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Diese
Erfindung betrifft die Herstellung von isoformen spezifischen Antikörpern. Wie
nachstehend erklärt
wird, können
bestimmte Antikörper,
die gemäß dieser
Erfindung hergestellt wurden, verwendet werden, um verschieden aktivierte
Proteine, die Tyrosinkinasen und Protoonkogenprodukte einschließen, zu
unterscheiden.
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Behandlungsentscheidungen
für einzelne
Brustkrebspatienten beruhen häufig
auf der Anzahl der Achsellymphknoten, die von der Krankheit betroffen
sind, Östrogenrezeptor-
und Progesteronrezeptorstatus, Größe des Primärtumors und Stadium der Krankheit
bei Diagnose (Tandon et al., J. Clin. Oncol. 7:1120–1128 (1989)).
Jedoch ist es auch mit dieser Vielzahl von Faktoren nicht möglich, den
Verlauf der Krankheit für
alle Brustkrebspatienten genau vorauszusagen. Es gibt offenbar eine
Notwendigkeit, neue Marker zu identifizieren, um Patienten mit guter
Prognose, die keine weitere Therapie benötigen, von denen zu trennen,
bei denen es wahrscheinlicher ist, dass deren Krebs wiederkehrt,
und die von intensiveren adjuvanten Behandlungen profitieren könnten.
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Einige
der vielversprechenderen Kandidaten für neue prognostische Faktoren
schließen
Protoonkogene ein, welche amplifiziert, überexprimiert, mutiert oder
in malignen Zellen anders aktiviert werden können. Alterationen von Protoonkogenen
sind in vielen Formen von menschlichen Tumoren festgestellt worden
(Bishop, Science 235:305–311
(1987); Klein et al., Nature 315:190–195 (1985); Varmus, Ann. Rev.
Genet., 18:553–612
(1984)). Für
eines dieser möglicherweise
transformierenden Gene, das c-erbB-2- (HER-2, neu) Gen, wurde gezeigt,
dass Amplifikation ein starker prognostischer Faktor in menschlichen
Primärbrustkrebsen ist;
Patienten mit amplifiziertem c-erbB-2 hatten kürzeres Krankheitfreies und
Gesamtüberleben
als Patienten ohne Amplifikation (Slamon et al., Science 235:177-182
(1987); Varley et al., Oncogen 1:423–439 (1987)).
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Expression
des c-erbB-2-Oncogenproteins selbst ist auch auf sein prognostisches
Potential sowohl beim Lymphknoten-positiven als auch Lymphknoten-negativen
Brustkrebs untersucht worden. Bei den Lymphknoten-positiven Patienten,
bei denen bereits bekannt ist, dass sie ein hohes Rezidivrisiko
haben, ist Überexprimierung
von c-erbB-2 auf der Protein-Ebene durchweg mit kürzerem Krankheit-freiem
und Gesamtüberleben
verbunden worden. Bei Lymphknoten-negativen Patienten jedoch hat,
wo eine verbesserte prognostische Vorhersage weit größere therapeutische
Implikationen aufweist, die Expression des c-erbB-2-Rezeptors in zahlreichen
Studien (Slamon et al., Science 235:177–182, (1987); Borg et al.,
Cancer Res. 50:4332–4337 (1990);
Paterson et al., Cancer Res. 51:556–567 (1991)) versagt, den Krankheitsausgang
vorauszusagen. Folglich könnte
ein genaueres Verfahren zur Charakterisierung der bioiogischen Bedeutung
der Rezeptor-Überexprimierung
in der Lymphknoten-negativen Krankheit klinische Voteile bereitstellen.
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Vor
kurzem ist gezeigt worden, dass der Wildtyp-c-erbB-2-Rezeptor in
zwei ineinander umwandelbare Formen, p175 und p185, vorkommt (Epstein
et al., J. Biol. Chem. 265:10746–10751 (1990)). Die p175/c-erbB-2-Rezeptorisoform
zeigt erhöhte
in-vitro-Tyrosinkinaseaktivität, rezeptorspezifischen
Phosphotyrosin-Gehalt und elektrophoretische Mobilität im Vergleich
zu der p185-Isoform. Unter Verwendung herkömmlicher Ein-Schritt-c-erbB-2-Immundetektionsassays
jedoch können
Tyrosin-phosphorylierfes p175 und Serin/Threonin-phosphoryliertes
p185 technisch nicht unterscheidbar sein.
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Es
ist wahrscheinlich, dass nur die aktivierte Form einer Tyrosinkinase
Zellwachstum und Differenzierung beeinflusst. Klinische Unstimmigkeiten
bezüglich
der Rolle von c-erbB-2 bei Brustkrebs könnten die Heterogenität der Rezeptoraktivierung
in vivo widerspiegeln. Ein einfaches Verfahren auf Antikörper-Basis,
welches die Kinase-aktive Form von c-erbB-2 (Entstehen zum Beispiel
wegen autokriner oder parakriner Loops oder Rezeptormutationen)
von der inerten Kinase-inaktiven Konfiguration unterscheiden würde, könnte wertvolle
biologische und klinische Information bereitstellen.
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Außerdem ist
die pharmazeutische Industrie an der Bewertung pharmazeutisch nützlicher
Verbindungen interessiert, welche als Wachstumsfaktoragonisten oder
-antagonisten dienen. Zehntausende Verbindungen pro Jahr müssen in
einem Anfangsdosis- oder „Hochfluss"-Screeningprotokoll
getestet werden. Aus den Tausenden der genau nachgeprüften Verbindungen
heraus zeigen ein oder zwei etwas Aktivität im Anfangsdosis-Assay. Diese Verbindungen
werden dann für
weitere Entwicklung und Testung ausgewählt. Idealerweise würde ein
Screeningprotokoll automatisiert werden, um viele Proben auf einmal
zu handhaben, und würde
keine Radioisotope oder andere Chemikalien verwenden, die Sicherheits-
oder Beseitigungsprobleme aufwerfen. Ein Versuch auf Antikörperbasis
zum Bewerten der Wachstumsfaktoraktivität des Arzneistoffs würde diese Vorteile
bereitstellen und den zugefügten
Vorteil der hohen Selektivität
anbieten.
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Aktivierungsspezifische
Rezeptorantikörper
sind von anderen Forschern isoliert worden, die eine Vielzahl von
experimentellen Studien durchführen.
Jedoch scheinen diese Isolierungen wenigstens teilweise zufällig aufgefunden
worden zu sein, und die verwendeten Verfahren stellen keine systematische
Annäherung an
diese Aufgabe bereit. Keating et al. (J. Biol. Chem. 263:12805–12808 (1988))
zog polyklonale Antikörper gegen
einem nichtphosphorylierten Peptid, das den Resten 934–951 der
C-terminalen Region des PDGF-Rezeptors
entspricht, und zeigte anschließend,
dass dieses Antiserum den nativen (immunopräzipitierten), aber nicht den
denaturierten (immunogeblotteten), aktivierten PDGF-Rezeptor erkannte.
Keating stellte fest, dass die Ligand-induzierbare Tyrosinkinaseaktivierung
mit einer Konformationsänderung
im Rezeptor verbunden ist, welches irgendwie Antikörperbindung
ermöglicht. Ähnlich zog
Downing et al.. (Mol. Cell. Biol. 11:2489–2495 (1991)) polyklonale Antikörper gegen
einer nichtphosphorylierten Juxtamembrandomänensequenz (552–574) des
CSF-1-Rezeptors. Dieses Antiserum zeigte auch Spezifität für die immunopräzipitierte (aber
nicht denaturierte) aktivierte Rezeptorisoform, die theoretisch
mit der Konformationsänderung übereinstimmt,
die durch die Phosphatidylinositol-3-kinase-Bindung an diese Region
vermittelt wurde. Campos-González und
Glenney (Growth Factors 4:305–316
(1991)) isolierten einen monoklonalen Antikörper, der gegen intakten Rezeptor
gezogen wurde, der sowohl die native als auch die denaturierte Form
des EGF-Rezeptors erkannte. Jedoch erkannte das Antiserum auch EGF
Rezeptoren, denen die drei Tyrosinhauptautophosphorylierungsstellen
fehlten, während
sie versagten, Peptide 32P-markierte tryptische
Peptide zu erkennen; folglich wurde vorgeschlagen, dass der Antikörper eine
phosphorylierungsabhängige
Konformationsänderung
erkennt, welche im Anschluss an SDS-Denaturierung für das Immunoblotting
teilweise renaturiert. Ein ähnlicher Versuch
unter Verwendung von intakten Proteinen als Immunogene für die monoklonale
Antikörperproduktion wurde
von Hu et al. unternommen (Mol. Cell. Biol. 11:5792–5799 (1991)).
Diese Arbeiter entwickelten einen breiten Bereich von monoklonalen
Antikörpern
gegen das Retinoblastom- (Rb-) Genprodukt, von welchen einige unter-
und nichtphosphorylierte Isoformen dieses Proteins unterschieden.
