JP7212955B2

JP7212955B2 - 甲状腺刺激ホルモン受容体阻害性自己抗体の活性測定法およびキット

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Publication number: JP7212955B2
Application number: JP2020218126A
Authority: JP
Inventors: 元気保科
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2023-01-26
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: JP2022103480A

Description

本発明は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；ＴｈｙｒｏｉｄＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＨｏｒｍｏｎｅ）受容体阻害性自己抗体の活性の測定方法及びキットに関する。

ＴＳＨ受容体は、甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨの受容体である。脳下垂体から分泌されたＴＳＨがＴＳＨ受容体に結合すると、その刺激によりＴＳＨの分泌及び合成が行われる。甲状腺疾患の１つであるバセドウ病は、ＴＳＨ受容体に対して刺激活性を有する、刺激型の自己抗体（ＴｈｙｒｏｉｄＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙ；ＴＳＡｂ）がＴＳＨ受容体を過剰に刺激し、甲状腺機能が亢進することによって発症する。一方、ＴＳＨ受容体に対する阻害型の自己抗体（ＴｈｙｒｏｉｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎＢｌｏｃｋｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙ；ＴＳＢＡｂ）は、ＴＳＨ受容体に結合することで、ＴＳＨの受容体への結合を阻害し、結果として甲状腺機能の低下を引き起こす。甲状腺関連疾患の診断では、これらＴＳＡｂおよびＴＳＢＡｂのような自己抗体の測定による方法が従来用いられている。

例えば従来、ＴＳＡｂまたはＴＳＢＡｂに起因する甲状腺疾患の判定を行うための自己抗体活性の測定法およびキットとして、ｃＡＭＰ結合領域を含むレポータータンパク質などのを、被験者由来の試料存在下でインキュベートした後、当該ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定することで、自己抗体活性の測定を短時間で行うことを可能とした測定法が知られる（特許文献１）。

また、ＴＳＢＡｂの測定方法としては、例えば、ヒトＴＳＨ受容体およびｃＡＭＰ依存性カルシウムチャネルを哺乳類細胞に発現させた後、当該細胞に試料およびＴＳＨを添加し、産生されるｃＡＭＰの量を定量することで、試料中に含まれるＴＳＢＡｂによるＴＳＨへの競合阻害のレベルを検出し、ＴＳＢＡｂを定量する方法などが知られる（特許文献２～４）。

ＷＯ２０２０／０５０２０８ＷＯ２０１１／００１８８５特開２０１６－０３２４７２号公報特開２０１７－１９２３９６号公報

従来の、短時間での自己抗体活性測定法（特許文献１）では、阻害性自己抗体の測定方法として、目的試料存在下と対照存在下でそれぞれ細胞をインキュベートし、バイオセンサーの活性化レベルを検出・比較することで、刺激性自己抗体と阻害性自己抗体の活性バランスを判定する方法が記載されている一方、インキュベート時にＴＳＨを添加することで、阻害性自己抗体と添加ＴＳＨの競合阻害によって阻害性自己抗体の活性を検出する方法については記載されておらず、検討もしていない。

したがって本願発明は、ＴＳＨの添加による競合阻害原理を用いた、短時間での阻害性自己抗体活性測定法を確立することにある。

発明者は、鋭意検討を行った結果、従来の競合阻害を用いた阻害性自己抗体の活性測定法やｃＡＭＰバイオセンサーを用いた自己抗体活性測定法において常識的に系に持ち込まれていたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が５％より多く含有されていると、添加ＴＳＨによる競合阻害原理を用いた測定法において短時間での阻害活性の検出が不可能となることを全く新たに見出した。

従って、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料およびＴＳＨの存在下でインキュベートする工程（ａ）；
工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程（ｂ）；及び、
工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較することで、試料中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体の活性を算定する工程（ｃ）；
の工程（ａ）～（ｃ）を含む、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体活性測定方法うに当たり、すべての工程をＰＥＧ濃度５％以下またはＰＥＧ非存在の条件下で行うことにより、ＴＳＨによる競合阻害原理を用いた測定法において短時間での阻害活性の検出が可能となることを見出し、本発明を完成させた。

