CN105121471A - 帕妥珠单抗变体及其评估 - Google Patents

帕妥珠单抗变体及其评估 Download PDF

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Abstract

本申请公开帕妥珠单抗的变体。特别地，它公开：在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体，帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体，帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)，和帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)。本申请进一步公开分离的变体，包含变体的组合物，药物组合物，和制品，以及生成和表征变体及其组合物的方法。

Description

帕妥珠单抗变体及其评估
依照37CFR§1.53(b)提交的此非临时申请要求2013年4月16日提交的流水号61/812,603的美国临时申请依照35USC§119(e)的权益，通过援引将其完整收录。
序列表
本申请含有经EFS-Web提交并通过援引在此完整收录的序列表。2014年4月8日创建的所述ASCII拷贝的名称为P5584R1-WO_SeqList.txt且大小为31,363个字节。
发明领域
本发明关注帕妥珠单抗(Pertuzumab)的变体。特别地，它关注：在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体，帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体，帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)，和帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)。本发明进一步关注分离的变体，包含变体的组合物，药物组合物，和制品，以及生成和表征变体及其组合物的方法。
发明背景
帕妥珠单抗()(也称作rhuMAb2C4)是一种单克隆抗体(MAb)，它是称作“HER二聚化抑制剂”的一系列药剂中它所在类别的第一种。通过结合HER2，它抑制HER2与其它HER受体二聚化并由此抑制肿瘤生长。帕妥珠单抗在2012年6月8日收到美国食品和药品管理局(USFDA)批准用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌。
美国专利No.7,862,817(Adams等人)记载了2C4抗体的人源化变体，称作人源化2C4型式574或重组人源化单克隆抗体2C4(rhuMAb2C4)。抗体结合人表皮生长因子受体2(HER2)胞外域(ECD)中的亚域II。以实验室规模生成rhuMAb2C4抗体，并显示结合HER2并抑制MDA-175细胞(其以1+水平表达HER2)和植入小鼠中的MCF7异种移植物生长。还可参见Adams等人，CancerImmunol.Immunother.55(6)：717-727(2006)。
美国专利No.6,339,142(Blank和Basey)记载了包含抗HER2抗体及一种或多种其酸性变体的混合物的HER2抗体组合物，其中酸性变体的量小于约25％。人源化单克隆抗体4D5变体8(humMAb4D5-8或曲妥珠单抗(Trastuzumab))是例示的HER2抗体。
美国专利No.7,560,111，美国专利No.7,879,325，和美国专利No.8,241,630(Kao等人)记载了在抗体的一条或全部两条轻链中包含氨基末端前导延伸(VHS-)的帕妥珠单抗变体(rhuMAb2C4)，即所谓的“VHS-变体”。在于天然条件使用Ellman氏分析对参照材料(I期)，LotS9802A(II期)，和400L规模工艺开发材料测试游离硫醇时，在测试的所有材料中游离硫醇水平低于检测限度。测试的组合物中1-2％的帕妥珠单抗是无岩藻糖基化(G0-F)的，如通过毛细管电泳(CE)测定的。参见美国专利No.7,560,111(Kao等人)的表5。
WO2009/099829(Harris等人)记载了帕妥珠单抗的酸性变体，包括：脱酰胺变体，糖化变体，二硫化物还原变体，不可还原变体，和唾液酸化变体。如披露的，变体表征如下：
表1：WO2009/099829(Harris等人)中的酸性变体
CEX＝阳离子交换。CE-SDS＝具有十二烷基硫酸钠的毛细管电泳。
WO2009/099829(Harris等人)中用于表征二硫化物还原变体的实验方法(即对完整抗体的非还原CE-SDS)评估还原的链间二硫键，而非链内二硫键。
Zhang等人，Anal.Chem.84(16)：7112-7123(2012)报告了在其可变重(VH域)中具有未配对半胱氨酸(Cys22和Cys96)的重组抗体(mAbA)。发现未配对半胱氨酸对抗体结合CD20没有显著影响，而且具有未配对半胱氨酸的mAbA在效力测定法(补体依赖性细胞毒性，CDC，测定法)中是有完全活性的。
