JP3442784B2 - キナーゼ受容体活性化検定法 - Google Patents

キナーゼ受容体活性化検定法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明はキナーゼ受容体活性化（KIRA）検定法に関す
る。特には本発明は、キナーゼ受容体活性化、酵素結合
免疫吸着検定法（KIRA ELISA）を用いる、受容体プロ
テインチロシンキナーゼ（rPTK）のキナーゼドメインの
自己リン酸化を測定する検定法に関する。
関連技術の記述 動物における信号伝達の一つの機構はタンパク質リン
酸化を含む。タンパク質リン酸化は、リン酸基をリン酸
ドナーから基質タンパク質中のアクセプターアミノ酸へ
転移させる酵素であるプロテインキナーゼの作用を含
む。プロテインホスファターゼは刺激が除かれた場合、
信号を逆にする手段を提供する。
プロテインキナーゼは多重基質であり、プロテインキ
ナーゼの分類はアクセプターアミノ酸特異性に基づいて
いる。２つの最もよくキャラクタライズされたプロテイ
ンキナーゼは、プロテインセリン／トレオニンキナーゼ
と呼ばれる、アクセプターとしてタンパク質のアルコー
ル基を有するプロテインキナーゼ、およびプロテインチ
ロシンキナーゼと呼ばれる、アクセプターとしてタンパ
ク質のフェノール基を有するプロテインキナーゼである
（Hunter、Methods in Enzymology 200:3〜９［199
1］）。
最もよく知られたタイプの信号伝達性プロテインキナ
ーゼは、成長因子受容体プロテインチロシンキナーゼ
（rPTK）である。rPTKは通常、大きい、グリゴシル化さ
れた細胞外リガンド結合ドメイン（ECD）、およびチロ
シンキナーゼ触媒ドメインを有する細胞内ドメイン（IC
D）を含んでなる。単一の疎水性の膜貫通（TM）ドメイ
ンがECDとICDを結合する。rPTKの例にはインスリン受容
体、上皮増殖因子受容体（EGF−Ｒ）、血小板由来増殖
因子受容体（PDGF−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容
体（IGF−Ｒ）、およびHER2受容体を含む。例えばUllri
chおよびSchlessinger、Cell 61:203〜212（1990）お
よびFantl等、Ann.Rev.Biochem.62:453〜481（1993）を
参照。rPTKは外来のタンパク質基質および固有のチロシ
ン残基をその触媒チロシンキナーゼドメインによりリン
酸化できる。固有のチロシン残基は、通常rPTKのICDに
ある（図１参照）。rPTKの細胞内キナーゼドメインの活
性化は、リガンド結合によるECDのコンホメーション変
化から生ずる受容体オリゴメリ化により媒介される。Ul
lrichおよびSclessinger（上書）を参照。
セリン−トレオニンキナーゼも文献に開示されてい
る。公知のプロテインセリン−トレオニンキナーゼの大
部分は細胞質タンパク質であり、セリン−トレオニンキ
ナーゼドメインを有する哺乳動物の膜貫通受容体のファ
ミリーが最近見出された。この受容体ファミリーの膜は
TGF−βおよびアクチビンを結合すると記載されてい
る。セリン−トレオニンキナーゼの総説については、Sa
le,G.、Biochem.Soc.Transaction 20:664〜670（199
2）;ten Dijke等、Prog.in Growth Factor Res.5:5
5〜72（1994）；およびMathews,L.、Endoc.Rev.15
（３）:310〜325（1994）を参照。
チロシンキナーゼ活性を測定する様々な検定法が開発
されている。これらの検定法のいくつかは、チロシンキ
ナーゼ酵素が合成基質ポリペプチドをリン酸化する能力
を測定する。例えばキナーゼがATPのγ−リン酸の適当
なアクセプター基質への転移を触媒す能力を測定するこ
とにより、成長因子媒介チロシンキナーゼの活性を測定
する検定法が開発された。例えばPike,L.、Methods of
Enzymology、146:353〜362（1987）およびHunter、Jo
urnal of Biological Chemistry 257（９）:4843〜
4848（1982）を参照。この検定法では［γ−32P］ATPを
用いるとリン酸化基質（合成のチロシン含有ペプチドで
ある）の放射性標識が可能になる。他のものはプロテイ
ンキナーゼ検定法を記載し、その検定法では、EGF受容
体（Danato等、Cell Growth Differ.3:259〜268［199
2］参照）、インスリン受容体（Kasuga等、Journal of
Biological Chemistry 257（17）:9891〜9884［199
2］およびKasuga等、Methods in Enzymology、109:60
9〜621［1985］参照）、および肝臓成長ホルモン受容体
（Wang等、Journal of Biological Chemistry 267
（24）:17390〜17396［1992］参照）等のチロシンキナ
ーゼ受容体への32Pの導入を測定する。
抗ホスホチロシン抗体の発見はチロシン残基のリン酸
化を測定する非放射性の、別の手段を提供した。例えば
WhiteおよびBacker（Methods in Enzymology 201:65
〜67［1991］）は、ホスホチロシンに選択的に結合し、
rPTKを研究するのに有用であると考えられるポリクロー
ナル抗体について述べている。抗ホスホチロシンモノク
ローナル抗体がMadden等（Anal.Biochem.199:210〜215
［1991］）中に引用された検定法の一つで用いられ、そ
の検定法はインスリン受容体へのホスファターゼ活性を
測定する。抗ホスホチロシン抗体はCleaveland等によ
り、プロテインチロシンキナーゼELISA検定法でも用い
られている。Cleaveland等、Analytical Biochemistry
190:249〜253（1990）参照。Cleaveland等の方法は、
精製した高活性オンコジーンチロシンキナーゼ、ｖ−sr
cおよびｖ−fpsを用い、これらのチロシンキナーゼの、
ELISAマイクロタイタープレート上にコートした合成ポ
リマー基質をリン酸化する能力を測定する。ポリマー基
質のsrc−誘導リン酸化により作られたホスホチロシン
を、抗ホスホチロシン抗体により次に定量化し、抗体の
存在はリポーター酵素、ホースラディッシュパーオキシ
ダーゼ（HRPO）に結合した第２のラビット抗マウス抗体
を用いて検出する。類似のELISA検定法はLazaro等によ
り開発され、該検定法をプロテインチロシンキナーゼの
検出に用いる。Lazaro等、Analytical Biochemistry 19
2:257〜261（1991）を参照。Cleaveland等の検定法と同
様に、この検定もプロテインチロシンキナーゼの、ミク
ロELISAウエルに結合した合成基質をリン酸化する能力
を測定する。
rPTKの特異的な活性化を評価する直接的な方法は、受
容体自己リン酸化の分析による。HunterおよびCooper、
Ann.Rev.Biochem.54:897〜930（1985）およびUllrichお
よびSchlessinger、Cell 61:203〜212（1990）を参
照。この直接的アプローチを用いて、KnutsonおよびBuc
kは、in situおよびインビトロ条件下にインスリン受容
体の自己リン酸化を測定する検定法を開示する（Archie
ves of Biochemistry and Biophysics 285（２）:
197〜204［1991］）。そのIn situ検定法において胚性
マウス3T3−C2線維芽細胞（内因性のインスリン受容体
を有する）の単層培養物を大きい細胞培養皿中でインス
リンとインキュベートする。インキュベーション後、そ
のインスリン受容体を膜から抽出する。インスリン受容
体の抽出を行うために、その細胞単層をプロテアーゼ阻
害剤を含む緩衝液中にかき出し、次にその細胞をホモジ
ナイザーで破壊する。その細胞ホモジネートを次に60分
遠心分離に付し、生成するペレットを界面活性剤を含む
緩衝液中に抽出する。更なる遠心分離工程の後に、上清
（インスリン受容体を含む）を抗インスリン受容体抗体
とインキュベートする。次にその受容体抗体複合体をプ
ロテインＡ−アガロースとインキュベートし、占有され
ていないプロテインＡ部位を通常のラビット1gGでブロ
ックする。アガロースビーズを次に遠心分離し、上清を
アスピレートし、ペレットを放射能標識抗ホスホチロシ
ン抗体を含む緩衝液に再懸濁する。結合したヨウ素化抗
ホスホチロシン抗体の量が測定される。
Kleinとその協力者は、インスリン受容体のインスリ
ン活性化を測定する検定法を議論する（Klein等、Diabe
tes 42:883〜890［1993］）。この検定法では、インス
リン受容体を有する単核血液細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マ
クロファージ等を含む）のヘテロジニアスな集団のアリ
コートを遠心管中でインスリンと接触させる。その細胞
をモーター駆動ホモジナイザーを用いて界面活性剤中で
次に溶解し（lysed）、溶解産物を真空遠心分離を用い
て２〜４倍濃縮する。時にはインスリン受容体をコムギ
胚芽凝集素アガロースを用いて部分的に精製する。遠心
後生成する上清を次に抗インスリン受容体を被覆したミ
クロタイタープレートに移す。ミクロタイタープレート
に捕獲される受容体のパーセントを最適化するために、
インスリン（8.7nM）、並びにキナーゼおよびホスファ
ターゼ阻害剤が受容体固定化中存在する。インスリン受
容体の活性化を、32P標識ATPを用いる基質ポリGlu,Tyr
のリン酸基転位により次に測定する。上清を次に吸収紙
上にスポットし、その吸収紙を冷TCAで洗浄して、結合
していない32P−ATPを除去する。洗浄した吸収紙上に残
存する32P−標識ポリGlu,Tyをシンチレーションカウン
ティングにより次にカウントする。
Hagino等も患者におけるインスリン受容体の研究に興
味を持った（Hagino等、Diabetes 43:274〜280［198
4」）。検定法ンにおける第１工程として、Hagino等
は、細胞型に関して特にホモジニアスでない一次細胞懸
濁液を刺激する。特にヘパリン化血液（1mlを媒地で２
回洗浄し、牛血清アルブミンBSAを含む媒地1mlに再懸
濁）を、様々な濃度のインスリンに接触させる。自己リ
ン酸化反応を中止し、細胞を30分遠心分離し、上清を捨
て、このようにして得た赤血球ゴーストを緩衝液に再懸
濁し、再度遠心分離する。これによって得たペレットを
500μに調節し、界面活性剤中に溶解する。溶解した
物質を次に遠心分離し、得られた上清をサンドイッチEL
ISA（抗インスリン受容体抗体を用いてインスリン受容
体を捕獲する）に付し、インスリン受容体自己リン酸化
の程度を測定する。
King等（Life Sciences 53:1465〜1472［1993］）
は、ヒトの無傷の表皮A431細胞における表皮細胞成長因
子（EGF）受容体関連チロシンキナーゼの阻害剤を調べ
るための比色検定法を記述する。
幾人かの他の人は、受容体自己リン酸化を測定するウ
エスタンブロット分析において酵素に結合した形の抗ホ
スホチロシン抗体を用いた。簡単に言えば、ウエスタン
ブロッティングは一般にポリアクリルアミドゲル上で活
性化rPTKを電気泳動することを含む。rPTKを次にニトロ
セルロースに移し、検出を可能にするよう標識した抗ホ
スホチロシン抗体でイムノブロットする。例えば、Wan
g,Molecular and Cellular Biology ５（12）:3640
〜3643（1985）;Glenney等、Journal of Immunologic
al Methods 109:277〜285（1988）;Kamps、Methods i
n Enzymology 201:101〜110（1991）;Kozma等、Metho
ds in Enzymology 201:28〜43（1991）;Holmes等、Sc
ience 256:1205〜10（1992）；およびCorfas等、PNAS,
USA 90:1624〜1628（1993）を参照。しかしウエスタン
ブロットの場合、正確な定量は非常に煩雑である。さら
にこの技術は時間を要す傾向があり、一般に高サンプル
処理ができない。
受容体プロテインチロシンキナーゼ（rPTK）自己リン
酸化を測定する感度の良い、信頼できる検定法を提供す
るのが本発明の目的である。その検定法はキナーゼ活性
化を定性的および定量的に測定し、およびある測定され
たrPTKの可能なアゴニストおよびアンタゴニストの同定
および特性づけを容易にするのに望ましく有用である。
リガンド−受容体相互作用をいずれかの選択したrPTKに
ついて研究することを可能にする検定法を提供するのが
本発明の更なる目的である。
この検定法は高処理量能力、すなわち、多数のサンプ
ルを比較的短時間で（例えば１日で）信頼可能に評価す
る能力を有しなければならない。その検定法は理想的に
は放射性材料を使用せず、自動化もすることができる。
所望の特徴を有する受容体特異的な捕獲剤が利用でき
るかどうかとは関係なく、問題のrPTKを研究することを
可能にする一般的な検定法を提供することは、本発明の
少なくとも一態様において、本発明の更なる目的であ
る。更に、in situでのチロシンキナーゼ受容体の活性
を実質的に表す検定法を提供するのは本発明の目的であ
る。受容体とリガンド間の相互作用の変化が膜に結合し
ていない受容体の結果として生ずる可能性を減少させる
限りにおいてこれは望ましい。更に受容体がマルチマー
的複合体であるなら、この検定法は正しく組立てられた
受容体を研究するのを可能にする。セリン−トレオニン
キナーゼリン酸化、細胞内キナーゼのリン酸化およびホ
スフォターゼ活性を測定する方法を提供するのが更なる
目的である。
これらおよび他の目的は、全体として本明細書を考慮
することにより当業者に明白であろう。
発明の要約 従って本発明は、問題のチロシンキナーゼ受容体の活
性化（すなわち自己リン酸化）を測定する検定法を提供
する。
その検定法は２つの主な段階に分けられる。各段階は
一般に別のアッセイプレートで行なう。検定法の第１段
階は受容体を活性化することを含み、検定法のキナーゼ
受容体活性化（KIRA）段階と呼ぶ。検定法の第２段階は
受容体活性化を測定することを含む。便利にはこれは、
酵素結合免疫吸着剤検定法（ELISA）を用いて行われ、
受容体活性化を測定する。
検定法のKIRA段階は、真核細胞の細胞膜に位置するチ
ロシンキナーゼ受容体を活性化することを含み、受容体
の細胞外ドメインは細胞の外部環境に面し、膜貫通ドメ
インは細胞膜中に位置し、キナーゼドメインは細胞内に
位置する。この段階の全体の検定法は下の（ａ）〜
（ｃ）を含む。
（ａ）第１の固相（例えば第１のアッセイプレートのウ
エル）を、細胞（通常は哺乳動物の細胞系）の実質的に
ホモジニアスな集団（population）で被覆し、細胞を固
相に付着させる。しばしば細胞は付着性であり、したが
って第１の固相に自然に付着する。本発明の一態様で
は、細胞は上に議論したように細胞膜に提示された内因
性のチロシンキナーゼ受容体を有する。別の態様では、
細胞は、チロシンキナーゼ受容体または以下で更に定義
する「受容体構築物」をコードするDNAで形質転換さ
れ、該DNAは受容体または受容体構築物が細胞膜中で適
当に位置するように細胞により発現される。
受容体構築物は、キナーゼ受容体とフラグ（flag）ペ
プチドの融合を含んでなる。フラグペプチドは検定法の
ELISA部分において捕獲剤、しばしば捕獲抗体により認
識される。本明細書に開示する受容体構築物の使用は特
に有益である。何故なら必要とされる特性を有する受容
体特異的な捕獲剤が利用できるか否かにかかわらず、い
かなるチロシンキナーゼ受容体の自己リン酸化をも測定
できる「一般的な」検定法をそれは提供するからであ
る。しばしばチロシンキナーゼ受容体は、ある選択され
たチロシンキナーゼのECDおよび他のよく特性づけされ
たチロシンキナーゼ（例えば、Rse受容体）の触媒的なI
CD（および多分膜貫通ドメイン）を含んでなる融合タン
パク質である。
（ｂ）分析物を付着細胞を有するウエルに次に加え、チ
ロシンキナーゼを分析物にさらす（すなわち接触させ
る）。この検定法は問題のチロシンキナーゼ受容体につ
いてのアゴニストおよびアンタゴニストリガンドの同定
を可能にする。アゴニストリガンドによる受容体の結合
および／または活性化をブロックするアンタゴニストリ
ガンドの存在を検出するために、付着細胞を先ず考えら
れるアンタゴニストリガンドに接触させ、次にアゴニス
トリガンド（またはアゴニストとアンタゴニスト混合
物）に接触させ、受容体結合および活性化の競合的阻害
を測定できる。また該検定法はアゴニストリガンドに結
合しそれによってrPTKに結合し、活性化するアンタゴニ
ストの能力を減少させ、失くすアンタゴニストを同定で
きる。そのようなアンタゴニストを検出するためにrPTK
に対する考えられるアンタゴニストおよびアゴニストを
一緒にインキュベートし、次に付着細胞をこのリガンド
混合物に接触させる。
（ｃ）分析物と接触させた後、付着細胞を細胞溶解緩衝
液（その中に溶解用界面活性剤を含む）および穏やかな
撹拌を用いて溶解させ、それによって、検定法のELISA
部分に細胞溶解産物の濃縮または清澄化なしに直接付す
ことのできる細胞溶解産物を放出させる。かくしてこの
検定法は、ELISA前に細胞溶解産物を濃縮することが驚
くべきことに不必要である点において、KnutsonおよびB
uck（上書）、Klein等（上書）およびHagino等（上書）
により記載された検定法に比べ顕著な改良を提供する。
さらに他の検定法とは異なり本検定法においては、細胞
は、細胞をホモジナイズし、遠心分離し、または清澄化
する必要なしに、細胞溶解緩衝剤中での穏やかな撹拌を
用いて溶解できる。このように調製された細胞溶解物は
検定法のELISA段階に付す準備ができる。検定法のELISA
段階の前に第１アッセイプレートは凍結温度（すなわち
約−20゜〜70℃）で相当な時間（少なくとも６月）貯蔵
できることが驚くべきことに発見された。これは、検定
法のKIRAおよびELISA段階を別の日に行い得る点におい
て重要な発見である。
検定法のELISA部分は工程（ｄ）〜（ｈ）を含んでな
り、以下に記載する。
（ｄ）第１工程として、第２の固相（通常ELISAマイク
ロタイタープレートのウエル）を、チロシンキナーゼ受
容体に、または受容体構築物の場合にはフラグポリペプ
チドに特異的に結合する捕獲剤（しばしば捕獲抗体）で
被覆する。第２固相の被覆は捕獲剤が第２固相に付着す
るよう行われる。捕獲剤は通常モノクローナル抗体であ
るが、実施例に記載するようにポリクローナル抗体も用
いてよい。
（ｅ）検定法の上述のKIRA段階の工程（ｃ）で得られた
細胞溶解物を、付着している捕獲剤にさらし、または接
触させ、受容体または受容体構築物は第２固相に付着す
る（または捕獲される）。Klein等の検定法とは異な
り、第２固相への受容体または受容体構築物の適当な固
定化を達成するために、受容体に対するリガンドおよび
キナーゼ阻害剤が存在することを本方法は要しない。
（ｆ）結合していない細胞溶解物を除去するため洗浄工
程を次に行い、捕獲された受容体または受容体構築物を
残す。
（ｇ）付着し、または捕獲された受容体または受容体構
築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチ
ロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に次にさら
しまたは接触させる。好ましい態様では抗ホスホチロシ
ン抗体を、非放射性の発色試薬の色変化を触媒する酵素
にコンジュゲート（直接または間接に）する。したがっ
て受容体のリン酸化を、試薬のその後の色の変化により
測定し得る。酵素を抗ホスホチロシン抗体に直接結合す
ることができ、またはコンジュゲート用分子（例えばビ
オチン）を抗ホスホチロシン抗体にコンジュゲートし、
酵素を、抗ホスホチロシン抗体に、コンジュゲート用分
子を介してその後結合できる。
（ｈ）最後に、捕獲された受容体または受容体構築物へ
の抗ホスホチロシン抗体の結合を、例えば発色試薬の色
変化により測定する。
本発明は、KIRA ELISA検定法における使用に特に有
用なRse.フラグ試薬にも関する。Rse.フラグ試薬は、フ
ラグポリペプチド（通常、本明細書に記載するgDフラ
グ）の、Rse rPTKの細胞内ドメインのカルボキシ末端へ
の融合を含むポリペプチドである。一般に、Rseの膜貫
通ドメインおよび問題の他のrPTKの細胞外ドメインも、
融合ポリペプチド試薬中に存在する。この試薬をコード
する核酸およびそれによって形質転換された細胞も特許
請求する。
他の要旨では、本発明は、上に開示したKIRA ELISA
に用いることのできるキットに関し、本明細書に記載す
る第２固相に通常結合する抗フラグポリペプチド捕獲剤
（例えば捕獲抗体）を含んでなる。従ってキットはウエ
ルに付着する抗フラグポリペプチド捕獲抗体を有するEL
ISAマイクロタイタープレートを通常提供する。場合に
よりキットはしばしば標識された抗ホスホチロシン抗体
をも提供し、または抗ホスホチロシン抗体を標識する試
薬をキットと共に供給する。時には本明細書に記載する
受容体構築物で形質転換した細胞の均一な集団をもキッ
トと共に提供する。キットはKIRA ELISAを行うための
説明書も適用に含む。
図面の簡単な記述 図1A−1Cは、Rse.gD（図1A）、受容体ECD/Rse.gDキメ
ラ（図1B）、および受容体ECD/Rse.gDキメラで形質転換
されたCHO細胞（図1C）の模式的な表示である。
図2Aおよび2Bは、Rse.gDのアミノ酸配列（配列番号
１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）の配列を示
す。シグナル配列の残基は（★）で示し、Rseの膜貫通
ドメインをボックスで囲み、RseのECDおよびICDを記述
する。gDフラグ配列の残基はアンダーラインをつける。
図３は、検定法での使用に適した捕獲剤を選択するた
めの例示的な戦略のフローダイアグラムである。
図４は、検定法での使用に適した形質転換細胞を選択
するための例示的な戦略のフローダイアグラムであり、
細胞は細胞膜に位置するアミノ末端フラグポリペプチド
を有する受容体構築物を有する。
図５は、検定法での使用に適した形質転換細胞を選択
するための例示的な戦略のフローダイアグラムであり、
細胞は細胞膜に位置するカルボキシ末端フラグポリペプ
チドを有する受容体構築物を有する。
図６は、実施例１に記載するHER2受容体についてのKI
RA ELISA検定法を説明するフローチャートおよびカー
トーンである。
図７は、実施例１に記載する検定法を用いて得られた
p185HER2/HRGβ1177-244KIRA ELISA標準曲線を示す。
標準曲線を得るために、定量的なアミノ酸分析（q.a.a.