本願発明の方法によれば、競合阻害原理を利用したＴＳＢＡｂのような阻害性自己抗体の活性測定において、短時間で活性を測定することができ、効率的な疾患の判定や判定の補助を行う際にきわめて有用である。

図１は、異なるＰＥＧ濃度条件下において、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、試料およびＴＳＨの存在下で２０分間インキュベートしたときの、各試料のＴＳＢＡｂ阻害率（％）を示す。図２は、異なるＰＥＧ濃度条件下において、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、試料およびＴＳＨの存在下で３０分間インキュベートしたときの、各試料のＴＳＢＡｂ阻害率（％）を示す。図３は、異なるＰＥＧ濃度条件下において、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、試料およびＴＳＨの存在下で４０分間インキュベートしたときの、各試料のＴＳＢＡｂ阻害率（％）を示す。図４は、異なるＰＥＧ濃度条件下において、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、試料およびＴＳＨの存在下で６０分間インキュベートしたときの、各試料のＴＳＢＡｂ阻害率（％）を示す。図５は、異なるＰＥＧ濃度条件下において、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、試料およびＴＳＨの存在下で１２０分間インキュベートしたときの、各試料のＴＳＢＡｂ阻害率（％）を示す。

本発明の測定方法は、
ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料およびＴＳＨの存在下でインキュベートする工程（ａ）；
工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程（ｂ）；及び、
工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較することで、試料中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体の活性を算定する工程（ｃ）；
の工程（ａ）～（ｃ）を含む、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体活性測定方法において、すべての工程をＰＥＧ濃度５％以下の条件下で行うことを特徴とする、阻害性時抗体活性の測定法（以下、「本件測定方法」ということがある）に関するものである。

また、本発明の測定用キットは、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞と、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの可視化及び／又は定量が可能な基質とを構成成分として含有する、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体活性の測定に用いるためのキット（以下、「本件測定キット」ということがある）であり、本件測定キットは、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体活性の測定に用いるためのキットに関する用途発明であり、かかるキットは、一般にこの種の測定キットに用いられる成分、例えば、担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤、増感剤、希釈液の他、取扱説明書、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体活性を測定するための説明書等の添付文書を含んでもよい。

本明細書において、「ＴＳＨ受容体阻害性自己抗体」とは、ＴＳＨ受容体を直接的又は間接的に阻害（不活性化）できる自己抗体、例えば、ＴＳＨのＴＳＨ受容体への結合を直接的又は間接的に阻害するアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト作用を有する抗ＴＳＨ抗体［ＴＳＢＡｂ］）を意味する。

本明細書において、「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。

上記ｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（文献「Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.」参照）を挙げることができ、本実施例において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。また、上記ｃＡＭＰバイオセンサーとしては、ｃＡＭＰに対する特異性が、ｃＧＭＰに対する特異性よりも高いものが好ましく、ここで、ｃＡＭＰに対する特異性を１としたときのｃＧＭＰの特異性は、例えば、１／１０以下、好ましくは１／３０以下、より好ましくは１／６０以下、さらに好ましくは１／１００以下である。

上記哺乳動物細胞としては、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が、一過的（transient）又は安定的（stable）に発現する哺乳動物細胞であればよく、外来性のｃＡＭＰバイオセンサーを発現し、かつ、内在性のＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞（例えば、哺乳類甲状腺細胞）であっても、外来性のｃＡＭＰバイオセンサーを発現し、かつ、外来性のＴＳＨ受容体を発現する哺乳類非甲状腺細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］、ヒト骨肉腫細胞株［Ｕ２ＯＳ細胞］）であってもよい。中でも、GloSensor cAMP（Promega社製）と組み合わせた際に高い発光値やシグナル誘導倍率を示すことから、ヒト胎児腎細胞由来細胞株が好ましい。

