KR101872060B1 - 자가항체를 검출하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 본 발명의 방법은 TBI에 민감하고 특이적이며, TBI 및 TSI 둘다의 이중 검출을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 TBI 및/또는 TSI의 존재와 관련된 질환의 진단을 위해, 질환 및/또는 치료 처방, 치료술, 백신 등의 진행을 모니터링하기 위해, 그리고 치료 결정을 함에 있어 임상의를 보조하기 위해 유용하다.

Description

자가항체를 검출하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AUTOANTIBODIES}
본 발명은 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 TBI에 민감하고 특이적이며, TBI 및 갑상선 자극 면역글로불린(TSI) 둘다의 이중 검출을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 TBI 및/또는 TSI의 존재와 관련된 질환의 진단을 위해, 질환 및/또는 치료 처방, 치료술, 백신 등의 진행을 모니터링하기 위해, 그리고 치료 결정을 함에 있어 임상의를 보조하기 위해 유용하다.
상당 수의 사람들이 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 갑상선기능항진증, 갑상선기능저하증(신생아 갑상선기능저하증 포함), 비갑상선종성 갑상선기능저하증, 갑상선기능정상 또는 갑상선기능부전 자가면역성 갑상선염, 일차성 점액수종 및 특발성 점액수종를 포함한 갑상선 질환을 앓고 있다. 이들 질환은 갑상샘 상에 존재하는 수용체를 인식하고 이에 결합하는 자가항체(갑상선 차단 면역글로불린(TBI) 및/또는 갑상선 자극 면역글로불린(TSI))의 작용을 수반하여, 갑상선 호르몬의 생성시 원치않은 변화를 초래한다.
이들 질환 중 몇몇 질환에 대한 진단 기법이 입수가능하지만, 이들 기법은 어렵고, 힘들고, 충분한 감도 및/또는 특이성이 결여되어 있다.
이에, 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI) 및/또는 갑상선 자극 면역글로불린(TSI)을 검출하기 위한 조성물 및 방법으로서, 민감하고 특이적이고 TBI 및 TSI 둘다의 이중 검출을 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 시험 샘플에서 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: a) i) 1) cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, 및 2) 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 TSH 수용체(TSHR) 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 세포가 세포막 상에서 키메라 TSHR을 발현하는 것인 세포, ii) 갑상선 자극 호르몬(TSH), iii) 대조 샘플, 및 iv) 시험 샘플을 제공하는 단계, b) 트랜스제닉 세포 및 TSH를 i) 대조 샘플과 접촉시켜 제1 샘플을 생성하고, ii) 시험 샘플과 접촉시켜 제2 샘플을 생성하는 단계로서, 접촉이 TSH의 상기 키메라 TSHR로의 결합을 위한 조건 하에 이루어지는 것인 단계, 및 c) 제1 샘플 및 제2 샘플에서 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 감소된 발현 수준이 시험 샘플에서 TBI의 존재를 나타내는 것인 단계. 일 실시양태에서, 상기 TBI 검출 방법은, 키메라 TSHR을 발현하는 트랜스제닉 세포를 야생형 TSHR을 발현하는 세포로 치환하는 단계를 포함하는 방법에서 TBI를 검출했을 때의 TBI IC50 보다 5배 내지 15배 더 작은 TBI IC50을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 TBI 검출 방법은, TBI와 항-TBI 단일클론 항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법에서 TBI를 검출했을 때의 TBI IC50 보다 10배 내지 30배 더 작은 TBI IC50을 갖는다. 추가 실시양태에서, 상기 방법은 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 감소된 발현 수준을 검출하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 a) 시험 샘플과의 접촉 후 리포터 유전자의 발현 수준을, b) 트랜스제닉 세포를, 각각 공지된 농도의 TSH를 함유하는 하나 이상의 표준 샘플과 접촉시킨 후 리포터 유전자의 발현 수준과 비교함으로써, 시험 샘플에서 TBI의 수준을 확인하는 단계를 더 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 방법은 TBI 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, TSH는 100 mIU/ml 미만의 농도를 가진다. 대안적인 실시양태에서, 리포터 유전자의 발현은 생물발광 단백질의 발현을 포함한다. 추가 실시양태에서, 생물발광 단백질은 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 아미노산 서열 서열번호:03을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 CHO-MC4 세포 및 RD-MC4 세포로부터 선택된 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, TSH는 갑상선 자극 단일클론 항체로 대체되고/되거나 갑상선 자극 다클론 항체로 대체된다.
본 발명은 부가적으로 시험 샘플에서 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI) 및 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 검출하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: a) i) 1) cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 및 2) 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 TSH 수용체(TSHR) 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 세포가 세포막 상에서 키메라 TSHR을 발현하는 것인 세포, ii) 갑상선 자극 호르몬(TSH), iii) 대조 샘플, 및 iv) 시험 샘플을 제공하는 단계, b) 트랜스제닉 세포 및 TSH를 i) 대조 샘플과 접촉시켜 제1 샘플을 생성하고, ii) 시험 샘플과 접촉시켜 제2 샘플을 생성하는 단계로서, 접촉이 TSH의 키메라 TSHR로의 결합을 위한 조건 하에 이루어지는 것인 단계, 및 c) 접촉 이전 및 접촉 이후에 트랜스제닉 세포에서 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, i) 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 감소된 발현 수준이 시험 샘플에서 TBI의 존재를 나타내고, ii) 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 증가된 발현 수준이 시험 샘플에서 TSI의 존재를 나타내는 것인 단계. 일 실시양태에서, 방법은 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 감소된 발현 수준을 검출하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 CHO-MC4 세포 및 RD-MC4 세포로부터 선택된 세포를 포함한다.
본원에서는 또한, a) i) cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, 및 ii) 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 TSH 수용체 (TSHR) 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 세포가 세포막 상에서 키메라 TSHR을 발현하는 것인 세포, 및 b) 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하기 위해 트랜스제닉 세포를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시양태에서, 키트는 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 함유하는 양성 대조 샘플을 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 갑상선 자극 호르몬(TSH)을 더 포함한다. 추가 실시양태에서, 키트는 시험 샘플에서 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 검출하기 위한 설명서를 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 함유하는 양성 대조 샘플을 더 포함한다.
도 1은 CHO-MC4 세포를 사용한 bTSH 용량 반응 곡선(dose response curve)을 도시한다.
도 2는 (A) 730개 아미노산 잔기를 함유하는 키메라 TSHR의 아미노산 서열 (서열번호:01), (B) 종결 코돈을 포함하여 2193개 염기를 함유하는 키메라 TSHR의 DNA 서열(서열번호:02), (C) 550개 아미노산을 함유하는 레닐라 루시퍼라제의 아미노산 서열(서열번호:03), 및 (D) 종결 코돈을 포함하여 1653개 염기를 함유하는 키메라 TSHR의 DNA 서열(서열번호:04)을 도시한다.
도 3: CHO-MC4 및 TSHRwt 세포(H10)에서 갑상선 차단 단일클론 항체(MAb) K1-70을 이용한 갑상선 차단 면역글로불린(TBI) 분석의 검출 감도의 비교.
도 4: MC4 및 H10 세포에서 차단 항체 함유 혈청을 이용한 TBI 분석의 검출 감도의 비교.
도 5: 갑상선 차단 단일클론 항체 K1-70 용량 반응 곡선의 비교: TBI 분석 대 TRAb 분석.
도 6: 연속 희석된(serial diluted) (A) 갑상선 자극 단일클론 항체 M22 또는 (B) TSI 양성 환자 혈청을 이용한 TBI 분석.
도 7: 171개 TSI 양성 혈청 샘플에 대한 TSI 및 TBI 분석 간의 상관관계.
도 8: 갑상선 자극 단일클론 항체 M22 및 갑상선 차단 단일클론 항체 K1-70의 상이한 비를 이용한 TBI 분석.
도 9: bTSH 대신 M22 단일클론 항체를 이용하여 실시된 TBI 분석.
도 10: bTSH 대 TSI-양성 혈청의 샘플 18HM 희석물을 이용한 TBI 분석. 혈청 샘플 18HM(TRAb 양성 및 TSI 음성)을 정상 혈청에서 1:44 내지 1:90112로 희석한 다음 A. bTSH (40 mIU/ml)와 혼합하거나 B. TSI 양성 혈청(4.54 ml/웰)과 혼합하였다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어들이 이하에서 정의된다.
용어 "트랜스제닉(transgenic)"은 세포를 언급하면서 사용시 전이유전자를 함유하거나, 또는 이의 게놈이 "전이유전자"의 도입에 의해 변경되어진 세포를 지칭한다. 트랜스제닉 세포는 핵산(일반적으로 DNA)을 포함하는 "전이유전자"를 표적 세포로의 도입 또는 인간 개입(intervention)에 의해 표적 세포의 염색체 중으로 전이유전자의 통합을 포함한 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "전이유전자(transgene)"는 실험 조작에 의해 세포에 도입되는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 전이유전자는 "내인성 DNA 서열" 또는 "이종 DNA 서열" (즉, "외래 DNA")일 수 있다. 용어 "내인성 DNA 서열"은, 천연 발생 서열에 비해 몇몇 변형(예를 들면, 점돌연변이, 선택성 마커 유전자의 존재, 등)을 함유하지 않는 한 도입되는 세포에서 천연적으로 발견되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "이종 DNA 서열"은 본래 결찰(ligation)되지 않거나 본래 다른 위치에서 결찰된 핵산 서열에 결찰되거나 결찰되도록 조작된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이종 DNA는 도입되는 세포에 내인성이 아니지만, 또 다른 세포로부터 얻어진다. 이종 DNA는 또한 몇몇 변형을 함유하는 내인성 DNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 비록 반드시 그러한 것은 아니지만, 이종 DNA는 발현되는 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는 RNA 및 단백질을 코딩한다. 이종 DNA의 예는 리포터 유전자, 전사 및 번역 조절 서열, 선택성 마커 단백질 (예를 들면, 약물 내성을 부여하는 단백질), 등을 포함한다.
