より好ましい変異箇所であることが読み取れる。
実施例３．ＴＳＨＲ変異体のバセドウ病患者陽性血清に対する活性測定
得られたＴＳＨＲ変異体ないし野生型ＴＳＨＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、バセドウ病患者陽性血清を添加して、ＴＳＨＲのＴＳＨＲ活性化レベルを測定した。
得られたＴＳＨＲ変異体ないし野生型ＴＳＨＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、バセドウ病患者陽性血清を添加して、ＴＳＨＲのＴＳＨＲ活性化レベルを測定した。
国際標準ＮＩＢＳＣ０８／２０４の代りに、polyethylene glycol含有インキュベート用液で４倍希釈した５種のＴＳＡｂＥＩＡ陽性（＞１２０％）血清及び２種のＴＳＡｂＥＩＡ陰性血清をそれぞれ２５μＬ添加した以外は、実施例２に記載された方法と同様の方法にて、ＴＳＨＲのＴＳＨＲ活性化レベル（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を測定した。
陰性血清及び陽性血清に対する各ＴＳＨＲ変異体のＴＳＨＲ活性化レベルを、図４及び表２に示す。表２中、各行は添加した血清試料の番号を表し、各列は導入された変異を示す。「ＷＴ」は野生型ＴＳＨＲであることを示す。「ＴＳＨＲ活性化レベル」と記載された上段は野生型ＴＳＨＲ及び各ＴＳＨＲ変異体におけるＴＳＨＲ活性化レベルを示し、「対ＷＴ ＴＳＨＲ活性化レベル」と記載された下段は各ＴＳＨＲ変異体のＴＳＨＲ活性化レベルを野生型ＴＳＨＲのＴＳＨＲ活性化レベルで除したものを表す。
実施例２でＴＳＨＲ活性化レベルが向上していた変異体の内、Ｒ５３１、Ｌ５５２、Ｓ５６７、Ｙ５８２、Ｒ６２５、Ｌ６６５に変異を有する変異体が、少なくとも１つの濃度域で、ＴＳＨＲ活性化レベルが高くなっていることが読み取れる。
上記変異の中でも、Ｌ５５２Ｖ及びＬ６６５Ｖの変異においては、全ての濃度域においてＴＳＨＲ活性化レベルが向上していることが読み取れる。
なお、本実験例の結果は、バセドウ病患者陽性血清に対する活性測定に関するものである。本結果より、上記ＴＳＨＲ活性化レベルが向上したＴＳＨＲ変異体はバセドウ病の診断に好適に利用可能なことが読み取れるが、一方で、ＴＳＨＲ活性化レベルが向上しなかったＴＳＨＲ変異体が産業上有用でないことを意味しない。ＴＳＨ産生腫瘍、妊娠甲状腺中毒症、甲状腺機能低下症、橋本病等といった、その他の甲状腺疾患を感度よく測定できる可能性があるためである。
実施例４．ＴＳＨＲ変異体の安定発現株における活性測定
ＴＳＨＲ変異体を安定発現する細胞株においても、一過性発現と同様、ＴＳＨＲ活性化レベルが高くなるか、検討を行った。
ＴＳＨＲ変異体を安定発現する細胞株においても、一過性発現と同様、ＴＳＨＲ活性化レベルが高くなるか、検討を行った。
ＨＥＫ２９３細胞に２種類のベクター（pGloSensor-22F及びpcDNA3.1_hTSHR、又はpcDNA3.1_hTSHRに対応するＴＳＨＲ変異体（Ｓ５６７Ａ、Ｌ６６５Ｖ）ベクター）をそれぞれ２μｇおよび０．０５μｇトランスフェクションし、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ＧＯＬＤ（invivogen社製）４００μｇ／ｍＬ添加して薬剤耐性となったコロニーを単離、ＴＳＡｂ国際標準であるＮＩＢＳＣ０８／２０４を添加してルシフェラーゼ活性レベルの上昇が認められた株を、安定発現株として選抜した。安定発現株は、各７株以上取得した。
野生型ＴＳＨＲ発現株、Ｓ５６７Ａ変異ＴＳＨＲ安定発現株、Ｌ６６５Ｖ変異ＴＳＨＲ安定発現株において、実施例２と同様の方法で、ＲＬＵを測定し、ＴＳＨＲ活性化レベルを算出した。得られた結果から、各安定発現株群のＴＳＨＲ活性化レベルの平均値及び分散を計算した。その結果を図５に示す。
Ｓ５６７Ａ変異ＴＳＨＲ安定発現株及びＬ６６５Ｖ変異ＴＳＨＲ安定発現株は、一過性発現株と同様にＴＳＨＲ活性化レベルが向上しており、野生型ＴＳＨＲ安定発現株に比べ有意に高いＴＳＨＲ活性化レベルを示した。