上記哺乳動物細胞としては、Ｇタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトした細胞株であってもよく、具体的にはＧＮＡＬ遺伝子（Ｇαｏｌｆタンパク質をコードする遺伝子）をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよく、ＧＮＡＳ遺伝子（Ｇαｓタンパク質をコードする遺伝子）をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよく、これら両方の遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよい。同時に、上記哺乳動物細胞としては、外来性のＧタンパク質、具体的には外来性のＧαｓ、あるいはＧαｉ、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１２とのキメラＧαｓを発現した哺乳動物細胞であってもよい。ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体に起因する甲状腺疾患においては、複数のＧタンパク質が活性化される可能性が示唆されているが、上記遺伝子のノックアウト及び／又は外来性Ｇタンパク質あるいはキメラＧタンパク質の発現により、細胞中で発現するＧタンパク質を選択し、各Ｇタンパク質の活性化について詳細な調査が可能となることから、本発明はＧＰＣＲ活性化後の各シグナル伝達経路におけるシグナル強度の調査ツールとして有用である。

ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞としては、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子にヌクレオチドを挿入したり、前記ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子のヌクレオチドを欠失することにより、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊した哺乳動物細胞であればよく、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊するために、相同組換えを利用してヌクレオチドを欠失させたり挿入したりすることにより遺伝子を破壊する方法を用いてもよいが、費用対効果や時間対効果の観点から、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（文献「Urnov, F.D. et al (2010) Nature Review Genetics. 11, 636-646」）や、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを改良したタンパク質（特開２０１３－９４１４８号公報）や、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；single-guide RNA）とＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（文献「Cong et al (2013) Science 339, 819-823」）等を用いて、ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子領域の２本鎖ＤＮＡを切断し、相同組換え修復時にヌクレオチドの欠失や挿入が起こることを利用して遺伝子を破壊する方法（遺伝子ターゲッティング法）を用いることが好ましく、特にｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子ターゲッティング法を用いることがより好ましい。

なお、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊する際、標的とするヌクレオチド配列を選択するために、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにリンクし、以下のGene IDを基に、ヒト由来のＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子の塩基配列情報を参照したり、これら遺伝子のオーソログ遺伝子（チンパンジー、マウス、ラット、ウシ等）を参照することができる。
ＧＮＡＳ遺伝子（Gene ID2778）
ＧＮＡＬ遺伝子（Gene ID2774）

外来性のｃＡＭＰバイオセンサー、外来性のＴＳＨ受容体、及び／又は外来性のＧタンパク質、例えばＧαｓを発現する哺乳動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］のＩＥ［immediate early］遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０［Simian virus 40］の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子、ＴＳＨ受容体をコードする遺伝子、及び／又Ｇαｓをコードする遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子）を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。

本明細書において、哺乳動物細胞としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、又はヒト由来の細胞を好適に例示することができる。

上記血液試料としては、血液そのものや、血液から調製された血清又は血漿を挙げることができ、血清が好ましい。

上記ＴＳＨとしては、各種動物試料から抽出したものであっても良く、遺伝子組換法等によって人為的に合成されたものであっても良く、市販品を利用することも可能である。ＴＳＨの由来は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等などを例示することができ、中でも、ウシまたはヒト由来のＴＳＨを好適に例示することができる。これらＴＳＨの由来は、動物細胞上に発現させるＴＳＨ受容体の由来と同一であっても良く、異なっていても良い。

上記工程（ａ）において、哺乳動物細胞をインキュベートする方法としては、ＴＳＨ受容体阻害性自己抗体が、添加ＴＳＨによる哺乳動物細胞におけるＴＳＨ受容体の活性化を競合阻害し、かかる競合阻害により細胞内のｃＡＭＰ産生量がＴＳＨのみを添加したＴＳＢＡｂ無添加区と比べて低下し、ｃＡＭＰバイオセンサーに結合するｃＡＭＰ産生量がＴＳＢＡｂ無添加区に比べて低下し、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化を対象に比べて低下させることができる条件下でインキュベートする方法であればよく、インキュベート時間、インキュベート温度、インキュベート用液の種類等の条件は、哺乳動物細胞の性質や、測定対象の活性化レベルの性質も考慮して適宜選択することができる。

上記インキュベート時間は、例えば、５分～２時間の範囲内、好ましくは１０分～１．５時間の範囲内、より好ましくは２０分～１時間の範囲内であり、上記インキュベート温度は、例えば、１４～４０℃の範囲内であり、好ましくは２０～３８℃の範囲内である。