"키메라," "융합" 및 "잡종(hybrid)" 서열 (예를 들면, 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열을 언급하는 경우)은 다양한 기원에서 유래한 부분들을 함유하는 서열을 지칭한다. 일 실시양태에서, 부분들은 동일한 유기체, 동일한 조직, 동일한 세포, 동일한 바이러스, 등으로부터의 다양한 단백질 및/또는 게놈 서열에서 유래할 수 있다. 일 실시양태에서, 키메라 단백질은 아미노산 서열을 코딩하는 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 발현하여 생산되는 재조합 단백질이다. 예를 들어, "키메라 TSH 수용체", "키메라 TSHR", 및 "키메라 MC4 수용체"는 상호교환적으로 다양한 유기체에서 유래한 아미노산 서열을 함유하는 TSHR을 지칭한다. 일 실시양태에서, 키메라 TSHR로는, 이미 개시된 바 있는(미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호, 2008년 8월 7일자 공개), 인간 TSHR(hTSHR)의 아미노산 잔기 262 - 335가 래트 황체형성 호르몬 융모성 고나도트로핀(LH/CG) 수용체에서 유래한 상응하는 73개 아미노산 잔기로 치환된 hTSHR 단백질 서열이 예시된다. 바람직한 실시양태에서, 키메라 MC4 수용체로는 DNA 서열(서열번호:02)(종결 코돈을 포함한, 2193개 염기쌍)에 의해 코딩되는 730개 아미노산 서열 서열번호:01(도 2A)이 예시된다.
"MC-4" 세포는 키메라 TSH 수용체를 발현하는 세포를 지칭한다. 예를 들면, "CHO-MC4" 세포 및 "RD-MC4" 세포는, 이미 개시된 바 있는(미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호, 2008년 8월 7일자 공개), 키메라 TSH 수용체를 발현하는 트랜스제닉 차이니즈 햄스터 난소 세포 및 트랜스제닉 인간 횡문근육암종 세포 각각을 지칭한다.
"리포터 서열" 및 "마커 서열"은 임의의 검출 시스템에서 검출가능한 DNA, RNA, 및/또는 폴리펩티드 서열을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 효소(예를 들면, ELISA, 및 효소 기반 조직화학 분석), 형광, 및 발광 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예시적인 리포터 유전자는, 예를 들면, β-글루쿠로니다제 유전자, 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, E. 콜라이 β-갈락토시다제(LacZ) 유전자, 할로박테리움(Halobacterium) β-갈락토시다제 유전자, 뉴로소라(Neuropsora) 티로시나제 유전자, 인간 태반 알칼라인 포스파타제 유전자, 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자, 에쿼린(Aequorin) (해파리 생물발광) 유전자, 아메리칸 반딧불(American firefly), 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)로부터의 반딧불 루시퍼라제(EC 1.13.12.7), 바다 팬지 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)로부터의 레닐라 루시퍼라제(EC 1.13.12.5), 및 포토박테리움 피세리(Photobacterium fischeri)로부터의 박테리아 루시퍼라제(EC 1.14.14.3)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 루시퍼라제 유전자는 레닐라 루시퍼라제 아미노산 서열인 서열번호:03을 코딩한다.
"생물발광 유전자" 에쿼린 (해파리) 생물발광 유전자 및 루시퍼라제 유전자와 같은 발광 반응을 촉진하는 단백질을 코딩하는 리포터 유전자를 지칭한다.
"루시퍼라제 유전자"는 아메리칸 반딧불, 포티누스 피랄리스로부터의 반딧불 루시퍼라제(EC 1.13.12.7), 바다 팬지 레닐라 레니포르미스로부터의 레닐라 루시퍼라제(EC 1.13.12.5), 및 포토박테리움 피세리로부터의 박테리아 루시퍼라제(EC 1.14.14.3)와 같은 발광 반응을 촉진하는 모노옥시게나제 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 루시퍼라제 유전자는 레닐라 루시퍼라제 아미노산 서열 서열번호:03을 코딩한다.
본원에서 사용된 "프로모터", "프로모터 요소", 또는 "프로모터 서열"은 목적 뉴클레오티드 서열에 결찰될 때 목적 뉴클레오티드 서열의 mRNA로의 전사를 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터는 전형적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 자신이 제어하는 mRNA로 전사되는 목적 뉴클레오티드 서열의 5' (즉, 상류)에 위치하고, RNA 폴리머라제에 의한 특이적 결합을 위한 부위 및 전사 개시를 위한 다른 전사 인자를 제공한다.
"유도성 프로모터"는 자극(예를 들면, 열충격, 화학물질, 등)의 부재 하에서와 비교해서 자극의 존재하에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 보다 높은 수준의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 예를 들면, "cAMP-유도성 프로모터"는 cAMP의 부재 하에서와 비교해서 cAMP의 존재 하에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 보다 높은 수준의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 예시적인 cAMP-유도성 프로모터는 PEPCK 프로모터(Roesler et al. (1998) The Journal of Biological Chemistry, 273, 14950-14957); 인간 사이클린 D2 프로모터의 번역 개시 부위에 대해 -294 위치에 위치된 cAMP-반응성 요소(CRE)를 함유하는 프로모터(Muniz et al. (2006) Biology of Reproduction 75(2): 279-288); 및 락테이트 데히드로게나제 A 서브유닛 프로모터의 cAMP-반응성 요소(CRE)를 함유하는 프로모터(Welfeld et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(12):6941-7)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 예시적인 cAMP-유도성 프로모터는 236 뉴클레오티드 글리코단백질 호르몬 알파 서브유닛 프로모터를 포함하며, 이는 2008년 8월 7일에 공개된 미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호에 기재된 바와 같이 사이클릭 AMP(cAMP) 조절 요소(CRE)(AF401991)를 함유한다.
"항시성(constitutive) 프로모터"는 자극(예를 들면, 열충격, 화학물질, 등)의 부재 하에서 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 연속 전사를 지시하는 프로모터를 지칭한다. 항시성 프로모터는 E. 콜라이(σ70, σS, σ32, σ54, 및 σA) 프로모터, B. 서브틸리스 σB 프로모터, 살모넬라 Pspv2 및 Pspv 프로모터, 박테리오파지 T7(T7 RNA 폴리머라제에 의해 인식됨), 박테리오파지 SP6(SP6 RNA 폴리머라제에 의해 인식됨), 효모(pAdh, ADH1, cyc1OO, pPGKl, pCYC) 프로모터, 및 SV40 프로모터를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항시성 프로모터는 SV40 프로모터이다.
"안정한 형질전환" 및 "안정한 형질감염" 및 이와 문법적인 동의어는 세포의 게놈 중으로 하나 이상의 목적 뉴클레오티드 서열의 도입 및 통합을 지칭한다. 따라서, "안정한 형질전환체"는, 안정한 형질전환체로부터의 게놈 DNA가 하나 이상의 목적 이종 뉴클레오티드 서열을 함유하지만, 일시(transient) 형질전환체로부터의 게놈 DNA가 목적 이종 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는다는 점에서 일시 형질전환체와 구별된다. 세포의 안정한 형질전환은 하나 이상의 목적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 핵산 서열을 가진 세포의 게놈 DNA의 서던 블랏 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 대안으로, 세포의 안정한 형질전환은 또한 목적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 세포의 게놈 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 검출될 수 있다.
"TBI", "갑상선 차단 면역글로불린", "갑상선 차단 항체"("TBAb"), "티로트로핀 수용체 차단 항체", "TSH 결합 억제 면역글로불린", "티로트로핀 결합 억제 면역글로불린"("TBII"), "차단 티로트로핀 수용체 항체" ("TSHRAb")는 갑상선 자극 호르몬 수용체(또한 "TSH 수용체" 또는 "TSHR" 또는 "티로트로핀 수용체"로서 지칭됨) 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고 이러한 수용체의 갑상선 자극 호르몬(TSH) 리간드로의 결합을 억제(즉, 감소)하는 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. TBI의 예로서 K1-70 단일클론 항체가 있다.
"TSI", "갑상선 자극 면역글로불린", "갑상선 자극 항체"("TSAb"), "자극 티로트로핀 수용체 항체"("TSHRAb")는 갑상선 자극 호르몬 수용체(또한 "TSH 수용체" 또는 "TSHR" 또는 "티로트로핀 수용체"로서 지칭됨) 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고 이러한 수용체의 갑상선 자극 호르몬(TSH) 리간드로의 결합을 자극(즉, 증가)하는 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 갑상선 자극 항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있다. 따라서, "갑상선 자극 단일클론 항체" 및 "단일클론 갑상선 자극 항체"는 상호교환적으로 TSH 결합 부위 내의 TSHR의 에피토프에 결합하는 단일클론 갑상선 자극 항체를 지칭하며, M22 항체가 예시된다.
"갑상선 자극 호르몬"("TSH")의 예로서, 문헌(Szkudlinski et al. (1996) Nat. Biotechnol.l4:1257- 1263)에 이미 개시된 바 있는 예시적인 아미노산 서열을 가진 인간 TSH(hTSH) 및 소 TSH(bTSH)가 있다.
"항체" 및 "면역글로불린"은 항원으로의 결합을 위한 "가변 도메인"(또한 "Fv 영역"으로 지칭됨)을 함유하는 글리코단백질(예를 들면, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 등) 및/또는 이의 일부를 지칭한다. 일 실시양태에서, 항체는 "다클론 항체," 즉, 혈장 세포(예를 들면, B-림프구)의 하나 초과의 클론에 의해 생성된 면역글로불린이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 "단일클론 항체" ("MAb"), 즉, 하이브리도마 세포의 단일 클론에 의해 생성된 면역글로불린이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 피험체에 의해 생성된 "자가항체"이고 동일 피험체에 의해 생성된 항원("자기 항원")과 결합할 수 있다.
"항원" 및 "면역원"은 분자를 언급하면서 사용될 때 특이적 체액성 면역 반응을 유도(가용성 항체 반응의 유도 포함)하고/하거나 세포-매개 면역 반응을 유도(CTL 반응의 유도 포함)할 수 있는 임의 물질을 지칭한다.
"특이적으로 결합하다" 및 "특이적 결합"은 분자(예를 들면, 펩티드)로의 항체의 결합 또는 펩티드로의 세포(예를 들면, T-세포)의 결합을 언급하면서 사용될 때 분자 상의 하나 이상의 에피토프와 항체 또는 세포의 상호작용을 지칭하는데, 여기서 상호작용은 분자 상의 특정 구조의 존재에 좌우된다. 예를 들면, 항체가 분자 상의 에피토프 "A"에 특이적이면, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 자유의, 표지되지 않은 A)를 함유하는 단백질의 존재가 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다. 일 실시양태에서, 분자로의 항체의 결합 수준은 "IC50", 즉 주어진 생물학적 공정, 또는 공정 성분(예를 들면, 효소, 항체, 세포, 세포 수용체, 미생물, 등)의 50% 억제를 달성하는 물질(예를 들면, 억제제, 길항제, 등)의 농도를 지칭하는 "반수최대억제농도(half maximal inhibitory concentration)"를 사용하여 결정된다. 이는 길항제 물질의 효능의 척도(measure)로서 흔히 사용된다.