Gullick et al. (EMBO J. 4:2869–2877
(1985)) stellte Antiseren gegen Autophosphorylierungsstellen des
EGF-Rezeptors unter Verwendung nichtphosphorylierter Peptide her,
aber die so erhaltenen Antikörper
unterschieden nicht die aktivierten und inaktivierten Rezeptorisoformen.
Antikörper,
die gegen Phosphotyrosin gerichtet sind, sind auch in Versuchen
verwendet worden, um aktivierte und inaktivierte Rezeptoruntertypen
zu unterscheiden (Wang, Mol. Cell. Biol. 5:3640–3643 (1985); Wildenhain et
al., Oncogene 5:879–883
(1990)), aber derartige Antikörper
sind nichtrezeptorspezifisch. Die so erhaltenen Daten sind deshalb
schwierig zu interpretieren: Tyrosin-phosphorylierte Banden mit
elektrophoretischer Mobilität
zwischen 160 und 190 Kilodalton könnten zum Beispiel die Aktivierung
des c-erbB-2-Rezeptors darstellen, könnten aber auch die Aktivierung
der Rezeptoren für
den epidermalen Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
oder aus Blutplättchen
stammenden Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor) anzeigen
(vergleiche zum Beispiel die elektrophoretische Mobilität von c-erbB-2-
und PDGF-Rezeptoren
in den 4 und 6,
Epstein et al., Cell Growth and Differentiation, 3:157-164 (1992)).
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Lee
et al. (Science 251:675, 1991) beschreibt eine Arbeit, die mit einem
mit der Alzheimer-Krankheit im
Zusammenhang stehenden Protein, tau, und einem phosphorylierten
Derivat von tau, bezeichnet als A68, durchgeführt wurde. Lee et al. synthetisierten
phosphorylierte und nichtphosphorylierte Formen von Peptiden, die
auf diesem Protein beruhten, und stellten Antiseren zu jedem Peptid
her. Die Antiseren zum phosphorylierten Peptid erkannten A68 aber
nicht tau, und das Gegenteil war richtig für das nichtphosphorylierte
Peptid. Lee et al. berichteten, dass sie „Protein-Immunoblots von Hirnhomogenaten
... mit beiden Seren testeten und feststellten, dass keine anderen
Proteine mit diesen Antikörpern
reagierten." Folglich
offenbaren Lee et al. das Ziehen von Antikörpern gegen bestimmte phosphorylierte
und nichtphosphorylierte Peptide, und berichteten, dass die sich
ergebenden Antiseren für
die jeweiligen glycosylierten und nichtglycosylierten Proteine spezifisch
waren.
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Die
Erfindung kennzeichnet allgemein einen Antikörper, der mit einer oder beiden
Isoformen eines reversibel phosphorylierten Proteins spezifisch
reagiert, und entweder mit der anderen Isoform des Proteins oder mit ähnlich modifizierten
(phosphorylierten oder nichtphosphorylierten) Formen von anderen
Proteinen nicht reagiert. Auch sind Verfahren zur Herstellung der
aktivierungszustandsspezifischen und proteinspezifischen Antikörper, Kits,
die die Antikörper
zur Verwendung bei der Charakterisierung des Aktivierungszustands
eines Proteins einschließen,
und Verfahren zur Bewertung der Agonisten- oder Antagonistenaktivität von pharmazeutisch
nützlichen
Verbindungen in Richtung der Umwandlung eines spezifischen Proteins
von seinem inaktiven in seinen aktiven Zustand.
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Gemäß eines
ersten Gesichtspunkts dieser Erfindung stellen wird ein Verfahren
zur Herstellung eines Antikörpers
bereit, der spezifisch an eine der beiden Isoformen eines reversibel
phosphorylierten Proteins bindet und nicht an die andere Isoform
des Proteins und nicht an andere Proteine als diesem Protein bindet,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- a) Bereitstellen eines Peptids von mindestens drei Aminosäuren, das
im Wesentlichen eine reversible Phosphorylierungsstelle des Proteins
umfasst, wobei sich eine phosphorylierbare Aminosäure in der
reversiblen Phosphorylierungsstelle im Phosphorylierungszustand
von einer der beiden Isoformen des Proteins befindet;
- b) Ziehen von Antikörpern
gegen das Peptid;
- c) Isolieren einer Population von Antikörpern, die mit dem Peptid reagieren;
- d) aus der Population Reinigen von Antikörper, die mit dem Peptid nicht
reagieren, das die phosphorylierbare Aminosäure im selben Phosphorylierungszustand
wie in Schritt (a) aufweist, wobei der Reinigungsschritt den Schritt
des Inkontaktbringens der Population mit dem Peptid einschließt, das
sich im Phosphorylierungszustand der anderen Isoform des Proteins
befindet, um Antikörper
aus der Population zu entfernen, die an das Peptid in seiner anderen
Isoform bindet; und
- e) Sammeln der Antikörper,
die im Reinigungsschritt (d) nicht aus der Population entfernt wurden.
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In
einem zweiten und alternativen Gesichtspunkt davon stellt die Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Antikörpers bereit,
der spezifisch an eine der beiden Isoformen eines reversibel phosphorylierten
Proteins bindet und nicht an die andere Isoform des Proteins und
nicht an andere Proteine als diesem Protein bindet, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
Bereitstellen eines Peptids
von mindestens drei Aminosäuren,
das im Wesentlichen aus einer reversiblen Phosphorylierungsstelle
des Proteins besteht, wobei sich eine phosphorylierbare Aminosäure in der
reversiblen Phosphorylierungsstelle im Phosphorylierungszustand
von einer der beiden Isoformen des Proteins befindet; Ziehen von
Antikörpern
gegen das Peptid;
Isolieren einer Population von Antikörpern, die
mit dem Peptid reagieren;
Screenen der Antikörper gegen
ein erstes Peptid, das sich im Phosphorylierungszustand einer Isoform
des Proteins befindet, und gegen ein zweites Peptid, das sich im
Phosphorylierungszustand der anderen Isoform des Proteins befindet;
und
Isolieren des gewünschten
Antikörpers,
der sich aus dem Durchführen
des Screenens ergibt.
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Es
wird in einem dritten alternativen Gesichtspunkt dieser Erfindung
ein Antikörper
bereitgestellt, der spezifisch an eine reversible Tyrosinphosphorylierungsstelle
eines reversibel phosphorylierten Proteins in seiner phosphorylierten
Isoform bindet und nicht an die nichtphosphorylierte Isoform des
Proteins und nicht an andere Proteine als diesem Protein bindet.
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Die
Erfindung stellt in einem vierten alternativen Gesichtspunkt davon
einen Antikörper
bereit, der spezifisch an eine reversible Tyrosinphosphorylierungsstelle
eines reversibel phosphorylierten Proteins in seiner nichtphosphorylierten
Isoform bindet und nicht an eine phosphorylierte Isoform des Proteins
und nicht an andere Proteine als diesem Protein bindet.
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Ein
fünfter
alternativer Gesichtspunkt dieser Erfindung stellt einen Antikörper bereit,
der spezifisch an eine reversible Phosphorylierungsstelle des c-erbB-2-Rezeptors
in seiner aktiven Form bindet und nicht an die inaktive Form des
c-erbB-2-Rezeptors und nicht an andere Proteine als dem c-erbB-2-Rezeptor
bindet.
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Wir
stellen in noch weiteren alternativen Gesichtspunkten dieser Erfindung
einen Kit zur Verwendung bei der Identifizierung des Aktivierungszustands
eines reversibel phosphorylierten Proteins unter Verwendung eines
der vorstehend genannten Antikörper;
und ein Verfahren zur Verwendung beim Screenen des metastatischen
Potentials von Tumoren bei Patienten mit Lymphknoten-negativem Brustkrebs
unter Verwendung des Antikörpers
gegen den aktiven c-erbB-2-Rezeptor bereit.
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Unsere
Verfahren nutzen synthetische Phosphopeptide, die informative Proteinphosphorylierungsstellen
einschließen.
Diese Peptide werden als Immunogene verwendet, um Antikörper gegen
entwickeln, welche den Aktivierungszustand von Tyrosinkinasen und
anderen Proteinen anzeigen, die an Serin- oder Threoninresten phosphoryliert
sind.
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Unsere
Antikörper
weisen breite Anwendbarkeit sowohl in der klinischen als auch der
Laborforschung auf. Die beschriebene Technologie ist zur Herstellung
von aktivierungszustandsspezifischen Immundetektionsreagenzien für einen
breiten Bereich von regulatorischen Proteinen relevant, die für die menschliche
Gesundheit und Krankheit relevant sind.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung
von bevorzugten Ausführungsformen
davon ersichtlich.