a.）により測定した、3000、1000、333、111、37、12、
４または0pM HRGβ1177-244でMCF−７細胞（２×105）
を刺激した。各キャリブレータ濃度は３回試験した。10
のそのような標準曲線から得られた値を平均し（全ｎ＝
30）、平均ABS450/650±sd対HRGβ1177-244濃度として
示す。
図８は、実施例１のp185HER2/HRG KIRA ELISAのヘ
レグリン特異性を示す。検定法において、HRGβ1
177-244（■）を用いて3000、1000、333、111、37、1
2、４、若しくは0pMで、またはIGF−１（▲）、EGF
（□）、VEGF（●）若しくはインスリン（◆）を用いて
30000、10000、3333、1111、370、120、40若しくは0pM
で、MCF−７細胞（２×105）を刺激した。すべてのリガ
ンド濃度について、ｎ＝３であり、データは平均ABS
450/650±sd対リガンド濃度として示した。
図９は、実施例２に記載するRse受容体についてのKIR
A ELISA検定法を説明するフローチャートおよびカート
ーンである。
図10は、実施例２に記載する検定法を用いて得られた
Rse KIRA ELISA標準曲線を示す。標準曲線を得るため
に、Rse.gD構築物で形質転換したCHO細胞を、1:100、1:
200、1:400、1:800、1:1600、1:3200または０希釈した
抗Rseアゴニスト抗体で刺激した。各キャリブレーター
濃度は３回試験した。値は、平均ABS450/650±sd対1/希
釈アゴニスト抗体として示す。
図11は、実施例３に記載するtrk受容体（すなわちtrk
A、trkBおよびtrkC）についてのKIRA ELISAを説明する
フローチャートおよびカルトーンである。
図12A−12Dは、実施例３に記載する検定法に用いるg
D.trkAのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチ
ド配列（配列番号４）の配列を示す。シグナル配列の残
基を（★）で示し、gDフラグ配列の残基にはアンダーラ
インを付し、trkAの膜貫通ドメインの残基は太線で示
し、そのECDおよびICDを記述する。
図13A−13Dは、実施例３に記載する検定法で用いるg
D.trkBのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチ
ド配列（配列番号６）の配列を示す。シグナル配列の残
基を（★）で示し、gDフラグ配列の残基にはアンダーラ
インを付し、trkBの膜貫通ドメインの残基は太線で示
し、そのECDおよびICDを記述する。
図14A−14Dは、実施例３に記載する検定法で用いるg
D.trkCのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチ
ド配列（配列番号８）の配列を示す。シグナル配列の残
基は（★）で示し、gDフラグ配列の残基はアンダーライ
ンを付し、trkCの膜貫通ドメインの残基は太線で示し、
そのECDおよびICDを記述する。
図15A−15Cは、実施例３に記載する検定法を用いて得
られた、それぞれtrkA、ＢおよびＣについての標準曲線
を示す。標準曲線を得るために、gD.trk構築物で形質転
換したCHO細胞を、リガンド、すなわち神経成長因子（N
GF,■）、ノイロトロフィン３（NT3,●）、またはノイ
ロトロフィン５（NT5,▲）の3000、1000、333、111、3
7、12、４または0pMで刺激した。値は平均ABS450/650±
sd対リガンド濃度として示す。
図16A−16Lは、実施例２のRse.gDの発現に用いるpSVI
17.ID.LL発現ベクターのヌクレオチド配列（配列番号
９）を示す。
図17は、実施例４に記載するMPL/Rse.gDキメラ受容体
の模式的な表示である。
図18は、実施例４に記載するMPL/Rse.gDキメラ受容体
についてのKIRA ELISAを説明するフローチャートおよ
びカートーンである。
好ましい態様の詳細な記述 I.略号および定義 「rPTK」は、受容体プロテインチロシンキナーゼを意
味する。
「ECD」、「TMドメイン」および「ICD」はそれぞれ、
rPTKの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイ
ンを意味する。
本出願において用いる場合「キナーゼ受容体活性化」
または「KIRA」は、今特許請求する検定法の第１段階を
言い、該検定法では、細胞に結合したrPTKを、rPTKの細
胞内ドメインのチロシン残基のリン酸化を誘導し得る
（またはし得ない）可能性のあるアゴニスト／アンタゴ
ニストと接触させる。KIRAは本明細書で定義する「第１
のアッセイプレート」中で一般に行う。
「酵素結合免疫吸着剤検定法」または「ELISA」と
は、今特許請求する検定法の第２段階を言い、rPTKのチ
ロシンリン酸化の測定を含む。ELISAは本明細書に開示
する「第２のアッセイプレート」中で通常行う。ELISA
は、それが第２固相（通常はELISAマイクロタイタープ
レートのウエル）へのrPTKまたは受容体構築物捕獲を含
む限りにおいて「サンドイッチELISA」である。ELISA検
定法は、酵素−抗体コンジュゲートの調製を一般に含
む。コンジュゲートした酵素は基質を解裂して、分光学
的に検出できる着色した反応生成物を生じる。この検定
法において個々のマイクロタイターウエル中の着色した
溶液の吸収は、ホスホチロシンの量に比例する。ELISA
の総説はCurrent Protocols in Molecular Biology
２巻、11章（1991）中に見出される。「ELISA」とい
う語は本検定法の第２段階を記載するのに用いるが、そ
れは本発明の好ましい態様にすぎない。なぜなら、本明
細書に開示するように酵素的検出以外の技術が、活性化
した受容体への抗ホスホチロシン抗体の結合の測定に利
用できるからである。
「受容体」、「キナーゼ受容体」、「チロシンキナー
ゼ」、「チロシンキナーゼ受容体」、「受容体プロテイ
ンチロシンキナーゼ」および「rPTK」は本明細書では互
換的に用い、少なくとも１つのリン酸を受容するフェノ
ール基を有するタンパク質を言う。そのタンパク質は、
それがリガンド結合性のECD、TMドメインおよびICDを有
する限りにおいて通常受容体である。ICDは通常触媒的
なキナーゼドメインを含み、１またはそれ以上のリン酸
を受容するチロシン残基を有する。例えば図1Aおよび1B
を参照。チロシンキナーゼ受容体の例には、インスリン
受容体、インスリン関連受容体、上皮増殖因子受容体
（EGF−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体ＡおよびＢ（P
DGF−Ｒ−ＡおよびPDGF−Ｒ−Ｂ）、インスリン様増殖
因子１受容体（IGF−１−Ｒ）、マクロファージコロニ
ー刺激因子受容体（Ｍ−CSF−Ｒ）、HER2/neu/c−erbB
−２受容体、HER3/c−erbB−３受容体、Xmrk受容体、IR
R受容体、線維芽細胞増殖因子（FGF）受容体bekおよびf
lg、ｃ−kit受容体、Flk/kDR受容体、Rse受容体、Eph、
Elk、EcK、Eek、Erk、Cek4/Mek4/HEkおよびCek5受容
体、Ax1受容体、肝細胞増殖因子受容体（HGF−Ｒ）、Fl
t1VEGF受容体、SAL−S I受容体、HpTk5受容体、trkA受
容体、trkB受容体およびtrkC受容体を含む。例えば、Ul
lrichおよびSchlessinger、Cell 81:203〜212（199
0）;Fantl等、Annu.Rev.Biochem.62:453〜481（1993）;
Mark等、Journal of Biological Chemistry、269（1
4）:10720〜10728（1994）；およびWO93/15201を参照。
上述の語は、選択されたチロシンキナーゼの少なくと
も細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン、および場合に
より他のチロシンキナーゼの膜貫通ドメインを含んでな
るキメラ「受容体」分子を包含する。勿論問題のチロシ
ンキナーゼは膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメ
インを提供し得る。その語は、様々なrPTKのアミノ酸配
列変異体および共有結合誘導体を、それがKIRA ELISA
においてチロシンキナーゼリン酸化活性を未だ示すなら
ば、包含する。それ故該変異体は保存的なアミノ酸の変
化を一般に有するであろう。チロシンキナーゼの個々の
ドメインは公知のチロシンキナーゼに対する配列相同性
および疎水性プロットに基づいて記述できる。例えば疎
水的な膜貫通ドメインは容易に決定でき、ECDとICDは通
常膜貫通ドメインの、それぞれアミノ末端およびカルボ
キシル末端である。便利にはRse受容体の膜貫通ドメイ
ンとICDを問題のチロシンキナーゼのECDに融合し、それ
によって上述のように受容体を示す用語に包含されるキ
メラ受容体を形成できる。
好ましい態様ではrPTKを、HER2受容体（Ullrichおよ
びSchlessinger、上書）、Rse受容体（Mark等、上書、
配列番号１）、trkA受容体（配列番号３）、trkB受容体
（配列番号５）およびtrkC受容体（配列番号７）よりな
る群から選択する。
「自己リン酸化」とはrPTKの触媒的なキナーゼドメイ
ンの活性化を意味し、それによって少なくとも１つの固
有のチロシン残基がリン酸化される。一般に自己リン酸
化はアゴニスト分子がキナーゼ受容体の細胞外ドメイン
に結合した場合に生じるであろう。特定の作用機構に限
定されることなく、アゴニスト分子の結合はキナーゼ受
容体のオリゴメリ化をもたらし、それが触媒的なキナー
ゼドメインの活性化を起こすかも知れないと考えられ
る。
「固相」とは、細胞（検定法のKIRA段階で）または捕
獲剤（検定法のELISA段階で）が付着し得る非水系のマ
トリックスを意味する。通常、固相はアッセイプレート
のウエルを含むが本発明はこの態様に限定されない。例
えば固相は分離した粒子よりなる非連続的な固相を含み
得る。その粒子は多孔性で、多くの異なった材料、例え
ば多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、
ポリスチレン、ポリビニルアルコール、シリコーンおよ
びガラスから形成し得る。適当な粒状固相の例について
は米国特許第4,275,149号を参照。
「ウエル」とは水性の試料を置き得る凹んだところ
（recess）または保持スペースを意味する。ウエルは
「アッセイプレート」に設けられる。本発明は「第１の
アッセイプレート」を用い、それは細胞（受容体または
受容体構築物を有する）の付着を最適にする材料（例え
ばポリスチレン）から形成される。一般に、第１アッセ
イプレートの個々のウエルは体積比に対し大きい表面積
を有し、それ故適当な形は平底のウエル（そこに細胞が
付着する）である。「第２のアッセイプレート」は捕獲
剤の付着を最適にする材料（例えばポリスチレン）から
一般に形成される。第２アッセイプレートは第１アッセ
イプレートと同じ一般的な構成および／または特徴を有
する。しかしながら検定法のKIRA段階とELISA段階に別
のプレートを用いる。
本発明の好ましい態様では、第１アッセイプレートお
よび第２アッセイプレートの両方とも「ミクロタイタ
ー」プレートである。本明細書で用いる「ミクロタイタ
ー」プレートの語は、約30〜200の個々のウエル、通常9
6ウエルを有するアッセイプレートを言う。しばしばマ
イクロタイタープレートの個々のウエルは約250μの
最大容量を保持するであろう。便利には第１アッセイプ
レートは96ウエルのポリスチレンまたはプラスチックの
細胞培養マイクロタイタープレート（Becnon Dickinso
n Labware、Lincoln Park、ニュージャージによって
販売されているもののような）であり、それは自動化可
能である。しばしば細胞が懸濁している細胞培養培地を
含む水性の試料約50μ〜300μ、より好ましくは100
μ〜200μを、検定法のKIRA段階において第１アッ
セイプレートの各ウエルに加えるであろう。ウエル当り
約１×104〜３×105の細胞を接種することが望ましい。
より好ましくはウエル当り５×104〜１×105の細胞を接
種する。通常第２アッセイプレートはNunc Maxisorp、
Inter Med、デンマークにより販売されているもののよ
うなポリスチレンマイクロタイターELISAプレートを含
むであろう。
「細胞の均一な集団」の語は、集団中の細胞の少なく
とも約80％、好ましくは90％が同じ細胞形を有する実質
的に均一な細胞集団を言う。それ故細胞系を用いるのが
便利である。細胞系は真核生物細胞系、通常は動物の細
胞系、望ましくは哺乳動物の細胞系である。
その細胞は選択された受容体または受容体構築物を有
し、または形質転換されて産生する。例えばキナーゼ受
容体がある細胞系に存在することが知られている場合
（例えばMCF−７細胞系におけるHER2受容体）、形質転
換工程は不要である。逆に、細胞が受容体を作らない
か、または細胞膜中に適当な数の受容体を有しない場合
には、細胞を受容体をコードする核酸で形質転換するこ
とが必要かも知れない。したがって細胞は受容体（また
は受容体構築物）をコードする核酸で形質転換され、核
酸が発現され、その受容体のECDは細胞の外側の環境に
面し、膜貫通ドメインは細胞膜に位置し、キナーゼドメ
インは細胞内に位置する。
検定法が内生のrPTKの活性化に頼る場合には、十分な
レベルのrPTKが細胞膜に存在し検出が可能であることを
条件に、問題のrPTKを産生することが知られている細胞
系を選択する。一般的な案として約１×104受容体／細
胞という最小数が必要である。例えばHER2受容体を産生
するMCF−７細胞系（ATCC−HTB22）は検定法に有用であ
ることが示された。５×104HER2受容体/MCF−７細胞が
存在する。他の細胞系およびそれらのそれぞれのrPTKの
例は、胚性マウス3T3−C2線維芽細胞細胞系およびイン
スリン受容体、およびHep3B（ATCC＃HB8064）細胞系お
よびRse受容体を含む。しかしながら細胞系におけるrPT
K核酸の発現の程度は大きくないのでrPTKの構成的（con
stitutive）リン酸化をもたらす。例えば３×106HER2受
容体／細胞を有するSK−BR−３細胞系（ATCC HTB30）は
本明細書に開示する検定法での使用に適しないことがわ
かった。それ故、受容体の種類に依存して、約３×106
受容体／細胞以下を有する細胞系を用いるのが有用かも
知れない。受容体／細胞の数は例えばScatchard分析（S
catchard、Ann.NY Acad.Sci.51:660〜672［1949］;Goo
dwin等、Cell 73:447〜456［1993］）を用いて測定で
きる。しかし適当な数の受容体／細胞を有する細胞系の
選択は本明細書に記載する技術を用いて可能である。
細胞を記述するため本明細書で用いる「付着」の語
は、第１固相（しばしば第１アッセイプレートのウエ
ル）に自然に付着し、それによってウエルの内表面上に
細胞によるかなり均一な被覆を形成する細胞を言う。細
胞による均一な被覆は、第１アッセイプレートのウエル
中で細胞を約８〜16時間インキュベートした後に一般に
形成される。インキュベーションの後に、非付着細胞お
よび細胞培養培地を第１アッセイプレートからデカント
して除く。インキュベーションは細胞の増殖に最適の温
度、すなわち約37℃で通常行う。付着性細胞系の例はCH
O細胞（UrlaubおよびChasin、Proc.NaH.Acad.Sci.USA
77:4216［1980］）、MCF−７細胞（ATCC HB22）、293
細胞（Graham等、J.Gen.Virol.36:59［1977］）、Swiss
albino 3T3線維芽細胞細胞系（ATCC No.CCL92）、
およびU937マクロファージ細胞系（ATCC No.CRL1593）
を含む。
「フラグポリペプチド」は、「捕獲剤」をそれに対し
て作ることができるエピトープ（好ましくは直鎖状のエ
ピトープ）を提供するに十分な残基を有するが、rPTKの
活性を妨害しないほど短い、短いポリペプチドを含んで
なる。フラグペプチドは、それに対する捕獲剤が検定法
の他の試薬に結合しないほど十分にユニークである。
「ユニーク」なフラグポリペプチド配列の選択は、例え
ばGenbankまたはEMBLにおいて他の公知の配列に対して
提案されたフラグポリペプチドの配列を比較することに
より行うことができる。適当なフラグポリペプチドは一
般に少なくとも６アミノ酸残基、通常は約８〜80アミノ
酸残基（好ましくは約９〜30アミノ酸残基）を有する。
「受容体構築物」とは、キナーゼ受容体と上に定義し
たフラグポリペプチドの融合を含んでなるポリペプチド
を意味する。フラグポリペプチドは、ａ）フラグポリペ
プチドが受容体へのリガンド結合を妨害しない、ｂ）フ
ラグポリペプチドは受容体の自己リン酸化を妨害しな
い、およびｃ）フラグポリペプチドは、検定法のELISA
段階で捕獲剤に結合できるよう適当な立体配置で存在す
るよう受容体構築物のある位置に設けられる。しばしば
ポリペプチドフラグは受容体構築物のＮ末端に存在する
であろう。例えば、gD.trk構築物についての実施例３を
参照。或いは、フラグポリペプチドは受容体構築物のＣ
末端に存在してもよい。例えば、Rse.gD構築物に言及す
る実施例２を参照。図1A−1Cも参照。本明細書に開示す
るRse構築物は特に有用である。何故ならそのLCD（およ
び場合により膜貫通ドメイン）は問題のキナーゼ受容体
のECDに融合でき、それによってフラグポリペプチドが
問題のキナーゼ受容体に関してどこに位置すべきかを決
める必要をなくすからである。
「Rse.gD」とは、そのCOOH末端に融合した単純疱疹ウ
イルスのグリコプロテインＤ（gD）フラグポリペプチド
を有するRse受容体プロテインチロシンキナーゼである
受容体構築物を言う。
「Rse.フラグ試薬」とは、COOH末端でフラグポリペプ
チド（通常gDフラグポリぺプチド）に融合したRse受容
体のICDを含んでなるポリペプチドを言う。時には、Rse
のTMドメインおよび問題のrPTKのECDもRse.gD試薬中に
存在するであろう。「受容体ECD/Rse.gDキメラ」とは、
gDフラグポリペプチドへCOOH末端で融合したRseのTMお
よびICDドメインへの問題のrPTKのECDの融合を言う。
「gD.trkA」、「gD.trkB」、および「gD.trkC」は、
アミノ末端に融合したgDフラグポリペプチドを有する各
trk受容体（Ａ〜Ｃ）を言う。
「捕獲剤（捕捉剤）」とは、本明細書で定義した第２
固相に結合することができる。rPTKまたは受容体構築物
に選択的な化合物または薬剤を意味する。したがって捕
獲剤は第２アッセイプレートのウエルへ受容体または受
容体構築物を捕獲する。通常、捕獲剤は問題の受容体に
融合しているフラグポリペプチドに選択的に結合する。
捕獲剤の結合は受容体に結合したリガンドの存在または
不存在に影響されず、捕獲により受容体活性化を誘導し
ない。さらに捕獲剤は抗ホスホチロシン抗体によるリン
酸化チロシンへの接近を立体的にブロックしない。適当
な捕獲剤を選択する手段は本明細書に記載する。一般に
捕獲剤は抗体（例えばアフィニティ精製されたポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体）を含んでなる
が、「strep−tag」ポリペプチドに選択的に結合するス
トレプタビジン等の他の選択性試薬も用い得る（Schmid
t等、Protein Engineering ６（１）:109〜122［199
3］）。ストレプタビシンは例えばZymed Laboratories
S,San Francisco、カリフォルニアから商業的に購入
し得る。或いは捕獲剤はプロテインＡ（免疫グロブリン
に特異的に結合する）を含み得る。本発明のこの態様で
は細胞溶解物中に存在する活性化された受容体または受
容体構築物をそれに特異的に結合する抗体とインキュベ
ートし、それによって受容体−抗体複合体を形成する。
この複合体を、複合体中に存在する抗体への特異的結合
によってプロテインＡにより捕獲できる。プロテインＡ
は例えばPharmacia Biotech Inc.Piscataway、ニュー
ジャージーより商業的に購入できる。適当な捕獲剤を選
択する戦略は図３に示されており、後により詳細に記載
するであろう。
最も好ましい態様においては、捕獲剤はフラグポリペ
プチド（受容体構築物中に存在する）に特異的に結合す
るモノクローナル抗体である。適当なフラグポリペプチ
ドおよびそれらのそれぞれの捕獲抗体の例には、flu HA
フラグおよびその抗体12CA5（Field等、Mol.Cell Biol
8:2159〜2165［1988］）;C−mycフラグおよびそれに
対する8F9、3C7、6E10、G4、B7および9E10抗体（Evan
等、Molecular and Cellular Biology ５（12）:36
10〜3616［1985］）；および単純性疱疹ウィルスグリコ
プロテインＤ（gD）フラグおよびそれに対する5B6抗体
（Paborsky等、Protein Engineerings ３（６）:547
〜553［1990］およびMark等、Journal of Biological
Chemistry 269（14）:10720〜10728［1994］）を含
む。他のフラグポリペプチドが開示されている。例とし
てはFlag−ペプチド（Hopp等、Biotechnology 6:1204
〜1210［1988］）、KT3エピトープペプチド（Martin
等、Science 255:192〜194［1992］）；α−チュブリ
ンエピトープペプチド（Skinner等、J.Biol.Chem.266:1
5163−15166［1971］）；およびT7ジーン10プロテイン
ペプチドTag（Lutz−Freyermuth等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87:6393〜6397［1990］）を含む。フラグポリペ
プチドが上記のように選択されると、それに対する捕獲
抗体を本明細書に開示する技術を用いて作ることができ
る。
「分析物」の後は、研究されるべき、通常は問題のチ
ロシンキナーゼ受容体を活性化する（または活性化を妨
げる）その能力を調査する化合物または組成物を言う。
分析物は、体液（血漿または羊水等の）、またはチロシ
ンキナーゼ受容体のリガンドを含むことが知られ、また
は含むのではないかと考えられている組成物を含み得
る。分析物は問題のrPTKに対するリガンドを有する細胞
をも含む。
本明細書で用いる「リガンド」とは、問題のチロシン
キナーゼのECDに、または問題のチロシンキナーゼに対
する公知のアゴニストに結合できる分子を言う。リガン
ドは通常チロシンキナーゼに対するアゴニストまたはア
ンタゴニストであろう。
「アゴニスト」とは、ECDに結合して、チロシンキナ
ーゼの細胞内キナーゼドメインを活性化することのでき
る分子を意味する。しばしばアゴニストは増殖因子（す
なわち、細胞分裂を刺激できるポリペプチド）を含むで
あろう。例示的な増殖因子は、ヘレグリン（HRG）、イ
ンスリン、インスリン様増殖因子ＩおよびII（IGF−Ｉ
およびIGF−II）、表皮細胞成長因子（EGF）、インター
ロイキン（例えばIL−８）、マクロファージコロニー刺
激因子（Ｍ−CSF）、エリスロポイエチン（EPO）、血小
板由来増殖因子（PDGF）、線維芽細胞増殖因子（FG
F）、トランスホーミング増殖因子アルファおよびベー
タ（TGF−αおよびTGF−β）、肝細胞増殖因子、および
神経成長因子（NGF）を含む。或いはアゴニストはrPTK
に対する抗体であり得る（例えばYarden.Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA 87:2569〜2573［1990］を参照）。しかし
ながら、小さい有機分子などの非プロテインアゴニスト
も本発明に包含される。
「アンタゴニスト」とは、アゴニスト作用をブロック
する分子を意味する。通常アンタゴニストは、（ａ）rP
TKに結合し、それによってアゴニストによるrPTKの結合
および／または活性化をブロックするか（アンタゴニス
トはrPTKのECDに結合し得るが、これは必ずしも事実で
はない）、または（ｂ）アゴニストに結合し、アゴニス
トによるrPTKの活性化を阻害する。この検定法は両タイ
プのアンタゴニストの検出を容易にする。アンタゴニス
トは、受容体に対する外来のアゴニストリガンドの受容
体結合ドメインを含むペプチドフラグメントを例えば含
み得る。アンタゴニストは、rPTKのECDに対する、また
はrPTKに対する公知アゴニストに対する抗体でもあり得
る。しかしながら他の非タンパク質分子もこの語に含ま
れ得る。
「抗体」という語は最も広義に用い、具体的にはモノ
クローナル抗体、およびポリエピトープ的特異性を有す
る抗体組成物（すなわちポリクローナル抗体）を包含す
る。ポリクローナル抗体は好ましくは「アフィニティ精
製された」抗体である。「アフィニティ精製された」な
る語は、ポリクローナル抗体を選択的に精製するために
抗体が抗原（例えばrPTK若しくはそのフラグメントまた
はフラグポリペプチド）を用いて精製されていることを