WO2009/009523(Kao等人)披露了结合CD20的ocreclizumab(rhuMAb2H7)抗体的重组生产期间链间二硫键还原的阻止。
Harris，R.，Dev.Biol.(Basel，Switzerland)122：117-127(2005)披露了omalizumab(一种人源化抗IgE抗体)的可变重(VH)域中的未配对半胱氨酸(Cys22和Cys96)。未配对半胱氨酸形式具有显著更低的效力。
发明概述
本文中的实验数据关注帕妥珠单抗的变体形式，包括未配对半胱氨酸变体，无岩藻糖基化变体，低分子量种类(LMWS)，和高分子量种类(HMWS)。用于鉴定，表征，和量化这些变体的手段在用于帕妥珠单抗药物组合物的制造和品质控制方法中是有价值的。
如此，在第一个方面，本发明关注包含帕妥珠单抗及其未配对半胱氨酸变体的组合物，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸。未配对半胱氨酸变体包括异二聚体变体(在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸)和/或同二聚体变体(在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸)。
组合物任选进一步包含一种或多种别的帕妥珠单抗变体，诸如无岩藻糖基化变体，低分子量种类(LMWS)变体，高分子量种类(HMWS)变体，糖化变体，二硫化物还原变体，不可还原变体，脱酰胺变体，唾液酸化变体，VHS-变体，C末端赖氨酸变体，甲硫氨酸氧化变体，G1糖基化变体，G2糖基化变体，和非糖基化重链变体。
本发明还关注包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为组合物的0.9-4.1％。在一个实施方案中，本发明关注包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为大于组合物的2％。依照这个实施方案，无岩藻糖基化变体的量大于美国专利No.7,560,111，美国专利No.7,879,325，和美国专利No.8,241,630(Kao等人)中报告的量。
在一个别的方面，本发明关注包含帕妥珠单抗，帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)，和帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)的混合物的组合物，其中LMWS的量为≤1.6％且HMWS的量为≤1.7％。
本发明还关注包含帕妥珠单抗，峰1，和峰2的混合物的组合物，其中峰1的量为≤0.5％且峰2的量为≤1.0％，如通过还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(R-CE-SDS)测定法测量的。
本发明的别的方面关注使用或包含本文中的组合物的药物组合物，制品，和治疗癌症患者的方法。
在一个别的方面，本发明关注用于评估帕妥珠单抗组合物的方法，其包括：(1)测量组合物中未配对半胱氨酸变体的量，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸；和/或(2)测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量；和/或(3)测量组合物中帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)或高分子量种类(HMWS)的量。
在还有一个别的方面，本发明关注用于评估帕妥珠单抗组合物的生物学活性的方法，其包括测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗变体的量以测定组合物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，并确认无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量在自约0.9至约4.1％的范围中。
在另一个方面，本发明关注用于生成组合物的方法，其包括：(1)生成包含帕妥珠单抗及一种或多种其变体的组合物，并(2)对如此生成的组合物进行分析性测定法以评估其中变体的量，其中变体包含：(i)在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体；和/或(ii)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体；和/或(iii)帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)；和/或(iv)帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)，和/或(v)帕妥珠单抗的峰1片段，和/或(vi)帕妥珠单抗的峰2片段。