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In
den Zeichnungen gilt:
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1 ist
ein schematisches Diagramm des c-erbB-2-Rezeptors;
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2 ist
eine Darstellung (SEQ 1D NR. 1) der beiden synthetisierten C-terminalen
Peptide von c-erbB-2, von welchen eines ein Phosphopeptid ist;
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die 3a und 3b zeigen
reverse Immunoaffinitäts-Reinigung
von polyklonalen Antiseren, die gegen die c-erbB-Sequenz 1243–1255 (SEQ
1D NR. 1) gezogen wurden, die einen phosphorylierten Tyrosinrest enthält;
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die 4a und 4b zeigen
reverse Immunoaffinitäts-Reinigung
von polyklonalen Antiseren der 3a und 3b von
kontaminierenden nichtproteinspezifischen Antiphosphotyrosin-Antikörpern;
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5 zeigt
eine Screening-Strategie zum Isolieren von monoklonalen Antikörpern, die
phosphorylierte Reste innerhalb spezifischer Proteinsequenzen erkennen;
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die 6a und 6b zeigen
die Verwendung von Phosphopeptiden als reverse Immunoaffinitäts-Reinigungsreagenzien
zur Herstellung polyklonaler Antiseren, die nur die nichtphosphorylierte
Proteinsequenz erkennen;
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7 ist
eine schematische Darstellung von einigen der evolutionär konservierten
Unterfamilien der Rezeptortyrosinkinase-Superfamilie;
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die 8a und 8b zeigen
Vergleichsaminosäuresequenzen
von tyrosinhaltigen und threoninhaltigen Hauptautophosphorylierungssequenzen
innerhalb sowohl der C-terminalen (8a; SEQ
1D NR. 2 und SEQ 1D NR. 3) als auch der Juxtamembran- (8b;
SEQ 1D NR. 4 und SEQ 1D NR. 5) Domänen des EGF-Rezeptors beziehungsweise
c-erbB- Moleküls;
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9 zeigt
Serin- und Threonin-haltige Phosphorylierungsstellen innerhalb der
p53- (SEQ 1D NR. 6), Retinoblastom- (Rb-) (SEQ 1D NR. 7) und Progesteronrezeptor-
(SEQ 1D NR. 8) Proteine;
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10a zeigt reverse Immunoaffinitäts-Reinigung
(RIP) von Antiphosphopeptid- (apt) Antiserum unter Verwendung eines
nichtphosphorylierten Peptids von identischer Sequenz zum Immunogen
zum Absorbieren von nichtaktivierungszustandsspezifischen Antikörpern;
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10b zeigt reverse Immunoaftinitäts-Reinigung
(RIP) von apt-Antiserum unter Verwendung von Phosphotyramin (PTyr-NH2)
zum Absorbieren von nichtproteinspezifischen Antiphosphotyrosinantikörpern; und
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11 zeigt
die Aminosäuresequenzhomologie
zwischen dem PDGF- (SEQ 1D NR. 9) und CSF-1-Rezeptor- (SEQ 1D NR.
10) Tyrosinkinasen und der src Nichtrezeptor- (SEQ 1D NR. 11) Tyrosinkinase.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Hier
beschreiben wir die Entwicklung von hochspezifischen Antikörpern gegen
die aktive Form des Wildtyp-c-erbB-2-Rezeptors, p175, unter Verwendung
einer Technik, welche wir aktivierungsspezifische Phosphoprotein-Immundetektion
oder APHID benannt haben.
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Um
diese Technik anzuwenden, wurden Tyrosin-phosphorylierte Peptide,
die der Tyrosinhauptautophosphorylierungsstelle des c-erbB-2-Rezeptors,
C-terminale Aminosäuren
1243–1255
(SEQ 1D NR. 1) (Akiyama et al., Mol. Cell. Biol., 11:838–842 (1991)),
entsprechen, synthetisiert, mit einem Trägerprotein (Hämocyanin)
gekoppelt (über
einen aminoterminalen Cysteinrest), mit einem Adjuvans kombiniert
und Kaninchen geimpft. Im Anschluss an das Ziehen von polyklonalen
Antiseren wurden Antikörper
gegen das Tyrosinphosphorylierte Peptid in einem Reversen Reinigungverfahren
durch Adsorption von nichtaktivierungsspezifischen Antikörpern an
ein nichtphosphoryliertes Peptid derselben Sequenz gereinigt. Wenn
erforderlich, wurden kontaminierende nichtrezeptorspezifische Antiphosphotyrosinantikörper durch
Adsorption an Phosphotyramin entfernt.
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Die
APHID-Technologie ist allgemein auf die Identifizierung von Proteinisoformen
anwendbar, die durch variierende Phosphorylierungszustände charakterisiert
sind. Ein typisches Schema zur Herstellung polyklonaler Antikörper für die aktivierungszustandsspezifische
Phosphoprotein-Immundetektion ist das folgende.
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Mit
Bezug auf 1 besteht der c-erbB-2-Rezeptor 10 aus
einer N-terminalen, extrazellulären
Domäne 12 und
einer C-terminalen, intrazellulären
Domäne 14.
Eine Hauptautophosphorylierungsstelle im Rezeptor 10 ist
das C-terminate Tyrosin bei Aminosäurerest 1248 (16).
Mit Bezug auf 2 wurden, um hochspezifische Antikörper herzustellen,
die Tyrosin-phosphorylierten Peptide 20, die der C-terminalen
Region des aktivierten c-erbB-2 entsprechen, von den Aminosäureresten
1243–1255
synthetisiert, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird,
und mit Adjuvans verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Die Antikörper, die
sowohl gegen den phosphorylierten Tyrosinrest (PTyr) 24,
bezeichnet als Y-P, als auch gegen flankierende Aminosäuren gerichtet
sind, sollten sowohl aktivierungsspezifisch als auch rezeptorspezifisch
sein.
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Die
Antikörper
von Interesse wurden gemäß dem folgenden
Isolierungsschema gereinigt. Mit Bezug auf 3a enthalten
die Rohantiseren, die von immunisierten Kaninchen gesammelt wurden,
polyklonale Antikörper 30,
die gegen das Immunogen 20 (Peptid X-P) gezogen wurden.
Einige der Antikörper 36 in
den Antiseren erkennen ein Epitop, das den phosphorylierten Tyrosin-
(PTyr) Rest 24 einschließt, und würden deshalb für die aktivierte
Form von den c-erbB-2-Rezeptoren spezifisch sein. Andere erkennen
Epitope, die nicht den PTyr-Rest 24 einschließen, und
müssen
aus der Antikörperpopulation
entfernt werden.
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Mit
Bezug auf 3b wird das Rohantiserum, das
polyklonale Antikörper 30 enthält, durch
reverse Immunoaffinitäts-Reinigung
unter Verwendung des nichtphosphorylierten Peptids-X 22 gereinigt,
das an Chromatographiekügelchen
angebracht ist, um solche Antikörper
gegen entfernen, die nicht-PTyr-spezifisch sind. Die isolierten
Antiseren enthalten nur aktivierungsspezifische Antiphosphoprotein-
(apt) Antikörper 36,
die spezifisch PTyr-haltige Sequenzen 20 erkennen.
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Bei
einigen Tieren kann das Immunogen 20 nichtrezeptorspezifische
Antiphosphotyrosinantikörper gezogen
haben. Diese Seren würden
einen zusätzlichen
Reinigungschritt erfordern. Mit Bezug auf 4a enthält die Antikörperpopulation 44,
die durch reverse Immunoreinigung in einem Schritt unter Verwendung
eines nichtphosphorylierten Peptids 22 gereinigt wurde,
einige nichtrezeptorspezifische Antikörper 46, die ein Epitop erkennen,
das nicht auf den Aminosäureresten überlappt,
die PTyr 24 flankieren. Mit Bezug auch auf 4b wird
das Antiserum 44 dann auf Phosphotyramin verbundenen Kügelchen 48 mittels
Immunoaffinität
gereinigt, um nichtrezeptorspezifische Antikörper gegen entfernen, wobei
Antiserum übrigbleibt,
das nur aktivierungsspezifische und rezeptorspezifische Antikörper 36 enthält, die
gegen die aktivierte Form vom c-erbB-2-Rezeptor gerichtet sind.
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Das
Verfahren der Aktivierungszustandsspezifischen Phosphoprotein-Immundetektion
oder APHID, wie vorstehend beschrieben, können sich als nützlich zum
Identifizieren von Tyrosinkinaserezeptoren erweisen, welche (entweder
durch strukturelle Mutationen oder durch autokrine Ligandherstellung)
in menschlichen Tumoren aktiviert werden, eine Unterscheidung, welche
sich als prognostisch und therapeutisch bedeutend erweisen könnte. Mit
kleineren Anpassungen sollte sich das APHID-Verfahren außerdem für eine breite
Vielzahl anderer klinischer und experimenteller Anwendungen als
wertvoll erweisen.
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Zum
Beispiel könnten
aktivierungsspezifische monoklonale Antikörper (mAb) gegen synthetische Phosphopeptide,
wie das vorstehend verwendete 1243–1255 c-erbB-Phosphopeptid, gezogen
werden. Dieses ist eine kleinere Anpassung der Technik, weil die
polyklonalen APHID-Antikörperherstellungen
in Wirklichkeit nicht mehr als ein Gemisch von mehrfachen monoklonalen
Antikörpern
sind. Eine Hybridomazelllinie, die einen monoklonalen APHID-Antikörper produziert,
würde jedoch
eine unerschöpfliche
Quelle von Antikörpern einheitlicher
Qualität
bereitstellen. Die Produktion von aktivierungszustandsspezifischen
monoklonalen Antikörpern
erfordert nicht reverse Immunoaffinitäts-Reinigung, sondern schließt eine ähnlich anspruchsvolle
klonale Screening-Strategie ein. Mit Bezug auf 5 werden
monoklonale Antiphosphopeptid- (apt) Antikörper 50 gegen das
1243–1255
c-erbB-Phosphotyrosin- (PTyr)-haltige Phosphopeptid 20 gezogen.