上記インキュベート用液としては、例えば、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を含有する生理的水溶液、無血清の生理的水溶液を挙げることができる。かかる生理的水溶液としては、例えば、哺乳動物細胞培養用培養液；生理食塩水；リン酸緩衝化生理食塩水；トリス緩衝化生理食塩水；ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；５％グルコース水溶液を挙げることができる。また、上記哺乳動物細胞培養用培養液としては、具体的には、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＡＩＭ－Ｖ等を挙げることができる。また、上記無血清の哺乳動物細胞培養用培養液としては、例えば、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１～３０％）添加した上記哺乳動物細胞培養用培養液を挙げることができる。さらに、インキュベート用液としては、特許文献１等のｃＡＭＰ検出系に関する公知文献にて慣用されている、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、3-イソブチル-1-メチルキサンチン［ＩＢＭＸ］やテオフィリン等）を含有したものであってもよいが、ホスホジエステラーゼ阻害剤の存在により、バックグラウンドの値が高くなり、十分なＳ／Ｎ比が確保されず、定量的な測定が困難になる場合は、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含有しないものが好ましい。

上記インキュベート用液には、可視化（イメージング）及び／又は定量が可能なｃＡＭＰバイオセンサーに対する基質や触媒等が含まれる。例えば、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがアルカリホスファターゼの場合、上記インキュベート用液には、ｐ－ニトロフェニルリン酸等の基質が含まれ、LabAssay ALP（和光純薬工業社製）、QuantiChrom Alkaline Phosphatase Assay Kit（フナコシ社製）等の市販品を用いて、かかるインキュベート用液を調整してもよい。また、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがβ－Ｄ－ガラクトシダーゼである場合、上記インキュベート用液には、Ｘ－ｇａｌ(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside)、ＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）等の基質が含まれ、Ｘ－ｇａｌ（TaKaRa社製）、β-Galactosidase Enzyme Assay System（Promega社製）等の市販品を用いて、かかるインキュベート用液を調整してもよい。また、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがルシフェラーゼである場合、上記インキュベート用液には、ルシフェリン、セレンテラジン等の基質が含まれ、GloSensor cAMP Reagent stock solution（Promega社製）等の市販品を用いて、かかるインキュベート用液を調整してもよい。なお、上記インキュベート用液には、上記基質の他、触媒（例えば、ＡＴＰ、マグネシウム）を添加してもよいが、哺乳動物細胞内にこれら触媒が十分ある場合は、添加しなくてもよい。

上記工程（ａ）において、哺乳動物細胞、ＴＳＨおよび血液試料とは、上記インキュベート用液を含む容器（例えば、マルチウエルプレート、培養皿［シャーレ、ディッシュ］、フラスコ）内で接触させることができる。具体的には、ＴＳＨおよび血液試料を予め上記インキュベート用液中に添加・混合した後、かかる液を哺乳動物細胞に添加してもよいし、ＴＳＨおよび血液試料を、哺乳動物細胞を含む上記インキュベート用液に添加・混合してもよい。哺乳動物細胞は、インキュベート用液で平衡化処理を行ってもよいし、時間対効果を得る観点から、平衡化処理を行わなくてもよい。平衡化処理時間としては、例えば、５分以上、１０分以上、３０分以上であり、２．５時間以下、２時間以下、又は１時間以下である。すなわち、平衡化処理時間としては、例えば、５分～２．５時間の範囲内、１０分～２時間の範囲内、３０分～６０分の範囲内である。また、平衡化処理の温度は、例えば、１４～４０℃の範囲内であり、好ましくは２０～３８℃の範囲内である。

本工程（ａ）は、工程全体を通じ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度５％以下の条件下で行う。より具体的には、ＰＥＧ濃度は４％以下、３％以下、２％以下または１％以下であってもよく、ＰＥＧを全く含有しない条件であっても良い。

上記工程（ｂ）において、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する方法は、測定対象の活性化レベルの性質に合わせて適切な方法を適宜選択することができ、例えば、活性化レベルが、ｐ－ニトロフェニルリン酸を基質として用いたアルカリホスファターゼの活性化レベルである場合、アルカリホスファターゼにより分解されるｐ－ニトロフェノール（４０５ｎｍ）の吸光度を、分光光度計により測定する方法を挙げることができる。また、活性化レベルが、ＯＮＰＧを基質として用いたβ－Ｄ－ガラクトシダーゼの活性化レベルである場合、β－Ｄ－ガラクトシダーゼにより分解されるｏ-ニトロフェノール（２０ｎｍ）の吸光度を、分光光度計により測定する方法を挙げることができる。また、活性化レベルが、ルシフェリンを基質として用いたルシフェラーゼの活性化レベルである場合、ルシフェラーゼにより生じる発光を、ルミノメーターにより測定する方法を挙げることができる。また、活性化レベルが、蛍光タンパク質の蛍光レベルである場合、蛍光レベルを蛍光顕微鏡で測定する方法を挙げることができる。