意味する。アフィニティ精製は、抗原はアフィニティカ
ラム（例えばアガロースカラム）上に固定化し、ポリク
ローナル抗体をカラムに通すことにより達成され得る。
アフィニティ精製された抗体は、例えば、溶出条件を変
えることにより、またはカオトロピック剤を添加するこ
とにより次に溶離し得る。抗体に関するアフィニティ精
製技術の総説については、例えばCurrent Protocols
in Immunology Coligen等編、Wiley publishers １
および２巻を参照。
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」の語は、実
質的にホモジニアスな抗体の集団から得られる抗体を言
う。すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量存在す
るかも知れない起こり得る天然に存在する変異を除いて
同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であっ
て、単一の抗原部位に対する。更に、異なった決定基
（エピトープ）に対する様々な抗体を典型的には含む従
来の（ポリクローナルな）抗体製品とは対照的に、各モ
ノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対する。
本明細書でモノクローナル抗体は、それらが所望の生
物学的活性を示す限り、由来の種、免疫グロブリンの種
類またはサブクラス呼称とは関係なく、定常ドメインを
有する選択した抗体の可変（超可変を含む）ドメイン
（例えば「人化」抗体）、重鎖を有する軽鎖、他の種か
らの鎖を有する一つの種の鎖、ヘテロガスなタンパク質
との融合、並びに抗体断片（例えば、Fab、Ｆ（ab'）２
およびFv）をスプライシングすることにより製造された
ハイブリッドおよび組換え抗体を含む。（例えば米国特
許第4,816,567号およびMageおよびLamoyi、Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applicati
ons、79〜97ページ、Marcel Decker,Inc.、ニューヨー
ク参照。） 従って改質剤「モノクローナル」は実質的にホモジニ
アスな抗体集団から得られる抗体の特性を示し、いずれ
かの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈す
べきでない。例えば本発明に従って用いるモノクローナ
ル抗体は、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495（1
975）により最初に記載されたハイブリドーマ法によっ
て製造してもよく、または組換えDNA法（米国特許第4,8
16,567号）によって製造してもよい。「モノクローナル
抗体」は、例えばClackson等、Nature、352:624〜628
（1991）およびMar等、J.Mol.Biol.、222 581〜597（1
991）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラ
リーからも単離し得る。
「抗ホスホチロシン抗体」の語は、rPTKのキナーゼド
メインにおけるリン酸化されたチロシン残基に選択的に
結合する分子、通常は抗体を言う。その抗体はポリクロ
ーナルであり得るが、望ましくはモノクローナル抗体で
ある。抗ホスホチロシンポリクローナル抗体は、White
およびBacker、Methods in Enzymology 201:65〜67
［1991］に開示された技術を用いて製造でき、モノクロ
ーナル抗ホスホチロシン抗体は、例えばUpstate Biolo
gicals,Inc（UBI、Lake Placid、ニューヨーク）から
商業的に入手し得る。
本明細書で用いる「標識」の語は、ある分子（抗ホス
ホチロシン抗体等の）と直接的または間接的にコンジュ
ゲートした検出可能な化合物または組成物を言う。標識
はそれ自体で検出可能であり（例えば放射性ラベルまた
は蛍光ラベル）、または、酵素ラベルの場合には、検出
可能な基質化合物または組成物の化学的な変化を触媒し
得る。好ましい標識は非放射性の発色試薬の色変化を触
媒する酵素的な標識である。
「洗浄」とは、非結合物質（例えば非付着細胞、非付
着捕獲剤、非結合リガンド、受容体、受容体構築物、細
胞溶解物または抗ホスホチロシン抗体）が除去されるよ
うな方法で固相を水相（通常緩衝液または細胞培養培
地）にさらすことを意味する。バックグラウンドノイズ
を減少させるために、洗浄溶溶液に界面活性剤（例えば
トリトンＸ）を含ませるのが便利である。通常洗浄後、
洗浄用水溶液をアッセイプレートのウエルからデカント
する。便利には洗浄は自動洗浄装置を用いて行う。時に
は数度の洗浄工程（例えば約１〜10の洗浄工程）が必要
であるかもしれない。
「ブロック緩衝液」とは、捕獲剤を被覆しない第２固
相のさらされた表面に結合できる少なくとも１つのブロ
ッキング剤を含む、水性の、pHが緩衝された溶液を意味
する。ブロッキング化合物は通常、牛血清アルブミン
（BSA）、ゼラチン、カゼインまたはミルク粉等タンパ
ク質であり、検定法においていずれの試薬（例えば抗ホ
スホチロシンキナーゼ抗体および検出試薬）とも交差反
応しない。ブロック緩衝液は約７〜7.5の間のpHで一般
に提供され、適当な緩衝剤はリン酸塩およびTRISを含
む。
「溶解緩衝液」とは、溶解用界面活性剤、１以上のプ
ロテアーゼ阻害剤および少なくとも１つのホスファター
ゼ阻害剤（ソジウルオルソバナデート等の）を含んでな
る水性の、pH緩衝化溶液を意味する。「溶解用界面活性
剤」とは、真核細胞の細胞膜を溶解するが、受容体また
は受容体構築物を変性し、または活性化しない、水混和
性の、非イオン性界面活性剤を言う。適当な非イオン性
界面活性剤の例は、トリトンX100、トイーン20、CHAPS
およびノニデトＰ−40（NP40）（Calbiochem、La Joll
a、カリホルニアから入手できる）を含む。多くの他の
非イオン性界面活性剤が利用できる。適当なプロテアー
ゼ阻害剤の例は、フェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（PMSF）、ロイペプチン、ペプスタチン、アポチニ
ン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフ
ルオライドヒドロクロライド−ベスタチン、キモスタチ
ンおよびベンズアミジンを含む。保存剤（例えばチミロ
サル）および溶液の等張性を維持する１以上の化合物
（例えば塩化ナトリウム［NaCl］またはシュクロース）
および緩衝剤（例えばトリスまたはPBS）も通常存在す
る。一般に溶解緩衝液のpHは約７〜7.5の範囲にある。
通常、第１アッセイプレートへの溶解緩衝剤の添加後
に、第１アッセイプレートを「緩やかに撹拌」する。こ
の表現は実質的に低速度で第１アッセイプレートを物理
的に振とうする（通常円運動を用いて）行為を言う。緩
やかな撹拌は細胞を機械的に破壊する（例えば細胞をホ
モジナイズし、また遠心分離することによって）ことを
含まない。例示的な振とう速度は、例えばBellco orbi
tal shakerで200〜500rpm、好ましくは300〜400rpmの
オーダーである。
II.本発明実施の態様 1.キナーゼ受容体活性化−KIRA 本検定法の第一段階は真核生物の細胞の細胞膜内に存
在するキナーゼ受容体のキナーゼドメインの燐酸化を包
含する。受容体は内在性受容体であってもよく、受容体
をコードする核酸を細胞に形質転換したものでもあって
もよい。本発明の一態様では、受容体構築物をコードす
る核酸を細胞に形質転換する。以下に細胞を受容体また
は受容体構築物核酸で形質転換する例示的技術を述べ
る。
A.細胞の形質転換 本発明は生体内における受容体の活性をさらにより正
確に反映すると考えられる範囲において可溶性キナーゼ
受容体検定法に関する実質的な改良を意味する。今回、
本検定法のELISA段階で検出できるチロシンキナーゼ活
性を保持しつつ、受容体構築物が細胞膜内に適当に集合
するような受容体構築物（キナーゼ受容体およびアミノ
末端またはカルボキシル末端フラグペプチドを含む）で
真核生物細胞を形質転換できることが発見された。これ
は目的とするいかなるチロシンキナーゼのチロシンキナ
ーゼ活性をも測定するための一般的検定法を提供する。
もし、選択したrPTKに対するここに記載された捕捉剤
が入手できるなら、フラグポリペプチドのない受容体単
独をコードする核酸で細胞を形質転換することができ
る。それとは別に、もし、受容体を生産する細胞（たと
えば、HER2受容体を生産するMCF−７細胞のような）が
入手できるなら、この検定で使用する細胞を形質転換す
る必要はない。
rPTKをコードする核酸または受容体構築物で細胞を形
質転換するために、rPTKをコードする核酸および、要す
れば、フラグポリペプチドを分離する。これはcDNAまた
はrPTKまたは目的フラグポリペプチドをコードするDNA
を含むことが知られたゲノムライブラリーを、rPTKまた
は目的フラグポリペプチド用の選択した標識プローブ
（たとえば、抗体またはオリゴヌクレオチド−プロー
ブ）で、例えばSambrookなど、「分子クローニング：実
験室指針（Molecular・Cloning:A・Laboratory・Mannua
l）」、（New・York:Cold・Spring・Harbor・Laborator
y・Press社、1989年）の第10〜12章に記載されているよ
うな標準的操作法を使用してスクリーニングすることに
よって達成できる。それと別に、フラグポリペプチドを
コードする核酸はオリゴ合成器（Applied・Biosystems
社、CA）を使用して合理的に製造できる。rPTKまたはフ
ラグポリペプチドをコードする核酸を単離するその他の
方法は前記Sambrookなどの第14章に記載されているよう
なPCR法を使用するものである。この核酸はここに記載
するRse−フラグポリペプチド構築物のTMおよびICDをコ
ードする核酸に融合できるので、目的rPTKのECDのみの
単離が必要である。図1A〜1Cおよび配列番号１および２
参照。しかしながら、もし必要ならば、Sambrookなど、
前出、7.79に記載されている通常のプライマー伸長操作
を使用して、cDNAには逆転写されていなかったmRNAの前
駆体およびプロセッシング中間体を検出できる。
この発明の好適な実施法の一つは、好ましくは目的rP
TKを持つ哺乳類細胞系からの様々な組織からのcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするために、注意深く選択し
たオリゴヌクレオチド配列を使用するものである。プロ
ーブとして選択したオリゴヌクレオチド配列は誤陽性を
最小化するのに十分な長さと十分な明白さのものとすべ
きである。
このオリゴヌクレオチドはスクリーニングするライブ
ラリーのDNAにハイブリッド化したら検出できるように
標識されなければならない。標識の好適な方法はオリゴ
ヌクレオチドを放射能標識するために、当業界で良く知
られているように、32P標識ATPをポリヌクレオチドキナ
ーゼとともに使用するものである。しかしながら、オリ
ゴヌクレオチドを標識するためには、これに限定するも
のではないが、ビオチン化または酵素標識を含む他の方
法も使用しうる。
受容体構築物をコードする核酸を提供するためにはrP
TKをコードする核酸を3'−末端でフラグポリペプチドの
Ｎ末端をコードする核酸に融合する。これとは別に、rP
TKをコードする核酸を5'−末端でフラグポリペプチドの
カルボキシル末端をコードする核酸に融合する。こうし
て、受容体構築物のカルボキシル末端またはアミノ末端
のいずれかにフラグポリペプチドが提供される。適当な
フラグポリペプチドの例は前記した。他の適当なフラグ
ポリペプチドの選択はここに記載する技術を使用すれば
可能である。
Rse.フラグ試薬と目的rPTKとの間の融合体を作製する
ためには、目的rPTKのECDをコードする核酸をその3'−
末端でRse.フラグ試薬のアミノ末端をコードする核酸に
融合する。
次に、後続するクローニング（DNAの増幅）または発
現のために、rPTKまたは受容体構築物をコードする核酸
（たとえば、cDNAまたはゲノムDNAなど）を複製可能な
ベクターに挿入する。熟練した実務家は多数のベクター
を利用できるがそのベクターは本検定法で使用すべき細
胞と適合していなければならない。このベクターはその
存在が種々の因子に依存するベクター成分を持つもので
ある。そのような成分は、例えば、シグナル配列、複製
起点、マーカー遺伝子１個またはそれ以上、エンハンサ
ーエレメント、プロモーター、転写終結配列などを含
む。これらベクター成分の選択は後記することとする。
ECDを細胞の外部環境に直面して配置させる細胞膜にr
PTKまたは受容体構築物を輸送しなければならないの
で、シグナル配列の発現ベクターへの組込が必要であ
る。それ故に、rPTKまたは受容体構築物のそのような様
式による配置のために適当なシグナル配列が使用され
る。シグナル配列は一般にベクターの成分であるか、ま
たはベクターに挿入するrPTKのDNAまたは受容体構築物D
NAの一部分であってもよい。もし、異種性シグナル配列
を使用するなら、宿主細胞によって認識され、処理され
る（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断され
る）ものからである。
酵母の分泌には、天然のシグナル配列を、たとえば酵
母インベルターゼのリーダー、アルファ因子リーダー
（サッカロミセスおよびクリュイベロミセスのα−因子
リーダーを含み、後者は1991年４月23日発行米国特許50
10182号に記載されている）、または酸性ホスファター
ゼリーダー、C.アルビカンスのグルコアミラーゼリーダ
ー（1990年４月４日発刊の欧州特許362179号）、または
1990年11月15日発刊のWO90/13646号に記載のシグナルな
どで置換しうる。たとえば他種動物rPTKからのシグナル
配列、同一または関連する種の分泌ポリペプチドからの
シグナル配列、ならびに、例えばヘルペス・シンプレッ
クスgDシグナルのようなウイルスの分泌リーダーのよう
な他種哺乳類シグナル配列が適当であることもありうる
けれども、哺乳類細胞では天然シグナル配列（たとえ
ば、生体内で正常には哺乳類細胞を指向する前rPTK配
列）をコードするDNAの発現は十分である。
前駆体領域のDNAは読み枠内に結合させて、rPTKまた
は受容体構築物をコードするDNAとする。
発現ベクターおよびクローニングベクターの両者は、
選択した宿主細胞１種またはそれ以上でベクターの複製
が可能な核酸配列を含む。一般に、クローニングベクタ
ー内ではこの配列はベクターが宿主染色体DNAと独立に
複製することが可能なものであって、複製起点または自
律性複製配列を含む。２μプラスミド起点は酵母に適し
ており、種々のウイルス起点（SV40、ポリオーマ、アデ
ノウイルス、VSVまたはBPV）は哺乳類細胞内でのクロー
ニングベクター用に有用である。一般に、複製起点成分
は哺乳類発現ベクターには不要である（早期プロモータ
ーを含有するだけの理由で、SV40起点が典型的に使用さ
れる）。
発現ベクターは殆ど「シャトル」ベクター、すなわち
それらは少なくとも１種の生物内で複製できるが、他種
の生物に形質転換しても発現できるものである。例え
ば、あるベクターは大腸菌にクローニングできるが、次
に同じベクターを、宿主染色体と独立には複製すること
はできないが、酵母または哺乳類の細胞に形質転換して
発現させる。
DNAを宿主ゲノムに挿入して増幅することもありう
る。これは、例えば宿主としてバチルス属の種を使用
し、ベクターにバチルス属ゲノムDNAにある配列に相補
的なDNA配列を含めることで、容易に達成できる。この
ベクターでバチルス属を形質転換するとゲノムおよびrP
TKまたは受容体構築物のDNAの挿入による均質的組換え
をもたらす。しかしながら、rPTKまたは受容体構築物を
コードするゲノムDNAの回収はrPTKまたは受容体構築物D
NAを切除するために制限酵素消化が必要なので、外因性
に複製されたベクターのそれよりもさらに複雑である。
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、選
択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。この遺
伝子は選択的培養培地内で形質転換された宿主細胞が生
存または生育するために必要な蛋白質をコードする。選
択遺伝子含有ベクターで形質転換されなかった宿主細胞
はこの培養培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子
は、（ａ）たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メ
トトレキセートまたはテトラサイクリンなどの抗生物質
または他種のトキシンに抵抗性を与える、（ｂ）栄養要
求性欠落を補足する、または（ｃ）複合体培地から取込
めない決定的栄養素を供給する、蛋白質をコードする。
選択方式の一例では、宿主細胞の生長を止める薬品を
使用する。異種遺伝子で形質転換に成功したこれらの細
胞は薬品耐性を授与する蛋白質をコードするDNAを発現
し、選択管理に生き残る。このような選択の有力な例で
は医薬品、ネオマイシン（Southernなど、J.Molec.App
l.Genet.、１巻:327頁［1982年］）、ミコフェノール酸
（Mulliganなど、Science、209巻:1422頁［1980年］）
またはヒグロマイシン（Sugdenなど、Mol.Cell.Biol.、
５巻:410〜413頁［1985年］）を使用する。前記３例は
それぞれ適当な医薬G418またはネオマイシン（ゲネチシ
ン）、xgpt（ミコフェノール酸）、またはヒグロマイシ
ンに対して耐性を与えるために真核生物制御下の細菌遺
伝子を採用するものである。
哺乳類細胞のための適当な選択マーカーのその他の例
は、たとえばDHFRまたはチミジンキナーゼのようなrPTK
または受容体構築物の核酸を取込む能力のある細胞の認
定を可能にする。哺乳類細胞の形質転換体を選択圧力下
に置いてマーカー取り込みによる形質転換体のみが独特
に適応する。選択圧力は培地中の選択剤濃度が順次変化
して、選択遺伝子およびrPTKまたは受容体構築物をコー
ドするDNAの双方を増幅に導く条件下に形質転換体を培
養することによって加える。増幅は生長に必須な蛋白質
の生産に要求の大きい遺伝子が組換え細胞の継代的染色
体内に共同的に反復するプロセスである。rPTKまたは受
容体構築物の増加量は増幅されたDNAから合成される。
増幅可能な遺伝子の他の例には、好ましくは霊長類メタ
ロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニ
チンデカルボキシラーゼなど、メタロチオネイン−Ｉお
よび−IIを含む。
例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換した細胞は形質転
換体全てをDHFRの競合的拮抗剤であるメトトレキセート
（Mtx）を含む培養培地中でまず培養して確認寸る。野
生型のDHFRを採用する時に適当な宿主細胞はUrlaubおよ
びChasinがProc.Natl.Acad.Sci.USA、77巻:4216頁（198
0年）に記載したようにして調製し、増殖したDHFR活性
欠失チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系であ
る。形質転換した細胞を次に濃度を増加しつつメトトレ
キセートに接触する。これでDHFR遺伝子の多重コピーお
よび、同時に、たとえばrPTKまたは受容体構築物をコー
ドするDNAのような、発現ベクターを含む他種のDNAの多
重コピーの合成に導く。この増幅技術は、もし、例えば
Mtxに高度に耐性の突然変異DHFR遺伝子が採用される（E
P117060）なら、たとえば内因性DHFRの存在に関わら
ず、ATCC・CCL61・CHO−K1のようなそうでなければ適当
な宿主であるいかなる適当な宿主についても使用でき
る。
これとは別に、rPTKまたは受容体構築物、野生型DHFR
蛋白質およびその他の選択可能なマーカー、たとえばア
ミノグリコシド−3'−ホスホトランスフェラーゼ（AP
H）のようなもの、をコードするDNA配列で形質転換また
は共−形質転換した宿主細胞（殊に内因性DHFR含有野生
型宿主）は、たとえばカナマイシン、ネオマイシン、ま
たはG418などのアミノグリコシド抗生物質のような選択
可能なマーカーに対する選択剤を含む培地中での細胞生
長により選択できる。米国特許4965199号参照。
酵母で使用するために適当な選択遺伝子の一つは酵母
プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である（Stinch
combなど、Nature、282巻:39頁［1979年］;Kingsmanな
ど、Gene、７巻、141頁［1979年］；またはTschemperな
ど、Gene、10巻:157頁［1980年］）。trp1遺伝子はトリ
プトファン中での生育能力を欠落する突然変異株酵母、
例えばATCC44076またはPEP4−１（Jones、Genetics、86
巻:12頁［1977年］）に対する選択マーカーを提供す
る。そこで、酵母宿主細胞ゲノム内にtrp1損傷がある
と、トリプトファン不在下での生長により形質転換を検
出するための効果的な環境が提供される。同様に、Leu2
−欠失酵母株（ATCC20622または38626）はこのLeu2遺伝
子を持つ既知プラスミドによって補完できる。
これに加えて、1.6μｍ環状プラスミドpKD1から誘導
したベクターをクリュイベロミセス酵母を形質転換する
ために使用できる。Bianchiなど、Curr.Genet.、12巻:1
85頁（1987年）。さらに最近、K.ラクチスについてウシ
組み換えキモシンの大量生産用発現システムが報告され
た（Van・den・Berg、Bio/Technology、８巻:135頁［19
90年］）。クリュイベロミセス工業用株による成熟ヒト
組み換え血漿アルブミン分泌のための安定な多重コピー
発現ベクターも開示されている。Fleerなど、Bio/Techn
ology、９巻:968〜975頁（1991年）。
発現およびクローニングベクターは通常宿主生物によ
り認識されるプロモーターを含有し、rPTKまたは受容体
構築物核酸に作動可能に結合している。プロモーターは
構造遺伝子（一般に約100から1000bp以内）の開始コド
ンの上流（5'）に位置する非翻訳配列であって、それが
作動可能に結合する、たとえばrPTK核酸配列のような特
定核酸配列の転写と翻訳とを制御する。このようなプロ
モーターは典型的には誘導性と構成的との２種類に分類
される。誘導性プロモーターは、たとえば栄養の存在ま
たは不在または温度変化など、培養条件の変化に応じて
支配下にあるDNAからの転写水準の増加を開始するプロ
モーターである。今日では可能性ある種々の宿主細胞多
数が認識するプロモーターが良く知られている。これら
プロモーターは制限酵素消化により起源DNAからプロモ
ーターを取り出し、ベクターにプロモーター配列を挿入
することによってrPTKまたは受容体構築物をコードする
DNAに作動可能に結合している。天然型rPTKプロモータ
ー配列および多数の異種プロモーター双方ともrPTKまた
は受容体構築物DNAの直接的増幅および／または発現を
指向して使用しうる。プロモーターは形質転換細胞の細
胞膜内に受容体または受容体構築物の適当数の蓄積（す
なわち、受容体の自己燐酸化がELISAで検出されるが構
成的燐酸化は起きないように）をもたらすものでもあろ
う。これを達成するために適当なプロモーターの選択は
ここに以下に記載するKIRA・ELISAで使用するために細
胞を選択するための指針に従えば可能である。
殆ど全部の真核生物遺伝子は転写開始部位からおよそ
25から30塩基上流に存在するAT豊富領域を持っている。
遺伝子多数では転写開始部位から70から80塩基上流にあ
る別の配列の一つはCXCAAT領域であるが、ここにＸはい
かなるヌクレオチドでもよい。殆どの真核生物遺伝子の
3'末端にはAATAAA配列があり、これはコード配列の3'末
端に末尾ポリＡを付加するためのシグナルであろう。こ
れら配列は全て真核生物発現ベクターに適当に挿入され
る。
酵母宿主での使用のために適当なプロモーター配列の
実例には３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanな
ど、J.Biol.Chem.、255巻:2073頁［1980年］）または、
たとえば、エノラーゼ、グリセルアデルヒド−３−ホス
フェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルベート脱カ
ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース
−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレ
ートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフ
ェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、
およびグルコキナーゼのような、他の解糖酵素（Hessな
ど、J.Adv.Enzyme・Reg.、７巻:149頁［1968年］；およ
びHolland、Biochemistry、17巻:4900頁［1978年］）を
含む。
他の酵母プロモーターは生育条件により制限される転
写という別の利点を持つ誘導性プロモーターであって、
アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホ
スファターゼ、窒素代謝関連分解酵素、メタロチオネイ
ン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素
および麦芽糖およびガラクトースの利用を担当する酵素
のプロモーター領域である。酵母での発現に使用するた
めに適当なベクターおよびプロモーターをHitzemanなど
が欧州特許73675Aにさらに記載している。酵母のエンハ
ンサーも酵母プロモーターとともに利用するのが有利で
ある。
哺乳類宿主細胞でベクターからrPTKまたは受容体構築
物を転写するには、例としては、たとえば、ポリオーマ
ウイルス、鶏痘ウイルス（1989年７月５日刊行の英国特
許2211504号）、アデノウイルス（アデノウイルス２の
ような）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイル
ス、唾液腺ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイル
スおよび最も好ましくはシミアンウイルス40（SV40）の
ようなウイルスのゲノムから、たとえばアクチンプロモ
ーターまたは免疫グロブリンプロモーターなど異種哺乳
類プロモーターから、熱ショックプロモーターから、お
よび正常にはrPTKまたは受容体構築物の配列に関連する
プロモーターから、おのおの得られたプロモーターによ
り制御するが、但し、このようなプロモーターが宿主細
胞系に適合することを条件とするものである。
SV40ウイルスの早期および後期プロモーターはSV40ウ
イルス複製開始点も含むSV40制限断片として容易に得ら
れる。Fiersなど、Nature、273巻:113頁（1978年）;Mil
liganとBerg、Science、209巻:1422〜1427頁（1980
年）;Pavlakisなど、Proc.Natl.Acad.Sic.USA、78巻:73
98〜7402頁（1981年）。ヒトサイトメガロウイルスの即
時型プロモーターはHind III・Ｅ制限断片として容易に
得られる。Greenawayなど、Gene、18巻:355〜360頁（19
82年）。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用
する哺乳類宿主においてDNAを発現する系は米国特許441
9446号に記載されている。この系の修飾は米国特許4601
978号に記載されている。サル細胞における免疫インタ
ーフェロンをコードするcDNAの発現に関するGrayなど、
Nature、295巻:503〜508頁（1982年）；ヘルペスシンプ
レックスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーター
制御下にマウス細胞内でのヒトβ−インターフェロンcD
NAの発現に関するReyesなど、Nature、297巻:598〜601
頁（1982年）；マウスおよびウサギ培養細胞内でのヒト
インターフェロンβ１遺伝子の発現に関するCanaaniとB
erg、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79巻:5166〜5170頁（19
82年）；およびラウスザルコマウイルスの長末端反復を
プロモーターとして使用するCV−１サル腎臓細胞、ニワ
トリ胚フィブロブラスト、チャイニーズハムスター卵巣
細胞、HeLa細胞、およびマウスNIH−3T3細胞内での細菌
CAT配列の発現に関するGormanなど、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、79巻:6777〜6781頁（1982年）も参照。
もし検定のELISA段階での検出を促進するために細胞
当りrPTKまたは受容体構築物の数の増加が必要なら、高
級真核生物によるrPTKまたは受容体構築物をコードする
DNAの転写を増加させてもよい。これはベクターにエン
ハンサー配列を挿入することによって達成する。エンハ
ンサーはDNAにあってプロモーターにその転写を増加す
るように働く通常約10から300bpのシス作用エレメント
である。エンハンサーは相対的に方向および位置に非依
存的であって、転写ユニットの5'（Laimineなど、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、78巻:993頁［1981年］）および3'
（Luskyなど、Mol.Cell・Bio.、３巻:1108頁［1983
年］）にあって、イントロン内部（Banerjiなど、Cel
l、33巻:729頁［1983年］）ならびにコード配列自体の
内部（Osborneなど、Mol.Cell・Bio.、４巻:1293頁［19
84年］）に発見されている。哺乳類遺伝子からエンハン
サー配列多数が公知になっている（グロブリン、エラス
ターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびイン
シュリン）。しかしながら、典型的には真核生物細胞ウ
イルスからのエンハンサーを使用するのがよい。実例に
は複製開始点の後期側にあるSV40エンハンサー（bp100
〜270）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエン
ハンサー、複写開始点の後期側にあるポリオーマエンハ
ンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真
核生物プロモーターの活性化用増強エレメントに関する
Yaniv、Nature、297巻:17〜18頁（1982年）も参照。エ
ンハンサーはベクターのrPTKまたは受容体構築物をコー
ドする配列の5'位置または3'位置に挿入してもよいが、
好ましくはプロモーターから5'の部位に置く。
真核生物宿主細胞中に使用する発現ベクターは転写の
終結に必要な配列およびmRNAを安定化させる配列も含む
のがよい。このような配列は真核生物またはウイルスの
DNAまたはcDNAの通常は5'−、希に3'−非翻訳領域から
得られる。これら領域はrPTKまたは受容体構築物をコー
ドするmRNAの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として
転写されるヌクレオチド断片を含む。
前記成分１個またはそれ以上を含有する適当なベクタ
ーの構築には標準的結合技術を使用する。分離したプラ
スミドまたはDNA断片を切断し、仕立て、そして必要な
プラスミドを発生させるために所望の形に再結合する。
構築したプラスミド内の正確な配列を確認するための
分析用に、結合混合物を使用して大腸菌K12の294株（AT
CC31446）を形質転換し、適当なアンピシリンまたはテ
トラサイクリン耐性により、成功した形質転換体を選択
する。形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エン
ドヌクレアーゼ消化により分析し、および／またはMess
ingなど、Nucleic・Acid・Res.、９巻:309頁（1981年）
の方法またはMaxamなど、Methods・in・Enzymology、65
巻:499頁（1980年）の方法により配列決定する。
組換え脊椎動物細胞培養物内でのrPTKまたは受容体構
築物の合成に適応するために適当な他の方法、ベクター
および宿主細胞はGethingなど、Nature、293巻:620〜62
5頁（1981年）;Manteiなど、Nature、281巻:40〜46頁
（1979年）;Levinsonなど、欧州特許117060号、および
欧州特許117058号に記載されている。rPTKまたは受容体
構築物のDNAの哺乳類細胞培養物での発現のために殊に
有用なプラスミドはpRK5（欧州特許出願307247号）また
はpSVI6B（1991年６月13日発行、PCT・WO91/08291号）
である。
低級真核生物宿主細胞の中で形質転換のために適当な
真核生物細胞系にはサッカロミセス・セレビシエおよび
シゾサッカコミセス・ポンベ（BeachとNurse、Nature、
290巻:140頁［1981年］;1985年５月２日発行の欧州特許
139383号）；クライベロミセス宿主（米国特許4943529
号;Fleerなど、Bio/Technology、９巻:968〜975頁［199
1年］）およびA.ニデュランス（Ballanceなど、Bioche
m.Biophys.Res.Commun.、112巻:284〜289頁［1983年］;
Tilburnなど、Gene、26巻:205〜221頁［1983年］;Yelto
nなど、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻:1470〜1474頁
［1984年］）およびA.ニガー（KellyとHynes、EMBO・
J.、４巻:475〜479頁［1985年］）のようなアスペルギ
ルス宿主を含む。
形質転換用の有用な動物宿主細胞系の実例にはSV40で
形質転換したサル腎CV1系（COS−７、ATCC・CRL165
1）；ヒト胎児腎系（懸濁培養での生長用にサブクロー
ニングした293または293系細胞、Grahamなど、J.Gen.Vi
rol.、36巻:59頁［1977年］）；幼若ハムスター腎細胞
（BHK、ATCC・CCL10）；チャイニーズハムスター卵巣細
胞／−DHFR（CHO、UrlaubとChasin、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、77巻:4216頁［1980年］）；マウスのセルトリ細
胞（TM4、Mather、Biol.Reprod.、23巻:243〜251頁［19
80年］）；サル腎細胞（CV1、ATCC・CCL70）；アフリカ
ミドリザル細胞（VERO−76、ATCC・CRL1587）；ヒト子
宮癌細胞（HELA、ATCC・CCL2）；イヌ腎細胞（MDCK、AT
CC・CCL34）；バッファローラット肝細胞（BRL・3A、AT
CC・CRL1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC・CCL175）；
ヒト肝細胞（Hep・G2、HB8065）；マウス乳腺癌（MMT06
0562、ATCC・CCL51）;TRI細胞（Matherなど、Annals.N.
Y.Acad.Sci.、383巻:44〜68頁［1982年］）;MRC5細胞;F
S4細胞；およびヒトヘパトマ系（Hep・G2）を含む。
宿主細胞を前記した本発明の発現またはクローニング
ベクターで形質転換し、適当ならプロモーターを誘発す
るために修正した通常の栄養培地中で培養し、形質転換
体を選択し、または所期の配列をコードする遺伝子を増
幅する。形質転換とはDNAが複製されるように染色体外
エレメントとしてまたは染色体成分として生物体にDNA
を導入することを意味する。使用する宿主細胞に依存し
て、その細胞に適当な形質転換は標準的な技術を使用し
て行う。形質転換の成功は一般にこのベクターの作動指
標が宿主細胞に出現した時に認定される。
哺乳類細胞にはGrahamとVan・der・Eb、Virology、52
巻:456〜457頁（1978年）の燐酸カルシウム沈降法が好
適である。哺乳類細胞宿主系の形質転換の概観はAxelが
1983年８月16日発行の米国特許4399216号に記載してい
る。酵母への形質転換は典型的にはVan・Solingenな
ど、J.Bact.、130巻:946頁（1977年）およびHsiaoな
ど、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76巻:3829頁（1979年）
の方法に従って実施する。しかしながら、DNAを細胞に
導入する、たとえば核微量注射法、電気穿孔法、無傷細
胞との細菌原形質体融合法、たとえばポリブレン、ポリ
オルニチンなどのポリカチオン法など、のようなその他
の方法を使用してもよい。
rPTKまたは受容体構築物調製のために使用する哺乳類
細胞は種々の培地中で培養しうる。たとえばハムF10（S
igma）、最少必須培地（［MEM］Sigma社）、RPMI−1640
（Sigma社）、およびダルベッコの修正イーグル培地
（［DMEM］、Sigma社）のような商業的に入手しうる培
地はこの宿主細胞培養に適当である。これに加えてHam
とWallaceがMeth.Enz.、58巻:44頁（1979年）に、Barne
sとSatoがAnal.Biochem.、102巻:255頁（1980年）に記
載したもの、および米国特許4767704号、4657866号、49
27762号または4560655号、WO87/00195号、WO90/03430
号、米国再発行特許30985号または米国特許5122469号に
記載がある培地はいずれもこの宿主細胞用の培養培地と
して使用しうる。これらの文献はいずれも参考のために
引用するものである。これら培地はいずれも必要に応じ
てホルモンおよび／またはその他の増殖因子（たとえば
インシュリン、トランスフェリン、または表皮増殖因子
のようなもの）、塩（たとえば塩化ナトリウム、カルシ
ウム、マグネシウム、および燐酸塩のようなもの）、緩
衝剤（例えばHEPESのようなもの）、ヌクレオシド（た
とえばアデノシンおよびチミジンのようなもの）、抗生
物質（たとえばゲンタマイシン（商品名）薬剤のような
もの）、微量元素（通常最終濃度がマイクロモルの範囲
内にある無機化合物として定義されるもの）、およびブ
ドウ糖または同等なエネルギー源を添加してもよい。当
業者には公知なはずのその他の必要な添加剤はいずれも
適当な濃度で含有させてもよい。温度、pH、などのよう
な培養条件は発現のためにその宿主細胞について使用さ
れており、当業者には明白となるであろう。
哺乳類細胞培養物の生産性を最大化するための原理、
実験計画、および実際的な技術は、「哺乳類細胞のバイ
オテクノロジー：実際的手法（Mammalian・Cell・Biote
chnology:a・Practical・Approach）」、M.Butler編、I
RL出版、1991年に一般的に記載されている。
遺伝子の増幅および／または発現は、例えばmRNAの転
写を定量化する通常のサザンブロッティング、ノーザン
ブロッティング（Thomas、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77
巻:5201〜5205頁［1980年］）、点染（DNA分析）、また
は切片上ハイブリッド形成によって、適当な標識プロー
ブを使用して、本明細書に記載する配列に基づいて、標
本中で直接測定してもよい。最も通常には放射性同位元
素、殊に32Pであるが、種々の標識を採用してもよい。
しかしながら、たとえばポリヌクレオチドへの導入のた
めにビオチン修飾したヌクレオチドを使用するような、
他の技術も採用しうる。次にビオチンはアビジンまたは
抗体の結合部位を与えるが、このアビジンまたは抗体は
たとえば放射能核種、螢光団、酵素、またはその他同様
なもののような、広範な標識を用いて標識しうる。ある
いは、DNA二本鎖、RNA二本鎖、DNA−RNAハイブリッド二
本鎖、またはDNA−蛋白質二本鎖、を含む特定の二本鎖
を認定できる抗体も採用しうる。また、抗体を二本鎖が
表面に結合し、その表面で二本鎖が形成すると、その二
本鎖に結合する抗体の存在を、検出できるような標識を
して、検定を実施してもよい。
これとは別に、遺伝子発現は、たとえば免疫組織化学
染色により遺伝子生産物発現の直接的定量のような免疫
学的方法によっても測定しうる。
B.検定で使用する細胞の選択 前記のように、検定に付すべき細胞は（ａ）内因的受
容体を持つ細胞、（ｂ）rPTKで形質転換した細胞、また
は（ｃ）受容体構築物で形質転換した細胞、であること
ができる。本検定法に使用する細胞の適合性を以下に検
討する。
外因性rPTKを持つ細胞はPTKの既知リガンド（たとえ
ば、作動剤抗体）および対照（たとえば、作動剤抗体用
希釈剤）を利用して試験的実施KIRA・ELISAに付すこと
ができる。ここに使用するようなリガンドの範囲（実施
例１、２および３参照）を使用して、検査する細胞に十
分な数の受容体が存在するかどうかを決定できる。受容
体が構成的に燐酸化されてその細胞系が不適当であるか
どうか見出すために、細胞系を陽性および陰性対照（た
とえば、陽性対照としてここに記載する細胞培養培地中
の既知作動剤リガンド、陰性対照として作動剤リガンド
のない培養培地）に接触させるものである、ここに開示
するKIRA・ELISAに付すことができる。もしも受容体の
燐酸化が陽性対照および陰性対照の双方で検出されれ
ば、これは受容体の構成的燐酸化が起きていることの表
示でありうる。しかしながら、細胞培養培地中の血漿成
分が受容体を活性化している可能性もある。そこで細胞
を血漿不在培地で約２〜12時間（細胞生存率に依存し
て）「スターブ」させ、次に陽性対照および陰性対照を
使用して検定を反復する。もし対照双方について活性化
が検出されれば、その細胞系は不適当であると考えら
れ、他の細胞系を検査できる。
もし、その細胞系が受容体により形質転換されれば
（フラグポリペプチドなしに）、図４に描くのに似た方
策を使用してその細胞系が本検定法に使用するために適
当であるかどうかを発見できる。第一段階として、rPTK
をコードする核酸の形質転換および発現の成功を決定で
きる（図４、段階ｂ参照）。細胞の表面にrPTKのECDが
存在するかどうかを確認するために、受容体のECDに対
する抗体を使用してフローサイトメトリー分析を行うこ
とができる。この抗体はここに検討する抗体を作製する
ための技術を使用して調製できる。フローサイトメトリ
ー分析は、例えばColigenなど編、「免疫学における最
新実験計画法（Current・Protocols・in・Immunolog
y）」、Wiley出版、１巻および２巻に記載されている技
術を使用して実施できる。概略的には、フローサイトメ
トリー分析は無傷の細胞（受容体を持つ）をそのECDに
対する抗体とインキュベーションし、続いて洗浄する。
抗体に結合した細胞を次にフルオロクロームに接合させ
た種特異性の抗−抗体・抗体とインキュベーションす
る。洗浄後、標識細胞を螢光活性化フローサイトメトリ
ーによって分析して、ECDが細胞表面上に存在するかど
うかを検出する。
次の段階、すなわち図４、段階（ｃ）では、活性化す
べき細胞結合受容体の性能を検査する。これを決定する
ためには、形質転換した細胞をその受容体に対する既知
の作動剤（たとえば、内因性リガンドまたはその受容体
の作動剤抗体）と接触する。接触後、細胞を適当な緩衝
液中で溶解し（たとえば、燐酸塩緩衝食塩水中のドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム;PBS中のSDS）、例え
ば、Wang、Molecular・and・Cellular・Biology、５（1
2）巻:3640〜3643頁（1985年）;Glenneyなど、Journal
・of・Innunological・Methods、109巻:277〜285頁（19
88年）;Kamps、Methods・in・Enzymology、201巻:101〜
110頁（1991年）;Kozmaなど、Methods・in・Enzymolog
y、201巻:28〜43頁（1991年）;Holmesなど、Science、2
56巻:1205〜10頁（1992年）；またはCorfasなど、PNAS
・USA、90巻:1624〜1628頁（1993年）に記載のある、抗
ホスホチロジン抗体によるウエスタンブロッティングに
付す。
ウエスタンブロッティング段階でrPTKを活性化できる
ことが指摘されたとして、KIRA・ELISA試験的実施、図
４の段階（ｄ）参照、を実行して、形質転換細胞系が本
検定法に使用できるかどうかをさらに確認する。
本発明の好適な態様においては、KIRA・ELISA法は受
容体特異的試薬（すなわち、捕捉剤）の入手可能性にか
かわらず、いかなる目的rPTKも研究できるという範囲で
「一般的」検定法である。この態様ではフラグポリペプ
チドのその受容体のアミノか、カルボキシル末端かのい
ずれかに持つ受容体構築物を採用する。
もしフラグポリペプチドをNH2−末端に持つなら（た
とえば、実施例３に記載する受容体構築物gD.trk・Ａ、
Ｂ、およびＣ参照）、図４に要約した本検定において使
用する形質転換細胞系を選択する走査を実施できる。こ
の態様では、細胞を前記フラグポリペプチド−受容体構
築物で形質転換する。段階（ａ）参照。段階（ｂ）で
は、受容体およびフラグポリペプチド（すなわち、受容
体構築物）の形質転換成功を確認する。これを検討する
ために、フラグポリペプチドと受容体のECDとの双方に
対する抗体を使用して二次元フローサイトメトリー分析
を実行できる。二次元フローサイトメトリー分析の技術
は免疫学における最新実験計画法、前出に開示されてい
る。受容体構築物の形質転換成功が証明されたものとす
れば、次に、図４の段階（ｃ）および（ｄ）を実施す
る。図４の段階（ｃ）から（ｄ）までの説明について
は、前記記載を参照。
Ｃ−末端フラグポリペプチドを持つ受容体構築物で形
質転換に成功し、また、この発明の検定法における使用
にも適切な細胞を確認するための技術を図５に図示す
る。細胞形質転換［段階（ａ）］に続いて、受容体の形
質転換成功は、例えば目的とする受容体ECDに対して指
向する抗体を使用するフローサイトメトリー分析により
決定する。フローサイトメトリー分析は実質的に前記の
通りに実行できる。これは図５に略述した操作法の段階
（ｂ）を構成する。
段階（ｂ）に続き、全受容体構築物（COOH−末端フラ
グポリペプチドを含む）の形質転換成功は段階（ｃ）で
分析する。これは細胞を溶解し（本明細書に記載の細胞
溶解技術を使用して）、膜抽出物を目的受容体に対する
抗体で免疫沈降することによって達成できる。この免疫
沈降した膜抽出物をフラグポリペプチドに対して特異的
な抗体でウエスタンブロッティングに付す。あるいは、
抗フラグポリペプチドが捕捉した膜溶解物のrPTK特異的
ELISA分析を実行できる。略述すれば、これはELISAウェ
ルを適当なフラグ特異的捕捉試薬で被覆することを含
む。ウェルをブロックし、洗浄し、次に細胞溶解物をウ
ェル内でインキュベーションする。非結合受容体構築物
は洗浄により除去する。ウェルを次に受容体特異的抗体
１種またはそれ以上と、直接的にまたは間接的に反応さ
せてHRPOに結合する。ウェルを洗浄し、HRPOを次に染色
体基質（たとえば、TMB）に接触させる。
段階（ｄ）および（ｅ）、すなわち受容体活性化およ
びKIRA・ELISA試験的実施、は実質的に前記したものと
同様である。
一旦、使用可能な細胞が確認されたら、それらを本発
明が特許請求する検定法のKIRA段階に付する。
C.細胞による第一固相の被覆 第一固相（たとえば、第一固相プレートのウェル）を
内因性受容体を持つ細胞または前記節に従って形質転換
した細胞で被覆する。
好ましくは、細胞が自然に第一固相に接着するような
接着細胞系を選択する。しかしながら、接着細胞系の使
用は必須ではない。例えば、非接着性細胞（たとえば、
赤血球）を、例えば、Becton・Dickinson・Labware社、
Lincoln・Park、New・Jerseyが販売しているような検定
プレートの丸底のウェルに添加できる。次に、検定プレ
ートをプレート運搬器に入れて遠心分離し、ウェルの底
に接着する細胞ペレットを作製する。細胞培養物の上清
液はピペットで除去する。そこで、検定における変動を
削減（すなわち丸底ウェルのペレット中の細胞は前記別
法を使用する時、上清液とともに排出される）するの
で、接着細胞の使用は明らかに非接着細胞の使用よりも
有利である。
第一検定レートのウェルに添加すべき細胞は組織培養
フラスコ内に維持し、細胞密度が全面生長の約70〜90％
を達成した時に使用してもよい。そこで、一般に、例え
ば平底ウェル１個につき約１×104から３×105個の間
（好ましくは、５×104から１×105）の細胞をピペット
を用いて接種する。予期に反して、前記細胞濃度の添加
は、事前に細胞の濃縮または清澄化または細胞溶解の必
要なしに、ELISA段階でrPTKを測定するように活性化す
るのに十分であることが発見された。しばしば、所期の
細胞濃度を達成するためマイクロタイターレートのウェ
ルに接種する前に細胞を培養培地で希釈する。
通常、細胞がマイクロタイタープレートのウェルに最
適な接着をするためには十分であるが、細胞が劣化し始
めるほど長くない時間培養する。そこで、細胞に対して
生理学的に最適な温度（通常約37℃）で約８から16時間
インキュベーションするのが好適である。この細胞を培
養するのに適当な培地は前記1A章に記載してある。５％
CO2中での培養を推奨する。
一夜インキュベーション後、ウェルの上清液をデカン
テーションし、マイクロタイタープレートを、たとえば
