JP2014529993A - 自己抗体を検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(thyroid hormone blocking immunoglobulin)(TBI)を検出するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、TBIに対して高感度であり、かつ特異的であり、TBIおよび甲状腺刺激免疫グロブリン(TSI)の両方の二重検出に使用されてもよい。本発明の組成物および方法は、TBIおよび/またはTSIの存在と関連する疾患の診断に、疾患および/または処置レジメン、治療薬、ワクチンなどの進行をモニターするのに、ならびに臨床医が処置決定を下すのを支援するのに有用である。
かなりの数の人口が、グレーブス病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症(新生児甲状腺機能低下症を含む)、非甲状腺腫性甲状腺機能低下症、甲状腺機能正常または甲状腺機能低下自己免疫性甲状腺炎、原発性粘液水腫、および特発性粘液水腫を含む甲状腺疾患に罹患している。これらの疾患は、甲状腺上に存在する受容体を認識し、かつそれらに結合する自己抗体(甲状腺阻害免疫グロブリン(TBI)および/または甲状腺刺激免疫グロブリン(TSI))の作用を伴い、甲状腺ホルモンの産生における望ましくない変化をもたらす。
本発明は、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を検出するための方法であって、a)i)1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、1)cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および2)構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体(TSHR)遺伝子を含み、であって、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ii)甲状腺刺激ホルモン(TSH)、iii)コントロールサンプル、ならびにiv)試験サンプル、を提供するステップ、b)トランスジェニック細胞およびTSHを、i)該コントロールサンプルと接触させて第1のサンプルを生成し、およびii)該第2のサンプルをもたらす試験サンプルと接触させて第2のサンプルを生成するステップであって、該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびにc)該第1のサンプルおよび該第2のサンプルにおける該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。一実施形態において、TBIを検出する方法が、キメラTSHRを発現するトランスジェニック細胞を野生型TSHRを発現する細胞で置換するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBI IC50の5〜15分の一のTBI IC50を有する。他の実施形態において、TBIを検出する方法が、抗TBIモノクローナル抗体とTBIの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBI IC50の10〜30分の一のTBI IC50を有する。さらなる実施形態において、方法が、第1のサンプルと比較して、第2のサンプルにおいて、レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む。さらに他の実施形態において、方法が、a)試験サンプルと接触させた後のレポーター遺伝子の発現のレベルを、b)それぞれが既知濃度のTSHを含有する1つ以上の標準サンプルとトランスジェニック細胞を接触させた後のレポーター遺伝子の発現のレベルと比較することによって、試験サンプルにおけるTBIのレベルを決定するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、方法が、TBI特異的である。他の実施形態において、TSHが、100mIU/ml未満の濃度を有する。代替の実施形態において、レポーター遺伝子の発現が、生物発光タンパク質の発現を含む。さらなる実施形態において、生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03を含む。他の実施形態において、トランスジェニック細胞が、CHO−MC4細胞およびRD−MC4細胞から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態において、TSHが、甲状腺刺激モノクローナル抗体および/または甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる。
本発明は、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を検出するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、TBIに対して高感度であり、かつ特異的であり、TBIおよび甲状腺刺激免疫グロブリン(TSI)の両方の二重検出に使用されてもよい。本発明の組成物および方法は、TBIおよび/またはTSIの存在と関連する疾患の診断に、疾患および/または処置レジメン、治療薬、ワクチンなどの進行をモニターするのに、ならびに臨床医が処置決定を下すのを支援するのに有用である。
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態および態様を実証し、かつさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されないものとする。
サンプルにおけるTBIを検出するための方法
1.1枚の黒色平/透明底96ウェルプレートを、100μl/ウェルの細胞付着溶液によりコーティングする(たとえば米国特許出願公開第2008−0187942号明細書において記載されており、Quidel Corp.&Diagnostic Hybrids,Inc.、Ohio、USAからThyretain(商標)細胞付着溶液として市販で入手可能である)。溶液を30秒間、ウェル上でそのままにし、次いで、溶液をデカントする。
2.5mlのThyretain(商標)増殖培地に、CHO MC4細胞の1本のフリーザーバイアルを追加する(たとえば米国特許出願公開第2008−0187942号明細書において記載されており、Quidel Corp.&Diagnostic Hybrids,Inc.、Ohio、USAからThyretain(商標)増殖培地として市販で入手可能である)。
3.48ウェルフォーマット中に100μl/ウェルで細胞を置く(プレートの一番上および一番下の行ならびにプレートの左手および右手の最初の2列を抜かす)。
4.37℃で16〜18時間、細胞のプレートをインキュベートする。
5.一晩の増殖期間の終わりに、コンフルエンスについて細胞を顕微鏡で調査し、細胞に混入物がないことを確認する。プレートをインキュベーターに戻す。
6.400μIU/ml bTSH(これは、それぞれのウェルにおいてbTSHの100μIU/ml最終濃度を可能にするであろう)を調製する。これが作業用ストックとなる。
7.bTSHによりそれぞれのサンプルの1:11希釈液を調製する−−40μLのそれぞれのサンプル、220μLの400μIU/ml bTSH、および180μL Thyretain(商標)反応バッファー(たとえば米国特許出願公開第2008−0187942号明細書において記載されており、Quidel Corp.&Diagnostic Hybrids,Inc.、Ohio、USAからThyretain(商標)反応バッファーとして市販で入手可能である)。
8.反応バッファーにおいて、正常血清を1:11に希釈することによって、ブランクコントロールを調製する(40μL血清および400μL反応バッファー)。
9.40μlの正常血清、220μlの400μIU/ml bTSH、および180μL Thyretain(商標)反応バッファーを希釈することによって、bTSHコントロールを調製する。注:プレートはまた、好ましくは、Thyretain(商標)反応バッファーのみを含有する反復ウェルを含有する。