上記工程（ｂ）において、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを、複数（例えば、少なくとも２つ、少なくとも４つ、少なくとも６つ、少なくとも８つ、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２８、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３４、少なくとも３６、少なくとも３８、少なくとも４０）の時点で測定することにより、活性阻害レベルの経時変化を測定することができる。活性阻害レベルの経時変化を測定するときの時点と時点の間の時間としては、特に制限されず、例えば、１～６０秒の範囲内、１～６０分の範囲内、１～２時間の範囲内である。また、活性阻害レベルの経時変化を測定するときの時点と時点の間隔としては、等間隔であっても、不等間隔であってもよい。

本工程（ｂ）は、工程全体を通じ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度５％以下の条件下で行う。より具体的には、ＰＥＧ濃度は４％以下、３％以下、２％以下または１％以下であってもよく、ＰＥＧを全く含有しない条件であっても良い。

上記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、阻害性自己抗体の阻害活性を算定する。すなわち、測定系にＴＳＨを添加することによりＴＳＨ受容体が活性化されると、ｃＡＭＰが産生され、ｃＡＭＰバイオセンサーが活性化する一方、試料中に阻害性自己抗体が含まれるときには、ＴＳＨによるＴＳＨ受容体の活性化を阻害性自己抗体が競合的に阻害するために、ｃＡＭＰの産生量は減少し、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルが、対照と比べて相対的に低下する。

より具体的な例としては、下記のような方法で阻害レベルを算出することが可能である。この例では、例えば下記［Ａ］～［Ｄ］のような試験区を設ける。
［Ａ］試料及びＴＳＨ添加区（インキュベート用液＋ＴＳＨ＋試料）
［Ｂ］試料及びＴＳＨ非添加区（インキュベート用液＋試料）
［Ｃ］対照溶液及びＴＳＨ添加区（インキュベート用液＋ＴＳＨ）
［Ｄ］対照溶液及びＴＳＨ非添加区（インキュベート用液）

［Ａ］～［Ｄ］それぞれの試験区について、上記工程（ａ）～（ｂ）によるｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベル測定を実施する。それぞれの活性化レベル（分光光度計によるＲＬＵ測定値など）を下記式に当てはめることにより、阻害性自己抗体による阻害率を算出することができる。

（計算式１）
阻害率（％）＝｛１－（［Ａ］活性化レベルー［Ｂ］活性化レベル｝）／（［Ｃ］活性化レベル－［Ｄ］活性化レベル）｝×１００

第２の具体例では、試験区［Ｅ］～［Ｈ］を下記のように設定する。
［Ｅ］試料及びＴＳＨ添加区（インキュベート用液＋ＴＳＨ＋試料）
［Ｆ］試料及びＴＳＨ非添加区（インキュベート用液＋試料）
［Ｇ］対照試料及びＴＳＨ添加区（インキュベート用液＋ＴＳＨ＋健常者由来試料）
［Ｈ］対照試料及びＴＳＨ非添加区（インキュベート用液＋健常者由来試料）

［Ｅ］～［Ｈ］それぞれの試験区について、上記工程（ａ）～（ｂ）によるｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベル測定を実施する。それぞれの活性化レベル（分光光度計によるＲＬＵ測定値など）を下記式に当てはめることにより、阻害性自己抗体による阻害率を算出することができる。

（計算式２）
阻害率（％）＝｛１－（［Ｅ］活性化レベルー［Ｆ］活性化レベル｝）／（［Ｇ］活性化レベル－［Ｈ］活性化レベル）｝×１００

上記工程（ｃ）によって、目的試料における上記阻害率（％）を算出し、これを対照における阻害率と比較することができる。対照と目的試料の関係としては、例えば対照として健常者より採取された試料、目的試料として被験者由来の試料を用い、両者の阻害率を比較したり、被験者から経時的に数点の試料を採取し、0時間時点で採取された試料を対象に、阻害率の経時的変化を追うことも可能である。