본원에서 사용된 "샘플" 및 "시편"은 최광의의 의미로 임의의 조성물, 예컨대 화학 반응 혼합물, 생물학적 및/또는 환경학적 공급원으로부터의 조성물, 및 이들 조성물과 접촉한 샘플링 디바이스(예를 들면, 면봉)을 포함하도록 사용된다. "생물학적 샘플"은 피험체로부터 얻어진 것을 포함하며, 체액(예컨대 소변, 혈액, 혈장, 대변, 뇌척수액(CSF), 정액, 가래, 및 타액), 및 고형 조직을 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 세포(예컨대 세포주, 조직으로부터 단리된 세포(조직으로부터 단리 후 배양되거나 배양되지 않은 단리된 세포), 고정된 세포 예컨대 조직학적 및/또는 면역조직화학적 분석을 위해 고정된 세포), 조직(예컨대 생검 재료), 세포 추출물, 조직 추출물, 및 세포 및/또는 조직으로부터 단리된 핵산(예를 들면, DNA 및 RNA), 등을 포함한다. 이러한 예들은 예시적이며, 본 발명에 적용가능한 샘플 유형을 제약하고자 하는 의도로 해석되지 않아야 한다.
"대조(control) 샘플"은 하나 이상의 특정 변수를 제외하고는 대조 및 다른 샘플에서 동일 조건을 유지함으로써 또 다른 샘플과 비교하기 위해 사용된 샘플을 지칭하며, 현상(phenomenon)에 대해 이러한 변화된 하나 이상의 변수의 인과적 유의성을 추측하기 위함이다. 예를 들면, "양성 대조 샘플"은 현상이 일어날 것으로 예상되는 대조 샘플이다. 예를 들면, "음성 대조 샘플"은 현상이 일어나지 않을 것으로 예상되는 대조 샘플이다.
"표준 샘플"은 또 다른 샘플(예컨대 시험 샘플)을 평가하기 위해 기준(reference)으로서 사용된 샘플을 지칭한다. 예를 들면, 하나 이상의 표준 샘플(각각은 공지 농도 및/또는 양의 TSH를 함유함)이 시험 샘플에서 TSH의 농도 및/또는 양을 평가하기 위한 기준으로서 사용될 수 있다.
용어 "감소하다", "억제하다", "낮추다", "억제하다", "줄이다" 및 이의 문법적 동의어("보다 낮은", "보다 작은", 등 포함)는, 제2 샘플(또는 제2 피험체)에 비해 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 임의 분자(예를 들면, 아미노산 서열, 및 핵산 서열, 항체, 등), 세포, 및/또는 현상(예를 들면, 유전자의 발현 수준, 질환 증상, 두 분자의 결합 수준 예컨대 갑상선 자극 호르몬(TSH) 리간드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSH 수용체)로의 결합 수준, 두 분자의 결합 특이성, 두 분자의 결합 친화성, 질환 증상, 질환에 대한 특이성, 질환에 대한 민감성, 결합 친화성, 효소 활성, 등)의 수준을 언급하면서 사용될 때, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양이 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서보다 업계에서 허용된 임의의 통계적 분석 방법을 사용하여 통계적으로 유의한 임의 양 만큼 더 낮음을 의미한다. 일 실시양태에서, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양이 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서 동일한 분자, 세포 및/또는 현상의 양 보다 적어도 10% 더 낮고/거나, 적어도 25% 더 낮고/거나, 적어도 50% 더 낮고/거나, 적어도 75% 더 낮고/거나, 적어도 90% 더 낮다. 또 다른 실시양태에서, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양이 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서 동일한 분자, 세포 및/또는 현상의 양 보다 5% 내지 100%의 임의 수치 퍼센트 만큼 더 낮은, 예를 들어 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 및 90% 내지 100% 더 낮다. 일 실시양태에서, 제1 샘플(또는 제1 피험체)로는, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 조작되어진 샘플(또는 피험체)이 예시되며 이에 한정되지 않는다. 추가 실시양태에서, 제2 샘플(또는 제2 피험체)로는, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 조작되어지지 않은 샘플(또는 피험체)이 예시되며 이에 한정되지 않는다. 대안적인 실시양태에서, 제2 샘플(또는 제2 피험체)은, 제1 피험체와 비교해서 상이한 용량으로 및/또는 상이한 기간 동안 및/또는 상이한 투여 경로를 통해, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 조작되어진 샘플(또는 피험체)이 예시되며 이에 한정되지 않는다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 샘플(또는 피험체)은, 예컨대 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 상이한 처방(예를 들면, 용량, 기간, 투여경로, 등)의 효과가 일 샘플(또는 피험체)에서 결정되어지는 경우, 동일할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 샘플(또는 피험체)은, 예컨대 일 샘플(피험체), 예를 들면 병원에서 임상 실험에 참여하는 환자 및 또 다른 개인에 대한 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 효과를 비교할 때, 상이할 수 있다.
용어 "증가하다", "상승하다", "높이다" 및 이의 문법적 동의어("보다 높은", "보다 큰", 등)는, 제2 샘플(또는 제2 피험체)에 비해 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 임의 분자(예를 들면, 아미노산 서열, 및 핵산 서열, 항체, 등), 세포, 및/또는 현상(예를 들면, 유전자의 발현 수준, 질환 증상, 두 분자의 결합 수준 예컨대 갑상선 자극 호르몬(TSH) 리간드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSH 수용체)로의 결합 수준, 두 분자의 결합 특이성, 두 분자의 결합 친화성, 질환 증상, 질환에 대한 특이성, 질환에 대한 민감성, 결합 친화성, 효소 활성, 등)의 수준을 언급하면서 사용될 때, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양이 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서보다 업계에서 허용된 임의의 통계적 분석 방법을 사용하여 통계적으로 유의한 임의 양 만큼 더 높음을 의미한다. 일 실시양태에서, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양이 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서 동일한 분자, 세포 및/또는 현상의 양 보다 적어도 10% 더 높고/거나, 적어도 25% 더 높고/거나, 적어도 50% 더 높고/거나, 적어도 75% 더 높고/거나, 적어도 90% 더 높다. 이는 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서 동일한 분자, 세포 및/또는 현상의 양 보다 적어도 10% 더 크고/거나, 적어도 15% 더 크고/거나, 적어도 20% 더 크고/거나, 적어도 25% 더 크고/거나, 적어도 30% 더 크고/거나, 적어도 35% 더 크고/거나, 적어도 40% 더 크고/거나, 적어도 45% 더 크고/거나, 적어도 50% 더 크고/거나, 적어도 55% 더 크고/거나, 적어도 60% 더 크고/거나, 적어도 65% 더 크고/거나, 적어도 70% 더 크고/거나, 적어도 75% 더 크고/거나, 적어도 80% 더 크고/거나, 적어도 85% 더 크고/거나, 적어도 90% 더 크고/거나, 적어도 95% 더 큰 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서의 분자, 세포 및/또는 현상의 양을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일 실시양태에서, 제1 샘플(또는 제1 피험체)로는, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 조작되어진 샘플(또는 피험체)이 예시되며 이에 한정되지 않는다. 추가 실시양태에서, 제2 샘플(또는 제2 피험체)로는, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 조작되지 않은 샘플(또는 피험체)이 예시되며 이에 한정되지 않는다. 대안적인 실시양태에서, 제2 샘플(또는 제2 피험체)은, 제1 피험체와 비교해서 상이한 용량으로 및/또는 상이한 기간 동안 및/또는 상이한 투여 경로를 통해, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 조작되어진 샘플(또는 피험체)이 예시되며 이에 한정되지 않는다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 샘플(또는 피험체)은, 예컨대 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 상이한 처방(예를 들면, 용량, 기간, 투여경로, 등)의 효과가 일 샘플(또는 피험체)에서 결정되어지는 경우, 동일할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 샘플(또는 피험체)은, 예컨대 일 샘플(피험체), 예를 들면 병원에서 임상 실험에 참여하는 환자 및 또 다른 개인에 대한 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 효과를 비교하는 경우, 상이할 수 있다.
용어 "실질적으로 감소되지 않은"은, 제2 샘플(또는 제2 피험체)에 비해 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 임의 분자(예를 들면, 아미노산 서열, 및 핵산 서열, 항체, 등), 세포, 및/또는 현상(예를 들면, 유전자의 발현 수준, 질환 증상, 두 분자의 결합 수준 예컨대 갑상선 자극 호르몬(TSH) 리간드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSH 수용체)로의 결합 수준, 두 분자의 결합 특이성, 두 분자의 결합 친화성, 질환 증상, 질환에 대한 특이성, 질환에 대한 민감성, 결합 친화성, 효소 활성, 등)의 수준을 언급하면서 사용될 때, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양이 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서의 양의 91% 내지 100%임을 의미한다.
용어 "변경하다" 및 "변형하다"는, 임의 분자 및/또는 현상의 수준을 언급하는 경우 증가 및/또는 감소를 지칭한다.
"실질적으로 동일한"은, 제2 샘플(또는 제2 피험체)에 비해 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 임의 분자(예를 들면, 아미노산 서열, 및 핵산 서열, 항체, 등), 세포, 바이러스 및/또는 현상(예를 들면, 유전자의 발현 수준, 질환 증상, 두 분자의 결합 수준 예컨대 갑상선 자극 호르몬(TSH) 리간드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSH 수용체)로의 결합 수준, 두 분자의 결합 특이성, 두 분자의 결합 친화성, 질환 증상, 질환에 대한 특이성, 질환에 대한 민감성, 결합 친화성, 효소 활성, 등)의 수준을 언급하면서 사용될 때, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양이 업계에서 허용된 임의의 통계적 분석 방법을 사용하여 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서의 양과 상이하지 않음을 의미한다. 일 실시양태에서, 제1 샘플(또는 제1 피험체)에서 분자, 세포 및/또는 현상의 양은 제2 샘플(또는 제2 피험체)에서의 양의 90% 내지 100% (예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100%)이다.
본원에서 임의의 수치 범위에 대한 명시적 언급은 상기 범위에 의해 포함된 각각의 수치 값(분수 및 정수 포함)을 포함한다. 설명을 위해, 그리고 비제한적으로, 본원에서 "적어도 50"의 범위에 대한 언급은 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 등의 정수, 및 50.1, 50.2, 50.3, 50.4, 50.5, 50.6, 50.7, 50.8, 50.9, 등의 분수를 포함한다. 추가 예에서, 본원에서 "50 미만"의 범위에 대한 언급은 정수 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 등, 및 분수 49.9, 49.8, 49.7, 49.6, 49.5, 49.4, 49.3, 49.2, 49.1, 49.0, 등을 포함한다. 또 다른 예에서, 본원에서 "5 내지 10"의 범위에 대한 언급은 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 각각의 정수, 및 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 등과 같은 각각의 분수를 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 TBI에 민감하고 특이적이며, TBI 및 갑상선 자극 면역글로불린(TSI) 둘다의 이중 검출을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 TBI 및/또는 TSI의 존재와 관련된 질환의 진단을 위해, 질환 및/또는 치료 처방, 치료술, 백신 등의 진행을 모니터링하기 위해, 그리고 치료 결정을 함에 있어 임상의를 보조하기 위해 유용하다.