在另一个方面，本发明关注分离的帕妥珠单抗变体，其中分离的变体包含：(a)帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中变体为在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的异二聚体变体；和/或(b)帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中变体为在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的同二聚体变体；和/或(c)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体；和/或(d)帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)；和/或(e)帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)；和/或(f)帕妥珠单抗的峰1片段，和/或(g)帕妥珠单抗的峰2片段。
在一个别的方面，本发明关注用于评估帕妥珠单抗组合物的片段化的方法，其包括通过还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(R-CE-SDS)测定法测量组合物中峰1和峰2的量并确认峰1的量为≤5％且峰2的量为≤1.0％。
附图简述
图1提供HER2蛋白质结构的示意图，及其胞外域的亚域I-IV(分别为SEQIDNO：1-4)的氨基酸序列。
图2A和2B描绘鼠单克隆抗体2C4的可变轻(VL)(图2A)和可变重(VH)(图2B)域(分别为SEQIDNO：5和6)；变体574/帕妥珠单抗的VL和VH域(分别为SEQIDNO：7和8)，和人VL和VH共有框架(humκ1，轻卡帕亚组I；humIII，重亚组III)(分别为SEQIDNO：9和10)的氨基酸序列比对。星号鉴别帕妥珠单抗和鼠单克隆抗体2C4的可变域之间或帕妥珠单抗和人框架的可变域之间的的差异。互补决定区(CDR)在括号中。
图3A和3B显示帕妥珠单抗轻链(图3A；SEQIDNO：11)和重链(图3B；SEQIDNO：12)的氨基酸序列。CDR以粗体显示。轻链和重链的计算分子量为23,526.22Da和49,216.56Da(半胱氨酸处于还原形式)。碳水化合物模块附着至重链的Asn299。
图4A和4B分别显示曲妥珠单抗轻链(图4A；SEQIDNO：13)和重链(图4B；SEQIDNO：14)的氨基酸序列。可变轻和可变重域的边界以箭指示。
图5A和5B分别描绘一种变体帕妥珠单抗轻链序列(图5A；SEQIDNO：15)和一种变体帕妥珠单抗重链序列(图5B；SEQIDNO：16)。
图6描绘(主要种类)帕妥珠单抗的结构，包括其4个链间和12个链内二硫键，包括每个可变轻(VL)域中的Cys23/Cys88链内二硫键。描绘的域为：VL＝可变轻域；VH＝可变重域；CL＝轻链恒定域；CH1＝重链恒定域1；CH2＝重链恒定域2；CH3＝重链恒定域3。
图7显示帕妥珠单抗的非还原(天然)胰蛋白酶肽图。
图8描绘还原的和非还原的帕妥珠单抗的胰蛋白酶肽图(全刻度)。
图9描绘还原的和非还原的帕妥珠单抗的胰蛋白酶肽图(0-120分钟)。
图10描绘还原的和非还原的帕妥珠单抗的胰蛋白酶肽图(120-204分钟)。
图11描绘木瓜蛋白酶消化的帕妥珠单抗的疏水相互作用层析(HIC)分析。
图12描绘木瓜蛋白酶消化的帕妥珠单抗的HIC分析(扩展视图)。
图13描绘完整帕妥珠单抗的HIC分析。显示包含下述各项的峰：富集的游离硫醇同二聚体(全部两条轻链上的游离硫醇)，游离硫醇异二聚体(一个轻链上的游离硫醇)，和野生型同二聚体(主要种类抗体)。
图14描绘帕妥珠单抗(批次anti2C4907-2)在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定法中的活性。
图15描绘G0-F水平对ADCC活性的影响。测试的样品为III期帕妥珠单抗(G0-F＝2.2％)和I期帕妥珠单抗(G0-F＝0.8％)。
图16描绘对自帕妥珠单抗释放的N连接寡糖的毛细管电泳分析。
图17描绘对自帕妥珠单抗释放的N连接寡糖的毛细管电泳分析(扩展视图)。注意：G1寡糖具有两种异构形式(标记为G1和G1’)，其中末端半乳糖残基附着至α1-6分支或α1-3分支任一。
图18描绘帕妥珠单抗Fab和Fc(有限的Lys-C消化)分开的反相-高效液体层析(HP-HPLC)。显示有限的Lys-C消化的帕妥珠单抗和然后用N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理的有限的Lys-C消化的帕妥珠单抗。
图19描绘肽作图，确认帕妥珠单抗游离硫醇Fab在其轻链含有游离Cys23和Cys88。来自含有游离硫醇的Fab的L2肽被NEM标记并因此在肽图分析中移位。