対照に比べ、目的試料における阻害率が高いときは、被験者由来の試料中には、対照よりもＴＳＨ受容体に対して阻害性を示す時抗体の割合が多い、及び／または、対照よりもＴＳＨ受容体に対して刺激性を示す自己抗体の割合が少ない阻害性自己抗体と判断できる。

上記工程（ｃ）において、対照における活性化レベルは、本件測定方法を実施する際、対照から採取された血液試料を基に、その都度測定した値であってもよいが、予め測定した値であってもよい。また、比較する両者（被験者における活性化レベル、及び対照における活性化レベル）は、実質的に同じ方法により調製された血液試料や、実質的に同じ活性化レベルの測定方法により得られたものが好ましい。

本件測定キットにおいて、ｃＡＭＰバイオセンサーの可視化及び／又は定量が可能な基質としては、例えば、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがアルカリホスファターゼの場合、ｐ－ニトロフェニルリン酸を挙げることができ、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがβ－Ｄ－ガラクトシダーゼである場合、Ｘ－ｇａｌ(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside)、ＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）を挙げることができ、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがルシフェラーゼである場合、ルシフェリン、セレンテラジンを挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、細胞培養は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤ－ＭＥＭ培養液中で、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃条件下）内で行った。

以下、本願発明を実施例等により説明するが、本願発明はこれらによって何ら制限されるものではない。

（実施例１）ＴＳＢＡｂ測定におけるＰＥＧの影響
ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを指標として、ＴＳＨ阻害性自己抗体の阻害活性を定量する際の、ＰＥＧ有無による測定への影響を検討した。

（１－１）ヒトＴＳＨ受容体発現細胞の作製
公知文献（ＷＯ２０２０／０５０２０８）の記載を参考に、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒｃＡＭＰ、すなわちホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質を発現するプラスミドベクター（ｐＧｌｏＳｅｎｓｏ－２２Ｆ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と、ヒトＴＳＨ受容体タンパク質を発現するｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＴＳＨＲ）とを、ＦｕＧＥＮＥＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒｃＡＭＰＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付のプロトコルに従って、ヒト胎児腎細胞由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）へトランスフェクションすることによって、測定に用いる組換ＨＥＫ２９３細胞を作製した。

（１－２）ＰＥＧ濃度によるＴＳＢＡｂ測定結果への影響評価
対象試料としては、ＴＳＢＡｂ高値であることがすでに知られている血清試料６例（陽性Ｐ８，Ｐ９，Ｐ１０，Ｐ１１，Ｐ１３，Ｐ１４）およびＴＳＢＡｂ量が健常であることが知られる血清６例（健常２７５，２７６，２７７，２７８，２８０，２８２）を使用した。試験区としては、下記４パターンを調製した。

［Ａ］試料各種及びＴＳＨ添加区（インキュベート用液＋ＴＳＨ＋試料）
［Ｂ］試料各種及びＴＳＨ非添加区（インキュベート用液＋試料）
［Ｃ］対照試料及びＴＳＨ添加区（インキュベート用液＋ＴＳＨ＋健常者由来試料）
［Ｄ］対照試料及びＴＳＨ非添加区（インキュベート用液＋健常者由来試料）

試料、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｈｕｍａｎＴＳＨおよび細胞液の調製には、１×Ｈａｎｋ’ｓＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）による希釈液に３，５，７，１０％相当のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を配合した希釈液、またはＰＥＧを全く配合しない（０％）希釈液を用いた。なお、試料は上記希釈液にて４倍希釈したものを測定に用いた。