Die Hybridoma-Überstände werden
anfänglich
unter Verwendung des Immunogens 20 in einem ELISA auf Phosphopeptid-Basis
gescreent 54, welches die Isolierung der positiven Klone
A, B und C zur Folge haben, die die 50A-, 50B- und 50C-mAb exprimieren.
Eine Reihe von sekundären
Screenings wird als nächstes
verwendet. Ein Screening 56 zeigt an, dass Klon A auch
positiv für
das nichtphosphorylierte Peptid ist, wobei vermutlich Affinität zu einer
Peptidsequenz widergespiegelt wird, die lateral zur phosphorylierten
Einheit ist; deshalb wird Klon A als nicht aktivierungsspezifisch
verworfen. Bei einem anderen sekundären Screening 58 wird
gezeigt, dass Klon C positiv für
ein nichtsequenzspezifisches Phosphotyrosin ist; deshalb wird auch
er verworfen. Klon B ist negativ 60 bei allen sekundären Screenings
und wird deshalb als ein aktivierungsspezifischer und proteinspezifischer
apt monoklonaler Antikörper 62 ausgewählt.
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Außerdem konnten
polyklonale Antiseren durch das reverse Immunoaffinitäts-Reinigungsverfahren aber
unter Verwendung von synthetischen Phosphopeptiden als Reinigungs-
an Stelle von Immunisierungreagenzien erhalten werden. Dieses Verfahren
würde die
Produktion von Antikörpern,
die spezifisch nichtphosphorylierte Peptidsequenzen erkennen, in
Situationen ermöglichen,
wo derartige Sequenzen entweder aus ihrem eigenen Recht (wenn zum
Beispiel ein inaktiviertes Protein gesucht werden kann oder wenn
die Proteinaktivierung mit der Dephosphorylierung eines spezifischen
Rests korreliert; siehe nachstehend) oder als Kontrollen oder Vergleiche
für die
Immundetektion von phosphorylierten Proteinspezies von speziellem
Interesse sind.
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Mit
Bezug auf 6a enthalten Rohantiseren, die
von Kaninchen gesammelt wurden, die mit dem Peptid-X 64 immunisiert
wurden, welches nichtphosphoryliert ist, die polyklonalen Antikörper A,
B und C 66. Antikörper
B erkennt ein Epitop, das den nichtphosphorylierten Tyrosinrest 68 einschließt, und
würde deshalb für die nichtphosphorylierte
Form von Protein-X 64 spezifisch
sein. Die Antikörper
A und C erkennen andererseits Epitope, die nicht den Tyrosinrest 68 einschließen, und
würden
deshalb versagen, verschieden phosphorylierte Formen dieses Proteins
zu unterscheiden.
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Mit
Bezug auf 6b werden die Rohantiseren,
die polyklonale Antikörper 66 enthalten,
durch reverse Immunoaffinitäts-Reinigung
auf dem phosphorylierten Peptid X-P 70 gereinigt, das an
einem festen Träger,
wie Agarosekügelchen,
befestigt ist. Die Antikörper
A und C werden an den Kügelchen
zurückgehalten,
und das isolierte Antiserum enthält
nur Antikörper
B, die nichtphosphorylierte Tyrosin-haltige Sequenzen 64 spezifisch erkennen.
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Abhängig davon,
ob Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines spezifischen Rests
mit dem gewünschten
Aktivierungszustand verbunden ist, können die vorstehenden Strategien
angewendet werden, um nicht nur aktivierte, sondern auch inaktivierte
Proteinisoformen zu detektieren.
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In
einem anderen Versuch würde
erwartet werden, dass die polyklonalen Antiseren, die gegen mehrfache
Phosphopeptide (oder Dephosphopeptide) gezogen wurden, erhöhte Sensitivität der Detektion
(wenn positiv) für
Proteine, die mehr als eine kritische Phosphorylierungsstelle enthalten,
sowie verbesserte Spezifität (wenn
negativ) bereitstellen. Diese Strategie konnte verwendet werden,
um hochsensitive aktivierungs- und inaktivierungsspezifische Antikörper für Proteinisoform-Quantifizierung
zu erzeugen. Zum Beispiel enthält
der Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) mindestens vier
Tyrosinautophosphorylierungsstellen (Margolis et al., J. Biol. Chem.
264:10667–10671
(1989)). Es würde
folglich erwartet werden, dass gleichzeitige Verwendung derartiger
Peptide (phosphoryliert oder nichtphosphoryliert) in Kombination
entweder als Immunogene oder Reinigungsreagenzien die Sensitivität und Spezifität der aktivierungszustandsspezifischen
Proteindetektion erhöht.
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Tyrosinphosphorylierte
Sequenzen stellen nur eine Art von posttranslationaler Modifikation
durch Phosphorylierung bereit; die anderen Hauptreste, die innerhalb
regulatorischer Proteine phosphoryliert sind, sind Serine und Threonine.
In struktureller Hinsicht ist die Serin-/Threoninphosphorylierung
hoch analog zur Tyrosinphosphorylierung. Folglich sollte die Immundetektion
von reversibler Phosphorylierung an Serin- oder Threoninresten unter
Verwendung der APHID-Technik ähnlich
wertvolle Information bereitstellen. Zum Beispiel ist Ser-315 im
regulatorischen p53-Zellzyklusprotein in Verbindung mit der Zellzyklusprogression
phosphoryliert (Bischoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4766–4770 (1990)).
Detektion dieser Modifikation könnte sich
folglich als Marker früher
Brustneoplasie als nützlich
erweisen. Ähnlich
stellt Thr-686 im c-erbB-2-Rezeptor die Proteinkinase C-Hauptphosphorylierungsstelle
dieses Proteins dar; Detektion dieser Modifikation könnte nützliche
Information in Untersuchungen von Wachstumsfaktorwechselwirkungen
in vitro und in vivo bereitstellen und kann auch einen Marker zum
Quantifizieren von inaktivierter Rezeptorexpression in menschlichen Tumorproben
bereitstellen. Die funktionelle Bedeutung derartiger reversibler
Modifikationen kann in verschiedenen Proteinen variieren, wobei
einige Proteine durch reversible Phosphorylierung von Serin oder
Threonin und andere durch Modifikation des Tyrosins aktiviert inaktiviert
werden.
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Antikörper können gezogen
werden, die gegen andere Mitglieder der strukturell verwandten Proteinkinase-Molekülsuperfamilie
gerichtet sind. Tyrosinkinasen (welche sowohl Rezeptor- als auch Nichtrezeptorkinasen
einschließen)
zeigen größere strukturelle
und funktionelle Homologie (Knäuel
et al., Science, 241:42–52 (1988)).
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Mit
Bezug auf 7 sind einige der Mitglieder
der Rezeptortyrosinkinasesuperfamilie in schematischer Darstellung
gezeigt. Die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor- (EGFR) Familie
schließt
den c-erbB-2-, c-erbB-3- und EGF-Rezeptor ein. Die Rezeptorfamilie
des aus Blutplättchen
stammenden Wachstumsfaktors (platelet-derived growth factor) (PDGF)
wird durch die Rezeptoren des aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktors
alpha und beta (PDGFR alpha und PDGFR beta), den Rezeptor des Kolonie-stimulierenden
Faktors-1 (CSF-1R) und den Rezeptor des Stammzellwachstumsfaktors
(auch bekannt als das c-Kit-Genprodukt und
das W-Locus-Genprodukt) dargestellt. Ein Satz von Rezeptoren für die Fibroblasten-Wachstumsfaktorfamilie
ist der PDGF-Rezeptorfamilie strukturell etwas ähnlich. Im Gegensatz dazu zeigen
die Mitglieder der Insulinrezeptorfamilie (einschließlich des
Rezeptors für
Insulin und des Rezeptors für
den insulinähnlichen Wachstumsfaktor
1) eine radikal verschiedene, heterotetramere Konfiguration an.
Im Schema, gezeigt in 7, zeigen gefüllte Vierecke
die ungefähre
Position der intrazellulären
Tyrosinkinase-(katalytischen)
Domänen
an, welche eine der strukturell homologen Module bilden, die zwischen
diesen angestammt-abgeleiteten Molekülen geteilt werden. Mit Bezug
auf 8a sind die Vergleichsaminosäuresequenzen der C-terminalen EGF-Rezeptor-
und c-erbB-2-Rezeptor-Autophosphorylierungssequenzen
angegeben, die die auffallende Sequenzhomologie der jeweiligen Tyrosinautophosphorylierungsstellen
zeigen. 8b zeigt einen ähnlichen Grad
von Sequenzhomologie zwischen der Juxtamembrandomäne dieser
beiden Rezeptoren, die die Proteinkinase C-Threoninhauptphosphorylierungsstellen
einschließen.