紙タオルなど、吸着剤基質で軽く固めて、過剰の上清液
をさらに除去するが、スポンジも同様に作用する。そこ
で、実質的に均質な接着細胞層がマイクロタイタープレ
ートの各ウェル内面に残留する。これら接着細胞を次に
分析物（analyte）と接触させる。
D.分析物の調製および添加 前記の通り、分析物は目的rPTKに対する作動剤リガン
ド（または推測上の作動剤）または拮抗剤（または推測
上の拮抗剤）を含みうる。これらリガンドは内因性ポリ
ペプチドであっても、たとえば無機または有機分子のよ
うな、合成的分子であってもよい。通常、リガンドはポ
リペプチドである。この検定法は目的とするチロジンキ
ナーゼ受容体を活性化（または活性化に拮抗）する分子
をスクリーニングするために有用である。そこで、この
検定法は治療的に有効な分子の開発用に使用できる。
リガンドが作動剤である場合、その分子には天然の増
殖因子、たとえば、ヘレグリン（HRG）、インシュリ
ン、インシュリン様増殖因子ＩおよびII（IGF−Ｉおよ
びIGF−II）、表皮増殖因子（EGF）、インターロイキン
（たとえば、IL−８）、マクロファージ・コロニー刺激
因子（Ｍ−CSF）、エリスロポイエチン（EPO）、血小板
由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子
アルファおよびベータ（TGF−αおよびTGF−β）、ヘパ
トサイト増殖因子（HGF）、フィブロブラスト増殖因子
（FGF）、および神経生長因子（NGF）など、を含有でき
る。これら増殖因子多数は商業的に入手できる。そうで
なければ、この増殖因子はここに記述するペプチド合成
または組換え技術により調製できる。合成低分子作動剤
は同様にして通常の化学的合成技術を使用して当業者が
作製できる。
リガンドが生物学的液体中に存在している場合には分
析物は当業界で公知の技術を使用して調製できる。たと
えば血液や羊水のような体液を直接使用してもよいが、
しかしながら、濃縮が必要である。もし検査すべき分析
物が特定の組織を含むならば、その細胞を細胞培養液中
で生長させ、分泌されたリガンドについて上清液を検査
することもできる。
しばしば、標準曲線を作成するためにリガンドを水性
希釈剤（たとえば細胞培養培地のような）で希釈する。
リガンドは、しかしながら、細胞または細胞成分（たと
えば、細胞膜など）中に存在していてもよい。殊に、検
定を使用して選択した細胞系の細胞膜中でのリガンドの
存在を検出できることが発見されている。これは既知の
rPTKに対する新規内因性リガンドの発見のために明らか
に有用である。
例えば、ピペットを使用して接着細胞を含む各ウェル
にリガンド組成物を添加する。検定には対照ウェル（た
とえば、リガンド用水性希釈剤を添加したもの）少なく
とも１個を含める。
接着細胞は通常シグナルを最適化するために十分であ
るが、内因性ホスファターゼによるrPTKの脱燐酸化の結
果としてそのシグナルが減弱するほど長過ぎない時間、
刺激する。適当な刺激時間は約10から60分の間、好まし
くはその細胞に生理学的に至適な温度（通常約37℃）で
は約30分である。
活性化後、ウェルの上清液をデカンテーションし、プ
レートを次に吸着剤基質で軽く固めることにより、過剰
の上清液をさらに除去する。
この検定を使用して目的rPTKに対する拮抗剤リガンド
を検出できる。拮抗剤は一般的に（ａ）rPTKと結合し
て、作動剤によるそのrPTKへの結合および／または活性
化を阻害するもの（拮抗剤はECDに結合してもよいが、
しかし必ずしもそうである必要はない）および（ｂ）作
動剤に結合して作動剤によるrPTKの活性化を阻止するも
のの２個のカテゴリーに分類される。
前記カテゴリー（ａ）の拮抗剤分子を検出するために
は、実質的に前記したように推定上のリガンドと細胞を
接触させる。拮抗剤との接触に続いて、ウェル上清液を
デカンテーションし、ペレットを軽く固める。次に、既
知の作動剤（たとえば、内因性増殖因子など）を実質的
に前記文節に記述したようにして洗浄した細胞に添加
し、続いてウェル上清液をデカンテーションし、プレー
トを軽く固める。これとは別に、拮抗剤および作動剤の
双方を含有する組成物を前記記載のように接着細胞に添
加できる。rPTKの結合および／または活性化を阻害する
推測上の拮抗剤の性能は、これに続いて後述するように
ELISAによって測定できる。
前記カテゴリー（ｂ）の拮抗剤分子を検出するには、
本検定法のKIRA段階の前に、既知の作動剤を推測上の拮
抗剤と前インキュベーションする。このインキュベーシ
ョンは拮抗剤−作動剤複合体の形成を可能にするに十分
な時間、例えば30分間から12時間まで、実施する。次に
この複合体を、対照として使用する非複合の作動剤およ
び拮抗剤とともに、検定に付す。
作動剤（要すれば拮抗剤とともに）リガンドとの接触
に続いて、前記のようにして細胞を溶解する。
E.細胞の溶解 検定のこの段階では本検定法のELISA段階に移るため
にrPTKが活性化されたままで残る（すなわち、チロジン
残基が燐酸化されたまま残る）ように、rPTKを溶解する
ように細胞溶解する。そこで、rPTKまたは受容体構築物
は溶解するが、しかしrPTKを脱燐酸化または変性させな
い前記細胞溶解緩衝液を使用して細胞を溶解する。
前記のようにマイクロタイタープレートを使用する場
合には、各ウェルに細胞溶解緩衝液約75から200μＬを
添加する。プレートを次にプレート振盪機（たとえば、
Bellco・Instruments社、Vineland、NJが販売している
もののようなもの）を使用して約１から２時間、穏やか
に振盪し得る。振盪は室温で行い得る。
2.酵素免疫吸着測定法−ELISA 本検定法の第二段階は第二検定プレート中で行われる
サンドイッチELISAを含む。ELISA実施のために、捕捉剤
を調製する。
A.捕捉剤の調製 前記のように、捕捉剤はしばしばポリクローナル抗体
（通常親和性により精製したポリクローナル抗体）また
はモノクローナル抗体を含む。他の捕捉剤は前記定義の
条項に考察し、検討した。捕捉剤はキナーゼ受容体に、
またはフラグポリペプチド（すなわち、抗原）に、特異
的に結合する。
抗原に対するポリクローナル抗体（受容体かまたはフ
ラグポリペプチドか）は一般に抗原またはその抗原断片
（しばしば、rPTKのECD）およびアジュバントの多回皮
上（sc）または腹腔体（ip）注射により動物体内に作製
する。抗原または標的アミノ酸配列を含む断片を二官能
性または誘導化剤を使用して免疫すべき種に免疫原性を
持つ蛋白質（たとえば、キーホールリンペット血青素）
に複合させることは有用である。
宿主動物またはそれから得られた抗体生産性培養細胞
への免疫原の投与のための経路および計画は一般に抗体
の刺激用および生産用に確立された通常技術と同じであ
る。マウスは検査モデルとして頻繁に採用される一方、
ヒトを含む哺乳類またはそれから得られた抗体生産細胞
はいずれも本発明の工程に従って操作すればヒトを含む
哺乳類のハイブリッド細胞系生産のための基礎として役
立つことができる。
典型的には複合体1mgまたは１μｇ（各々ウサギまた
はマウスに対して）とフロイントの完全アジュバント３
容とを混合し、その溶液を多重部位皮内注射によって動
物を免疫原複合体または誘導物に対して免疫する。１ケ
月後、動物に元の量の1/5から1/10の複合体をフロイン
ト完全アジュバント（または他の適切なアジュバント）
中にとかして多部位への皮下注射によってブーストす
る。７から14日後、動物を瀉血し、血清の抗−抗原力価
を検定する。力価が定常値になるまで動物をブーストす
る。好ましくは、同一抗原の複合体であるが、異なる蛋
白質および／または異なる交差結合剤に複合した複合体
で動物をブーストする。複合体は蛋白質融合体として組
換え細胞培養物中に製造することができる。また、たと
えば明礬のような凝集剤も免疫反応を強化するために使
用される。
免疫後、免疫した動物から免疫細胞（典型的には脾臓
細胞またはリンパ節組織からのリンパ球）を取出し、た
とえば骨髄種細胞との融合またはエプスタイン−バール
（EB）ウイルス形質転換および所期の抗体を生産するク
ローンのスクリーニングなど、この細胞を通常の様式で
不死化することによってモノクローナル抗体を調製でき
る。KohlerとMilsteinがEur.J.Immunol.、６巻:511頁
（1976年）に記載し、Hammerlingなどが「モノクローナ
ル抗体およびＴ細胞−ハイブリドマ（Monoclonal・Anti
bodies・and・Ｔ−Cell・Hybridomas）」、Elsevier、
N.Y.、563〜681頁（1981年）中でさらに記載した細胞融
合技術は特異的抗原多数に対するモノクローナル抗体を
高濃度で分泌する融合細胞系を生産するために広範に適
用されている。
ある種属の細胞を他種属のものと融合することは可能
である。しかしながら、免疫抗体生産細胞および骨髄腫
の源泉は同種属からであるのが好ましい。
融合細胞系は細胞培養培地内で培養を維持できる。本
発明の細胞系はヒポキサンチン−アミノプテリン−チミ
ジン（HAT）培地内にある連続細胞系からなる組成物の
中で選択をし、および／または維持をすることができ
る。事実、ハイブリドマ細胞系が一度樹立されると、種
々の栄養的に適切な培地上で維持できる。その上、融合
細胞系は液体窒素上の凍結および貯蔵を含む常法多数に
よって貯蔵し、保存できる。凍結した細胞系は無限に蘇
生し、モノクローナル抗体の合成および分泌を再開する
培養ができる。
分泌された抗体は、たとえば沈降、イオン交換クロマ
トグラフィー、親和性クロマトグラフィーのような、常
法によって組織培養上清液から回収される。ここに記載
する抗体は、場合によってはIgGまたはIgM精製用にこれ
ら免疫グロブリンを貯蔵血漿から精製するために使用さ
れる、たとえばエタノールまたはポリエチレングリコー
ル沈降操作法など、常法により融合細胞培養物からも回
収される。精製した抗体は無菌濾過する。抗体がポリク
ローナル抗体である場合は、一般に抗体を実質的に特異
的に捕捉するように目的抗原から作成した親和性カラム
を使用して親和精製する。通常、液体クロマトグラフィ
ーのような他の精製法を親和性クロマトグラフィーの前
に行う。
他の態様では、抗体または抗体断片は、McCaffetyな
ど、Nature、348巻:552〜554頁（1990年）に記載されて
いる、適当な抗体または抗体断片を選択するためにフラ
グポリペプチド、rPTK、またはこれらの断片を使用する
技術で作成した抗体ファージライブラリーから分離でき
る。Clacksonなど、Nature、352巻:624〜628頁（1991
年）およびMarksなど、J.Mol.Biol.、222巻:581〜597頁
（1991年）はファージライブラリーを使用する各々マウ
スおよびヒトの抗体の分離を記載している。これに続く
文献はチェイン・シャッフリングによる高親和性（nMの
範囲で）ヒト抗体の生産（Markなど、Bio/Technol.、10
巻:779〜783頁［1992年］）、ならびに非常に大きいフ
ァージライブラリーを構築するための方策の一つとして
組合せ感染および生体内組換え（Waterhouseなど、Nuc.
Acdis・Res.、21巻:2265〜2266頁［1993年］）を記載し
ている。そこで、これら技術は「モノクローナル」抗体
単離のための慣習的なモノクローナル抗体ハイブリドー
マ技術に代わる本発明に包含される有力な選択肢であ
る。
本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは常法
操作（たとえば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコード
する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用する）を使用して容易に分離され、配列決
定される。本発明のハイブリドマ細胞はこのようなDNA
の好適な源泉として役立つ。一旦分離したDNAは発現ベ
クターに入れ、これを次に通常は免疫グロブリン蛋白質
を生産しない、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞
中に形質転換することによって、組換え宿主細胞内での
モノクローナル抗体の合成がなされる。例えば相同的な
マウス配列の代わりにヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメ
インのコード配列を置換することによって（Morrisonな
ど、Proc.Nat.Acad.Sci.、81巻:6851頁［1984年］）、
または免疫グロブリンをコードする配列に共有結合的に
非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列全部または
一部を組込むことによって、DNAを修飾しうる。この様
式で、本発明の抗rPTKまたは抗フラグポリペプチドモノ
クローナル抗体に結合特異性を持つ「キメラ」または
「融合」抗体を調製する。こうして、組み換えDNA法に
よって抗体を製造できる（Cabillyなど、米国特許48165
67号）。
捕捉剤の結合は受容体に結合するリガンドの存在また
は不在によっては影響を受けず、また、捕捉剤は抗ホス
ホチロジン抗体による燐酸化チロジンへの接近を立体的
に阻害することはない。さらにその上、この捕捉剤は、
勿論、目的受容体を活性化しない。これらの性質を持つ
抗体をスクリーニングするために、図３に略記した操作
法を実施できる。
まず、捕捉剤（たとえば、抗体またはストレプトアビ
ジン）を選択したなら、受容体かフラグポリペプチドか
（本検定で受容体構築を使用する場合）どちらかへの結
合を確認する。これは例えばフローサイトメトリー分
析、免疫沈降または抗原被覆ELISAにより測定できる。
フローサイトメトリー分析については前記した。免疫沈
降は通常適切な緩衝液（たとえばPBS）中での非イオン
性界面活性剤（たとえば、0.5％トリトンＸ−100）によ
って細胞（受容体または受容体構築物を持つ）を溶解
し、得られた細胞溶解物を抗受容体または抗フラグポリ
ペプチド捕捉剤の候補とインキュベーションすることを
含む。これらの免疫複合体は（ａ）免疫複合体の沈降を
促進するポリエチレングリコール（PEG）の存在下に抗
捕捉剤抗体か、または（ｂ）固定化（たとえば、アガロ
ース結合）Ａ蛋白質またはＧ蛋白質か、のいずれかと沈
降させる。この免疫沈降物質を次にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（PAGE）により分析する。抗原被覆ELISA
では、ELISAのウェルを精製受容体か、精製フラグポリ
ペプチドか、または精製受容体構築物かのいずれかで一
夜被覆する。被覆したウェルを次に捕捉剤候補と接触さ
せ、HRPOと複合した種特異性抗捕捉剤抗体でスクリーニ
ングする。
受容体に対するリガンドの存在下に受容体またはフラ
グポリペプチドに結合する捕捉剤の性能も確認する。こ
れは受容体または受容体構築物を受容体に対する既知の
リガンド（たとえば、内因性増殖因子またはそれに対す
る抗体作動剤）とともにインキュベーションすることに
よって分析できる。次にフローサイトメトリー分析、免
疫沈降、または抗原被覆ELISAを実質的に前記したよう
に実行して捕捉剤の結合を検討できる。
前記の二段階によって捕捉剤が適切であると決定され
ると、次にその捕捉剤が細胞溶解前および後のいずれに
おいても受容体活性化（すなわち、自己燐酸化）を起こ
さないことを証明する。そこで、細胞に結合した受容体
または受容体構築物を捕捉剤候補または負の対照（たと
えば、受容体を活性化しない対照抗体）と接触させる。
細胞溶解に続いて受容体または受容体構築物を標識抗ホ
スホチロジン抗体を使用するウエスタンブロット分析に
付すことができる。たとえば、Glenneyなど、Journal・
of・Immunological・Methods、109巻:277〜285頁（1988
年）;Kamps、Methods・in・Enzymology、201巻:101〜11
0頁（1991年）;Kozmaなど、Methods・In・Enzymology、
201巻:28〜43頁（1991年）;Holmesなど、Science、256
巻:1205〜10頁（1992年）参照。細胞溶解後に捕捉剤が
受容体活性化を誘発するかどうか確認するためには、KI
RA・ELISAの試験的実施（前記のように捕捉剤および負
の対照の双方について）を行うことができる。
最後に、抗ホスホチロジン抗体（たとえば、ビオチン
化抗−ホスホチロジン抗体）が捕捉剤候補の存在下に活
性化受容体に結合する性能をここに開示するKIRA・ELIS
Aの試験的実施によって確認する。
ある捕捉剤が前記選択基準全てに合格したとすれば、
それはKIRA・ELISAでの使用に良好な可能性を持ってい
る。
適切な捕捉剤が調製されたら、第二固相をそれで被覆
する。例えば、約0.1から10μg/mLまでの間の捕捉剤を
ピペットを使用して第二検定プレートの各ウェルに添加
できる。全電荷を増加させ、それ故、第二検定プレート
に強く結合させるため、捕捉剤はしばしば高pH（たとえ
ば、約7.5から9.6までの間）の緩衝液中で使用される。
通常、捕捉剤をウェル中で約８から72時間までの間イン
キュベーションしてウェル内壁への捕捉剤被覆の十分な
生成を可能にする。一般にこのインキュベーションは低
温（たとえば、約３から８℃の間）で実施して捕捉剤の
分解を削減する。
インキュベーション後、プレートのウェルをデカンテ
ーションし、吸着剤基質で軽く固める。次に非特異的結
合を阻止する。これを達成するために、ブロック緩衝液
をウェルに添加する。例えば、Intergen社、Purchase、
N.Y.が販売しているような、ウシ血清アルブミン（BS
A）を含むブロック緩衝液が適当である。各ウェルへの
ブロック緩衝液約100から200μＬの間の添加と、それに
続く室温で約１から２時間の間の穏やかな撹拌は非特異
的結合の阻止に十分であることが見出された。第二検定
プレートへの添加ではなく、前段で得た細胞溶解物に直
接ブロック緩衝液を添加することも可能である。
これに続いて、捕捉剤被覆プレートを洗浄緩衝液で数
回（通常、約３〜８回の間）洗浄する。洗浄緩衝液は、
例えばpH7.0から7.5の燐酸緩衝液食塩水（PBS）を含有
できる。しかしながら、他の洗浄緩衝液も入手可能で、
これらも使用できる。好都合には、本検定法のこの洗浄
段階および他の洗浄段階には、ScanWasher300型（Skatr
on・Instruments社、Sterling、VA）その他のような自
動プレート洗浄器を使用できる。
B.チロジンホスホリル化の測定 活性化された可溶化rPTK（または受容体構築物）を次
に捕捉剤が接着した各ウェルに添加する。一般的計画と
して、前記1E節に述べたようにして得た細胞溶解物の約
80％（すなわち、ウェルの元の容積に依存して約60から
160μＬ）を各ウェルに添加できる。各ウェルにrPTKを
捕捉できるために適切な時間、たとえば１時間から３時
間まで、の間、細胞溶解物を捕捉剤とインキュベーショ
ンする。インキュベーションは室温で実施できる。
非結合細胞溶解物を次に洗浄緩衝液での洗浄により除
去する。この洗浄段階に続き、前に添加したブロック緩
衝液量と等量またはそれ以下の抗ホスホチロジン抗体一
定量を各ウェルに添加する。例えば、適当な緩衝液（た
とえば細胞溶解緩衝液中に含まれるもののような界面活
性剤を含むPBS）中に抗体約0.3μg/mLから0.5μg/mLま
での間を含む抗ホスホチロジン抗体製品約50から200μ
Ｌをウェルに添加する。これに非結合抗ホスホチロジン
抗体を除去する洗浄段階を続ける。
チロジン燐酸化を次に第二固相に結合する抗ホスホチ
ロジン抗体結合量により定量する。当業者は抗体の存在
を検出する方法多数を入手できる。そのいくつかを以下
に例示する。
一般には抗ホスホチロジン抗体を検出可能な標識で直
接的か間接的かいずれかで標識する。一般的に次の類型
に分類される多数の標識が入手可能である。
（ａ）放射性同位元素、たとえば35S、14C、125I、3Hお
よび131Iのようなもの。抗体は、例えばCurrent・Proto
cols・in・Immunology、前出、に記載されている技術を
使用して放射性同位元素で標識することができ、放射能
はシンチレーション計測を使用して測定できる。
（ｂ）螢光標識、たとえば希土類元素キレート（ユーロ
ピウムのキレート）またはフルオレッセインおよびその
誘導体、ロダミンおよびその誘導体、ダンシル、リッサ
ミン、フィコエリスリンおよびデキサスレッドのような
ものを使用できる。これら螢光標識は、例えばCurrent
・Protocols・in・Immunology、前出、に開示されてい
る技術を用いて抗体に結合できる。螢光は螢光光度計
（Dynatech社）を用いて定量できる。
（ｃ）種々な酵素−基質標識を使用でき、米国特許4275
149号はそれらのいくつかを綜説している。これら酵素
は一般に種々の技術を使用して測定することのできる発
色団基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素が基質の
変色を触媒するなら、分光学的に測定できる。その他
に、酵素が基質の螢光または化学発光を変化するものも
ある。螢光の変化を定量する技術は前記した。化学発光
基質は化学反応によって電子的に励起され、測定できる
光を放射する（例えば、Dynatech社・ML3000化学発光光
度計を使用）か、またはエネルギーを螢光受容体に与え
る。酵素標識の例にはルシフェラーゼ（たとえば、ホタ
ルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許
4737456号）、ルシフェリン、2,3−ジヒドロフタラジン
ジオン、マレエート脱水素酵素、ウレアーゼ、たとえば
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRPO）のようなペル
オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチール、配糖体オ
キシダーゼ（たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェ
ート脱水素酵素など）、ヘテロ環オキシダーゼ（たとえ
ばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクト
ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、その他
の同類を含む。酵素を抗体に結合する技術はMethods・i
n・Enzym.（J.LangoneとH.Van.Vunakis編）、73集:147
〜166頁（1981年）、Academic・Press社、New・York
中、O'Sullivanなど、「酵素免疫検定で使用する酵素−
抗体結合物の製造法（Methods・for・the・Preparation
・of・Enzyme−Antibody・Conjugates・for・use・in・
Enzyme・Immunoassay）」およびCurrent・Protocols・i
n・Immunology、前出、に記載されている。
酵素−基質組合せの例には次を含む。例えば： （ｉ）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRPO）および
基質としての過酸化水素。ここでは過酸化水素が色素前
駆体（たとえば、オルトフェニレンジアミン［OPD］ま
たは3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン・塩酸塩［TM
B］など）を酸化する。
（ii）アルカリホスファターゼ（AP）とクロモーゲン基
質としてのパラ−ニトロフェニル燐酸塩。
（iii）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Gal）とク
ロモーゲン基質（たとえば、ｐ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ）またはフルオロゲン基質である
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ。
他に多数の酵素−基質組合せが当業者には入手でき
る。これらの一般的綜説としては米国特許4275149号お
よび4318980号を参照。
標識を間接的に抗体に結合することもある。当業者は
これを達成するための種々の技術を知っている。例え
ば、抗体をビオチンと結合し、前記広範囲類型３種の中
のいずれかの標識をアビジンと結合するか、その逆とす
る。ビオチンはアビジンに選択的に結合するので、そこ
で、標識をこの間接的な様式で抗体に結合できる。ビオ
チン−アビジン結合技術の綜説についてはCurrent・Pro
tocols・in・Immunology、前出、を参照。この他に、標
識を間接的に抗体に結合するために、抗体を小さなハプ
テン（たとえば、ジゴキシン）と結合し、前記標識中で
異なる型のものの一つを抗ハプテン抗体（たとえば、抗
−ジゴキシン抗体）と結合する。こうして、抗体と標識
との間接的な結合を達成できる。
本発明の別の態様では抗ホスホチロジン抗体を標識す
る必要がなく、その存在は標識抗−抗ホスホチロジン抗
体（たとえば、HRPOに結合した抗−マウス抗ホスホチロ
ジン抗体）を使用して検出できる。