下記（１）～（７）の手順に従い、ルシフェラーゼ活性レベルを測定した。
（１）調製済の各試料を、９６ｗｅｌｌｗｈｉｔｅｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に２５μＬずつ分注する。
（２）前記９６ｗｅｌｌｗｈｉｔｅｐｌａｔｅに、各濃度のｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔヒト由来ＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）を２５μＬずつ分注する。
（３）ＧｌｏＳｅｎｓｏｒｃＡＭＰＲｅａｇｅｎｔ含有希釈液２ｍＬに、ＴＳＨＲ組換ＨＥＫ２９３細胞液を１．２５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように加えてよく混合し、調製済細胞液を作製する。
（４）室温で遮光し、５分間静置する。
（５）工程（３）で得た調製済細胞液を前記９６ｗｅｌｌｗｈｉｔｅｐｌａｔｅに１００μＬずつ分注する。
（６）８００ｒｐｍで３０秒間撹拌する。
（７）２５℃で遮光し、２０分、３０分、４０分、６０分または１２０分間静置して反応させた。それぞれの反応時間におけるルシフェラーゼ活性レベルを、Ｇｌｏｍａｘ発光プレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定する。

ルシフェラーゼ活性の測定結果をもとに、下記計算式を用いてＴＳＢＡｂ阻害率（％）を算出した。

ＴＳＢＡｂ阻害率（％）＝｛１－（［Ａ］のＲＬＵ－［Ｂ］のＲＬＵ）／［Ｃ］のＲＬＵ－［Ｄ］のＲＬＵ）｝×１００

各反応時間におけるＴＳＢＡｂ阻害率（％）の算出結果を表１～５および図１～５に示す。

なお、上記算出された値について、一部ＴＳＢＡｂ阻害率が負の値となっている項が存在するが、ＴＳＢＡｂ阻害率％は健常例あるいは緩衝液に対する試験検体のＴＳＨの阻害率を示しているものであることから、阻害率が負の値になるとは考えられず、従って実務上は阻害率０％として扱う。

当該原則に従い、健常例における阻害率が測定上負の値となった場合は、これを０％として考えると、ＰＥＧを含まない条件（０％）およびＰＥＧ３％、ＰＥＧ５％条件では、反応時間２０分の時点で、健常例の阻害率は１％以下であるのに対し、いずれのＴＳＢＡｂ高値血清も阻害率１０％以上と両者を判別可能であった。反応時間をさらに長く設定した場合においても、健常例とＴＳＢＡｂ高値血清の阻害率は変動するものの、両者の判別が可能であった。

これに対しＰＥＧ７％の条件下では、反応時間１２０分の場合は、健常例とＴＳＢＡｂ高値血清Ｐ１１の判別が可能であるのに対し、反応時間２０分の場合は、健常血清とＴＳＢＡｂ高値血清Ｐ１１の間で差がみられず、両者を判別することはできなかった。

ＰＥＧ１０％の条件下では、いずれの反応時間でも健常例とＴＳＢＡｂ高値血清Ｐ１１の判別は不能であった。また、反応時間１２０分の場合は、健常例とＴＳＢＡｂ高値血清Ｐ１０の判別が可能であったのに対し、反応時間が６０分以下の場合では、健常血清とＴＳＢＡｂ高値血清Ｐ１０の間で阻害率に差がみられず、両者を判別することはできなかった。

以上の検討結果から、測定時のＰＥＧ濃度７％以上の高濃度の条件下で、６０分以下という短時間での反応におけるＴＳＢＡｂ阻害の検出を行うことはできないことが明らかになった。

Claims

ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼ及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料およびＴＳＨの存在下でインキュベートする工程（ａ）；
工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼの活性化レベルを測定する工程（ｂ）；及び、
工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較することで、試料中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体の活性を算定する工程（ｃ）；
の工程（ａ）～（ｃ）を含む、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体活性測定方法であって、工程（ａ）のインキュベート時間が６０分以下であり、かつすべての工程をＰＥＧ濃度５％以下の条件下で行うことを特徴とする、阻害性自己抗体活性の測定法。
ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼ及びＴＳＨ受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を、被験者から採取された血液試料およびＴＳＨの存在下でインキュベートする工程（ａ）；
工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼの活性化レベルを測定する工程（ｂ）；及び、
工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較することで、試料中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体の活性を算定する工程（ｃ）；
の工程（ａ）～（ｃ）を含む、哺乳動物細胞中のＴＳＨ受容体に対する阻害性自己抗体活性測定方法であって、工程（ａ）のインキュベート時間が６０分以下であり、かつすべての工程をＰＥＧの非存在下で行うことを特徴とする、阻害性自己抗体活性の測定法。