图20示意性描绘：主要种类或野生型IgG1(图20A)，Cys23/Cys88异二聚体变体(图20B)，和Cys23/Cys88同二聚体变体(图20C)。
图21描绘帕妥珠单抗批次的％G0-F对ADCC活性，使用本文中实施例4中的测定法。
图22示意性描绘帕妥珠单抗在HER2的异二聚体结合位点处结合，由此阻止与活化的EGFR或HER3异二聚化。
图23比较曲妥珠单抗(其结合HER2ECD的近膜域附近的亚域IV)和帕妥珠单抗(其结合HER2ECD的亚域II)的活性。
图24A和24B描绘附着至IgG抗体的寡糖结构。
图25描绘帕妥珠单抗的大小排阻层析(SEC)分析(全刻度)。
图26描绘帕妥珠单抗的SEC分析(扩展刻度)。峰包括主峰(主要种类抗体)，高分子量种类(HMWS)，和低分子量种类(LMWS)。
图27描绘帕妥珠单抗样品的大小排阻-高效液体层析(SE-HPLC)分析。样品A为代表性帕妥珠单抗成品药批次。样品B为以1.2毫勒克斯小时进行光暴露的帕妥珠单抗批次。样品C为以3.6毫勒克斯小时进行光暴露的帕妥珠单抗批次。样品D为于pH3.2进行酸处理的帕妥珠单抗批次。样品E为来自离子交换-HPLC(IEHPLC)的纯化的碱性变体。
图28描绘分析性超速离心(AUC)沉降速度和SE-HPLC分析的一致性图(concordanceplot)。误差棒代表来自n＝3测定的两个标准偏差。所有其它数据点表示单次测定。圆圈表示具有低于AUC检测水平的HMWS水平的样品。
图29描绘非还原帕妥珠单抗的毛细管电泳十二烷基硫酸钠分析(CE-SDS)及激光诱导荧光(LIF)检测。
图30描绘非还原(NR)帕妥珠单抗的CE-SDS-LIF(扩展视图)。
图31A和31B描绘实施例6的SE-HPLC层析图：全刻度(图31A)和扩展刻度(图31B)。
图32A和32B描绘实施例6的非还原CE-SDS(NR-CE-SDS)电泳图：全刻度(图32A)和扩展刻度(图32B)。
图33A和33B描绘实施例6的还原CE-SDS(R-CE-SDS)电泳图：全刻度(图33A)，和扩展刻度(图33B)。
图34提供酸处理样品的NR-CE-SDS和R-CE-SDS电泳图的比较(扩展刻度)。
图35描绘NR-CE-SDS和SE-HPLC之间Fab量化的相关性。
发明详述
I.定义
“配对半胱氨酸”在本文中指蛋白质(诸如抗体)中形成二硫键的两个半胱氨酸残基。此类二硫键可以是链间二硫键(例如抗体的重和轻链之间的或抗体的两条重链之间的二硫键)，或链内二硫键(例如抗体的一条轻链内的或抗体的一条重链内的)。大多数IgG1抗体包含四个链间二硫键和十二个链内二硫键。见图6。
“未配对半胱氨酸变体”为蛋白质(例如抗体，诸如帕妥珠单抗)的一种变体，其中一个或多个配对半胱氨酸没有处于成二硫键状态。此类未配对半胱氨酸可以是尚未配对以形成二硫键(例如当蛋白质最初折叠成它的三级结构时)或可以是已经形成二硫键但其稍后断裂(例如在制造期间或在贮藏后)。未配对半胱氨酸常常称作游离硫醇或游离氢硫基。在一个实施方案中，未配对半胱氨酸来自链内二硫键。在一个实施方案中，未配对半胱氨酸在抗体的轻链(例如可变轻域)中。在一个实施方案中，未配对半胱氨酸变体为Cys23/Cys88变体。
“Cys23/Cys88”未配对半胱氨酸变体缺乏抗体的一个或全部两个可变轻域中的半胱氨酸残基23和88处的分子内二硫键。见本文中的图20(b)和(c)。
“同二聚体变体”缺乏抗体的全部两个可变轻域中的Cys23/Cys88二硫键。见本文中的图20(c)。
“异二聚体变体”缺乏抗体的一个可变轻域中的仅一个Cys23/Cys88二硫键。见本文中的图20(b)。
“无岩藻糖基化变体”为抗体的一种糖基化变体，其中附着至一条或全部两条重链中的残基Asn299的一个或全部两个寡糖结构中缺乏岩藻糖，例如在核心寡糖结构中缺乏Fucα(1->6)。
帕妥珠单抗的“低分子量种类”或“LMWS”包含帕妥珠单抗的一种片段，其具有小于主要种类或完整帕妥珠单抗的分子量的分子量(例如其中完整帕妥珠单抗具有约145,197Da的分子量，仅测量它的肽链)。LMWS可通过大小排阻高效液体层析(SE-HPLC)和/或具有十二烷基硫酸钠的非还原毛细管电泳(CE-SDS)来检测，例如实施例5中的。在一个实施方案中，LMWS包含通过CE-SDS获得的“峰6”或由通过CE-SDS获得的“峰6”组成(见例如实施例5)。
“高分子量种类”或“HMWS”包含帕妥珠单抗的一种制备物，其具有大于主要种类或完整帕妥珠单抗的分子量的分子量(例如其中完整帕妥珠单抗具有约145,197Da的分子量，仅测量它的肽链)。HMWS可通过大小排阻高效液体层析(SE-HPLC)和/或具有十二烷基硫酸钠的非还原毛细管电泳(CE-SDS)测定法来检测，例如实施例5中的。
本文中的“峰1”指其大小比帕妥珠单抗轻链(LC)要小的帕妥珠单抗片段。可以通过CE-SDS测定法(优选还原CE-SDS(R-CE-SDS)测定法)将峰1片段与主要种类帕妥珠单抗分开。见例如本文中的图33B，表16，和表18。优选地，帕妥珠单抗组合物中峰1的量为≤0.5％。任选地，如实施例6中所述进行R-CE-SDS测定法，而且校正峰面积(CPA)提供组合物中的％峰1。