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Der
auffallende Umfang der strukturellen und funktionellen Homologie
innerhalb dieser evolutionär-verwandten
Moleküle
zeigt an, dass sich das aktivierungszustandsspezifische Immundetektionsverfahren als
leicht anwendbar auf andere Tyrosinkinasen (und auch auf an Serin
oder Threonin phosphoryliertes Protein) erweisen sollte. Zum Beispiel
ist die Aktivität
des c-src- (Nichtrezeptortyrosinkinase) Proteins kritisch abhängig von
der unterschiedlichen Phosphorylierung von Tyr-416 und Tyr-527 (Yarden
et al., Nature 323:226–232
(1986); Hunter, Cell 49:1–4
(1987); Cobb et al., Mol. Cell. Biol. 11:5832–5838 (1991)). Die Antikörper, die
gegen diese Phosphopeptidsequenz gerichtet sind, sollten folglich
in der Lage sein, verschiedene Aktivierungszustände des src-Moleküls zu unterscheiden.
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Die
Phosphorylierung von Tyrosin oder Serin/Threonin ist ein allgegenwärtiger Mechanismus
der Proteinaktivitätsregulation,
welche nicht auf Proteinkinasen beschränkt ist. Das APHID-Verfahren würde sich
deshalb als auf das Unterscheiden von verschieden phosphorylierten
Isoformen anwendbar erweisen, nicht nur von Proteinkinasen, sondern
auch von vielen anderen Phosphoproteinen. Der p53-Zellzyklusregulator
(Bischoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4766–4770 (1990)),
das funktionell verwandte Retinoblastom- (Rb) Tumorsuppressorgenprodukt
(Lees et al., EMBO J., 10:4279–4290
(1991)) und die Kernsteroidhormonrezeptorfamilie (Denner et al.,
Science, 250:1740–1743
(1990); Kemppainen et al., J. Biol. Chem., 267:968–974 (1992))
sind einige der wichtigen zellulären
Proteine, von denen bekannt ist, dass ihre Tätigkeit durch reversible Phosphorylierung
reguliert wird.
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Mit
Bezug auf 9 ist das p53-Zellzyklus-Kontrollmolekül an Serin-315
reversibel phosphoryliert, wobei die inaktiven Spezies erhalten
werden, wenn Zellen Proliferation durch den Zellzyklus beginnen.
Ein anderes Zellzykluskontrollprotein, das Retinoblastom- (Rb) Molekül, ist während der
Zellzyklusmodulation an zwei dicht-verbundenen Resten, Ser-249 und
Thr-252, gleichzeitig phosphoryliert (Lees et al., EMBO J. 10:5279–4290 (1991)). Ähnlich ist
der menschliche Progesteronrezeptor (hPR) – ein Mitglied der Kernsteroidhormonrezeptorsuperfamilie,
welche die Rezeptoren für Östrogen,
Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Androgene, Vitamin D, Vitamin
A-Säure
und Schilddrüsenhormon
(T3) einschließt – an Serin
676 reversibel phosphoryliert, wobei Ligandaktivierung folgt (Denner
et al., Science, 250:1740–1743
(1990)). Die APHID-Technologie,
wie beschrieben, kann verwendet werden, um aktivierungs- und inaktivierungsspezifische
Antikörper
gegen alle derartigen Phosphoproteinspezies zu erzeugen.
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Die
folgenden Beispiele werden dargestellt, um die Vorteile der vorliegenden
Erfindung zu veranschaulichen und den Fachmann bei der Herstellung
und Verwendung derselben zu unterstützen. Diese Beispiele sollen
in keiner Weise anderweitig den Schutzbereich der Offenbarung beschränken.
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BEISPIEL I
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Isolierung von hochspezifischen
Antikörpern
gegen die aktive Form des c-erbB-2-Rezeptors Synthese von tyrosinphosphorylierten
Peptiden
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Eine
Hauptautophosphorylierungsstelle des c-erbB-2-Rezeptors, der in
NIH 3T3-Zellen exprimiert wird, ist Tyr-1248 (Akiyama et al., Mol.
Cell Biol., 11:833–842
(1991); Hazan et al., Cell Growth Differentiation, 1:3–7 (1990);
Margolis et al., J. Biol. Chem., 264:10667–10671 (1989)). Die C-terminale
1243–1255 c-erbB-2-Peptidsequenz,
die am äußersten
C-terminalen Ende
des Rezeptors jenseits der Kinasedomäne gelegen ist, wurde in Verbindung
mit einem N-terminalen Cystein synthetisiert. An Stelle eines Einbaus
eines Tyrosinrestes bei Position 1248 wurde jedoch ein phosphoryliertes
Peptid durch Merrifield- Standardfestphasen-Syntheseverfahren
unter Verwendung der t-boc-Strategie synthetisiert. Die Synthese
wurde mit einem ABI 430 Peptidsynthesizer unter Verwendung von schnellen
Zyklen im kleinen Maßstab
(0,1 mmol) durchgeführt. Das
Phosphotyrosin wurde als tert-Butyloxycarbonyl-O-(dibenzyl)phosphono-L-tyrosin
eingebaut, welches von Peninsula Laboratories (Belmont, CA) erworben
wurde. Das vollständig
geschützte
Peptid wurde entschützt
und vom Phenylacetamidomethylharz unter Verwendung von Trifluormethansulfonsäure gespalten. Reversed-Phase-Analyse
des Rohpeptids wurde auf einer Vydac C-18 5 μm Säule 250 mm × 2,1 mm erzielt. Ein linearer
Gradient von 0 bis 60 min wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
und 0,09% TFA in Acetonitril laufen gelassen. Aminosäureanalyse
wurde unter Verwendung von Standard-Pico-Tag-Verfahren durchgeführt. Die
Hydrolyse wurde 2 Stunden lang bei 145°C mit 6N HCl durchgeführt. Zusammensetzungsanalyse zeigte
wegen der Hydrolysebedingung eine fast vollständige Umwandlung von Phosphotyrosin
zu Tyrosin. Um zu zeigen, dass Phosphotyrosin tatsächlich in
das Peptid eingebaut wurde, wurde Sequenzanalyse unter Verwendung
einer ABI 477 Gasphasen-Sequenators durchgeführt. Die Anwesenheit eines
Phosphotyrosinrests wurde durch das Fehlen eines Signals im erwarteten
Zyklus (weil das Phosphotyrosin durch die verwendeten Lösungsmittel
nicht extrahiert wird) und das Wiederauftreten der erwarteten Sequenz
in nachfolgenden Zyklen festgestellt.
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Ein
nichtphosphoryliertes Cystein-gebundenes 1243–1255 Peptid wurde auch synthetisiert.
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B104-1-1-Zellen,
welche die aufbauend aktivierte c-erbB-2-Transmembranmutante exprimieren
(Weiner et al., Nature, 339:230–231
(1989)), wurden lysiert und unter Verwendung von Antiphoshotyrosin-Antikörpern immunopräzipitiert.
Vorinkubation des Antiphoshotyrosins entweder mit dem PTyr-haltigen
Peptid oder dem Peptid, das mit aktiviertem Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin
gekoppelt ist, wirkte als Antagonist mindestens so wirksam wie 1
mM Phosphotyrosin bei der c-erbB-2-Immunpräzipitation. Diese Daten zeigen erfolgreichen
Einbau von Phosphotyrosin in die synthetische Peptideinheit an.
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Antikörperisolierung und -reinigung
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Die
Cystein-gebundenen Peptide, die der C-terminalen Domäne der c-erbB-2-Peptidsequenz 1243–1255 entsprechen,
und phosphoryliertes Tyr-1248 enthalten, wurden mit aktiviertem
Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin
gekoppelt (KLH; Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Das Peptid-KLH-Konjugat
wurde dann gelgereinigt und die Fraktionen bei OD28O identifiziert.
Unvollständiges
Freunds-Adjuvans wurde mit dem Konjugat und dem Immunogen gemischt,
die als Aliquots bei -20°C
gelagert wurden, bis sie gebrauchsfertig waren. Kaninchen wurden
in ungefähr
4–6 Wochenabständen geimpft.
Antiseren wurden in 20–40
ml-Mengen gesammelt, wobei eine Wochen nach der Auffrischung (Boost)
begonnen wurde.
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Um
die Ausführbarkeit
von chromatographischer reverser Reinigung des Rohantiphosphopeptid-
(apt) Antiserums festzustellen, wurde das Immunoblotting von c-erbB-2-haltigen Lysaten
durchgeführt,
nachdem Antikörperlösungen mit
verschiedenen Peptiden vorinkubiert worden waren. PTyr-1248-haltige
Peptide wirkten als Antagonist zu apt, das an c-erbB-2 gebunden
war, in menschlichen SK-Br-3-Brustkrebszellen wirksamer, als es
das nichtphosphorylierte 1243–1255-Peptid
tat, während
ein Juxtamembrandomäneabgeleitetes
Peptid (Thr-Peptid) keine Wirkung hatte. In G8-/DHFR-Lysaten, zusätzlich zum
nichtphosphorylierten Peptid hob die Immunreaktivität von im
Handel erhältlichen
anti-erbB-2-Antikörpern, die
gegen diese nichtphosphorylierte Sequenz (p185) gezogen wurden,
im Grunde auf, während
die apt-p175-Bindung stark blieb. Die Nahezu-Monospezifität der apt-p175-Bindung war
im Anschluss an die chromatographische reverse Einschrittreinigung
des Roh- (apt) Antiserums ähnlich
ersichtlich.