본 발명은 이하 (A) 갑상선 차단 면역글로불린(TBI)의 검출을 위한 분석, (B) 갑상선 차단 면역글로불린(TBI) 및 갑상선 자극 면역글로불린(TSI)의 이중 검출을 위한 분석, 및 (C) 키트에서 추가로 기재된다.
A. 갑상선 차단 면역글로불린(TBI)의 검출을 위한 분석
본 발명은 시험 샘플에서 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하는 방법으로서 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: a) i) 1) cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 (예를 들면, 루시퍼라제 유전자), 및 2) 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 TSH 수용체(TSHR) 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 세포가 세포막 상에서 키메라 TSHR을 발현하는 것인 세포, ii) 갑상선 자극 호르몬(TSH) (예를 들면, bTSH), 및 iii) 대조 샘플, 및 iv) 시험 샘플(예를 들면, TBI를 함유하는 것으로 의심되는 샘플)을 제공하는 단계, b) 트랜스제닉 세포 및 TSH를 i) 대조 샘플과 접촉시켜 제1 샘플을 생성하고, ii) 시험 샘플과 접촉시켜 제2 샘플을 생성하는 단계로서, 접촉이 TSH의 키메라 TSHR로의 결합을 위한 조건 하에 이루어지는 것인 단계, 및 c) 제1 샘플 및 제2 샘플에서 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 감소된 발현 수준이 시험 샘플에서 TBI의 존재를 나타내는 것인 단계.
일 실시양태에서, 본 발명의 TBI 분석은 세포-기반 면역글로불린 경쟁 분석이며, 갑상선 차단 면역글로불린이 예시적인 CHO-MC4 세포 상에서 발현된 TSH 수용체(TSHR)에 결합하기 위해 갑상선 자극 호르몬(TSH)과 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, TBI 분석은 CHO-MC4 세포, 세포 성장 배지, bTSH, 티레타인(Thyretain)TM 반응 완충제(퀴델 코포레이션 및 다이아그노스틱 하이브리드 인코포레이션(Quidel Corp. & Diagnostic Hybrids, Inc.), 미국 오하이오주 소재), 루시퍼라제 기질 및 환자 혈청 샘플을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 TBI 분석의 시약 및 성분은 당업자가 입수가능하다(티레타인TM 분석; Quidel Corp. & Diagnostic Hybrids, Inc.).
본 발명의 분석은 실시예 1에서 예시된다. 본 발명의 TBI 분석의 예시적인 CHO-MC4 세포는 글리코단백질 호르몬 알파 서브유닛 프로모터에 의해 구동된 키메라 인간/래트 TSHR 및 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 유전적으로 조작된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다. CHO-MC4 세포가 티레타인TM 분석(Quidel Corp. & Diagnostic Hybrids, Inc.)에 사용된다.
본 발명의 방법은 TBI의 존재와 연관된 질환, 예컨대 그레이브스병, 하시모토 갑상선염(Endo et al. (1978) J. Clin. Endocrinology & Metabolism 46(5):734-739; Takasu et al. (1987) J. Clin. Endocrinology & Metabolism 64(2):239-245); 갑상선기능저하증(Takasu et al. (1984) J. Clin. Endocrinology & Metabolism 599(1):142-146); 신생아 갑상선기능저하증(Iseki et al. (1983) 57(2):384-387; Matsuura et al. (1980) The New England Journal of Medicine 303(13):738-741); 비갑상선종성 갑상선기능저하증(Arikawa et al. (1985) J. Clin. Endocrinology & Metabolism60(5):953-959); 갑상선 기능 정상 또는 갑상선 기능 부전 자가면역성 갑상선염(Chiovato et al. (1990) 71 :40-45); 일차성 점액수종(Drexhage et al. (1980) Nature 289:594-596; Konishi et al. (1983) J. Clin. Endocrinology & Metabolism 57(3):544-549); 및 특발성 점액수종(Kohn et al. (2003) Autoimmunity 36:331-337)의 진단에 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 질환 및/또는 치료 처방, 치료술, 백신 등의 진행을 모니터링하기 위해, 그리고 치료 결정을 함에 있어 임상의를 보조하는데 있어 유용하다.
MC4 키메라 수용체를 사용하여 갑상선 호르몬 자가항체에 대한 선행기술로서 개시된 분석이 또한 본 발명에서 사용된다(2008년 8월 7일자 공개된 미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호). 그러나, 본 발명의 방법은, 선행 기술 분석이 MC4 키메라 수용체가 자극 항체에만 반응성이고 갑상선 호르몬 차단 항체의 결합이 제거되고/거나 감소되는 관점에 기초하여 갑상선 호르몬 자극(차단이 아님) 면역글로불린(TSI)을 측정하기 위해 고안되었다는 점에서 볼때, 놀랍다. 부가적으로, 선행 기술은, TSI 검출을 위한 방법의 특이성이 키메라 MC4 수용체를 발현하는 세포의 사용의 결과이고, 이는 자극 자가항체(즉, 차단 자가항체와 대조됨)에 대해 선호적으로 결합함으로써 야생형 수용체 보다 더 큰 특이성을 제공하는 것으로 기재되어 있다. 또한, 선행기술은, TSI 검출을 위한 방법의 감도가 키메라 MC4 수용체를 발현하는 세포의 사용의 결과이고, 이는 자극 자가항체(즉, 차단 자가항체와 대조됨)에 대해 선호적으로 결합함으로써 야생형 수용체 보다 더 큰 감도를 제공하는 것으로 기재되어 있다.
TBI의 검출시 본 발명의 방법의 놀라운 측면 이외에, 본 발명의 방법은 TBI 검출을 위해 민감한 놀라운 이점을 제공한다. 따라서 일 실시양태에서, 본 발명의 TBI 검출 방법은, 키메라 TSHR을 발현하는 트랜스제닉 세포를 야생형 TSHR을 발현하는 세포로 치환하는 단계를 포함하는 방법에서 TBI를 검출하는 경우의 TBI IC50 보다 5배 내지 15배 더 작은(가장 바람직하게는 7.5배 더 작은) TBI IC50을 가진다. 본원에서 데이터는 CHO-MC4 세포에 의해 발현된 키메라 TSHR이 TBI 검출시 야생형 TSHR보다 더 유용함을 입증해 준다 (실시예 2 및 4). 예를 들면, 본원에서 데이터는 야생형 TSHR을 발현하는 H10 세포와 비교해서 키메라 TSHR을 발현하는 CHO-MC4 세포를 사용하는 경우 TBI 검출시에 보다 높은 감도를 입증하고 있으며; CHO-MC4 세포의 IC50은 H10 세포의 것보다 7.5배 더 작았다.
TBI 검출을 위한 본 발명의 감도에 대한 또 다른 놀라운 이점은, 본 발명의 방법이 (예컨대 ELISA 분석에서) 항-TBI 단일클론 항체와 TBI의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법에서 TBI를 검출하는 경우의 TBI IC50 보다 10배 내지 30배 더 작은(가장 바람직하게는 22배 더 작은) TBI IC50을 가진다는 점이다. 본원에서의 데이터는 CHO-MC4 세포를 사용하는 본 발명의 TBI 분석의 IC50이 1.344ng/ml이고, 이는 TRAb 분석의 IC50 보다 22배 더 낮음을 보여준다 (실시예 3 및 4).
본 발명의 방법의 상술된 감도는, 적어도 부분적으로는 TSH 수용체(TSHR)가 래트 루테오트로핀-융모막 고나도트로핀(LH-CG) 수용체에 연결된 선행기술의 키메라 수용체 TSHR-LH/CGR이 TSI에 민감하지만 TBI에 매우 둔감한 것으로 보고되었다는 점에서 볼때 놀랍다(Tahara et al. (1991) BBRC 179:70-77; Tahara et al. (1997) Thyroid 7(6):867-877). 또한, 선행기술은, 본 발명의 예시적인 트랜스제닉 세포(예를 들면, CHO-MC4 세포 및 RD-MC4 세포)에 의해 발현된 MC4 키메라 수용체 TSHR-LH/CGR이 TSI에 대한 에피토프를 보유하지만 TBI에 대한 에피토프를 결여하고 있음을 시사하고 있다(Kohn et al. (2003) Autoimmunity 36:331-337; Sanders et al. (2011) J. Molecular Endocrinol. 46;81 -99).
반드시 필요한 것은 아니지만, 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자(예를 들면, 루시퍼라제 유전자)의 감소된 발현 수준을 검출하는 단계 d)를 더 포함한다.
또한, 필수적인 것은 아니지만, 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 시험 샘플에서 TBI의 수준을 확인하는 단계를 더 포함한다. 이는 예를 들면, 1) 시험 샘플과의 접촉 후 리포터 유전자의 발현 수준을, 2) 트랜스제닉 세포를 공지 농도의 TSH를 함유하는 하나 이상의 표준 샘플과 접촉시킨 후 리포터 유전자의 발현 수준과 비교함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가의 놀라운 측면은 본 방법이 TBI 특이적이라는 점이다. 샘플에서 TBI의 존재를 검출하는 방법은, 본 방법이 TSH의 자신의 수용체(TSHR 예컨대 키메라 TSHR)로의 특이적 결합의 TBI에 의한 억제를 검출하는 것을 포함하는 경우와, TBI에 의한 억제 수준이 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모막 고나도트로핀(hCG) 및 난포 자극 호르몬(FSH) 중 하나 이상의 존재에 의해 실질적으로 변경되지 않는 (즉, 1% 내지 10% 만큼 증가하지 않거나, 또는 1% 내지 10% 만큼 감소되지 않는) 경우 "TBI에 특이적인"으로서 또는 "TBI 특이적인"으로서 언급된다.
예를 들면, 본원에서의 데이터는, 세 종류 글리코단백질 호르몬 LH, hCG, 및 FSH를 본 발명의 TBI 분석에서 이들의 최고 생물학적 정상 범위 농도 및 이들의 최고 생물학적 정상 범위 농도의 2배에서 시험했을 때 TSH와 TSHR의 결합의 TBI 억제에 대한 간섭 또는 실질적인 교차-반응성이 없었다는 점에서 본 발명의 TBI 분석이 bTSH에 특이적임을 입증해 준다 (실시예 5). 보다 구체적으로, 본 발명의 분석은 TBI에 의한 86% 억제를 검출했지만, LH, hCG, 및 FSH 중 임의의 하나와 TBI를 함유하는 혼합물은 81% 내지 84% 억제 범위를 검출했다.