本文中的“峰2”指其大小比要帕妥珠单抗轻链(LC)大且比帕妥珠单抗非糖基化重链(NGHC)要小的帕妥珠单抗片段。可以通过CE-SDS(优选还原(R-CE-SDS)测定法)将峰2与主要种类帕妥珠单抗分开。峰2排除R-CE-SDS测定法期间可出现的峰3，如本文中的实施例6中解释的。见例如本文中的图33B，表16，和表18。优选地，帕妥珠单抗组合物中峰2的量为≤1.0％。任选地，如实施例6中所述进行R-CE-SDS测定法，而且校正峰面积(CPA)提供组合物中的％峰2。
“片段化”指多肽链切割，例如帕妥珠单抗轻链和/或重链的切割。它不包括例如NR-CE-SDS分析期间非共价联合的多肽链的解离。
“分析性测定法”为定性评估和/或定量测量组合物中分析物(例如抗体变体)的存在或量的测定法。进行测定法的组合物可以是纯化的组合物，包括药物组合物。
“Fab疏水性相互作用层析测定法”或“FabHIC测定法”包含生成组合物中的抗体的片段(例如Fab片段)(例如使用酶木瓜蛋白酶)并对如此生成的抗体片段进行HIC以将未配对半胱氨酸变体与主要种类帕妥珠单抗分开。本文中的实施例1中公开一种例示性此类测定法。
“HER受体”为属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，而且包括EGFR，HER2，HER3和HER4受体。HER受体通常会包含胞外域，其可结合HER配体和/或与另一个HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜域；保守的细胞内酪氨酸激酶域；和羧基末端信号传导域，其包含数个可被磷酸化的酪氨酸残基。
表述“HER2”指例如Semba等人，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto等人，Nature319：230-234(1986)中记载的人HER2蛋白质(Genebank登录号X03363)。
在本文中，“HER2胞外域”或“HER2ECD”指HER2中在细胞外部的域，或是锚定至细胞膜或是在循环中，包括其片段。图1中显示HER2的氨基酸序列。在一个实施方案中，HER2的胞外域可包含四个域：“亚域I”(氨基酸残基约1-195；SEQIDNO：1)，“亚域II”(氨基酸残基约196-319；SEQIDNO：2)，“亚域III”(氨基酸残基约320-488：SEQIDNO：3)，和“亚域IV”(氨基酸残基约489-630；SEQIDNO：4)(残基编号不含信号肽)。参见Garrett等人，Mol.Cell.11：495-505(2003)；Cho等人，Nature421：756-760(2003)；Franklin等人，CancerCell5：317-328(2004)；和Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746-1750(1993)；以及本文中的图1。
“HER二聚体”在本文中为非共价联合的二聚体，其包含至少两个HER受体。例如，此类复合物可在表达两种或更多种HER受体的细胞暴露于HER配体时形成，而且可以通过免疫沉淀来分离，通过SDS-PAGE来分析，如Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)中记载的。其它蛋白质(诸如细胞因子受体亚基，例如gp130)可以与二聚体联合。优选地，HER二聚体包含HER2。
“HER异二聚体”在本文中为非共价联合的异二聚体，其包含至少两个不同HER受体，诸如EGFR-HER2，HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体。
“HER活化”指任一种或多种HER受体的活化或磷酸化。通常，HER活化导致信号转导(例如由HER受体的细胞内激酶域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基引起的)。HER活化可通过HER配体结合包含感兴趣HER受体的HER二聚体来介导。HER配体结合HER二聚体可活化二聚体中的HER受体中的一种或多种的激酶域，并由此导致HER受体中的一种或多种中的酪氨酸残基磷酸化和/或别的底物多肽(诸如Akt或MAPK细胞内激酶)中的酪氨酸残基磷酸化。