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Reinigung
der Antiseren wurde deshalb zuerst durch 16 h lange Koppelung des
nichtphosphorylierten Cystein-gebundenen 1243–1255-Peptids an Affigel-501-Chromatographiekügelchen
(Biorad, Richmond, CA) bei 4°C
untergenommen. Die Kügelchen
wurden von ungebundenem Peptid durch sechs Zyklen leichte Zentrifugation,
gefolgt von Resuspendieren in dH2O gereinigt.
Die gewaschenen Kügelchen
wurden dann mit 1 ml Antiseren kombiniert und 6 h lang bei 4°C gemischt.
Im Anschluss an die Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und der gereinigte
Antikörper
als Aliquots bei – 20°C gelagert.
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Anders
als polyklonale Antikörper
zum nichtphosphorylierten 1243-1255-Peptid (Pab-1) können Roh-apt-Antiseren
die aktivierte p175-c-erbB-2-Isoform vorzugsweise erkennen. Diese
visuelle Unterscheidung wurde durch weitere Auffrischungen (Boosts)
vermindert, welche die Immunreaktivität sowohl von anti-p175 als
auch anti-p185 erhöhten,
aber diese Hochtiterantiseren wurden leicht durch das reverse Einschritt-Immunoaffinitätsverfahren
gereinigt. Mit Bezug auf 10a unterschied
das Hochtiterantiphosphopeptidantiserum aus einem Kaninchen (apt-2)
p175 und p185 vor der Reinigung nicht – ähnlich zu im Handel erhältlichen
Antikörpern
(pan-erbB-2). Jedoch führte
reverse Einschritt-Immunoaffinitäts-Reinigung (RIP) des Roh-apt-Antiserums
unter Verwendung des nichtphosphorylierten Peptids, das mit Agarosekügelchen
verbunden war, zu Nahezu-Monospezifität der p175-Immundetektion. Dieses wirkt durch Vorinkubation
des gereinigten apt-2-Antiserums (apt-RIP) mit Phosphotyrosin (Ptyr 1 mM)
nicht als Antagonist, wobei angezeigt wird, dass die p175-Immundetektion
nicht hauptsächlich
an den nichtrezeptorspezifischen Antiphosphotyrosinantikörpern lag.
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Obwohl
ein kleinerer Grad von nichtspezifischer Antiphosphotyrosinaktivität bei zwei
der drei produzierten Kaninchenantiseren detektierbar war, wurde
diese unerwünschte
Kontaminierung erneut durch eine reverse Immunoaffinitäts-Reinigungsstrategie
leicht entfernt. Mit Bezug auf 10b wurde
festgestellt, dass apt-2-Antiserum einen kleineren Anteil von EGF-Rezeptor-verbundenem
Phosphotyrosin detektiert, sowie das, das in der rekombinanten Ick-Tyrosinkinase
gesehen wurde. Jedoch führte
die Adsorption dieses Antiserums zu Phosphotyramin (PTyr-NH2) zum Verschwinden dieser Immunreaktivität.
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Aktivierungsspezifische
Detektion der denaturierten und nativen Formen des c-erbB-2-Rezeptors
-
Wir
haben vorher gezeigt, dass der c-erbB-2-Rezeptor in G8/DHFR-Zellen
durch Aussetzen zu Kälberserum,
PDGF, dem Proteinkinase C-Agonisten Tetradeconylphorbolesteracetat
(TPA) (Epstein et al., J. Biol. Chem., 265:10746–10751 (1990)) negativ transmoduliert
ist, oder extrazelluläres
Calcium erhöht
ist (Epstein et al., Cell Growth Differentiation 3:157–164 (1992)).
Anders als die c-erbB-2-Gesamtexpression ist die p175-Expression – wie durch
apt-Immunreaktivität gemessen – schnell
durch derartige Stimuli aufgehoben. Erkennung des nativen c-erbB-2-Rezeptors
erscheint in Immunopräzipitationsexperimenten
aktivierungsspezifisch gleich und ist bei der Zellfärbung entsprechend
nützlich.
Hauptunterschiede in der apt-1-Immunreaktivität sind auch im menschlichen
Brustkrebs und in Ovarialkrebszellen dargelegt worden.
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Die
Fähigkeit,
aktivierte gegen inaktivierte c-erbB-2-Proteinüberexprimierung über die
Verwendung von APHID zu unterscheiden, könnte helfen, Teilmengen von
Tumoren zu unterscheiden, welche sich im metastatischen Potential
oder in der therapeutischen Ansprechbarkeit unterscheiden. Dieses
würde bei
der Stadium l- (Lymphknoten-negativen) Krankheit von besonderem
Wert sein, wenn die c-erbB-2-Detektion gegenwärtig von geringem klinischem
Wert ist.
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Experimentelle Verfahren
Zellen, Zelllyse und Kontrollantikörper
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Stammkulturen
von G8/DHFR-Mausfibroblasten, die ein amplifiziertes dicistronisches
Ratten-c-neu/Dihydrofolat-Reduktasekonstrukt enthalten (ein Geschenk
von Dr. Robert Weinberg, Whitehead Institute, Cambridge, MA), wurden
in Dulbecco's minimalem
essentiellem Medium (minimal essential medium) (DME), ergänzt mit
10% Rinderkälberserum,
Glutamin, Antibiotika und 0,3 μM
Methotrexat, gehalten. Alle anderen Zelllinien wurden aus der American
Type Culture Collection erhalten. Zellhandhabung, Immunoblotting-Protokolle,
Polyacrylamidgelelektrophorese und Reagenzien waren wie vorher beschrieben
(Epstein et al., J. Biol. Chem., 265:10746–10751(1990)). Phosphotyrosin
wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. Zellen wurden
in 10 mM Na2HPO4·7H2O, 10 mM NaH2PO4·H2O, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 (v/v), 10%
Glyzerin (v/v), 50 mM Natriumfluorid, 10 mM Natriumpyrophosphat
plus Proteaseinhibitoren (Natriumorthovanadat 1 mM, Leupeptin 40 μM, Aprotinin
10 μg/ml,
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 1 mM, Benzamidin HCl 50 μg/ml und
Natriummolybdat 50 μg/ml)
lysiert. Um Phosphotyrosin-Negativkontrollen bereitzustellen, wurden
einige G8/DHFR-Zellproben 15 Minuten lang mit 10% Rinderkälberserum
behandelt, um den c-erbB-2-Rezeptor
zu transmodulieren (Epstein et al., J. Biol. Chem., 265:10746–10751 (1990)),
und wurden dann in Abwesenheit des Tyrosinphosphatase-Inhibitors
Natriumorthovanadat lysiert. Für
das Immunoblotting wurde der polyklonale pAb-1-Kaninchen-Antikörper, der gegen die carboxyterminale
1243–1255-Peptidsequenz
des neu-Genprodukts
(Triton Biosciences, Alameda, CA) gezogen wurde, in Wasser gelöst und 1:100 in
TBST-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20)
verdünnt,
während
der monoklonale Antiphosphotyrosinantikörper (anti-PTyr) auf einer
S. aureus-Protein
A-Affinitätssäule gereinigt
und bei einer 1:1000-Konzentration verwendet wurde. Zellproben wurden
im Anschluss an das Aussetzen zu PDGF (30 ng/ml), EGF (100 ng/ml),
TPA (100 μg/ml)
oder Calciumchlorid (10 mM) lysiert. Die Kontrollimmunpräzipitation des
c-erbB-2-Rezeptors
wurde unter Verwendung von im Handel erhältlichen Antikörpern (Oncogene
Science, Manhasset, NY; Triton Biosciences, Alameda, CA) durchgeführt.
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Kompetition um die Antiphosphotyrosinantikörper-Bindung
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B104-1-1-Zellen,
die den konstitutiv aktivierten c-erbB-2-Rezeptor exprimieren, wurden
lysiert und mit 1:100 Antiphosphotyrosinantikörper vor dem Immunoblotting
mit demselben Antikörper
mit 1:1000 immunopräzipitiert.
Der Antikörper
wurde 30 Minuten lang entweder mit KLH, 1 mM Phosphotyrosin (PTyr),
synthetischem Phosphopeptid (PTyr-Peptid), nichtphosphoryliertem
Peptid (Thr-Peptid), KLH-Phosphopeptid-Konjugat (PTyr-Konjugat)
oder KLH-nichtphosphoryliertem KLH-Peptid-Konjugat (Thr-Konjugat)
vorinkubiert.
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Bestimmung der Immunreaktivität von Kaninchenantiseren
im Anschluss an die Phosphopeptid-Immunisierung
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Der
polyklonale Antikörper
Pab-1 (gezogen gegen das nichtphosphorylierte 1243–1255-c-erbB-2-Peptid) wurde
bei 1:100 verwendet, während
die Antiphosphotyrosin- (anti-PTyr), apt, und Präimmun-Antikörper bei 1:1000 verwendet wurden.