このことから、本発明のＴＳＨＲ変異株は、一過性発現株においても、安定発現株においても、同様にＴＳＨＲ活性化レベルが向上することが理解された。
このことから、本発明のＴＳＨＲ変異株は、一過性発現株においても、安定発現株においても、同様にＴＳＨＲ活性化レベルが向上することが理解された。
実施例５．複数の変異を有するＴＳＨＲ変異体のＮＩＢＳＣ０８／２０４に対する活性測定
複数の変異を有する場合に、ＴＳＨＲ変異体のＳ／Ｎ比がどのように変化するか調べるため、以下に示す方法で二重変異体を作成し、Ｓ／Ｎ比を測定した。
複数の変異を有する場合に、ＴＳＨＲ変異体のＳ／Ｎ比がどのように変化するか調べるため、以下に示す方法で二重変異体を作成し、Ｓ／Ｎ比を測定した。
導入する変異が下記に示す二重変異であること以外は、実施例１に記載の方法に従い、各ＴＳＨＲ二重変異体を作成した。
Ｒ５３１Ｑ／Ｌ６６５Ｖ、Ｌ５５２Ｖ／Ｌ６６５Ｖ、Ｓ５６７Ａ／Ｌ６６５Ｖ、Ｙ５８２Ｆ／Ｌ６６５Ｖ
Ｒ５３１Ｑ／Ｌ６６５Ｖ、Ｌ５５２Ｖ／Ｌ６６５Ｖ、Ｓ５６７Ａ／Ｌ６６５Ｖ、Ｙ５８２Ｆ／Ｌ６６５Ｖ
上記で得られたＴＳＨＲ二重変異体、対照としてＬ６６５Ｖ変異体、野生型ＴＳＨＲについて、実施例２に記載の方法に従い、Ｓ／Ｎ比を測定した。測定した結果を、以下の表３に記載する。なお、表３中の各行は添加したＮＩＢＳＣ０８／２０４濃度を示し、各列は導入された変異を表す。「ＷＴ」は野生型であることを示す。
ＴＳＨＲ二重変異体は、１重変異体（Ｌ６６５Ｖ）と同等程度、もしくはより高いＳ／Ｎ比を有していた。このことから、本発明のＴＳＨＲ変異体は、複数の変異を有していてもよいことが理解された。
本発明は、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の診断及び治療に資するものである。
Claims (8)
- 以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有し、野生型ヒトＴＳＨＲ（配列番号１）と比較したとき９０％以上の同一性を有することを特徴とする、ＴＳＨＲ変異体；
Ｄ４６０Ｎ、Ｌ４６９Ｐ、Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｉ５６８Ｌ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖ。 - 以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、請求項１に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖ。 - 以下に記載する点変異を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のＴＳＨＲ変異体；
Ｌ６６５Ｖ。 - 請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載のＴＳＨＲ変異体を発現する動物細胞。
- 以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有し、野生型ヒトＴＳＨＲ（配列番号１）と比較したとき９０％以上の同一性を有するＴＳＨＲ変異体を発現した動物細胞を含有する、甲状腺疾患診断キット；
Ｄ４６０Ｎ、Ｌ４６９Ｐ、Ｓ４７９Ａ、Ｎ４８３Ａ、Ｄ４８７Ａ、Ｒ５３１Ｑ、Ｌ５５２Ｖ、Ｓ５６７Ａ、Ｉ５６８Ｌ、Ｍ５７２Ａ、Ｙ５８２Ｆ、Ｒ６２５Ａ、Ｌ６６５Ｖ。 - 前記動物細胞がｃＡＭＰバイオセンサーを発現することを特徴とする、請求項６に記載の甲状腺疾患診断キット。
- 前記甲状腺疾患がバセドウ病であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の甲状腺疾患診断キット。
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