10.インキュベーターからプレートを取り出し、100μl/ウェルのThyretain(商標)反応バッファーにより細胞をすすぎ、次いで、それを細胞に再度供給する。
11.100μl/ウェルで三通り、細胞に、調製したサンプルを追加する。
12.3時間、37℃で、細胞をインキュベートする。
13.3時間のインキュベーション後に、すべてのウェルの内容物をデカントする。
14.それぞれのウェルに75μl/ウェルBright−Glo(商標)を追加する。
15.10分間、室温で細胞をインキュベートし、次いで、Veritas(商標)プレート読み取り装置上でプレートを読み取る。
キメラTSHRは、TBIを検出する際に、野生型TSHRよりも有用である
本発明のTBIアッセイの感度は、Kronus(商標)ELISAアッセイなどのような競合的結合方法よりも高い
本発明のTBIアッセイの感度
本発明のTBIアッセイの特異度
本発明の二重バイオアッセイ方法は、TBIおよびTSIの両方をうまく検出することができる
B.171 TSIポジティブ血清サンプルを使用するTSIおよびTBIアッセイの間の相関
本発明の二重バイオアッセイ方法は、甲状腺を刺激するものおよび甲状腺の刺激を阻害するものに、抗TSHR自己抗体を区別することができる
TBIおよび/またはTSIを検出するための本発明の二重バイオアッセイの感度
ロールサンプルをさらに含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺刺激ホルモン(TSH)をさらに含む。さらなる実施形態において、キットが、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を検出するための説明書をさらに含む。他の実施形態において、キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を検出するための方法であって、
a)
i)1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
1)cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子、および
2)構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体(TSHR)遺伝子
を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、
ii)甲状腺刺激ホルモン(TSH)、
iii)コントロールサンプル、ならびに
iv)試験サンプル、
を提供するステップ、
b)前記トランスジェニック細胞および前記TSHを、
i)該コントロールサンプルと接触させて第1のサンプルを生成し、および
ii)該試験サンプルと接触させて第2のサンプルを生成するステップであって、
該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
c)該第1のサンプルおよび該第2のサンプルにおける該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示す、ステップを含む方法。
(項目2)
TBIを検出する前記方法が、前記キメラTSHRを発現する前記トランスジェニック細胞を、野生型TSHRを発現する細胞で置換するステップを含む前記方法においてTBIを検出する場合のTBI IC 50 の5〜15分の一の該TBI IC 50 を有する、項目1に記載の方法。
(項目3)
TBIを検出する前記方法が、抗TBIモノクローナル抗体とのTBIの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBI IC 50 の10〜30分の一のTBI IC 50 を有する、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記方法が、前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記方法が、
a)前記試験サンプルとの前記接触の後の前記レポーター遺伝子の発現のレベルを、
b)それぞれが既知濃度のTSHを含有する1つ以上の標準サンプルと前記トランスジェニック細胞を接触させた後の該レポーター遺伝子の発現のレベルと
比較することによって、該試験サンプルにおけるTBIのレベルを決定するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記方法が、TBI特異的である、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記TSHが、100mIU/ml未満の濃度を有する、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記レポーター遺伝子の前記発現が、生物発光タンパク質の発現を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03を含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記トランスジェニック細胞が、CHO−MC4細胞およびRD−MC4細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記TSHが、甲状腺刺激モノクローナル抗体で置き換えられる、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記TSHが、甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる、項目1に記載の方法。
(項目13)
試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)および甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を検出するための方法であって、
a)
i)1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
1)cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および
2)構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体(TSHR)遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、
ii)甲状腺刺激ホルモン(TSH)、
iii)コントロールサンプル、ならびに
iv)試験サンプル、
を提供するステップ、
b)該トランスジェニック細胞および該TSHを、
i)該コントロールサンプルと接触させて、第1のサンプルを生成し、および
ii)該試験サンプルと接触させて、第2のサンプルを生成するステップであって、
該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
c)該接触前および該接触後の、該トランスジェニック細胞における該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、
i)該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示し、
ii)該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが上昇していることが、該試験サンプルにおけるTSIの存在を示す、ステップを含む方法。
(項目14)
前記方法が、前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記トランスジェニック細胞が、CHO−MC4細胞およびRD−MC4細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目13に記載の方法。
(項目16)
キットであって、
a)1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
i)cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および
ii)構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体(TSHR)遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ならびに