본 발명의 분석에서 TSH의 농도 범위를 제한하고자 하는 의도는 없지만, 일 실시양태에서, TSH는 100 mIU/ml 미만, 보다 바람직하게는 0.2 mIU/ml 내지 lOO mIU/ml의 농도를 가진다. 도 1B는 TSH 농도가 1OO mIU/ml와 동일하거나 이보다 낮은 경우 생물발광 유전자(예를 들면, 루시퍼라제 유전자)의 발현과 TSH 농도 간의 상관관계가 직선형임을 보여준다.
본 발명의 방법에 사용된 트랜스제닉 세포는 임의의 특정 리포터 유전자를 함유하는 것으로 의도되지 않는다. 그러나, 일 실시양태에서, 리포터 유전자는 생물발광 단백질, 예컨대 레닐라 루시퍼라제 아미노산 서열 서열번호:03을 포함하는 단백질을 발현한다.
본 발명의 방법에 사용된 트랜스제닉 세포는 임의의 특정 유형에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 그러나, 일 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 CHO-MC4 세포 및 RD-MC4 세포로서 예시된 세포를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 TSH를 갑상선 자극 단일클론 항체(예컨대 M22) 및/또는 갑상선 자극 다클론 항체로 대체함으로써 실시될 수 있다 (도 9). 본원에서의 데이터는 본 발명의 TBI 분석이 bTSH 및/또는 갑상선 자극 면역글로불린(TSI)에 의한 자극을 차단하는 예시적인 샘플 18HM의 능력을 검출할 수 있음을 입증해 준다 (도 10).
B. 갑상선 차단 면역글로불린(TBI) 및 갑상선 자극 면역글로불린(TSI)의 이중 검출을 위한 분석
본 발명은 시험 샘플에서 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI) 및 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 검출하는 방법으로서 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: a) i) 1) cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자(예를 들면, 루시퍼라제 유전자), 및 2) 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 TSH 수용체(TSHR) 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 세포가 세포막 상에서 키메라 TSHR을 발현하는 것인 세포, ii) 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 iii) 대조 샘플, iv) 시험 샘플(예를 들면, TBI 및/또는 TSI를 함유하는 것으로 의심된 샘플)을 제공하는 단계, b) 트랜스제닉 세포 및 TSH를 i) 대조 샘플과 접촉시켜 제1 샘플을 생성하고, ii) 시험 샘플과 접촉시켜 제2 샘플을 생성하는 단계로서, 접촉이 TSH의 키메라 TSHR로의 결합을 위한 조건 하에 이루어지는 것인 단계, 및 c) 접촉 이전 및 이후에 트랜스제닉 세포에서 (예를 들면, 루시퍼라제 효소 활성을 인한 생물발광을 검출함으로써) 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, i) 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 감소된 발현 수준이 시험 샘플에서 TBI의 존재를 나타내고, ii) 제1 샘플과 비교해서 제2 샘플에서 리포터 유전자의 증가된 발현 수준이 시험 샘플에서 TSI의 존재를 나타낸는 것인 단계.
본원의 실시예 6-8에서의 데이터는 혈청 샘플에서의 검출을 포함하여 TBI 및 TSI 둘다를 검출하기 위한 본 발명의 분석의 용도를 입증한다 (표 8).
TBI 및 TSI 둘다의 이중 검출을 위한 본 발명의 방법은 TSI의 존재와 관련된 질환, 예컨대 그레이브스병 및 갑상선기능항진증의 진단을 위해, 질병 및/또는 치료의 진행을 모니터링하기 위해, 그리고 치료 결정을 함에 있어 임상의를 보조하기 위해 유용하다.
트랜스제닉 세포를 임의의 특정 유형으로 한정하고자 하는 의도는 없지만, 일 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 CHO-MC4 세포 및 RD-MC4 세포에 의해 예시된 세포를 포함한다.
C. 키트
본 발명은 본 발명의 방법을 실시함에 있어 이를 보조하기 위한 키트를 제공한다. 일 실시양태에서, 키트는 i) 1) cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자, 및 2) 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 TSH 수용체 (TSHR) 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 세포가 세포막 상에서 키메라 TSHR을 발현하는 것인 세포, 및 ii) 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하기 위해 트랜스제닉 세포를 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
용어 "키트"는 시약 및 다른 재료의 조합을 언급하는데 사용되어진다. 키트는 시약 예컨대 완충제, 단백질 안정화제, 신호 생성 시스템(예를 들면, 생물발광 및/또는 형광 발생 시스템), 항체, 대조 샘플, 및 시험 용기(예를 들면, 마이크로타이터 플레이트, 등)를 포함할 수 있는 것으로 해석된다.
일 실시양태에서, 키트는 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 함유하는 양성 대조 샘플을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 갑상선 자극 호르몬(TSH)을 포함한다.
TBI 및 TSI 둘다의 이중 검출을 원한다면, 키트는 시험 샘플에서 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 검출하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 함유하는 양성 대조 샘플을 더 포함할 수 있다.
실험
하기 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태 및 측면을 입증하고 나아가 예시하기 위해 제공된 것이며 이의 범위를 제약하는 의도로 해석되지 않아야 한다.
하기의 실험적 개시내용에서, 하기 약어들이 적용된다: eq (당량); M (몰(Molar)); μM (마이크로몰); N (노말); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); ng (나노그램); 또는 L (리터); ml (밀리리터); ㎕ (마이크로리터); μ (마이크로); m (밀리); IU (국제 단위); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); ℃ (°섭씨); sec. 또는 s (초); min. 및 m (분); MW (분자량); 갑상선 자극 호르몬 또는 티로트로핀 (TSH); bTSH (소 TSH); TSI (갑상선 자극 면역글로불린); TSAb (갑상선 자극 항체); EDTA (에틸렌 디아민 테트라아세트산); RLU/sec (초당 상대적 광 단위); GM 또는 PM (성장 배지 또는 생육 배지); SM (결핍(Starvation) 배지); HBSS (행크 평형 염 용액); EMEM (이글 최소 필수 배지); FBS 또는 FCS (소태아 혈청 또는 우태아 혈청); DMSO (디메틸 술폭시드); CHO (차이니즈 햄스터 난소 세포); CHO-R (인간 TSH 수용체로 형질감염된 CHO 세포); CHO-Rluc (cre-루시퍼라제 리포터 유전자 복합체로 형질감염된 CHO-R 세포); Oxoid (Oxoid, 영국 베이싱스토크); BBL (Becton Dickinson Microbiology Systems, 메릴랜드주 콕키스빌); DIFCO (Difco Laboratories, 미시간주 디트로이트); U.S. Biochemical (U.S. Biochemical Corp., 오하이오주 클리블랜드); Fisher (Fisher Scientific, 펜실베니아주 피츠버그); Sigma (Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트루이스); ATCC (American Type Culture Collection, 메릴랜드주 록빌); LTI (Life Technologies, 메릴랜드주 록빌); 및 Promega (Promega Corp., 위스콘신주 매디슨).
하기 방법에서, 이들 방법에서 사용된 모든 용액은 멸균된 것이고(TSH, 대조군, 환자 시편 제외) 무균 처리되었다. 모든 조작을 무균 조건 하에 생물안전 캐비넷에서 실시하였다. 세포 배양 배지(예를 들면, 햄(Ham) F-12, EMEM, 등)는 LTI로부터 수득한 반면, 첨가 시약들 예컨대 비필수 아미노산은 Sigma로부터 얻어졌다.
세포의 냉동 바이알은, 온도 사이클링이 생존능력 상실을 일으킬 수 있기 때문에, 해동 및 본 발명의 방법에서 사용 직전까지 -80℃ (또는 그 이하) 저장 온도로부터 데워지지 않아야 한다. 5x 세포 용해 용액은 실온에서 불안정한 디티오트레이톨을 함유하기 때문에 1x 용액의 제조를 위한 요구 부피를 제거하기에 단지 충분히 길게 -20℃ 저장 온도로부터 제거되어야 한다. 재구성된(reconstituted) 루시퍼라제 기질 용액은 또한 디티오트레이톨을 함유하기 때문에 사용 직전까지 -20℃에서 동결되어야 하며, 사용 시점에 해동 및 실온에 도달하기 위해 옮겨져 25-37℃ 수조에 놓일 수 있다.
일반적으로, 웰(예를 들면, 마이크로타이터 플레이트, 등)로부터 액체를 제거하는 경우, 액체는 웰로부터 생물안전 후드 내 수용기 중으로 떨어뜨려질 수 있다. 잔류 액체는 멸균 흡수 와이프 상에 플레이트를 거꾸로 둠으로써 배출 및 제거될 수 있다. 이와 달리, 액체는 흡입기 상에서 미세 팁을 사용하여 흡입함으로써 제거될 수 있다. 흡입이 사용된다면, 액체가 웰에서 넘치지 않도록 하기 위해 플레이트를 경사가 급한 각으로 유지하며, 흡입기 팁은 액체를 제거하고 최소 잔사만을 남기기 위해 웰의 측면을 대략 바닥으로 향하도록 한다. 그러나, 세포는 흡입기에 의해 쉽게 제거될 수 있기 때문에 세포 단층의 교란을 방지하도록 주의를 기울여야 한다.
하기 방법에서 나타낸 바와 같이, 시편, 표준, 및 대조군이 3중으로(in triplicate) 실행될 것을 권장하지만 필수사항은 아니다. 용액 3의 점성과 웰에서 적절한 혼합의 달성의 어려움으로 인해, 총 3중 부피가 이들 시약의 +10%(33 ㎕)이고, 용액 3의 요구 3중 부피 +10%(330 ㎕)로 옮겨지고, 철저히 혼합되고, 110 ㎕가 3중 웰에 옮겨지는 경우에 최상의 재현성이 달성되었다.
세포 단층의 제조에서 (예를 들면, 마이크로타이터 플레이트 웰 내에서), 세포는 웰 내에서 고르게 분포하는 것이 바람직하다. 따라서, 고르지 않은 세포 분포를 피하기 위해, 무진동 생물안전 후드에서 세포 현탁물의 웰 내로의 전달이 실시되어야 한다. 플레이트 중의 모든 웰에 세포를 수용한 후, 플레이트를 덮고 고체의 무진동 표면 상에서 30분간 주의깊게 두어 세포가 웰의 기저부에 교란없이 부착되도록 한다. 이는 각각의 웰에 세포의 고른 분포가 존재하도록 돕는다.