EGF-Rezeptor-exprimierende A431-Zellen wurden vor der Lyse 15 Minuten lang
EGF 100 ng/ml ausgesetzt und wurden dann neben G8/DHFR-Zelllysaten,
die aktivierte oder inaktivierte c-erbB-2-Rezeptoren enthielten,
elektrophoretisch getrennt. Immunoblots wurden mit ungereinigten
apt-Antiseren (1:1000), apt-Antiseren, die 30 Minuten lang mit 1
mM Phosphotyrosin vorinkubiert wurden, oder Antiphosphotyrosinantikörper (1:1000)
inkubiert.
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BEISPIEL II
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Der
Rezeptor für
den aus Blutplättchen
stammenden Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor) (PDGF)
ist ein Hauptsignalmolekül
in menschlichen Bindegeweben und im sich entwickelnden Gehirn (Williams,
Science 248:1564–1570
(1989)). Wie c-erbB-2 und der EGF-Rezeptor ist der PDGF-Rezeptor
ein Mitglied der Tyrosinkinase-Superfamilie, hat sich aber als Teil
einer strukturell verschiedenen Subfamilie entwickelt, die den koloniestimulierenden
Faktor-1- (CSF-1) Rezeptor und das kit-Genprodukt einschließt; eine
dritte Hauptrezeptortyrosinkinasesubfamilie wird durch den Insulinrezeptor
(IR) und den nahe-verwandten Rezeptor für den insulinähnlichen
Wachstumsfaktor-1 oder IGF-1 dargestellt (7). Eine
Hauptautophosphorylierungsstelle des menschlichen PDGF-Rezeptors wird bei
Tyrosin 857 innerhalb der Kinaseinsertionsdomäne festgestellt (Kazlauskas & Cooper, Cell
58:1121–1133
(1989)). Diese Autophosphorylierungssequenz trägt starke Homologie zu einer
Sequenz, die der ähnlich
ist, die in der Kinaseinsertion des CSF-1-Rezeptors positioniert
ist (11).
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Wir
erwarten, dass die aktivierungsspezifischen Antikörper zur
phosphorylierten Tyrosin 857-Peptidsequenz
des PDGF-Rezeptors – und
folglich zum aktivierten Rezeptor selbst – unter Verwendung der APHID-Technik
leicht erhältlich
ist. Zusätzlich
zum möglichen
Wert derartiger Antikörper
in Grundlagenforschungsuntersuchungen von Zellenwachstumregulation
und embryogenetischen Wechselwirkungen, sollte sich die aktivierungsspezifische
PDGF-Rezeptor-Detektion bei der Immunophänotypisierung von menschlichen
Hirntumoren (Hermansson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:7748–7752 (1988)),
Sarkomen (Fahrer et al., Int. J. Cancer, 44:652–657 (1989)) und Schilddrüsenkarzinomen
(Heldin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:9302–9306 (1988))
als nützlich
erweisen.
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Ähnlich könnten apt-Antikörper gegen
CSF-1-Rezeptoren verwendet werden, um autokrine, parakrine oder
mutationsassozüerte
Aktivierung dieser Rezeptoren in hämatologischen und anderen Malignomen
zu detektieren. Derartige Antikörper
könnten
auch bei der Untersuchung von unerklärter Leukozytose und bei der Einschätzung des
wahrscheinlichen therapeutischen Nutzens bei Patienten verwendet
werden, die CSF-Therapie gegen klinische Probleme, wie aplastische
Anämie,
chemotherapeutische Krebszellenunterstützung und Knochenmark-Transplantation,
erhalten.
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BEISPIEL III
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Es
ist bemerkenswert, dass beide der vorstehend diskutierten Sequenzen
größere Homologie
zu einer Schlüsselautophosphorylierungsstelle
des src-Protoonkogenprodukts (11), einer
Nichtrezeptortyrosinkinase behalten, welche als kritisches intrazelluläres Signalprotein
dient.
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Die
src-Familie umfasst zahlreiche Mitglieder, die die fyn- und Ick-Moleküle einschließen, welche
die Immunzellfunktion regulieren. Aufgrund ihrer homologen Struktur
und tyrosinphosphorylierungsabhängigen Aktivierung
(Hanks et al., Science, 241:42–52
(1988)), erwarten wir, dass aktivierungsspezifische Antikörper gegen
src-ähnlichen
Proteinen unter Verwendung der APHID-Technologie leicht erhältlich sein
würden.
Wie andere Protoonkogenprodukte spielt src eine zentrale Rolle bei
der normalen intrazellulären
Signalgebung, während
es auch mit der Pathogenese einiger menschlicher Malignome in Verbindung
gebracht wird. Zum Beispiel zeigte Cartwright et al. eine zweifache
Zunahme der c-src-Expression und eine zehnfache Zunahme der c-src-Tyrosinkinasetätigkeit
von Kolonadenomen und -karzinomen, verglichen mit benachbarter normaler Schleimhaut
(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:558–562 (1990)). Dieses Molekül stellt
eine besonders attraktive Wahl für
das Anwenden des APHID-Verfahrens dar, weil Tyrosin-416 eine aktivierungsspezifische
Autophosphorylierungssequenz darstellt (Yarden et al., Nature 323:226–232 (1986)),
während
Phosphorylierung von Tyr-527 mit negativer Regulation verbunden
ist (Cobb et al., Mol. Cell. Biol., 11:5832–5838 (1991)). Es würde folglich
erwartet werden, dass mit der Anwendung von einem oder allen Verfahren,
die in den 3–6 umrissen
wurden, Antikörper
erhalten werden, die sowohl die aktivierten als auch die inaktivierten
src-Molekülisoformen
unterscheiden. Dies könnte
beim weiteren Untersuchen der intrazellulären Signaländerungen nützlich sein, welche bei frühen menschlichen
Tumoren und während
der Tumorprogression auftreten, mit möglichen klinischen und therapeutischen
Implikationen, die sich aus derartigen Untersuchungen ergeben. Viele
andere intrazelluläre
Schlüsselsignalproteine – wie Phospholipase
C (Kim et al., Cell, 65:435–441
(1991)) und die Serin/Threoninkinase-ERK-Familie (welche an Tyrosin
phosphoryliert ist; Boulton et al., Cell, 65:663–675 (1991)) – sollten
sich als der APHID-Art-Immunophänotyp-Charakterisierung ähnlich zugänglich erweisen.
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BEISPIEL IV
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Immundetektion des Ser-315-phosphorylierten
p53-Genproduktes
-
Viele
Proteine ändern
ihre metabolische Aktivität
durch Phosphorylierung von Serin- oder Threoninresten. Kinasen,
die für
derartige Phosphorylierung verantwortlich sind, schließen Proteinkinase
C, Proteinkinase A und die Caseinkinasen ein. Eine andere Kinase,
der Zellzyklusregulator cdc2, phosphoryliert zwei Schlüsselkernfaktoren,
das Retinoblastomprotein, Rb (Lees et al., EMBO J., 10:4279–4290 (1991))
und das p53-Genprodukt
(Bischoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4766–4770 (1990)).
Beide dieser Kernfaktoren sind als Tumorsuppressoren in Verbindung
gebracht worden, welche die Zellzyklusprogression regulieren. Nichtphosphoryliertes
Wildtyp-p53 ist mit Zellruhe verbunden, die Zellproliferation ist
aber mit der Phosphorylierung von p53 an Serin-315 verbunden, wobei
angezeigt wird, dass die p53-Phosphorylierung die antiproliferative
Aktivität
dieses Moleküls
aufheben kann (Bischoff et al., vorstehend zitiert). Allelischer
Verlust des p53-Gens wird in vielen gewöhnlichen menschlichen Tumoren
erkannt, und Mutationen innerhalb dieses Gens sind mit einigen familiären Brustkrebssyndromen
in Verbindung gebracht worden (Malkin et al., Science, 250:1233–1238 (1990)).
-
Mutantenformen
des Proteins kann durch einen im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörper erkannt
werden (Gannon et al., EMBO J., 9:1595–1602 (1990)). Es ist jedoch
von keinem Beweis von mutiertem p53 bei früher Brustneoplasie berichtet
worden, und die Gesamtexpression von p53 korreliert nicht mit der
Anwesenheit von Mutationen in den menschlichen Brusttumoren (Thompson
et al., Int. J. Cancer, 50:528–532 (1992)).
Diese Feststellungen werfen die Möglichkeit auf, dass Immundetektion
von Ser-315-phosphoryliertem p53
einen klinisch nützlichen
Marker zum Identifizieren von neoplastischen und präneoplastischen
Zellen bereitstellen kann, welche entweder als Ergebnis von Primär-DNA-Mutationen oder
als Sekundäreffekt
anderer tumorigener Stimuli dysregulierte Proliferation durchmachen.
Solch ein Marker könnte
bei der klinischen Charakterisierung von frühen Brusttumoren helfen, die
bei der Screening-Mammographie entdeckt wurden, und könnte helfen,
die Notwendigkeit für
die systemische oder lokale (z.B., Mastektomie oder Bestrahlung)
Adjuvanstherapie bei derartigen Patienten vorzuschreiben.