“人源化”形式的非人(例如啮齿类)抗体为最小限度含有自非人免疫球蛋白衍生的序列的嵌合抗体。对于绝大部分，人源化抗体为如下的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基用来自具有期望特异性，亲和力，和能力的非人种类(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类)的高变区的残基替换。在一些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应非人残基替换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰以进一步细调抗体性能。一般而言，人源化抗体会包含基本上整个如下的至少一个，通常两个可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，而且所有或基本上所有FR为人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。关于更多详情，参见Jones等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。人源化HER2抗体具体包括曲妥珠单抗和人源化2C4抗体，诸如帕妥珠单抗，如本文中描述和定义的。
“完整抗体”在本文中为包含两个抗原结合区和一个Fc区的。优选地，完整抗体具有功能性Fc区。在一个实施方案中，“完整帕妥珠单抗”具有约145,197Da的分子量，仅测量它的肽链。
术语“高变区”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如轻链可变域中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基为那些除高变区残基以外的可变域残基，如本文中定义的。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以有所变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自位于位置Cys226的氨基酸残基或自Pro230延伸至其羧基末端。可去除Fc区的C末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基449)，例如在抗体生产或纯化期间或通过重组工程改造编码抗体重链的核酸。因而，完整抗体的组合物可包含去除所有K449残基的抗体群体，无一K449残基去除的抗体群体，和具有有和无K449残基的抗体的混合物的抗体群体。
除非另外指明，在本文中免疫球蛋白重链中的残基的编号为Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中EU索引的，通过援引明确收入本文。“Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性“效应器功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)；等。此类效应器功能通常要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合，而且可使用多种测定法来评估。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区，以及其天然发生变体。
“裸抗体”为未缀合异源分子(诸如细胞毒性模块或放射性标记物)的抗体。
术语“主要种类抗体”或“野生型抗体”在本文中指组合物中如下的抗体氨基酸序列结构，它是组合物中数量上占优势的抗体分子。优选地，主要种类抗体为HER2抗体，诸如结合HER2亚域II的抗体，比曲妥珠单抗更加有效地抑制HER二聚化的抗体，和/或结合HER2上的异二聚体结合位点的抗体。在一个实施方案中，主要种类抗体为如下的抗体，其包含CDR-H1(SEQIDNO：17或23)，CDR-H2(SEQIDNO：18)，和CDR-H3(SEQIDNO：19)，CDR-L1(SEQIDNO：20)，CDR-L2(SEQIDNO：21或24)和CDR-L3(SEQIDNO：22)，分别在SEQIDNO：7和8中的VL和VH氨基酸序列(见图2A-2B)，和任选的SEQIDNO：11或15中的轻链氨基酸序列和SEQIDNO：12或16中的重链氨基酸序列(见图3A-3B和5A-5B)。在一个实施方案中，主要种类抗体为帕妥珠单抗。
“抑制HER二聚化”的抗体为抑制或干扰HER二聚体或异二聚体形成的抗体。在一个实施方案中，此类抗体在其异二聚体结合位点处结合HER2。本文中最优选的二聚化抑制性抗体为帕妥珠单抗。
HER2上的“异二聚体结合位点”指HER2的胞外域中如下的区域，其与EGFR，HER3或HER4的胞外域中的一个区域形成二聚体，此时接触后者或与后者成界面。区域在HER2的亚域II(SEQIDNO：2)中找到。Franklin等人，CancerCell5：317-328(2004)。
“结合HER2的异二聚体结合位点”的HER2抗体结合亚域II(SEQIDNO：2)中的残基且任选还结合HER2胞外域的其它域，诸如亚域I和III(SEQIDNO：1和3)中的残基，而且能至少一定程度地在空间上阻碍HER2-EGFR，HER2-HER3，或HER2-HER4异二聚体形成。Franklin等人，CancerCell5：317-328(2004)表征HER2-帕妥珠单抗晶体结构，保存于RCSB蛋白质数据库(身份代码IS78)，例示结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。