好適な態様では、抗−ホスホロチロジン抗体を基質
（たとえば、テトラメチルベンズイミジン［TMB］、ま
たはオルトフェニレンジアミン［OPD］）の変色を触媒
する酵素標識により標識する。こうして、放射能物質の
使用を避ける。試薬の変色は適切な波長（たとえば、TM
Bには450nm、OPDには490nm、対照波長は650nm）で分光
光学的に測定できる。
3.細胞内キナーゼ活性 ここに記載する検定法は細胞内キナーゼ（たとえば、
原形質チロジンキナーゼおよび／または原形質セリン−
スレオニンキナーゼ）の燐酸化および／または活性化の
測定用にも有用である。これら分子の燐酸化はキナーゼ
受容体または「キナーゼ複合体」（細胞膜に存在するキ
ナーゼ受容体１個またはそれ以上を含む）による細胞内
キナーゼのトランス燐酸化の結果として起きることがで
きる。細胞内チロジンキナーゼの例は、例えばインシュ
リン受容体基質Ｉ（IRS−Ｉ）、Shc、Ras、およびGRB2
を含む。これらチロジンキナーゼの捕捉剤として使用で
きるヒトShc、ヒトRasおよびGRB2に対する抗体はUBI
社、NYから購入できる。細胞内セリン−トレオニンキナ
ーゼの例にはMEKおよびMAPKを含む。
これらキナーゼの燐酸化を測定するための操作は細胞
内キナーゼとフラグポリペプチドとのキメラ（すなわち
「キナーゼ構築物」）が形成されることを除いて本質的
に前記と同様である。あるいは、この細胞は内因性細胞
内キナーゼを持っているか、目的とする細胞内キナーゼ
をコードする核酸で形質転換される。一般に、真核生物
細胞はキナーゼ構築物をコードする核酸で形質転換する
のがよい。核酸が発現されると、キナーゼまたはキナー
ゼ構築物が細胞内（すなわち、原形質内）に存在するこ
とになる。キナーゼまたはキナーゼ構築物を含む細胞を
前記KIRAに付す。作動剤との接触が細胞内キナーゼのト
ランス燐酸化を起こせば、これを前記ELISAで定量でき
る。ELISA内の捕捉剤は細胞内キナーゼかフラグポリペ
プチドかのどちらかと結合する。
4.セリン−スレオニンキナーゼ活性 この検定はさらに燐酸化および／またはセリン−スレ
オニンキナーゼの活性化を測定するために有用である。
用語「セリン−スレオニンキナーゼ」はホスフェートを
受容できるアルコール基少なくとも１個を持つ基質を燐
酸化するキナーゼを示す。リガンド結合ECD、TMドメイ
ンおよびICDを持つという範囲においては、セリン−ス
レオニンキナーゼは通常は「受容体」である。ICDは通
常触媒キナーゼドメインを持ち、一般にホスフェートを
受容するセリンおよび／またはスレオニン残基１個また
はそれ以上を含む。細胞内セリン−スレオニンキナーゼ
の例にはMEKおよびMAPKを含む。細胞内セリン−スレオ
ニンキナーゼの燐酸化の測定に関する検討は前記３章を
参照のこと。セリン−スレオニンキナーゼ受容体の例は
daf−１、アクチビンII型受容体（ActR−II）、アクチ
ビンII B型受容体（ActR−II B）、TGF−βII型受容体
（ＴβＲ−II）、アクチビン受容体様キナーゼ（ALK）
−１、−２、−３、−４およびTGF−βＩ型受容体（Ｔ
βＲ−１）/ALK−５を含む。ten・Dijkeなど、前出、参
照。セリン−スレオニンキナーゼ検定は燐酸化を抗ホス
ホセリンおよび／または抗ホスホスレオニン抗体を使用
して定量すること以外はチロジンキナーゼについて記載
したものと本質的に同一である。抗ホスホセリンおよび
抗ホスホスレオニンモノクローナル抗体は、例えばSigm
a・Immuno・Chemicals社、St.Louis、MO、から購入でき
る。
5.ホスファターゼ活性 ホスファターゼ活性も同様にここに記載する検定法を
使用して測定できる。ホスファターゼ酵素はホスホリル
化チロジン、セリンおよび／またはスレオニン残基を脱
ホスホリル化（すなわち、これらアミノ酸残基の燐酸エ
ステルから無機燐酸を遊離する）することができる。一
般に、ホスファターゼ酵素はチロジン残基かセリン−ス
レオニン残基かいずれかに特異的であるが、時にはチロ
ジン、セリンおよびスレオニン残基を脱燐酸化できる。
時には「内因性」ホスファターゼ活性を測定するが、こ
れは選択した細胞内に天然に存在するホスファターゼ酵
素の活性を示す。
内因性ホスファターゼ活性を定量するため、ホスファ
ターゼ少なくとも１種を持つ細胞をホスファターゼ阻害
剤１種またはそれ以上の存在または不在下に刺激する。
蛋白質チロジンホスファターゼ（PTPase）阻害剤の例に
はオルトバナジン酸ナトリウムおよびモリブデン酸ナト
リウム（Sigma・Chemical社、St.Louis、MO）を含む。
セリン−スレオニンホスファターゼ阻害剤であるオカダ
酸はICN・Biochemicals社が供給している。一般的な計
画では、検定プレートの各ウェルに約１から10μＭの間
のホスファターゼ阻害剤を添加できる。他の点全ては実
質的に前記のようにして検定する。そこで、選択した細
胞内のキナーゼを脱燐酸化する内因性ホスファターゼの
性能を定量することができる。
好適な態様では、目的とするホスファターゼ酵素を検
討できる。蛋白質チロジンホスファターゼ（PTPase）の
例にはPTP1B、PTPMEG、PTP1c、Yop51、VH1、cdc25、CD4
5、HLAR、PTP18、HPTPα、およびDPTP10Dを含む。Zhang
とDixon、Adv.Enzym.、68巻:1〜36頁（1994年）参照。
蛋白質セリン−スレオニンホスファターゼの例にはPP
1、PP2A、PP2BおよびPP2Cを含む。HunterとSefton編、M
eth.Enzym.、Academic・Press社、New・York、201集:38
9〜398頁（1991年）参照。これら蛋白質は商業的に購入
でき、またはここに記載する組換え技術を使用して製造
できる。ホスファターゼ活性を測定するため、本質的に
前記のようにして、次の修正を加えてKIRA・ELISAを実
施できる。キナーゼまたはキナーゼ構築物（たとえば受
容体構築物）の第二固相への捕捉および洗浄段階（非結
合細胞溶解物を除去するため）に続いて、目的ホスファ
ターゼを第二検定プレートの各ウェルに添加し、接着し
たキナーゼまたはキナーゼ構築物とともにインキュベー
ションする。例えば、適切な希釈緩衝液中のホスファタ
ーゼ（HunterとSefton編、Meth.Enzym.、Academic・Pre
ss社、New・York、201巻:416〜440［1991年］）約50〜2
00μＬを各ウェルに添加できる。一般に、これに続けて
キナーゼをホスファターゼに脱燐酸化させるため、室温
（または37℃）で約30分から２時間の間穏やかに振盪す
る。洗浄でホスファターゼを除去後、対照（すなわち、
ホスファターゼ無添加）と比較したキナーゼの燐酸化度
合の減少を前記ELISAによって定量する。
6.キット 便宜のため、試薬をキット、すなわち、試薬の包装し
た組合せ、目的rPTK活性化を阻害または活性化するため
の分析物の性能を検定する分析物の組合せとして供給で
きる。キットの各成分は予め決められた比率で供給され
よう。そこでキットは本検定用特異的第二固相ならびに
別々に包装されているか、または第二固相（たとえば、
マイクロタイタープレート）に捕捉されている抗フラグ
ポリペプチド捕捉剤を含む。通常、酵素標識で直接的ま
たは間接的に標識された抗ホスホチロジン抗体のような
他種の試薬もキットに入れるであろう。検出可能な標識
が酵素である場合、キットは基質および酵素が必要とす
る補助因子（たとえば、検出可能な発色団または螢光団
を提供する基質前駆体）も含有するであろう。これに加
えて、たとえば、安定化剤、緩衝剤（たとえば、ブロッ
ク緩衝液および細胞溶解緩衝液）などのような他の添加
剤も含めうる。好都合には、このキットは受容体構築物
で形質転換した均質な細胞集団も供給できる。様々な試
薬の相対的な量は検定の感度を実質的に最適化する試薬
の溶液内濃度を提供するために広範に変動してもよい。
殊に、試薬は溶解後に適当な濃度を持つ試薬溶液を提供
するであろう添加剤を含み、乾燥粉末、通常は凍結乾燥
粉末、として提供されてもよい。キットにはまたKIRA・
ELISAを実行するための指示書を入れるのが適当であ
る。
7.検定のための使用 この出願は信頼性良く高感度にキナーゼ活性化を定量
的に検出するために有用な検定法二種を提供する。第一
の検定法はここに記載する所望の特性を持つキナーゼ受
容体に特異的な捕捉剤抗体が入手できるか製造されてい
る場合に使用できる。第二の検定法はフラグポリペプチ
ドおよびそこに特異的に結合する捕捉剤の使用により測
定すべきいずれかのキナーゼ受容体の活性化を可能にす
る一般的検定法である。
これら検定法は選択したキナーゼ受容体のための新規
な作動剤／拮抗剤を認定するために有用である。また、
この検定法はリガンド−受容体間相互作用を研究（すな
わち、機序研究）する手段を提供する。また、選択した
細胞系中の内因性受容体の存在をこの検定の使用によっ
て定量できる。これら検定法はさらに生物学的標本中の
選択したキナーゼ受容体に対するリガンドの存在を認定
し、また、たとえば精製操作後に増殖因子が分離された
かどうかを確認するために有用である。個々の受容体を
活性化するこれら増殖因子の性能を測定する検定法を持
つことは望ましいことである。
本検定法はヒトから採取した生物学的標本中の選択し
たrPTK（たとえばインシュリン受容体）に対するリガン
ドの存在を検出する臨床的応用も持ち、そこで、リガン
ド濃度が上昇または下降した患者を認定できる。リガン
ド濃度の上昇または下降が病理学的症状を起こす場合に
はこれは殊に望ましい。従って、選択したリガンド（た
とえば、インシュリン）の投与対象候補をこの診断法に
よって認定できる。ここに開示する検定法を用いて患者
に投与する作動剤または拮抗剤のpKを検定することも可
能である。この検定法はまた生物学的標本中に隠れてい
る受容体の検出を促進する。
この検定法はまた内因性ホスファターゼ、好適な態様
においては目的ホスファターゼ、のホスファターゼ活性
を定量するためにも有用である。これは、例えばホスフ
ァターゼ阻害剤のスクリーニングに使用できる。
以下は本発明実施の特異的態様の実例である。これら
実施例は例示的目的のみで提出されるものであり、いか
なる意味でも本発明の範囲を限定することは意図されて
いない。
ここに引用する報告、特許および特許出願は、前記も
後記もいずれでも全て、それら全体を参考にするために
ここに引用するものである。
実施例１ HER2受容体のKIRA・ELISA この実施例に記載する検定法は、HER2受容体とその特
異的活性化剤、ヘレグリン（heregulin:HRG）との間の
相互作用の結果としての自己燐酸化の程度を測定するた
めに開発した。p185HER2の過剰発現は上皮由来性癌多数
の不十分な臨床的成果に関連する。ヘレグリンとその齧
歯類同族体neu分化因子（NDF）は最初に乳癌細胞系MCF
−７およびMDA−453中の185kDA蛋白質の自己燐酸化を促
進する性能に基づいて精製した。本発明のこの態様にお
いて、チロジンキナーゼ受容体DNA（内因性または形質
転換のいずれか）を発現する細胞系は接着性で、リガン
ド不在下に自己燐酸化を促進せず、結合リガンドの存在
が原因で非対結合を起こすこともないような、この受容
体に特異的に結合することのできる抗体（たとえば、モ
ノクローナルまたは親和性精製ポリクローナル）があ
る。標準曲線作製と標本多数とをこの検定を使用してい
くつかの希釈で反復して同時に進行でき、未知標本多数
の中のリガンド活性を容易に定量できる。
（ｉ）捕捉剤の製造 HER2分子の細胞外ドメインで免疫したニュージーラン
ド白色ウサギの免疫血漿からポリクローナル抗体−HER2
抗体を分離した（Fendlyなど、Journal・of・Biologica
l・Response・Modifiers、９巻:449〜455頁［1990
年］）。このrHER2・ECD特異性抗体をAvidgel・Ｆ（Bio
probe・International社、Tustin、CA）に結合したrHER
2・ECDから構成した親和カラムによるFPLC（Pharmacia
・Biotech社、Piscataway、NJ）を使用して精製した。
得られた精製抗体保存液は0.829mg/mL燐酸塩緩衝食塩水
（PBS）、pH7.4で、0.5mL量づつにして−20℃で保存し
た。
（ii）抗ホスホチロジン抗体の製造 モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン4G10、は
Upstate・Biologicals社（UBI、Lake・Placid、N.Y.）
から購入し、長鎖ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンア
ミド（Biotin−Ｘ−NHS、Research・Organics社、Cleve
land、OH）を使用してビオチン化した。
（iii）リガンド 組換えにより、末端を切詰めた残基177〜244に対応す
るβ１ヘレグリン（分子量＝7.88Kd）（HRGβ１
177〜244）をHolmesなどがScience、256巻:1205〜1210
頁（1992年）に記載したように、大腸菌中で生産し、均
一になるまで精製し、pH7.5の50mM−トリス/HCl中の89.
7μＭ−ストック溶液として４℃で貯蔵した。
（iv）接着細胞 人乳腺癌から分離した接着細胞系MCF−７（ATCC−HBT
22）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATC
C、Rockville、MD）から入手した。MCF−７細胞はFACS
およびELISA分析で測定可能量の表面p185HER2を生産す
ることが証明されている。この細胞を150cm2組織培養フ
ラスコ中（Corning社、Corning、NY）に保存し、細胞濃
度が全面生長の60％から75％の時に使用した。検定のた
めには、平底マイクロタイタープレート（Falcon3072
型、Becton・Dickinson・Labware社、Lincoln・Park、N
J）のウェル毎に２×105細胞を接種し、37℃で一夜５％
CO2中で培養した。細胞は通常組成としてのF12/DMEM50:
50Gibco（Gibco/BRL、Life・Technologies社、Grand・I
sland、NY）中で生長させた。培地には10％FBS（HyClon
e、Logan、Utah）、25mM−HEPES（Gibco社）、および2m
M−Ｌ−グルタミン（Gibco社）を添加した。
（ｖ）KIRA・ELISA MCF−７細胞（２×105）を培地100μＬ中で平底96穴
培養プレートの各ウェルに添加、一夜37℃で５％CO2中
で培養した。翌朝ウェルの上清液をデカンテーション
し、紙タオルでプレートを軽く押し固めた。実験標本ま
たは組換えHRGβ１177〜244標準（3000、1000、333、11
1、37、12、４、および0pM）を含む培地50μＬを各ウェ
ルに添加した。細胞を37℃で30分間刺激し、ウェル上清
液をデカンテーションし、プレートを再度軽く押し固め
た。細胞を溶解し、受容体を溶解するために細胞溶解緩
衝液100μＬを各ウェルに添加した。この細胞溶解緩衝
液は50mM−HEPES（Gibco社）、0.5％トリトン−Ｘ−100
（Gibco社）、0.01％チメロサール、30KIUアプロチニン
（ICN・Biochemicals社、Aurora、OH）/mL、1mM−４−
（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フッ化物塩酸
塩（AEBSF、ICN・Biochemicals社）、50μＭ−リュウペ
プチン（ICN・Biochemicals社）および2mM−オルトバナ
ジン酸ナトリウム（Na3VO4,Sigma・Chemical社、St.Lou
is、MO）を含む150mM−NaCl、pH7.5、から構成した。次
にプレートをプレート振盪機（Bellco・Instruments
社、Vineland、NJ）上、室温で60分間穏やかに振盪し
た。
細胞が溶解したら、親和性精製したポリクローナル抗
HER2・ECD（50mM−炭酸緩衝液中1.0μg/mL、pH9.6、100
μL/ウェル）で一夜４℃で被覆したELISAマイクロタイ
タープレート（Nunc・Maxisorp、Inter・Med社、デンマ
ーク）をデカンテーションし、紙タオルで押し固め、ブ
ロック緩衝液［0.5％BSA（Intergen社、Purchase、NY）
および0.01％チメロサール含有PBS］150μL/ウェルで穏
やかに振盪しながら室温で60分間ブロックした。60分
後、抗HER2・ECD被覆プレートを自動プレート洗浄器（S
canWasher300、Skatron・Instruments社、Sterling、V
A）を使用して洗浄緩衝液（0.05％トゥイーン20および
0.01％チメロサール含有PBS）で６回洗浄した。
細胞培養マイクロタイターウェルからの溶解p185HER2
含有細胞溶解物（85μL/ウェル）を抗rHER2・ECDで被覆
し、ブロックしたELISAウェルに移動し、穏やかに振盪
しながら室温で２時間インキュベーションした。非結合
受容体を洗浄緩衝液で洗浄して除去し、希釈緩衝液（0.
5％BSA、0.05％トゥイーン20、5mM−EDTA、および0.01
％チメロサール含有PBS）で1:2000、すなわち400pg/m
L、に希釈したビオチン化4G10（抗ホスホチロジン）100
μＬを各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベー
ションした後、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で1:1000
0に希釈したHRPO結合ストレプトアビジン（Zymed・Labo
ratories社、S.San・Francisco、CA）100μＬを各ウェ
ルに添加した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で
30分間インキュベーションした。遊離のアビジン結合体
を洗い去り、新しく調製した基質溶液（テトラメチルベ
ンジジン［TMB］、２成分基質キット、Kirkegaad・and
・Perry社、Gaithersburg、MD）100μＬを各ウェルに添
加した。反応が10分間進行した後、1.0M−H3PO4を100μ
L/ウェル添加して発色を止めた。Macintosh・Centris65
0（Apple・Computers社、Cupertino、CA）およびDeltaS
oftソフトウエア（BioMetallics社、Princeton、NJ）の
制御下にvmaxプレート読取器（Molecular・Devices社、
Palo・Alto、CA）を使用し、参照波長を650nmとする450
nmの吸光度を読み取った（ABS450/650）。
図７に示す標準曲線は、MCF−７細胞を3000、1000、3
33、111、37、12、４または0pMのHRGβ１177〜244で刺
激し、pM−HRGβ１177〜244対平均ABS450/650±標準偏
差として表示し、DeltaSoftプログラムを使用して作成
した。標準濃度は吸光度をその標準曲線に内挿して得ら
れ、pM−HRGβ１177〜244活性として表示した。
データを四パラメーター非線型最小自乗方程式に適合
させた時、相関係数0.9998を与えた。図７に示すデータ
について、HRGβ１177〜244による受容体活性化のEC50
は373pMであった。p185HER2KIRA・ELISAの高度な再現性
を証明するために、１ケ月にわたり標準曲線を７回作成
し、EC50値を平均した。これでHRGβ１177〜244の平均E
C50値360±40pM（平均±標準偏差）の値を得た。
（vi）検定内および検定間精度および検定特異性 p185HER2KIRA・ELISAを別々の日に３回行って検定間
変動を測定した。各検定では標準曲線を３回作成した。
高（1000pM）、中（200pM）および低（40pM）HRGβ１
177〜244に対応する対照を24反復で検定した。各被検標
本のABS450/650をpM−HRGβ１177〜244活性に変換し、
各検査濃度での変換値24個を平均した。データを平均値
および変動係数％（％cv［（検定内標準偏差／検定内算
出値平均値）×100］）で表示した。次の表1A参照。
この検定が実際に生物検定とELISAとの両要素から構
成されている事実にも拘らず、KIRA・ELISAの検定内変
動値は容認できる範囲内であった。最高の変動係数
（％）は20％以下であり、中値および低値では10％以下
であった。
検定間変動は各検査での所定サンプル濃度について隣
接ウェル３個（24ウェル試験の中で）の最高値の平均に
より算出した。各検査濃度の平均値３個を平均した。デ
ータを平均値と％cv［（検定間標準偏差／検定間平均
値）×100］とで表示した。前記表1B参照。このKIRA・E
LISAの検定間変動は容認できる範囲内であった。
この検定法の特異性を確認するため、MCF−７細胞を3
000、1000、333、111、37、12、４または0pMのHRGβ１
177〜244または30000、10000、3333、1111、370、120、
40または0pMのインシュリン様増殖因子−１（IGF−
１）、表皮増殖因子（EGF）、血管上皮増殖因子（VEG
F）、またはインシュリンで刺激した。p185HER2KIRA・E
LISAを前記の通りに行った。結果を表８に示す。
p185HER2KIRA・ELISAは明らかにヘレグリンに特異的
であった。HRGβ１177〜244は正常な受容体刺激および
自動燐酸化を誘発した一方で、近縁のEGFは検査した最
高濃度（100nM）でも極く僅かな刺激しか与えなかっ
た。EGF−ＲはMCF−７細胞中で生産されるので、このシ
グナルはp185HER2のEGF受容体トランス燐酸化に起因す
ると思われる。インシュリン様増殖因子−１（IGF−
１）、血管表皮増殖因子（VEGF）およびインシュリンは
いずれもMCF−7p185HER2KIRA・ELISAには検出可能な効
果を及ぼさなかった。MCF−７細胞は活性なインシュリ
ン受容体を生産するにも関わらず、インシュリンでさえ
効果がなかった。
この実施例が示す結果は、KIRA・ELISAはキナーゼ受
容体のリガンド活性化、たとえば、p185HER2受容体のヘ
レグリン活性化、を検定するための有用な方法であるこ
とを証明する。チロジン燐酸化で表示される受容体活性
化水準は容易に定量化され、所与リガンドのEC50は容易
に測定される。この検定が使用される可能性の一つは受
容体の作動剤または拮抗剤に関する化合物のスクリーニ
ングであろう。この検定の処理可能量はウエスタンブロ
ット分析のそれを大きく超える。この検定の細胞培養部
分は96ウェルのプレート中で実施されるので、１日の検
定で１度に異なる希釈率で多数の標本を反復して検定し
てもよい。
実施例２ Rse受容体のKIRA・ELISA MarkなどはJournal・of・Biological・Chemistry、26
9（14）巻:10720〜10728頁（1994年）にヒトおよびネズ
ミの組織からのRse受容体蛋白質チロジンキナーゼの分
離を記載している。このRse受容体とカルボキシ末端フ
ラグポリペプチド（すなわち、Rse.gD）とをここに記載
するKIRA・ELISAに付した。実験操作を以下に略述す
る。
（ｉ）捕捉剤の調製 モノクローナル抗gD（クローン5B6）はヘルペス／シ
ンプレックスウイルスのグリコプロテインＤからのペプ
チドに対して調製した（Paborskyなど、Protein・Engin
eering、３（６）巻:547〜553頁［1990年］）。精製ス
トック製品を3.0mg/mL燐酸緩衝食塩水（PBS）、pH7.4に
調整し、1.0mL量を−20℃で貯蔵した。
（ii）抗ホスホチロジン抗体の調整 モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン4G10、は
Upstate・Biologicals社（UBI、Lake・Placid、NY）か
ら購入し、長鎖ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンアミ
ド（Biotin−Ｘ−NHS、Research・Organics、Clevelan
d、OH）を使用してビオチン化した。
（iii）リガンド Rse受容体への内因性リガンドは入手できなかったの
で、この実施例に記載するKIRA・ELISAに用いるリガン
ドを形成するRse受容体への作動剤抗体を調製した。作
動剤抗体を作製するためRse.IgGキメラを作製した。略
述すれば、Rse・ECDのコード配列を多段工法によりヒト
IgG−γ１重鎖配列に融合した。PRCを用いて、Rseアミ
ノ酸428のコード配列の3'に独特なBstE II部位を持つ断
片を作製した。PCR生成物をその構築物中の独特なBstE
II部位を通してヒトIgG−γ１重鎖cDNAに結合した（Mar
kなど、J.Cell.Biol.、267巻:26166〜26171頁［1992
年］）。得られた構築物（pRK.bpTK3.IgG.融合体と命
名）はヒトIgG−r1重鎖をコードする配列に結合したRse
アミノ酸375〜428のコード配列を含む。Rse・ECDのの残
りの部分（アミノ酸１〜374）を次にpRK.bpTK3.IgG.融
合体中のBamH I部位を経由する結合で付加してpRK.Rse.