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BEISPIEL V
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Immundetektion des Ser-675-ghosphorylierten
Progesteron-Rezeptors
-
Gegenwärtige Detektion
von Primärbrusttumorhormon-
(Östrogen
und Progesteron) Rezeptoren sagt eine Wahrscheinlichkeit der Ansprechbarkeit
von 60–70%
auf die Hormontherapie im Falle der nachfolgenden Tumordissemination
voraus. Die falsch-positive Voraussage dieser Maßnahme ist lang Gegenstand
für Debatten
gewesen. Eine Möglichkeit
ist, dass herkömmliche
Verfahren auf Antikörper-Basis
oder Radioimmunoassayverfahren funktionell defekte Rezeptoren detektieren
können.
Die Anwendung des APHID-Verfahrens kann in der Lage sein, Tumoren
selektiv zu identifizieren, die Hormonrezeptoren exprimieren, welche
aktiv arbeiten und (folglich) zu Krankheitswachstum und -progression
beitragen. Es würde
erwartet werden, dass durch die Behandlung derartiger Tumoren eine
weit höhere
Antwortrate erhalten wird, als die, die gegenwärtig erhältlich ist, wobei folglich
Patienten mit APHID-negativen Hormonrezeptoren ermöglicht wird,
vorteilhaftere Therapien zu beginnen. Neue Studien haben gezeigt,
dass eine 20-fache Zunahme der Phosphorylierung des Ser-530-Rests
des Hühnerprogesteronrezeptors
die Rezeptoraktivierung begleitet, und dass dies vermutlich an der
Aktivität
einer prolinabhängigen
Kinase liegt (Denner et al., J. Biol. Chem. 265:16548–16555 (1990)). Die
Ser-530-Einheit entspricht dem homologen Ser-675 des menschlichen
Progesteronrezeptors (Misrahi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
143:740–748
(1987); Denner et al., J. Biol. Chem. 265:16548–16555 (1990)). Folglich kann
die Immundetektion an dieser Phosphopeptidstelle beim Identifizieren
von Tumoren, die einen funktionellen ligandaktivierten Rezeptor
exprimieren, klinisch nützlich
sein, und folglich beim genaueren Vorhersagen der Nützlichkeit
von endokrinen Manipulationen sowohl beim Adjuvans- als auch beim
metastatischen Brustkrebsmanagement.
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BEISPIEL VI
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Identifizierung von PDGF-Rezeptoragonisten
oder -antagonisten unter Verwendung von apt-Antikörpern bei Hochfluss"-Arzneistoffscreeningprotokollen
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apt-Antikörper, die
gegen Wachstumsfaktorrezeptoren, Tyrosinkinasen und anderen regulatorischen Phosphoproteinen
gezogen wurden, können
bei „Hochfluss"- oder Anfangsdosis-Arzneistoffscreeningprotokollen
verwendet werden, um pharmazeutisch nützliche Verbindungen zu identifizieren,
welche als Wachstumsfaktoragonisten oder – antagonisten dienen. Allgemein
werden zwei ausgedehnte Verfahren von Hochflussarzneistoffscreenings
vorgeschlagen. Verfahren auf Zellbasis verwenden eine Indikatorzelllinie,
die der zu testenden Verbindung ausgesetzt wird. Man meint, dass
dieses Verfahren Arzneistoffe schnell beseitigt, die Löslichkeits-
oder Membrandurchlässigkeitsprobleme
haben. Screenings auf Protein- oder Enzymbasis verwendeen auf der
anderen Seite gereinigte Proteine und können Arzneistoffe identifizieren,
die mit dem Rezeptor direkt reagieren. Diese Verbindungen können dann
chemisch modifiziert werden, um ihnen zu erlauben, Zellmembranen
zu durchqueren.
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In
dem Assay auf Zellbasis kann eine Indikatorzelllinie, die Rezeptoren
des aus Blutplättchen
stammenden Wachstumsfaktors (platelet-derived growth factor) (PDGF)
exprimiert, in Mikrotitergefäßen mit
96 Vertiefungen direkt oben auf sterilen Nitrocellulosefiltern gezüchtet werden.
Eine festgelegte Dosis PDGF-Ligand wird zusammen mit einer auf Antagonistenaktivität zu testenden
Verbindung zu jeder Vertiefung zugefügt. Nach fünf Minuten wurden die Zellen
mit Detergens direkt auf der Oberfläche des Nitrocellulosefilters
lysiert. Jedes der 96 Kulturlysate wird dann durch herkömmliche „Westernblot"-Protokolle, die
auf dem Fachgebiet bekannt sind (z.B., wie in Towbin et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–4354
(1979) beschrieben), unter Verwendung von apt-Antikörpern, die für die aktivierte
Form des PDGF-Rezeptors spezifisch sind, aufgearbeitet. Die Kulturen,
welche versagten, mit dem Antikörper
gegen reagieren, würden
eine potentielle PDGF-Antagonistenaktivität anzeigen. Dieses Verfahren
könnte
leicht modifiziert werden, um Arzneistoffe mit PDGF-Agonistenaktivität durch
Züchten
von Indikatorzellen zu screenen, wie vorstehend beschrieben, wobei sie
zu testenden Verbindungen aber nicht einem PDGF-Liganden ausgesetzt
werden, und die Zellen mit Antikörpern
getestet werden, die für
die aktivierte Form des PDGF-Rezeptors spezifisch sind. Zelllysate,
welche mit dem Antikörper
reagieren, würden
nahelegen, dass die getestete Verbindung ein potentieller PDGF-Agonist
ist.
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In
dem Assay auf Proteinbasis wird biologisch aktives rekombinantes
PDGF-Rezeptorprotein unter Verwendung eines Baculovirusvektor/Insekten-Wirtszellsystems
produziert, welches auf dem Fachgebiet bekannt ist (z.B. wie in
Morrison et al. beschrieben, Cell 58: 649–657 (1989)). Der auf diese
Art und Weise produzierte Rezeptor ist in Lösung konstitutiv autophosphoryliert
und Kinase-aktiv. Jedoch dephosphoryliert die Phosphatasebehandlung
den rekombinanten Rezeptor, und es werden Milligramm-Mengen des
Rezeptors für ein
Anfangsdosis-Arzneistoffscreening auf Proteinbasis erhalten. Nach
der Zugabe von Natriumorthovanadat zum Deaktivieren der Phosphatase
werden Aliquots des dephosphorylierten rekombinanten PDGF-Rezeptors zusammen
mit PDGF-Ligand, ATP und auf Antagonistenaktivität zu testenden Verbindungen
in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen dispensiert. Nach mehreren
Minuten werden die Reaktionsgemische auf Nitrocellulosefilter dispensiert.
Jedes der 96 Reaktionsgemische wird dann durch herkömmliche „Westernblot"-Protokolle unter Verwendung von Antikörpern, die
für die
aktivierte Form des PDGF-Rezeptors
spezifisch sind, aufgearbeitet. Reaktionsgemische, die versagten,
mit dem Antikörper
gegen reagieren, würden
einen potentiellen PDGF-Antagonisten anzeigen. Um auf Arzneistoffe
mit PDGF-Agonistenaktivität
zu screenen, wird der rekombinante Rezeptor (hergestellt, wie vorstehend
beschrieben) zu testenden Verbindungen und ATP ausgesetzt, und das
Reaktionsgemisch wird mit Antikörpern
getestet, die für
die aktivierte Form des PDGF-Rezeptors spezifisch sind. Reaktionsgemische,
welche mit dem Antikörper
reagieren, würden
nahelegen, dass die getestete Verbindung ein potentieller PDGF-Agonist
ist.
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Die
vorstehenden Beispiele haben viele klinisch wichtige Verwendungen
für apt-Antikörper in
Diagnostik- und Screening-Protokollen gegeben. Vorschläge sind
auch in Bezug auf die therapeutischen Implikationen von Diagnoseinformation
gemacht worden. Apt-Antikörper
könnten
in einem in einem Diagnoselabor zu verwendenden Kit bereitgestellt
werden, der bei der Charakterisierung des Aktivierungszustands des
reversibel phosphorylierten Proteins von Interesse eingesetzt wird.
Der Kit würde
die Komponenten enthalten, die zur Extraktion einer spezifischen
Gewebeprobe erforderlich sind, und die Komponenten, die zur Verwendung
in einem Bindungsassay erforderlich sind, einschließlich des
passenden apt-Antikörpers.
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Während die
vorliegende Erfindung in Verbindung mit einer bevorzugten Ausführungsform
beschrieben worden ist, ist der Fachmann nach dem Lesen der vorhergehenden
Beschreibung in der Lage, verschiedene Änderungen, Substitutionen von Äquivalenten
und andere Veränderungen
zu den Zusammensetzungen und Verfahren, die hier aufgezeigt sind,
zu bewirken. Es wird deshalb beabsichtigt, dass der Schutz, der
durch das Patent hierauf erteilt ist, nur durch die Definitionen
beschränkt
ist, die in den angefügten
Patentansprüchen und Äquivalenten
davon enthalten sind.
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