실시예 1
샘플 중 TBI 의 검출 방법
갑상선-자극 면역글로불린을 검출하기 위한 키메라 TSH-수용체(TSHR) 및 CRE-의존 루시퍼라제를 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주(CHO-MC4)(TSI 생물검정, 티레타인TM)는 이미 개시되어 있다(2008년 8월 7일에 공개된 미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호). 상보성 갑상선-차단 항체(TBI) 생물검정을 진행하기 위해, 본 발명자들은 야생형(wt) TSHR과 키메라 TSHR의 성능을 비교하였다.
wt 또는 키메라 TSHR 및 CRE-의존 루시퍼라제를 발현하는 CHO 세포를 단리하였다. 세포를 37℃에서 15-18 시간 동안 성장시킨 다음 bTSH, TSI, TBI, 및/또는 환자 혈청과 함께 인큐베이팅하였다. 루시퍼라제 발현은 3시간 동안 인큐베이션 후 측정하였다. 차단 활성은 bTSH만을 이용한 유도에 대한 루시퍼라제 발현의 억제%로서 정의하였다.
키메라 및 wt 세포주 둘다 용량-의존 방식으로 bTSH에 반응하여 루시퍼라제 유도를 나타내었지만, 감도 및 최대 유도에서 상이한 수준을 나타내었다. wt TSHR-발현 세포주는 0.8 내지 50 mIU/L의 bTSH 농도에 반응하였지만, 키메라 TSHR-발현 세포주는 보다 넓은 동적(dynamic) 범위(1.6 내지 200 mIU/L)를 가졌고 8-배 더 높은 수준으로 유도되었다. 두 세포주는 그레이브스병을 앓고있는 환자의 혈청에서 TSI를 검출하였다. 세포주를 TSI 또는 bTSH로 자극했을 때, 루시퍼라제 발현은 차단 MAb, K1-70 (RSR, 영국 카디프) 또는 TBI 함유 혈청의 농도 증가에 따른 첨가에 의해 용량-의존 방식으로 감소되었다. 키메라 세포주는 K1-70의 억제 농도 50%(IC50)가 키메라 세포주 상에서 3 내지 5 배 더 낮았다는 점에서 더 민감하였다. 또한, wt 세포와 달리, 키메라 세포주는 TBI-양성 혈청을 이용하여 시험했을 때 3-4 배 더 높은 억제 활성을 나타내었고 연속으로 희석된 차단 혈청을 사용해서는 S형 용량-반응 곡선을 일정하게 나타내었다.
결과는, wt와 비교해서, 키메라 TSHR 세포주가 보다 우수하게 작용하고 자극 및 차단 생물검정 둘다를 진행하기 위한 독특한 비히클임을 보여준다.
A. 혈청 샘플에서 TBI를 검출하기 위한 예시적인 프로토콜:
1. 하나의 검은색, 평탄한/투명한-바닥의 96-웰 플레이트를 100 ㎕/웰의 세포 부착 용액(예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호에 기재되고, 미국 오하이오주 Quidel Corp. & Diagnostic Hybrids, Inc.로부터 티레타인TM 세포 부착 용액으로서 상업적으로 입수가능함)으로 코팅한다. 용액을 웰 상에서 30초간 둔 다음 용액을 따라 버린다.
2. 5 ml의 티레타인TM 성장 배지(예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호에 기재되고, 미국 오하이오주 Quidel Corp. & Diagnostic Hybrids, Inc.로부터 티레타인TM 성장 배지로서 상업적으로 입수가능함)에 CHO MC4 세포의 1 냉동 바이알을 첨가한다.
3. 48-웰 포맷에서 세포를 100 ㎕/웰로 이식(plant)한다 (플레이트의 상부 및 바닥 줄(rows) 및 플레이트의 좌측 및 우측 상의 첫번째 두 열(columns)을 스킵함).
4. 세포의 플레이트를 37℃에서 16-18 시간 동안 인큐베이팅한다.
5. 밤샘 성장 기간의 말미에, 세포에 대해 융합(confluence)을 현미경으로 검사하고 세포에 오염물이 없음을 확인한다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣는다.
6. 400 μIU/ml bTSH를 준비한다 (이는 각 웰에서 bTSH의 100 μIU/ml 최종 농도를 허용할 것이다). 이것이 표준 원액(working stock)이다.
7. 각 샘플과 bTSH의 1 : 11 희석물을 준비한다 -- 40 μL의 각 샘플, 220 μL의 400 μIU/ml bTSH, 및 180 μL의 티레타인TM 반응 완충제(예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호에 기재되고, 미국 오하이오주 Quidel Corp. & Diagnostic Hybrids, Inc.로부터 티레타인TM 반응 완충제로서 상업적으로 입수가능함).
8. 반응 완충제에서 정상 혈청을 1:11로 희석함으로써 블랭크 대조군을 준비한다(40 μL 혈청 및 400 μL 반응 완충제).
9. 40 μL의 정상 혈청, 220 ㎕의 400 μIU/ml bTSH, 및 180 μL의 티레타인TM 반응 완충제를 희석함으로써 bTSH 대조군을 제조한다.
주: 플레이트는 바람직하게는 또한 티레타인TM 반응 완충제만을 함유하는 복제(replicate) 웰을 함유한다.
10. 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼내와 세정한 다음 세포에 100 ㎕/웰의 티레타인TM 반응 완충제를 재공급한다.
11. 제조된 샘플을 3중의 세포에 100 ㎕/웰로 첨가한다.
12. 세포를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이팅한다.
13. 모든 웰의 내용물을 3시간 인큐베이션 후 따라 버린다.
14. 75 ㎕/웰 브라이트-글로(Bright-Glo)TM를 각 웰에 첨가한다.
15. 세포를 실온에서 10분간 인큐베이션한 다음 베리타스(Veritas)TM 플레이트 리더 상에서 플레이트를 판독한다.
B. TBI 분석에서 예시적인 TSH 농도:
도 1은 CHO-MC4 세포를 사용하여 bTSH 용량 반응 곡선을 도시한다. 도 1A는 0.2mIU/ml 내지 400 mIU/ml의 농도 범위에서 bTSH의 연속 2배 희석하여 루시퍼라제 유도를 도시하고; 도 IB는 0.2mIU/ml 내지 100 mIU/ml의 보다 좁은 농도 범위의 bTSH를 사용하여 루시퍼라제 유도를 도시한다. S/B의 비는 루시퍼라제 신호-대-배경 비를 나타내고, 상이한 실험에서 생성된 루시퍼라제 활성(RLU로 측정됨)을 표준화(normalize)한다.
도 1A는 루시퍼라제 유도가 bTSH 농도에 따라 증가함을 보여준다. 루시퍼라제 유도와 bTSH 농도 간의 상관관계는 bTSH 농도가 lOOmIU/ml 이하일 때 직선형이다. bTSH의 농도가 lOOmIU/ml 보다 높으면, 루시퍼라제 활성 증가가 감소하고 유도가 점차적으로 안정기(plateau)에 접근하지만 도달하지는 않는다. 도 1B는 bTSH 농도가 lOOmIU/ml 이하일 때 도 1A의 직선 부분을 확대한 것이다. R2(계수 값)은 1에 가깝다.
TBI 분석에서, 갑상선 차단 항체는 세포막 상에 위치한 TSH 수용체의 결합에 대해 bTSH와 경쟁한다. 따라서, bTSH의 농도는 분석 감도의 확인을 위한 중요한 성분이다. 도 1B에 도시된 루시퍼라제 유도에 대한 직선 범위에서 bTSH 농도는 bTSH의 보다 높은 비직선 농도 보다 더 높은 검출 감도를 가진다. bTSH의 농도의 직선 범위 내에서, 최고 농도가 분석을 위한 일 최적 농도로서 사용될 수 있다. 모든 직선 농도가 동일한 bTSH 검출 감도를 가지지만, 더 높은 bTSH 농도는 보다 큰 신호-대-배경 비를 의미한다.
실시예 2
키메라 TSHR TBI 를 검출함에 있어 야생형 TSHR 보다 더 유용하다
A. MC4 TSHRwt 세포( H10 )에서 Kl -70 갑상선 차단 단일클론 항체( MAb )를 이용한 갑상선 차단 면역글로불린( TBI ) 분석의 검출 감도의 비교
연속으로 희석된 갑상선 차단 MAb K1-70(0.1 내지 lOOng/ml)을 CHO-MC4 세포 또는 H10 세포에서 TBI 분석으로 시험하였다. 결과가 도 3에 도시되어 있다.
모든 샘플 데이터를 1:11 희석된 정상 혈청을 가진 반응 완충제의 배경 RLU로 표준화하였다. 억제 퍼센트(%)를 (bTSH 대조군 RLU - 샘플 RLU)/bTSH 대조군 RLU로서 계산하였다.
결과는, CHO-MC4 세포가 H10 세포 보다 K1-70에 더 높은 검출 감도를 가지는 것을 보여준다. CHO-MC4 세포의 IC50은 H10 세포의 것보다 7.5배 더 작았다.
B. MC4 및 H10 세포에서 차단 항체 함유 혈청을 이용한 TBI 분석의 검출 감도의 비교
한 명의 TBI 양성 환자의 혈청을 1:22에서 1:90,000으로 연속 희석하고 MC4 또는 H10 세포에서 TBI 분석으로 시험하였다. 결과가 도 4에 도시되어 있다.
결과는, CHO-MC4 세포에서 혈청 희석물의 억제%의 S형 곡선을 보여주며, 이는 이전 실험에서 K1-70의 것과 유사하다. 그러나, 이는 H10 세포에서 동일한 곡선을 나타내지 않았다.
이러한 결과는 CHO-MC4 세포가 HI0 세포 보다 TBI를 검출함에 있어 더 민감함을 보여준다.
실시예 3
본 발명의 TBI 분석의 감도는 경쟁 결합 방법, 예컨대 크로누스( Kronus) TM ELISA 분석 보다 더 높다
본 발명자들은 본 발명의 TBI 분석을 선행기술의 경쟁 결합 방법, 예컨대 크로누스TM ELISA 분석(TRAb 분석)과 비교하기 위해 갑상선 차단 단일클론 항체 K1-70 용량 반응 곡선의 비교를 실시하였다. 이 실험에서, K1-70 자극 단일클론 항체를 CHO-MC4 세포에서의 TBI 분석과 TRAb 분석(크로누스TM) 둘다에 대해 시험하였다. 결과가 도 5에 도시되어 있다.