IgGを得た。
Rse.IgGを発現する安定な細胞集団を作製するため
に、CachiancesなどがBio.Techniques、15巻:225〜259
頁（1993年）に開示したpRK5誘導物であるCMV推進発現
プラスミドpCIS.EBONのエピソームにRse.IgGをコードす
るcDNAをサブクローニングした。ヒト胎児腎臓293細胞
（ATCC、Parklawn・Drive、Rockville、MD、米国から入
手）を燐酸カルシウム法により形質転換した。細胞単層
をDNA沈降物存在下にインキュベーションし、グリセリ
ンでショックを与え、2mM−グルタミン、10％ウシ胎児
血清、ペニシンリンおよびストレプトマイシンを含有す
るF12:DMEM（1:1）中で培養した。48時間後、細胞集団
をG418を含有する培地に再接種して安定な細胞集団を選
択した。条件付け媒体を血清不含培地中でG418不在下に
72時間培養したRse.IgG核酸発現細胞から集めた。
Chamow,S.M.などがBiochemistry、29巻:9885〜9891頁
（1990年）に記載した操作に次の小規模の修正を加えて
使用するプロテインＡカラムでの親和性クロマトグラフ
ィーによりRse.IgGを精製した。Rse.IgGを発現する細胞
から採集した条件付け媒体を0.1M−クエン酸、pH6.0に
調整し、プロテインＡカラム（Repligen社）に直接負荷
した。カラムを0.1M−クエン酸、pH6.0で洗浄し、3M−M
gCl2と10％グリセリンとで溶離した。画分を集め、PD−
10カラム上で脱塩し、透析し、PBSに対して濃縮した。
蛋白質濃度はヒトIgG（Fc）に対するELISAにより測定し
た。この蛋白質の純度はPAGEゲルのクーマジー染色によ
って分析した。
前記の通り、Rse.IgGに対するポリクローナル抗体を
ニュージーランド白ウサギ中に発生させた。Rse.IgG4μ
ｇのPBS100μＬ溶液をフロインドのアジュバント100μ
Ｌ中に乳濁化した（最初の注射には完全アジバント、全
ブーストには不完全アジュバント）。最初の免疫および
第１回ブーストでは蛋白質を膝窩のリンパ節に直接注射
した（Sigelなど、Methods・Enzymol.、93巻:3〜12頁
［1983年］）。後続するブーストでは、蛋白質を皮下お
よび筋肉内部位に注射した。蛋白質1.3μg/体重kgを３
週間毎に注射し、各ブースト後１および２週間目に血液
を採取した。作製したポリクローナル抗血清を次に50％
硫酸アンモニウム中で沈殿させた。
得られた精製ポリクローナル抗血漿をここでは「19
B」と呼称する。Rse受容体の自動燐酸化を誘発する19B
抗血清の性能を確認するために、血清でスターブした3T
3.gD.R11細胞（MarkなどがJournal・of・Biological・C
hemistry、269（14）巻:10720〜10728頁［1994］に記載
した技術を使用してアミノ末端gDフラグポリペプチド
［すなわち、gD.Rse］を持つRse受容体をコードする核
酸で形質転換したもの）またはNIH3T3細胞を1:200希釈
の免疫前血漿または19Bポリクローナル抗血清と10分間
接触させた。抗gDモノクローナル抗体5B6を使用して抽
出物からgD.Rse蛋白質を免疫沈降させた。蛋白質を７％
SDS−PAGEで還元条件下に分画し、ニトロセルロースに
移した。Rseの燐酸化は標識抗ホスホチロジン抗体で検
出した。3T3.gD.R11細胞の19B抗血清処理で140kDのgD.R
se蛋白質の燐酸化を刺激した。この増加は免疫前血清処
理細胞には観察されなかった。
精製した19Bポリクローナル抗血清はpH7.5の2.8mg/PB
SmLストック溶液として４℃で保存した。
（iv）Rse.gD核酸の調製 合成二重鎖オリゴヌクレオチドを使用してヒトRseの
Ｃ末端アミノ酸10個（880〜890）に対するコード配列を
再構築し、さらに抗体5B6のエピトープおよび終止コド
ンを含むアミノ酸21個を付加した。融合遺伝子の合成部
分の最終的配列は次の通りであった： コード鎖:5'−TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCA
GATGCTAGCCTCAAGATGGCTGATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCT
TCCGGTCCTGTAGAAGCT−3'（配列番号10）。
非コード（アンチセンス）鎖:5'−AGCTTCTACAGGACCGG
AAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCATCTTGAGGCTAGCAT
CTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA−3'（配列番号
11）。
この合成DNAをヒトRseのアミノ酸１〜880をコードす
るcDNAに公知のヒトRsecDNA配列におけるヌクレオチド2
644から始まるPst I部位（Markなど、Journal・of・Bio
logical・Chemistry、269（14）巻:10720〜10728頁［19
94］）および発現ベクターpSVI7.ID.LL（図16、配列番
号９参照）のポリリンカー中のHind III部位に結合し
て、発現プラスミドpSVI7.ID.Rse.gDを作製した。略述
すれば、この発現プラスミドには二シストロン性の一次
転写体を含み、5'−切断ドナーおよび3'−切断アクセプ
ターイントロンの切断部位、続いてRse.gDをコードする
配列が結合したDHFRをコードする配列を含む。全長（非
切断）メッセージは第一オープン読み枠としてDHFRを含
むので、DHFR蛋白質が作製されて、安定な形質転換体の
選択が可能である。
（ｖ）細胞の形質転換 dp12.CHO細胞（欧州特許307247号、1989年３月15日発
行）にプラスミド骨格中の独特なNot I部位でリネアラ
イズしたpSV.ID.Rse.gD20μｇを電気穿孔した。このDNA
をフェノール／クロロホルム抽出後にエタノール沈降
し、1/10トリスEDTA20μＬ中に再懸濁した。次にDNA10
μｇをCHO.dp12細胞107個とともにPBS1mL中で氷上で10
分間インキュベーションした後、400ボルトで330μｆで
電気穿孔した。細胞を氷に戻し、10分後に非選択培地に
接種した。24時間後、細胞にヌクレオシド不含培地を加
えて安定なDHFR＋クローンを選択した。
（vi）KIRA・ELISAで使用する形質転換細胞の選択 Rse.gD核酸を発現する細胞系を認定するために、候補
クローンをRseの細胞外エピトープを認識する前記のよ
うにして作製したポリクローナル抗血漿19Bを使用する
螢光活性化細胞選択（FACS）分析によってスクリーニン
グした。図５、段階（ｂ）参照。
FACS検定で陽性を示したクローンが全長Rse.gD核酸を
発現することを確認するため、細胞溶解物を調製（Lokk
erなど、EMBO・J.、11巻:2503〜2510頁［1992年］）
し、溶解したRse.gDを19B抗血漿で免疫沈降した。免疫
沈降した蛋白質を還元条件下に７％PAGEを使用して分画
し、ニトロセルロースにブロットし、セイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体で検出する抗−gD
・5B6抗体でプローブした。図５の段階（ｃ）参照。細
胞クローン中のRse.gDが19B作動剤抗体に反応して活性
化して自動燐酸化を起こす性能を測定した。略述すれ
ば、前記のRse.gD核酸で形質転換したdp.CHO細胞を血清
でスターブし、1:200希釈の免疫前血清または19B抗血清
と10分間接触した。gD・5B6モノクローナル抗体を使用
してRse.gD蛋白質を抽出物から免疫沈降した。蛋白質を
７％SDS−PAGEで還元条件下に分画し、ニトロセルロー
スに転写した。Rseの燐酸化は標識抗ホスホチロジン抗
体で検出した。図５、段階（ｄ）参照。
（vii）培地 細胞はF12/DMEM50:50（Gibco/BRL・Life・Technologi
es社、Grand・Island、NY）中に生長させた。この培地
には10％透析濾過したFBS（HyClone社、Logan、Uta
h）、25mM−HEPESおよび2mM−Ｌ−グルタミンを添加し
た。
（viii）KIRA・ELISA Rse.gDで形質転換したdp12.CHO細胞（1989年３月15日
発行、欧州特許307247号）を平底96穴培養プレートのウ
ェルに接種（ウェル当り５×104個）し、一夜37℃で５
％CO2中で培養した。翌朝、ウェルの上清液をデカンテ
ーションし、プレートを紙タオルで軽く押し固めた。各
ウェルに実験標本または1:100、1:200、1:400、1:800、
1:1600、1:3200または０希釈した抗Rse作動剤ポリクロ
ーナル抗体（19BpAb）を添加した。細胞を37℃で30分間
刺激し、ウェル上清液をデカンテーションし、プレート
を紙タオルで軽く押し固めた。細胞を溶解し、受容体を
溶解するために溶解緩衝液100μＬを各ウェルに添加し
た。溶解緩衝液は50mM−HEPES（Gibco社）、0.5％トリ
トン−X100（Gibco社）、0.01％チメロサール、30KIU/m
Lアプロチニン（ICN・Biochemicals社、Aurora、OH）、
1mM−４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フ
ッ化物塩酸塩（AEBSF、ICN・Biochemicals社）、50μＭ
−ロイペプチン（ICN・Biochemicals社）および2mM−オ
ルトバナジン酸ナトリウム（Na3VO4、Sigma・Chemical
社、St.Louis、MO）を含有する150mM−NaCl、pH7.5から
構成されていた。次にプレート振盪機（Bellco・instru
ments社、Vineland、NJ）で室温で60分間穏やかに振盪
した。
細胞が溶解したらば、5B6モノクローナル抗−gD抗体
（50mM−炭酸緩衝液中0.5μg/mL、pH9.6、100μL/ウェ
ル）で一夜４℃で被覆したELISAマイクロタイタープレ
ート（Nunc・Maxisorp、Inter・Med社、デンマーク）を
デカンテーションし、紙タオルで押し固め、ブロック緩
衝液［0.5％BSA（Intergen社、Purchase、NY）および0.
01％チメロサール含有PBS］150μL/ウェルで穏やかに振
盪しながら室温で60分間ブロックした。60分後、抗gD・
5B6被覆プレートを自動プレート洗浄器（ScanWasher30
0、Skatron・Instruments社、Sterling、VA）を使用し
て洗浄緩衝液（0.05％トゥイーン20と0.01％チメロサー
ルとを含有するPBS）で６回洗浄した。
細胞培養マイクロタイターウェルからの溶解Rse.gD含
有細胞溶解物（85μL/ウェル）を抗gD・5B6で被覆し、
ブロックしたELISAウェルに移動し、穏やかに振盪しな
がら室温で２時間インキュベーションした。非結合Rse.
gDを洗浄緩衝液で洗浄して除去し、希釈緩衝液（0.5％B
SA、0.05％トゥイーン20、5mM−EDTA、および0.01％チ
メロサール含有PBS）で1:2000、すなわち400pg/mL、に
希釈したビオチン化4G10（抗ホスホチロジン）100μＬ
を各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベーショ
ンした後に、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で1:10000
に希釈したHRPO結合ストレプトアビジン（Zymed・Labor
atories社、S.San・Francisco、CA）100μＬを各ウェル
に添加した。プレートを穏やかに振盪しつつ室温で30分
間インキュベーションした。遊離のアビジン結合体を洗
い去り、新しく調製した基質溶液（テトラメチルベンジ
ジン［TMB］、２成分基質キット、Kirkegaad・and・Per
ry社、Gaithersburg、MD）100μＬを各ウェルに添加し
た。反応が10分間進行した後、1.0M−H3PO4を100μL/ウ
ェル添加して発色を止めた。Macintosh・Centris650（A
pple・Computers社、Cupertino、CA）およびDeltaSoft
ソフトウエア（BioMetallics社、Princeton、NJ）の制
御下にvmaxプレート読取器（Molecular・Devices社、Pa
lo・Alto、CA）を使用して、参照波長を650nmとする450
nmの吸光度を読取った（ABS450/650）。
図10に示す標準曲線は、Rse.gD形質転換CHO細胞を1:1
00、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200または０希
釈の抗Rse作動剤抗体（19B）で刺激し、1/抗Rse作動剤
抗体（19B）希釈率対平均ABS450/650±標準偏差として
表示し、DeltaSoftプログラムを使用して作成した。
この実施例で示された結果はKIRA・ELISAがカルボキ
シ末端フラグポリペプチドを持つ受容体構築物、たとえ
ばRse.gD、のリガンド活性化、を検定するために有用な
方法であることを証明する。チロジン燐酸化としての受
容体活性化水準は容易に定量され、所与のリガンド（た
とえば、受容体に対する作動剤抗体）に対するEC50は簡
易に測定できる。
実施例３ trkA、ＢおよびＣ受容体のKIRA・ELISA ノイロトロフィンは神経系の発達と維持に決定的役割
を果たす小さな塩基性の蛋白質の一族に属する。最初に
確認され、多分最もよく理解されているこの族の構成員
は神経生長因子（NGF）である。1992年12月８日発行の
米国特許5169762号参照。最近、NGFに逐次的な関連があ
って、NGFに類似の機能を持つが、別種のポリペプチド
が確認されている。例えば、今ではノイロトロフィン−
２（NT2）と呼ばれる脳由来神経栄養因子（BNGF）をLei
brockなど（Nature、341巻:149〜152頁［1989年］）が
クローニングし、配列決定した。研究者数グループが最
初には神経因子（NF）と呼ばれ、今ではノイロトロフィ
ン−３と呼ばれる神経栄養因子を確認している（Ernfor
sなど、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻:5454〜5458頁
［1990年］;Hhnなど、Nature、344巻:339頁［1990
年］;Maisonpierreなど、Science、247巻:1446頁［1990
年］;Rosenthalなど、Neuron、４巻:767頁［1990年］;J
onesとReichardt、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻:8060
〜8064頁［1990年］;Kaishoなど、FEBS・Lett.、266巻:
187頁［1990年］）。最近、ノイロトロフィン−４およ
び−５（NT4およびNT5）がこの族に追加された（Hallbo
okなど、Neuron、６巻:845〜858頁［1991年］;Berkmeie
rなど、Neuron、７巻:857〜866［1991年］;Ipなど、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA、89巻:3060〜3064頁［1992
年］）。
ノイロトロフィンは他のポリペプチド増殖因子と同様
に、細胞表面のrPTK（Trk受容体と呼ばれる）との相互
作用を通してそれらの標的細胞に影響を与える。trk族
の最初の一員であるtrkAは最初にトロポミオシン配列の
触媒ドメインへの転座に起因する腫瘍原性形質転換の結
果として確認された。その後の研究から、trkAはNGFに
対するシグナル伝達の受容体であることが確認された。
続いて、他の関連受容体２個、マウスおよびラットtrkB
（Kleinなど、EMBO.J.、８巻:3701〜3709頁［1989年］;
Middlemasなど、Mol.Cell.Biol.、11巻:143〜153頁［19
91年］;1991年11月６日発行の欧州特許455460号）およ
びブタ、マウスおよびラットのtrkC（Lamballeなど、Ce
ll、66巻:967〜979頁［1991年］;1993年１月13日発行の
欧州特許522530号）がtrk受容体族の構成員であること
が確認された。trk受容体の構造は極めて類似している
が、異なるスプライシングによってこの族の複雑さが増
加し、既にtrkAの型２個、trkBの型３個（２個は機能的
チロジンキナーゼドメインを持たない）、およびtrkCの
型少なくとも４個（いくつかは機能的チロジンキナーゼ
ドメインを持たないが、２個はチロジンキナーゼドメイ
ンに小さな挿入断片を持つ）が知られている。ヒトtrk
A、ＢおよびＣ受容体の配列は、ここに参考のために引
用する、1994年３月18日出願の米国特許出願08/215139
号に開示されている。
次にKIRA・ELISAはアミノ末端フラグポリペプチドを
持つtrkA,BおよびＣ受容体構築物を使用して実施した。
（ｉ）捕捉剤の調製 実施例２に記載したようなヘルペス・シンプレックス
ウイルスのグリコプロテインＤからのペプチドに対して
モノクローナル抗−gD（クローン5B6）を製造した。精
製したストック製品は燐酸緩衝液食塩水（PBS）、pH7.4
中、3.0mg/mLに調製し、1.0mL量づつを−20℃で貯蔵し
た。
（ii）抗ホスホチロジン抗体の調製 モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン4G10、は
Upstate・Biologicals社（UBI社、Lake・Placid、NY）
から購入し、長鎖ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンア
ミド（Biotin−Ｘ−NHS、Research・Organics社、Cleve
land、OH）を使用してビオチン化した。
（iii）リガンド 神経生長因子（NGF）、ノイロトロフィン−３（NT
3）、およびノイロトロフィン５（NT5）は前記報告に記
載されたこれら各蛋白質の配列データを用いて組み換え
技術により調製した。精製したNGF、NT3およびNT5はpH
7.5のPBS中のストック溶液（各180μＭ、8.8μＭ、26.9
μＭ）として４℃で貯蔵した。
（iv）gD.trk核酸の調製 gDフラグ（すなわちgD.trk構築物）を持つ種々のtrk
受容体を発現するために、種々のtrk受容体のアミノ末
端に融合するgDのシグナルとエピトープ（Paborskyな
ど、前出参照）とをコードするDNA構築物を作った。こ
れらはtrk受容体およびgD配列をpRK5またはpRK7（Suva
など、Science、237巻:893〜896頁［1987年］）に標準
的な分子生物学技術を使用して挿入することによって図
12−14に示す構築物を作製した。gD.trk構築物に加え
て、gDタグ付trk.IgG融合蛋白質（すなわち、gD.trk.Ig
G）を発現する構築物を造った。trk細胞外ドメインとIg
G−１・FcドメインとのキメラをヒトIgG−１のFc領域ク
ローン（Ashkenaziなど、Immunoadhesins・Intern.Rev.
Immunol.、10巻:219〜227頁［1993年］）を作製した。
さらに具体的には、IgG−１をコードする配列の源泉
は、重−軽鎖結合に関与するシステイン残基の後のIgG
−１ヒンジの第一残基であるアスパラギン酸216に始ま
り（アミノ酸114を重鎖定常領域の第一残基とする;Kaba
tなど、「免疫学的に重要な蛋白質の配列（Sequences・
of・Proteins・of・Immunological・Interest）」、第
４版［1987年］）、IgG−１のCH2およびCH3・Fcドメイ
ンを含み、残基441に終わるヒトIgG−１配列に融合した
成熟ヒトCD4蛋白質の残基１〜180から構成されるハイブ
リッドポリペプチドをコードするcDNA配列を含むCD4−I
gG−１発現プラスミドpRKCD42Fc1（Caponなど、Natur
e、334巻:525頁［1989年］;Byrnなど、Nature、344巻:6
67頁［1990年］）であった。CD4コードする配列を発現
プラスミドpRKCD42Fc1から除去し、このベクターをtrk
受容体をコードするDNAとIgG−１のアスパルテート216
とtrkAの402バリン、trkBのステオニン422、またはtrkC
のスレオニン413との間のスプライスで融合させた。gD
タグは各trk.IgGのアミノ末端にgD.trk構築物でと同様
な方法で付加した。
（ｖ）細胞の形質転換 ヒト胎児腎臓293細胞（ATCC、Rockville、MDから入
手）をgD.trk.IgGをコードする核酸で燐酸カルシウム実
験計画（Gorman、「DNAクローニング：実際的方法（DNA
・Cloning:A・Practical・Approach）」［Glover,D.
編］、II巻、143〜190頁、IRL・Press社、Washington、
DC）を使用して一過性に形質転換した。12時間後、形質
転換した細胞を血清不含F12/DMEM50:50培地（Gibco社）
で３回洗浄し、次に血清不含培地を添加して48時間採取
した。
各gD.trk構築物を安定に発現する細胞系は、gDをタグ
したtrk受容体をコードするするpRKプラスミドおよびDH
FRをコードするプラスミドを再度燐酸カルシウム媒介形
質転換法を使用してdp12.CHO細胞に共形質転換すること
によって作製した。
前記培地（gD.trk.IgG含有）はさらに精製することな
しにgD.trk.IgGポリペプチドへのノイロトロフィン結合
に及ぼすgDフラグポリペプチドの存在の効果を評価する
ための結合検定に用いた。非タグtrk.IgGポリペプチド
を対照として並行して実験した。細胞上清液を含むtrk.