b)甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を検出するために該トランスジェニック細胞を使用するための説明書
を備えるキット。
(項目17)
前記キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、項目16に記載のキット。
(項目18)
前記キットが、甲状腺刺激ホルモン(TSH)をさらに含む、項目16に記載のキット。
(項目19)
前記キットが、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を検出するための説明書をさらに含む、項目16に記載のキット。
(項目20)
前記キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、項目19に記載のキット。
Claims (20)
- 試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を検出するための方法であって、
a)
i)1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
1)cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子、および
2)構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体(TSHR)遺伝子
を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、
ii)甲状腺刺激ホルモン(TSH)、
iii)コントロールサンプル、ならびに
iv)試験サンプル、
を提供するステップ、
b)前記トランスジェニック細胞および前記TSHを、
i)該コントロールサンプルと接触させて第1のサンプルを生成し、および
ii)該試験サンプルと接触させて第2のサンプルを生成するステップであって、
該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
c)該第1のサンプルおよび該第2のサンプルにおける該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示す、ステップを含む方法。 - TBIを検出する前記方法が、前記キメラTSHRを発現する前記トランスジェニック細胞を、野生型TSHRを発現する細胞で置換するステップを含む前記方法においてTBIを検出する場合のTBI IC50の5〜15分の一の該TBI IC50を有する、請求項1に記載の方法。
- TBIを検出する前記方法が、抗TBIモノクローナル抗体とのTBIの特異的な結合を検出するステップを含む方法においてTBIを検出する場合のTBI IC50の10〜30分の一のTBI IC50を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、
a)前記試験サンプルとの前記接触の後の前記レポーター遺伝子の発現のレベルを、
b)それぞれが既知濃度のTSHを含有する1つ以上の標準サンプルと前記トランスジェニック細胞を接触させた後の該レポーター遺伝子の発現のレベルと
比較することによって、該試験サンプルにおけるTBIのレベルを決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記方法が、TBI特異的である、請求項1に記載の方法。
- 前記TSHが、100mIU/ml未満の濃度を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子の前記発現が、生物発光タンパク質の発現を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生物発光タンパク質が、レニラルシフェラーゼアミノ酸配列の配列番号03を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記トランスジェニック細胞が、CHO−MC4細胞およびRD−MC4細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記TSHが、甲状腺刺激モノクローナル抗体で置き換えられる、請求項1に記載の方法。
- 前記TSHが、甲状腺刺激ポリクローナル抗体で置き換えられる、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルにおける甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)および甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を検出するための方法であって、
a)
i)1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
1)cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および
2)構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体(TSHR)遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、
ii)甲状腺刺激ホルモン(TSH)、
iii)コントロールサンプル、ならびに
iv)試験サンプル、
を提供するステップ、
b)該トランスジェニック細胞および該TSHを、
i)該コントロールサンプルと接触させて、第1のサンプルを生成し、および
ii)該試験サンプルと接触させて、第2のサンプルを生成するステップであって、
該接触が、該キメラTSHRに対する該TSHの結合のための条件下にある、ステップ、ならびに
c)該接触前および該接触後の、該トランスジェニック細胞における該レポーター遺伝子の発現のレベルを測定するステップであって、
i)該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることが、該試験サンプルにおけるTBIの存在を示し、
ii)該第1のサンプルと比較して、該第2のサンプルにおいて、該レポーター遺伝子の発現のレベルが上昇していることが、該試験サンプルにおけるTSIの存在を示す、ステップを含む方法。 - 前記方法が、前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプルにおいて、前記レポーター遺伝子の発現のレベルが低下していることを検出するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記トランスジェニック細胞が、CHO−MC4細胞およびRD−MC4細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項13に記載の方法。
- キットであって、
a)1つ以上の発現ベクターにより安定してトランスフェクトされたトランスジェニック細胞であって、該発現ベクターは、
i)cAMP誘導性プロモーターに対して作動可能に連結されたレポーター遺伝子および
ii)構成的プロモーターに対して作動可能に連結されたキメラTSH受容体(TSHR)遺伝子を含み、該細胞が、細胞膜上にキメラTSHRを発現する、トランスジェニック細胞、ならびに
b)甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を検出するために該トランスジェニック細胞を使用するための説明書
を備えるキット。 - 前記キットが、甲状腺ホルモン阻害免疫グロブリン(TBI)を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、請求項16に記載のキット。
- 前記キットが、甲状腺刺激ホルモン(TSH)をさらに含む、請求項16に記載のキット。
- 前記キットが、試験サンプルにおける甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を検出するための説明書をさらに含む、請求項16に記載のキット。
- 前記キットが、甲状腺ホルモン刺激免疫グロブリン(TSI)を含有するポジティブコントロールサンプルをさらに含む、請求項19に記載のキット。
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