결과는, CHO-MC4 세포를 이용한 TBI 분석의 IC50이 1.344ng/ml임을 보여주고 있으며, 이는 TRAb 분석의 것 보다 22배 더 낮은 것으로, CHO-MC4 세포가 TRAb 분석 보다 더 높은 TBI 검출 감도를 가지고 있음을 시사한다.
실시예 4
본 발명의 TBI 분석의 감도
하기 데이터는 TBI 검출에 있어 본 발명의 분석의 감도를 다른 분석과 비교하고 있다.
[표 1]
TBI 양성 혈청 샘플의 희석 반응
Figure 112014033075917-pct00001
[표 2]
갑상선 차단 단일클론 항체 K1-70의 용량 반응
Figure 112014033075917-pct00002
[표 3]
TBI 및 TRAb 분석에 대한 TBI 양성 혈청 희석 결과의 비교
Figure 112014033075917-pct00003
[표 4]
TBI 및 TRAb 분석에 대한 갑상선 차단 단일클론 항체 K1-70 용량 반응의 비교
Figure 112014033075917-pct00004

실시예 5
본 발명의 TBI 분석의 특이성
표 5 및 6은 글리코단백질 호르몬 서브패밀리 -- 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모막 고나도트로핀(hCG), 및 난포 자극 호르몬(FSH)을 이용한 본 발명의 TBI 분석의 특이성 시험의 결과를 보여준다. 실험에서, 각 호르몬에 대해 두 가지 농도를 시험하였다. 일 농도는 정상 범위 내에서 가장 높은 수준이고; 나머지 농도는 그러한 농도의 2배이다. K1-70 갑상선 차단 단일클론 항체가 양성 대조군으로 사용되었고; 호르몬은 반응 완충제에서 K1-70과 함께 시험하였다.
인간에서 각 호르몬의 정상 범위는 하기와 같다: LH 5-20 mIU/ml; hCG 0.1-8000 mIU/ml; FSH 1.4-116.3 mIU/ml.
CHO-MC4 세포에서 최고 정상 범위 농도로 시험된 글리코단백질 호르몬을 이용한 루시퍼라제 유도
RLU 억제율%
TBI 양성 2.5 ng K1-70 5532 86%
FSH 116.3 mIU/ml
2.5 ng K1-70 6101 81%
반응 완충제 16489 0%
LH 20 mIU/ml
2.5 ng K1-70 6102 81%
반응 완충제 17263 -5%
hCG 8000 mIU/ml
2.5 ng K1-70 5998 82%
반응 완충제 17502 -7%
CHO-MC4 세포에서 최고 정상 범위 농도의 2배로 시험된 글리코단백질 호르몬을 이용한 루시퍼라제 유도
RLU 억제율%
TBI 양성 2.5 ng K1-70 5532 86%
FSH 232.6 mIU/ml
2.5 ng K1-70 5811 83%
반응 완충제 16272 1%
LH 40 mIU/ml
2.5 ng K1-70 5773 84%
반응 완충제 17368 -6%
hCG 16000 mIU/ml
2.5 ng K1-70 5947 82%
반응 완충제 16483 0%
데이터는 세 종류 글리코단백질 호르몬이 TBI 분석에서 시험되었을 때 실질적인 교차-반응성 또는 간섭이 없었음을 입증해 준다. 이러한 결과는 TBI 분석이 bTSH에 매우 특이적임을 의미한다.
실시예 6
본 발명의 이중 생물검정법은 TBI TSI 둘다를 성공적으로 검출할 수 있다
여기서 본 발명자들은 키메라 TSH-수용체(TSHR)를 발현하는 동일한 트랜스제닉 세포 CHO 세포주(CHO-MC4)를 사용하여 갑상선-자극 면역글로불린(TSI) 및 갑상선-차단 면역글로불린(TBI) 둘다의 검출을 위한 분석을 기재하며, 이는 2008년 8월 7일에 공개된 미국 특허 출원 공보 제2008-0187942호에 기재되어 있다.
방법: 차단 활성을 검출하기 위해 CHO-MC4 세포를 인간 혈청 샘플 또는 항-TSHR 차단 MAb와 혼합된 소 TSH(bTSH)로 유도하였다. 차단 활성은 bTSH 단독에 의한 유도에 대한 루시퍼라제 발현의 억제%로서 정의되었다. MAb K1-70 및 M-22를 RSR(영국 카디프)로부터 구입하였다. 모든 샘플에 대해, 또한 TSHR 자가항체(TRAb)(ELISA, 크로누스TM) 및 TSI(티레타인TM)를 측정하였다.
결과: bTSH-자극된 CHO-MC4 세포의 루시퍼라제 발현은 차단 MAb K1-70에 반응하여 용량-의존 방식으로 감소하였다. 50개 갑상선 기능 정상 대조군 혈청은 7 내지 52%의 억제를 나타내었으며 본 발명자들로 하여금 50% 억제의 예비적인 95번째 백분위 컷오프(percentile cut-off)를 설정하도록 했다. 자가면역 갑상선기능저하증이 있는 환자의 TRAb-양성 및 TSI-음성 혈청은 루시퍼라제 발현을 배경 수준으로 감소시켰다(100% 억제). 연속 희석 실험은 이들 샘플에서 최대 1:200의 차단 활성의 역가를 보여주었다. TBI 생물검정은 K1-70 MAb를 이용한 TRAb 분석보다 20배 이상 더 민감하였으며 이는 IC50 1.34+/-0.09 ng/ml 대 IC50 29.73+/-3.27 ng/ml를 보여준다.
TBI 생물검정은 또한 TSI를 검출할 수 있었다. 자극 MAb(M-22) 또는 TSI-양성 혈청을 사용하여, 본 발명자들은 bTSH 단독, 즉 음성 억제에서 관찰된 것 이상의 루시퍼라제 발현을 확인하였다. 두 분석에서 M-22 자극 활성의 용량-반응은 TSI 및 TBI 분석 각각에서 0.14 ng/ml 및 0.16 ng/ml의 50% 유효 농도(EC50)와 실질적으로 일치하였다. 두 분석에서 시험된 TSI-양성 혈청의 연속 희석은 또한 대등한 용량-반응 곡선을 보여주었다.
A. 연속 희석된 M22 또는 TSI 양성 환자 혈청을 이용한 TBI 분석
갑상선 자극 단일클론 항체 M22, 또는 TSI 양성 혈청을 연속 희석하고 CHO-MC4 세포를 사용하는 본 발명의 TBI 분석으로 시험하였다. 결과가 도 6에 나타나 있다. 도 6에 따르면, 두 희석 곡선에서 본 발명의 TBI 분석이 갑상선 자극 면역글로불린(TSI)을 분석할 수 있음을 입증하고 있다.
B. 171개 TSI 양성 혈청 샘플을 이용하여 TSI 및 TBI 분석 간의 상관관계
이 실험에서, 171개 TSI 양성 혈청을 준비하고 TSI 또는 TBI 분석을 동시에 실시하였다. 결과가 도 7에 도시되어 있다.
결과는, TSI 및 TBI 분석 간에 높은 상관관계를 보여주는데 (R2= 0.9), 이는 TBI 분석이 TSI 양성 혈청을 검출하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 7
본 발명의 이중 생물검정법은 항-TSHR 자가항체를 갑상선 자극 항체와 갑상선 자극 차단 항체로 구별할 수 있다
이 실험에서, 갑상선 자극 단일클론 항체 M22 및 갑상선 차단 단일클론 항체 K1-70을 다양한 비, 예컨대 100:0, 90:10, 80:20, 내지 0:100으로 함께 혼합하고 CHO-MC4 세포를 사용하는 본 발명의 TBI 분석으로 시험하였다. 결과가 도 8에 도시되어 있다.
도 8은 혼합물에서 K1-70의 비율이 0에서 100%로 증가했을 때 (M22는 100에서 0%), TBI 억제%가 음성 100%에서 양성 100%로 점진적으로 증가함을 보여준다. 이는 TBI 분석에서, 갑상선 자극 항체를 검출할 수 있음을 나타내고, 음성 억제 결과로서 항체를 차단함을 보여준다.
실시예 8
TBI 및/또는 TSI 를 검출하기 위한 본 발명의 이중 생물검정의 감도
하기 결과는 혈청 샘플에서 TBI 및/또는 TSI를 검출하기 위해(표 6) 또는 단일클론 항체 M22 및 K1-70을 사용하는 경우(표 5 및 7)의 본 발명의 이중 생물검정의 감도를 보여준다.