IgGおよびgDタグ付trk.IgGは前記の通りに調製し、適当
なヨード化ノイロトロフィンとの競合的置換検定に使用
した。NGFをtrkAのリガンドとして使用し、NT5をtrkBの
リガンドとして使用し、NT3をtrkCのリガンドとして使
用した。得られた結果を次表に要約する。
表１ trk.IgGへのノイロトロフィンの結合 gD不在下IC50 gD存在下IC50 trkA 68.4±11.9pM 68.8± 3.0pM trkB 31.1±15.6pM 12.1±18 pM trkC 31.1± 1.1pM 30.2± 0.7pM （vi）KIRA・ELISAで使用するための形質転換細胞の選
択 前記実験からノイロトロフィンとそれらの受容体との
間の相互作用の親和性にはアミノ末端にあるgDフラグポ
リペプチドの存在に起因する変化が観察できなかったこ
とは明らかである。この結果に基づいて、KIRA・ELISA
で使用するために前記の章に記載した技術を使用してg
D.trk構築物で細胞を形質転換した。
２日後、gD.trk構築物で形質転換したdp12.CHO細胞
（1989年３月15日発行、欧州特許307247号）をGHT不含
培地内での生長によって選択し、２週間後、それらの表
面にgDフラグポリペプチドを発現する細胞を選択するた
めに、生長した細胞を5B6モノクローナルを使用するFAC
S分析で分類した。限界希釈法で接種することによってg
D陽性細胞をクローニングし、得られたコロニーを次にF
ACS分析（抗gD5B6モノクローナル抗体を使用する）、ノ
イロトロフィン結合（前記の通り）、抗ホスホチロジン
抗体を使用するウエスタンブロッティングで示されるチ
ロジン燐酸化、抗gD.5B6抗体を使用するウエスタンブロ
ッティングによるgD発現、および5B6抗体を使用する免
疫細胞化学で再スクリーニングした。陽性を示したクロ
ーンを次に限界希釈法により再クローニングし、後記の
KIRA・ELISAに付した。
（vii）培地 F12/DMEM・50:50（Gibco/BRL・Life・Technologies
社、Grand・Island、NY）中に細胞を生育させた。培地
には10％透析濾過FBS（HyClone社、Logan、Utah）、25m
M−HEPESおよび2mM−Ｌ−グルタミンを添加した。
（viii）KIRA・ELISA gD.trkで形質転換したdp12.CHO細胞（1989年３月15日
発行、欧州特許307247号）を平底96穴培養プレートの各
ウェル中の培地100μＬに接種（ウェル当り５×104）
し、一夜37℃で５％CO2中で培養した。翌朝、ウェルの
上清液をデカンテーションし、紙タオルでプレートを軽
く押し固めた。実験標本または組み換え精製NGF、NT3、
またはNT5標準（3000、1000、333、111、37、12、４、
および0pM）を含む培地100μＬを各ウェルに添加した。
細胞を37℃で30分間刺激し、ウェル上清液をデカンテー
ションし、プレートを再度軽く押し固めた。細胞を溶解
し、受容体を溶解するため、細胞溶解緩衝液100μＬを
各ウェルに添加した。この細胞溶解緩衝液は50mM−HEPE
S（Gibco社）、0.5％トリトン−Ｘ−100（Gibco社）、
0.01％チメロサール、30KIUアプロチニン（ICN・Bioche
micals社、Aurora、OH）/mL、1mM−４−（２−アミノエ
チル）ベンゼンスルホン酸フッ化物塩酸塩（AEBSF、ICN
・Biochemicals社）、50μＭ−ロイペプチン（ICN・Bio
chemicals社）、および2mM−オルトバナジン酸ナトリウ
ム（Na3VO4,Sigma・Chemical社、St.Louis、MO）を含む
150mM−NaCl、pH7.5から構成した。次にプレートをプレ
ート振盪機（Bellco・Instruments社、Vineland、NJ）
上、室温で60分間穏やかに振盪した。
細胞が溶解したら、5B6モノクローナル抗gD抗体（50m
M−炭酸緩衝液中0.5μg/mL、pH9.6、100μL/ウェル）で
一夜４℃で被覆したELISAマイクロタイタープレート（N
unc・Maxisorp、Inter・Med社、デンマーク）をデカン
テーションし、紙タオルで押し固め、ブロック緩衝液
［0.5％BSA（Intergen社、Purchase、NY）および0.01％
チメロサール含有PBS］150μL/ウェルで穏やかに振盪し
ながら室温で60分間ブロックした。60分後、抗gD・5B6
被覆プレートを自動プレート洗浄器（ScanWasher300、S
katron・Instruments社、Sterling、VA）を用いて洗浄
緩衝液（0.05％トゥイーン20および0.01％チメロサール
含有PBS）で６回洗浄した。細胞培養マイクロタイター
ウェルからの溶解gD.trk含有細胞溶解物（85μL/ウェ
ル）を抗gD5B6で被覆し、ブロックしたELISAウェルに移
し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベーシ
ョンした。非結合gD.trkを洗浄緩衝液で洗浄して除去
し、希釈緩衝液（0.5％BSA、0.05％トゥイーン20、5mM
−EDTA、および0.01％チメロサール含有PBS）で1:200
0、すなわち400pg/mL、に希釈したビオチン化4G10（抗
ホスホチロジン）100μＬを各ウェルに添加した。室温
で２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄
し、希釈緩衝液で1:10000に希釈したHRPO結合ストレプ
トアビジン（Zymed・Laboratories社、S.San・Francisc
o、CA）100μＬを各ウェルに添加した。プレートを穏や
かに振盪しながら室温で30分間インキュベーションし
た。遊離のアビジン結合体を洗い去り、新しく調製した
基質溶液（テトラメチルベンジジン、２成分基質キッ
ト、Kirkegaad・and・Perry社、Gaithersburg、MD）100
μＬを各ウェルに加えた。反応を10分間進行させ、1.0M
−H3PO4を100μL/ウェル添加して発色を止めた。Macint
osh・Centris650（Apple・Computers社、Cupertino、C
A）およびDeltaSoftソフトウエア（BioMetallics社、Pr
inceton、NJ）の制御下にvmaxプレート読取器（Molecul
ar・Devices社、Palo・Alto、CA）を使用して、参照波
長を650nmとする450nmの吸光度（ABS450/650）を読み取
った。
図15A〜15Cに示す標準曲線はgD.trk形質転換CHO細胞
を3000、1000、333、111、37、12、４または0pMのNGF、
NT3またはNT5で刺激し、pM−ノイロトロフィン対平均AB
S450/650±標準偏差として表示し、DeltaSoftプログラ
ムを用いて作成した。標本濃度は吸光度をその標準曲線
に内挿して得られ、pM−ノイロトロフィン活性として表
示した。
この実施例が提示する結果はKIRA・ELISAがアミノ末
端フラグポリペプチド、たとえばgD.trk受容体構築物な
ど、を持つ受容体構築物のリガンド活性化を検定するた
めに有用な方法であることを証明する。チロジン燐酸化
として受容体活性化水準は容易に定量化され、所与リガ
ンドのEC50は容易に測定される。
実施例４ MPL/Rseキメラ受容体のKIRA・ELISA ヒトMPL受容体はVigonなど、PNAS,USA、89巻:5640〜5
644頁（1992年）に開示されている。MPL受容体のECDと
カルボキシル末端フラグポリペプチド（すなわち、Rse.
gD、実施例２参照）を持つRseのTMおよびICD（Markな
ど、前出）とを含むキメラ受容体の一つを本発明に記載
するKIRA・ELISAに付した。この実験操作を以下に略記
する。図16および図17も参照。
（ｉ）捕捉剤の製造 ヘルペスシンプレックスウイルスのグリコプロテイン
Ｄ（Paborskyなど、Protein・Engineering、３（６）
巻:547〜553頁［1990年］）からのペプチドに対してモ
ノクローナル抗gD（クローン5B6）を作製した。精製ス
トック製品は燐酸緩衝食塩水（PBS）、pH7.4で3.0mg/mL
に調整し、1.0mL量を−20℃で貯蔵した。
（ii）抗ホスホチロジン抗体の調製 モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン4G10、は
UBI社（Lake・Placid、NY）から購入し、長鎖ビオチン
−Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド（Biotin−Ｘ−NHS、R
esearch・Organics社、Cleveland、OH）を使用してビオ
チン化した。
（iii）リガンド MPLリガンド［de・Sauvageなど、Nature、369巻:533
〜538頁（1994年）］を組み換え技術で調製した。この
精製MPLリガンドはストック溶液として４℃で貯蔵し
た。
（iv）MPL/Rse.gD核酸の調製 前記実施例２に記載した通りに製造した発現プラスミ
ドpSV.ID.Rse.gDをRse.gDの膜貫通ドメインおよび細胞
内ドメイン（アミノ酸429〜911）に融合したヒトMPLのE
CDコード配列（アミノ酸１〜491）を含むプラスミドpS
V.ID.M.tmRd6を製造するように修飾した。合成オリゴヌ
クレオチドを使用してヒトMPLの細胞内ドメイン部分の
コード配列をRseコード配列部分にMarkなどがJ.Biol.Ch
em.、267巻:26166〜26171頁（1992年）に記載したよう
な２段階PCRクローニング反応で結合した。第一PCR反応
で使用したプライマーはMPLのcDNA鋳型についてM1（5'
−TCTCGCTACCGTTTACAG−配列番号12）およびM2（5'−CA
GGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT−配列番号13）であり、Rseの
cDNA鋳型についてR1（5'−GGGCCATGACACTGTCAA−配列番
号14）およびR2（5'−GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACC
TGTGGTCCTT−配列番号15）であった。この融合結合部の
Pvu II−Sma I部分を使用して全長キメラ受容体を構築
した。
（ｖ）細胞の形質転換 dp12.CHO細胞（1989年３月15日発行、欧州特許307247
号）にプラスミド骨格中の独特なNot I部位でリネアラ
イズしておいたpSV.ID.M.tmRd6を電気穿孔した。フェノ
ール／クロロホルムで抽出後に、DNAをエタノール沈降
し、1/10トリスEDTA20μＬ中に再懸濁した。次にDNA10
μｇをPBS1mL中のCHO.dp12細胞107個とともに氷上で10
分間インキュベーションした後に、400ボルトおよび330
μｆで電気穿孔した。細胞を氷に戻し、10分後に非選択
培地に接種した。24時間後に、細胞にヌクレオシド不含
培地を補給し、安定なDHFR＋クローンを選択した。
（vi）KIRA・ELISAで使用する形質転換細胞の選択 MPL/Rse.gDを発現するクローンをgDエピトープのタグ
を検出する抗体5B6を使用するSDS−PAGEによる分画後に
全細胞溶解物のウエスタンブロットにより認定した。
（vii）培地 F12/DMEM・50:50（Gibco/BRL・Life・Technologies
社、Grand・Island、NY）中に細胞を生育させた。培地
には10％透析透過FBS（HyClone社、Logan、Utah）、25m
M−HEPESおよび2mM−Ｌ−グルタミンを添加した。
（viii）KIRA・ELISA MPL/Rse.gD.形質転換CHO細胞（ウェル当り３×10
4個）を平底96穴培養プレートのウェル中の培地100μＬ
に添加し、一夜37℃で５％CO2中で培養した。翌朝、ウ
ェルの上清液をデカンテーションし、紙タオルでプレー
トを軽く押し固めた。次に実験標本か、MPLリガンド20
0、50、12.5、3.12、0.78、0.19、0.048または0ng/mLか
のいずれかを含む培地50μＬを各ウェルに添加した。細
胞を37℃で30分間刺激し、ウェル上清液をデカンテーシ
ョンし、プレートを再度軽く押し固めた。細胞を溶解
し、キメラ受容体を溶解するために、細胞溶解緩衝液10
0μＬを各ウェルに添加した。この細胞溶解緩衝液は50m
M−HEPES（Gibco社）、0.5％トリトン−Ｘ−100（Gibco
社）、0.01％チメロサール、30KIUアプロチニン（ICN・
Biochemicals社、Aurora、OH）/mL、1mM−４−（２−ア
ミノエチル）ベンゼンスルホン酸フッ化物塩酸塩（AEBS
F、ICN・Biochemicals社）、50μＭ−ロイペプチン（IC
N・Biochemicals社）、および2mM−オルトバナジン酸ナ
トリウム（Na3VO4,Sigma・Chemical社、St.Louis、MO）
を含む150mM−NaCl、pH7.5、から構成した。次にプレー
トをプレート振盪機（Bellco・Instruments社、Vinelan
d、NJ）上、室温で６分間穏やかに振盪した。
細胞が溶解したら、5B6モノクローナル抗gD抗体（50m
M−炭酸緩衝液中5.0μg/mL、pH9.6、100μL/ウェル）で
一夜４℃で被覆したELISAマイクロタイタープレート（N
unc・Maxisorp、Inter・Med社、デンマーク）をデカン
テーションし、紙タオルで押し固め、ブロック緩衝液
［0.5％BSA（Intergen社、Purchase、NY）および0.01％
チメロサール含有PBS］150μL/ウェルで穏やかに振盪し
ながら室温で60分間ブロックした。60分後、抗gD5B6被
覆プレートを自動プレート洗浄器（ScanWasher300、Ska
tron・Instruments社、Sterling、VA）を使用して洗浄
緩衝液（0.05％トゥイーン20および0.01％チメロサール
含有PBS）で６回洗浄した。細胞培養マイクロタイター
ウェルからの溶解したMPL/Rse.gD含有細胞溶解物（85μ
L/ウェル）を抗gD5B6で被覆し、ブロックしたELISAウェ
ルに移し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュ
ベーションした。非結合MPL/Rse.gD受容体を洗浄緩衝液
で洗浄して除去し、希釈緩衝液（0.5％BSA、0.05％トゥ
イーン20、5mM−EDTA、および0.01％チメロサール含有P
BS）で1:18000、すなわち56ng/mL、に希釈したビオチン
化4G10（抗ホスホチロジン）100μＬを各ウェルに添加
した。室温で２時間インキュベーションした後、プレー
トを洗浄し、希釈緩衝液で1:60000に希釈したHRPO結合
ストレプトアビジン（Zymed・Laboratories社、S.San・
Francisco、CA）100μＬを各ウェルに添加した。プレー
トを穏やかに振盪しながら室温で30分間インキュベーシ
ョンした。遊離のアビジン結合体を洗い去り、新たに調
製した基質溶液（テトラメチルベンジジン［TMB］、２
成分基質キット、Kirkegaad・and・Perry社、Gaithersb
urg、MD）100μＬを各ウェルに添加した。反応を10分間
進行させ、1.0M−H3PO4100μL/ウェルを添加して発色を
止めた。Macintosh・Centris650（Apple・Computers
社、Cupertino、CA）およびDeltaSoftソフトウエア（Bi
oMetallics社、Princeton、NJ）の制御下にvmaxプレー
ト読取器（Molecular・Devices社、Palo・Alto、CA）を
使用して、参照波長を650nmとする450nmの吸光度（ABS
450/650）を読み取った。
この結果はMPLリガンドが、濃度依存的におよびリガ
ンド特異的にMPL/Rse.gDキメラ受容体を活性化すること
ができることを証明した。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｓ 33/573 33/573 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０８／２８６，３０５ (32)優先日 平成６年８月５日(1994．8．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 サディック，マイケル・ダニエル アメリカ合衆国カリフォルニア94530、 エル・セリット、アルベマール・ストリ ート610番 (72)発明者 ウォン，ウェイ・リー・タン アメリカ合衆国カリフォルニア94022、 ロス・アルトス・ヒルズ、アリック・レ ーン 26333番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 C07K 14/705 G01N 33/48 G01N 33/573 C12N 15/09

Claims (34)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の工程を含んでなるチロシンキナーゼ
    受容体の自己リン酸化測定方法： （ａ）第１固相を、フラグポリペプチドおよびチロシン
    キナーゼ受容体を含んでなる受容体構築物を細胞膜に有
    する真核細胞の均一な集団で被覆して、細胞を第１固相
    に付着させ； （ｂ）付着している細胞を分析物に接触させ； （ｃ）付着している細胞を溶解し、それによって細胞溶
    解物を放出させ、 （ｄ）フラグポリペプチドに特異的に結合する捕獲剤で
    第２固相を被覆して、捕獲剤を第２固相に付着させ； （ｅ）工程（ｃ）で得られた細胞溶解物に、付着してい
    る捕獲剤を接触させて、受容体構築物を第２固相に付着
    させ； （ｆ）非結合細胞溶解物を除去するため第２固相を洗浄
    し； （ｇ）付着している受容体構築物を、チロシンキナーゼ
    受容体中のリン酸化したチロシン残基を同定する抗ホス
    ホチロシン抗体に接触させ；そして （ｈ）付着している受容体構築物への抗ホスホチロシン
    抗体の結合を測定する。
  2. 【請求項２】工程（ａ）の前に細胞を受容体構築物をコ
    ードする核酸で形質転換する請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】細胞が哺乳動物細胞系を含んでなる請求項
    １に記載の方法。
  4. 【請求項４】細胞が付着性である請求項１に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】捕獲剤が捕獲抗体を含んでなる請求項１に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】第１固相が第１アッセイプレートのウエル
    を含んでなる請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】第１アッセイプレートがマイクロタイター
    プレートである請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】約１×104〜３×105の細胞を工程（ａ）で
    ウエルに加える請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】第２固相が第２アッセイプレートのウエル
    を含んでなる請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】工程（ｅ）の前に細胞溶解物を濃縮また
    は清澄化しない請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】工程（ｃ）が第１アッセイプレートのウ
    エルに溶解緩衝液を加え、第１アッセイプレートを緩や
    かに撹拌することを含んでなる請求項６に記載の方法。
  12. 【請求項１２】溶解緩衝液が溶解用界面活性剤を含んで
    なる請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】抗ホスホチロシン抗体が標識されている
    請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】標識が発色試薬にさらされる酵素を含ん
    でなり、発色試薬の色変化を工程（ｈ）で測定する請求
    項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】フラグポリペプチドがチロシンキナーゼ
    受容体のアミノ末端に融合している請求項１に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】チロシンキナーゼ受容体がtrkA受容体、
    trkB受容体、またはtrkC受容体である請求項15に記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】フラグポリペプチドが、チロシンキナー
    ゼ受容体のカルボキシ末端に融合している請求項１に記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】チロシンキナーゼ受容体がRse受容体で
    ある請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】受容体構築物が問題の受容体の細胞外ド
    メインとRse受容体の細胞内ドメインを含んでなる請求
    項17に記載の方法。
  20. 【請求項２０】問題の受容体がMPL受容体である請求項1
    9に記載の方法。
  21. 【請求項２１】受容体構築物がRse受容体の膜貫通ドメ
    インを更に含んでなり、フラグポリペプチドがgDポリペ
    プチドを含んでなる請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】分析物がチロシンキナーゼ受容体に対す
    るアゴニストを含んでなる請求項１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】分析物がチロシンキナーゼ受容体に対す
    るアンタゴニストを含んでなる請求項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】アゴニストによるチロシンキナーゼ受容
    体への結合または活性化をアンタゴニストが競合的に阻
    害し、工程（ｂ）の後に付着細胞をアゴニストに接触さ
    せる工程が続く、請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】分析物が、受容体に対するアンタゴニス
    トおよびアゴニストを含んでなる組成物であり、検定法
    がアゴニストに結合するアンタゴニストの能力を測定
    し、それによってアゴニストによるチロシンキナーゼ受
    容体の活性化を減少させる請求項１に記載の方法。
  26. 【請求項２６】工程（ｄ）の後にブロック緩衝液を第２
    固相に加える請求項１に記載の方法。
  27. 【請求項２７】以下の工程を含んでなるチロシンキナー
    ゼ受容体の自己リン酸化を測定する方法： （ａ）第１アッセイプレートのウエルを、細胞膜に位置
    するチロシンキナーゼ受容体を有する付着性細胞の均一
    な集団で被覆して、細胞をウエルに付着させ； （ｂ）付着している細胞を分析物に接触させ； （ｃ）付着している細胞を溶解して、それによって細胞
    から細胞溶解物を放出し； （ｄ）チロシンキナーゼ受容体に特異的に結合する捕獲
    剤で第２アッセイプレートのウエルを被覆して、捕獲剤
    をウエルに付着させ； （ｅ）付着している捕獲剤に、工程（ｃ）で得られた細
    胞溶解物を接触させて、チロシンキナーゼ受容体をウエ
    ルに付着させ； （ｆ）非結合の細胞溶解物を除去するためウエルを洗浄
    し； （ｇ）付着しているチロシンキナーゼ受容体を、チロシ
    ンキナーゼ受容体中のリン酸化チロシン残基に選択的に
    結合する抗ホスホチロシン抗体に接触させ； （ｈ）付着しているチロシンキナーゼ受容体への抗ホス
    ホチロシン抗体の結合を測定する。
  28. 【請求項２８】チロシンキナーゼ受容体がHER2受容体を
    含んでなる請求項27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】以下の工程を含んでなるキナーゼのリン
    酸化を測定する検定法： （ａ）フラグポリペプチドおよびキナーゼを含んでなる
    キナーゼ構築物を含んでなる真核細胞の均一な集団で第
    １固相を被覆して、細胞を第１固相に付着させ； （ｂ）分析物に、付着している細胞を接触させ； （ｃ）付着している細胞を溶解し、それによって細胞か
    ら細胞溶解物を放出させ； （ｄ）フラグポリペプチドに特異的に結合する捕獲剤で
    第２固相を被覆して、捕獲剤を第２固相に付着させ； （ｅ）工程（ｃ）で得られた細胞溶解物に、付着してい
    る捕獲剤を接触させて、キナーゼ構築物を第２固相に付
    着させ； （ｆ）非結合細胞溶解物を除去するため第２固相を洗浄
    し； （ｇ）キナーゼ構築物中のリン酸化された残基を同定す
    る抗体に、付着しているキナーゼ構築物を接触させ；そ
    して （ｈ）付着しているキナーゼ構築物への抗体の結合を測
    定する。
  30. 【請求項３０】キナーゼが受容体である請求項29に記載
    の検定法。
  31. 【請求項３１】キナーゼがセリン−スレオニンキナーゼ
    である請求項29に記載の検定法。
  32. 【請求項３２】ホスファターゼ活性を測定する請求項29
    に記載の検定法。
  33. 【請求項３３】細胞がさらにホスファターゼを含み、方
    法が工程（ｃ）の前に真核細胞をホスファターゼ阻害剤
    に接触させる工程をさらに含んでなる請求項32に記載の
    検定法。
  34. 【請求項３４】付着しているキナーゼ構築物をホスファ
    ターゼに接触させ、非結合ホスファターゼを除去するた
    め第２固相を次に洗浄する、工程（ｆ）と（ｇ）との間
    の工程をさらに含んでなる請求項32に記載の検定法。
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