“结合HER2的亚域II”的抗体结合亚域II(SEQIDNO：2)中的残基和任选的HER2的其它亚域，诸如亚域I和III(分别为SEQIDNO：1和3)中的残基。
为了本文中的目的，可互换使用的“帕妥珠单抗”和“rhuMAb2C4”指包含分别在SEQIDNO：7和8中的可变轻(VL)和可变重(VH)氨基酸序列的抗体。本文中的图22和23例示帕妥珠单抗的例示性生物学功能。在帕妥珠单抗为完整抗体的情况中，它优选包含IgG1抗体；在一个实施方案中，包含SEQIDNO：11或15中的轻链氨基酸序列，和SEQIDNO：12或16中的重链氨基酸序列。抗体任选是由重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生成的。术语“帕妥珠单抗”和“rhuMAb2C4”在本文中涵盖美国采用名称(USAN)或国际非专利名称(INN)为帕妥珠单抗的药物的生物仿制药或故意拷贝。
为了本文中的目的，可互换使用的“曲妥珠单抗”和rhuMAb4D5”指抗体包含分别在SEQIDNO：13和14内的可变轻(VL)和可变重(VH)氨基酸序列(见图4A-4B)。在曲妥珠单抗为完整抗体的情况中，它优选包含IgG1抗体；在一个实施方案中包含SEQIDNO：13的轻链氨基酸序列和SEQIDNO：14的重链氨基酸序列。抗体任选是由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生成的。术语“曲妥珠单抗”和“rhuMAb4D5”在本文中涵盖美国采用名称(USAN)或国际非专利名称(INN)为曲妥珠单抗的药物的生物仿制药或故意拷贝。
“氨基酸序列变体”抗体在本文中为具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体会与主要种类抗体拥有至少约70％同源性，且优选地，它们会与主要种类抗体至少约80％，和更优选至少约90％同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置处拥有替代，删除，和/或添加。本文中的氨基酸序列变体的例子包括脱酰胺抗体变体，在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导延伸(例如VHS-)的抗体，在其一条或两条重链上具有C末端赖氨酸残基的抗体，等，而且包括对重和/或轻链的氨基酸序列的变异的组合。
“酸性变体”为主要种类抗体如下的变体，其比主要种类抗体更加酸性。酸性变体相对于主要种类抗体已经获得负电荷或丢失正电荷。此类酸性变体可使用依照电荷将蛋白质分开的分开方法学来解析，诸如离子交换层析。在通过阳离子交换层析分开时，主要种类抗体的酸性变体比主峰要早洗脱。
“二硫化物还原变体”具有一个或多个成链间二硫键半胱氨酸化学还原成游离硫醇形式。这种变体可通过具有十二烷基硫酸钠的非还原毛细管电泳(CE-SDS)来监测，例如如WO2009/099829(Harris等人)在记载的。
在本文中，“不可还原变体”或“不完全还原变体”为主要种类抗体如下的变体，其不能通过还原剂(诸如二硫苏糖醇)处理化学还原成重链和轻链。此类变体可通过用还原剂处理组合物并使用评估蛋白质大小的方法学(诸如具有十二烷基硫酸钠的毛细管电泳(CE-SDS)，例如使用WO2009/099829(Harris等人)中记载的技术)评估所得组合物来评估。
“糖基化变体”抗体在本文中为具有与附着至主要种类抗体的一种或多种碳水化合物模块不同的一种或多种碳水化合物模块附着至其的抗体。在一个实施方案中，糖基化变体具有附着至抗体的一条或全部两条重链的寡糖结构，例如在重链的残基299处。在一个实施方案中，主要种类抗体(例如帕妥珠单抗)包含G0寡糖，作为占优势的附着至它的Fc区的寡糖。图24A-24B中描绘附着至IgG1的例示性寡糖结构。本文中的糖基化变体的例子包括无岩藻糖基化变体，具有G1或G2寡糖结构代替G0寡糖结构附着至其Fc区的抗体(“G1糖基化变体”或“G2糖基化变体”)，没有碳水化合物附着至抗体的一条或两条重链的抗体(“非糖基化重链变体”)，唾液酸化变体，等，以及此类糖基化改变的组合。参见例如美国专利7,560,111(Kao等人)。
在抗体具有Fc区的情况中，寡糖结构可附着至抗体的一条或两条重链，例如在残基299处。在一个实施方案中，G0为占优势的寡糖结构，其它寡糖结构，诸如G0-F，G-1，Man5，Man6，G1-1，G1(1-6)，G1(1-3)和G2以较少的量在组合物中找到。
除非另外指明，“G1寡糖结构”在本文中包括G1(1-6)和G1(1-3)结构。
为了本文中的目的，“唾液酸化变体”为主要种类抗体如下的变体，其包含一种或多种唾液酸化碳水化合物模块附着至一条或两条其重链。唾液酸化变体可通过在有或无唾液酸酶处理的情况下评估组合物(例如通过离子交换层析)来鉴定，例如如WO2009/099829中记载的。