[표 6]
갑상선 자극 단일클론 항체 M22 및 갑상선 차단 단일클론 항체 K1-70의 상이한 비를 이용한 TBI 분석
Figure 112014033075917-pct00005
[표 7]
TSI 양성 혈청 샘플을 이용하여 TBI 및 TSI 간의 비교
Figure 112014033075917-pct00006
[표 8]
갑상선 자극 단일클론 항체 M22를 이용하여 TBI 및 TSI 간의 비교
Figure 112014033075917-pct00007

상기 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 본원에서 참고적으로 도입된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범위 및 취지에서 벗어남이 없이 당업자에게 자명할 것이다. 비록 본 발명이 특정의 바람직한 실시양태의 관점에서 기재되어 있지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시양태에 부당하게 한정되지 말아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 실시하기 위한 기재된 모드의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> QUIDEL CORPORATION Li, Yunsheng Olivo, Paul D. Kim, Jaekyung <120> Compositions And Methods For Detecting Autoantibodies <130> DHI-17182 <140> PCT/US11/50976 <141> 2011-09-09 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 730 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro 1 5 10 15 Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His 20 25 30 Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro 35 40 45 Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu 50 55 60 Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg 65 70 75 80 Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser 85 90 95 Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg 100 105 110 Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu 115 120 125 Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu 130 135 140 Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys 165 170 175 Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val 180 185 190 Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn 195 200 205 Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val 210 215 220 Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala 225 230 235 240 Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn 245 250 255 Thr Trp Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ser Lys Glu Lys Phe Thr Ser Leu 260 265 270 Leu Val Ala Thr Leu Thr Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Ser Asn 275 280 285 Leu Pro Lys Lys Glu Gln Asn Phe Ser Phe Ser Ile Phe Glu Asn Phe 290 295 300 Ser Lys Gln Cys Glu Ser Thr Val Arg Lys Ala Asp Asn Glu Thr Leu 305 310 315 320 Tyr Ser Ala Ile Phe Glu Glu Asn Glu Leu Ser Gly Trp Asp Glu Leu 325 330 335 Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His Tyr Asp 340 345 350 Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro Lys Ser 355 360 365 Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe Leu Arg 370 375 380 Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn Val Phe 385 390 395 400 Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val Pro Arg 405 410 415 Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly Met Tyr 420 425 430 Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu Tyr Tyr 435 440 445 Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr Ala Gly 450 455 460 Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Val 465 470 475 480 Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg Leu Asp 485 490 495 Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly Gly Trp 500 505 510 Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile Ser Ser 515 520 525 Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr Pro Leu 530 535 540 Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val Ala Phe 545 550 555 560 Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val Arg Asn 565 570 575 Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg Met 580 585 590 Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe 595 600 605 Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val Ser Asn 610 615 620 Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys Ala Asn 625 630 635 640 Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp Val Phe 645 650 655 Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln Ala Tyr 660 665 670 Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln Val Gln 675 680 685 Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu Asp Val 690 695 700 Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln Gly Gln 705 710 715 720 Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu 725 730 <210> 2 <211> 2193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 atgaggccgg cggacttgct gcagctggtg ctgctgctcg acctgcccag ggacctgggc 60 ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg aggaggactt cagagtcacc 120 tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta cgcagactct gaagcttatt 180 gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta atctgcccaa tatttccaga 240 atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat cacactcctt ctacaatttg 300 agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact taacttacat agaccctgat 360 gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt tcaacactgg acttaaaatg 420 ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct ttatacttga aattacagac 480 aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg gactatgcaa tgaaaccttg 540 acactgaagc tgtacaacaa tggctttact tcagtccaag gatatgcttt caatgggaca 600 aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga cagttattga caaagatgca 660 tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt ctcaaaccag tgtcactgcc 720 cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag caagaaacac ctggactctt 780 aagacactgc cctccaaaga aaaattcacg agcctcctgg tcgccacgct gacctacccc 840 agccactgct gcgccttcag taatttgccg aagaaagaac agaatttttc attttccatt 900 tttgaaaact tctccaaaca atgcgaaagc acagttagaa aagcagataa cgagacgctt 960 tattccgcca tctttgagga gaatgaactc agtggctggg atgagctcaa 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Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val 115 120 125 Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro 130 135 140 Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175 Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile 180 185 190 Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val 195 200 205 Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp 210 215 220 Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val 225 230 235 240 Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu 245 250 255 Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu 260 265 270 Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val 275 280 285 Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr 290 295 300 Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser 305 310 315 320 Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile 325 330 335 Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr 340 345 350 Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe 355 360 365 Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val 370 375 380 Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly 385 390 395 400 Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly 405 410 415 Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430 Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln 435 440 445 Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile 450 455 460 Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465 470 475 480 Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys 485 490 495 Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu 500 505 510 Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly 515 520 525 Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys 530 535 540 Gly Gly Lys Ser Lys Leu 545 550 <210> 4 <211> 1653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380 caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa 1653

Claims (26)

  1. 트랜스제닉 세포를 포함하는 키트를 사용하여 시험 샘플에서 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI; Thyroid hormone Blocking Immunoglobulin)을 검출하는 방법으로서, 트랜스제닉 세포는
    1) 리포터를 코딩하며, cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 제1 뉴클레오티드 서열, 및
    2) 키메라 갑상선 자극 호르몬(TSH; Thyroid Stimulating Hormone) 수용체(TSHR; TSH Receptor)를 코딩하며, 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 서열번호:02의 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염되고,
    상기 세포는 세포막 상에서 상기 키메라 TSHR을 발현하며,
    a) i) 상기 트랜스제닉 세포, ii) 상기 TSHR에 결합시 상기 키메라 TSHR을 자극하며, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 갑상선 자극 단일클론 항체, 및 갑상선 자극 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 갑상선 자극 폴리펩티드, 및 iii) 대조 샘플 또는 시험 샘플인 샘플을 배합하는 단계로서, 상기 트랜스제닉 세포 및 상기 갑상선 자극 폴리펩티드와
    A) 상기 대조 샘플과의 상기 배합이 제1 샘플을 생성하고,
    B) 상기 시험 샘플과의 상기 배합이 제2 샘플을 생성하며,
    상기 배합이 상기 갑상선 자극 폴리펩티드의 상기 키메라 TSHR과의 결합을 위한 조건 하에 이루어지는 것인 단계, 및
    b) 상기 제1 샘플 및 상기 제2 샘플에서 상기 리포터의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 제1 샘플과 비교해서 상기 제2 샘플에서 상기 리포터의 감소된 발현 수준이 상기 시험 샘플에서 TBI의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TBI 검출 방법은, 상기 키메라 TSHR을 발현하는 상기 트랜스제닉 세포를 야생형 TSHR을 발현하는 세포로 치환하는 단계를 포함하는 상기 방법에서 TBI를 검출했을 때의 TBI IC50 보다 5배 내지 15배 더 작은 TBI IC50을 갖는 것인 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TBI 검출 방법은, 항-TBI 단일클론 항체와 TBI의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법에서 TBI를 검출했을 때의 TBI IC50 보다 10배 내지 30배 더 작은 TBI IC50을 갖는 것인 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 샘플과 비교해서 상기 제2 샘플에서 상기 리포터 의 감소된 발현 수준을 검출하는 단계를 더 포함하는 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    a) 상기 시험 샘플과의 상기 배합 후 상기 리포터의 발현 수준을,
    b) 상기 트랜스제닉 세포를, 각각 공지된 농도의 TSH를 함유하는 하나 이상의 표준 샘플과 접촉시킨 후 상기 리포터의 발현 수준과
    비교함으로써 상기 시험 샘플에서 TBI의 수준을 확인하는 단계를 더 포함하는 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서, TBI 특이적인 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 갑상선 자극 폴리펩티드가 100 mIU/ml 미만의 농도를 가지는 것인 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포터의 상기 발현이 생물발광 단백질의 발현을 포함하는 것인 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생물발광 단백질이 서열번호:03의 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 아미노산 서열을 포함하는 것인 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 트랜스제닉 세포가 서열번호:02의 키메라 TSH 수용체 서열로 형질감염된 CHO 세포를 포함하는 것인 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 갑상선 자극 폴리펩티드가 갑상선 자극 단일클론 항체인 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 갑상선 자극 폴리펩티드가 갑상선 자극 다클론 항체인 검출 방법.
  13. 트랜스제닉 세포를 포함하는 키트를 사용하여 샘플에서 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI) 및 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI; Thyroid hormone Stimulating Immunoglobuin)을 검출하는 방법으로서, 트랜스제닉 세포는
    1) 리포터를 코딩하며, cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 제1 뉴클레오티드 서열, 및
    2) 키메라 TSH 수용체(TSHR)를 코딩하며, 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 서열번호:02의 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염되고,
    상기 세포는 세포막 상에서 상기 키메라 TSHR을 발현하며,
    a) i) 상기 트랜스제닉 세포, ii) 갑상선 자극 호르몬(TSH), 갑상선 자극 단일클론 항체, 및 갑상선 자극 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 갑상선 자극 폴리펩티드, 및 iii) 대조 샘플 또는 시험 샘플을 배합하는 단계로서,
    상기 트랜스제닉 세포 및 상기 갑상선 자극 폴리펩티드와
    A) 상기 대조 샘플과의 상기 배합이 제1 샘플을 생성하고,
    B) 상기 시험 샘플과의 상기 배합이 제2 샘플을 생성하며,
    상기 배합이 상기 갑상선 자극 폴리펩티드의 상기 키메라 TSHR과의 결합을 위한 조건하에 이루어지는 것인 단계, 및
    b) 상기 배합 이전 및 상기 배합 이후에 상기 트랜스제닉 세포에서 상기 리포터의 발현 수준을 측정하는 단계로서,
    i) 상기 제1 샘플과 비교해서 상기 제2 샘플에서 상기 리포터의 감소된 발현 수준이 상기 시험 샘플에서 TBI의 존재를 나타내고,
    ii) 상기 제1 샘플과 비교해서 상기 제2 샘플에서 상기 리포터의 증가된 발현 수준이 상기 시험 샘플에서 TSI의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 샘플과 비교해서 상기 제2 샘플에서 상기 리포터 의 감소된 발현 수준을 검출하는 단계를 더 포함하는 검출 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 트랜스제닉 세포가 서열번호:02의 키메라 TSH 수용체 서열로 형질감염된 CHO 세포를 포함하는 것인 검출 방법.
  16. 하기를 포함하는 키트:
    a) i) cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터, 및 ii) 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된 키메라 TSH 수용체(TSHR)를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 상기 세포가 세포막 상에서 키메라 TSHR을 발현하는 것인 트랜스제닉 세포, 및
    b) 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 검출하기 위해 상기 트랜스제닉 세포를 사용하기 위한 설명서로서, 상기 설명서는
    A) i) 1) 리포터를 코딩하며, cAMP-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 2) 키메라 TSH 수용체(TSHR)를 코딩하며, 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 서열번호:02의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 트랜스제닉 세포로서, 상기 세포가 세포막 상에서 상기 키메라 TSHR을 발현하는 것인 트랜스제닉 세포, ii) 상기 TSHR에 결합시 상기 키메라 TSHR을 자극하며, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 갑상선 자극 단일클론 항체, 및 갑상선 자극 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 갑상선 자극 폴리펩티드, 및 iii) 대조 샘플 또는 시험 샘플인 샘플을 배합하는 단계로서,
    상기 트랜스제닉 세포 및 상기 갑상선 자극 폴리펩티드와
    a) 상기 대조 샘플과의 상기 배합이 제1 샘플을 생성하고,
    b) 상기 시험 샘플과의 상기 배합이 제2 샘플을 생성하며,
    상기 배합이 상기 갑상선 자극 폴리펩티드의 상기 키메라 TSHR과의 결합을 위한 조건 하에 이루어지는 것인 단계, 및
    B) 상기 제1 샘플 및 상기 제2 샘플에서 상기 리포터의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 제1 샘플과 비교해서 상기 제2 샘플에서 상기 리포터의 감소된 발현 수준이 상기 시험 샘플에서 TBI의 존재를 나타내는 것인 단계
    에 대한 지시를 포함하는 것인 설명서.
  17. 제16항에 있어서, 갑상선 호르몬 차단 면역글로불린(TBI)을 함유하는 양성 대조 샘플을 더 포함하는 키트.
  18. 제16항에 있어서, 갑상선 자극 호르몬(TSH)을 더 포함하는 키트.
  19. 제16항에 있어서, 샘플에서 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 검출하기 위한 설명서를 더 포함하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 갑상선 호르몬 자극 면역글로불린(TSI)을 함유하는 양성 대조 샘플을 더 포함하는 키트.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제1항에 있어서, TSH가 인간 TSH 또는 소 TSH인 검출 방법.
  25. 제13항에 있어서, TSH가 인간 TSH 또는 소 TSH인 검출 방법.
  26. 제16항에 있어서, TSH가 인간 TSH 또는 소 TSH인 키트.
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