“糖化变体”为糖(诸如葡萄糖)已经共价附着至例如其一条或全部两条轻链的抗体。这种添加可通过葡萄糖与蛋白质(例如细胞培养培养基中的)上的赖氨酸残基的反应而发生。糖化变体可通过对还原抗体的质谱术分析来鉴定，即评估重或轻链的质量的增加。糖化变体还可通过硼酸盐层析来量化，如WO2009/099829(Harris等人)中解释的。
“脱酰胺”抗体为其中一个或多个其天冬酰胺残基已经衍生化成例如天冬氨酸，琥珀酰亚胺，或异天冬氨酸的。脱酰胺抗体的一个例子是如下的帕妥珠单抗变体，其中帕妥珠单抗的一条或两条重链上的Asn-386和/或Asn-391是脱酰胺的。参见例如WO2009/099829(Harris等人)。
“氨基末端前导延伸变体”在本文中指在主要种类抗体的任一条或多条重或轻链的氨基末端处具有氨基末端前导序列的一个或多个氨基酸残基的主要种类抗体。一种例示性氨基末端前导延伸在抗体变体的一条或全部两条轻链上包含三个氨基酸残基，VHS-或由其组成，在本文中称作“VHS-变体”。参见美国专利7,560,111(Kao等人)。
“C末端赖氨酸变体”指在其重链的C末端处包含赖氨酸(K)残基的变体。参见美国专利7,560,111(Kao等人)。
“甲硫氨酸氧化变体”指其中包含一个或多个氧化的甲硫氨酸残基(例如氧化的Met-254)的变体。参见美国专利7,560,111(Kao等人)。
术语“癌症”指哺乳动物中通常特征为不受调节的细胞生长的生理状态。本文中的癌症的例子包括乳腺癌(例如转移性乳腺癌)，胃癌，卵巢癌，原发性腹膜癌，和输卵管癌。本文中的癌症的例子包括HER2阳性癌症和低HER3癌症。
“展示HER表达，扩增，或活化”的癌症或生物学样品为在诊断性测试中表达(包括过表达)HER受体，已经扩增HER基因，和/或以其它方式证明HER受体活化或磷酸化的。
“HER2阳性”癌症包含具有比正常要高的HER2水平的癌细胞。HER2阳性癌症的例子包括HER2阳性乳腺癌和HER2阳性胃癌。用于鉴定HER2阳性癌症的方法包括：测量HER2蛋白质的测定法，诸如免疫组织化学测定法(IHC)，测量HER2编码核酸的测定法，诸如原位杂交(ISH)，包括荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)和发色原位杂交(CISH；参见例如Tanner等人，Am.J.Pathol.157(5)：1467-1472(2000)；Bella等人，J.Clin.Oncol.26：(May20suppl；abstr22147)(2008))，Southern印迹，或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)；脱落抗原(例如HER2ECD)测定法(参见例如1990年6月12日公告的美国专利No.4,933,294；和1995年3月28日公告的美国专利5,401,638)；和体内测定法。任选地，HER2阳性癌症具有2+或3+的免疫组织化学(IHC)得分和/或≥2.0的原位杂交(ISH)扩增比。
“低HER3”癌症包含具有比正常要低的HER3水平的癌细胞。低HER3癌症的例子包括卵巢癌，原发性腹膜癌，和输卵管癌。参见例如美国专利No.7,981,418(Amler等人)。在一个实施方案中，低HER3是基于HER3mRNA表达水平测定的(等于或低于2.81的浓度比，如在COBAS仪器上通过qRT-PCR评估的)。
“表位2C4”为HER2的胞外域中抗体2C4结合的区域。为了筛选本质上结合2C4表位的抗体，可实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies,ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，EdHarlow和DavidLane(1988)中记载的。优选地，抗体阻断2C4结合HER2达约50％或更多。或者，可实施表位作图来评估抗体是否本质上结合HER2的2C4表位。表位2C4包含来自HER2的胞外域中的亚域II(SEQIDNO：2)的残基。2C4和帕妥珠单抗在亚域I，II和III(分别为SEQIDNO：1，2，和3)附近结合HER2的胞外域。Franklin等人，CancerCell5：317-328(2004)。
“处理/治疗”指治疗性处理和防范性或预防性措施二者。需要治疗的那些包括早就具有癌症的那些以及其中要预防癌症的那些。因此，本文中要治疗的患者可以是已经诊断为具有癌症或可以是倾向或易得癌症。
术语“有效量”指药物有效治疗患者中的癌症的量。有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤大小；抑制(即一定程度减缓和优选停止)癌细胞浸润入周围器官中；抑制(即一定程度减缓和优选停止)肿瘤转移；一定程度抑制肿瘤生长；和/或一定程度减轻一种或多种与癌症有关的症状。就药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。有效量可延长无进展存活(例如如通过实体瘤响应评估标准(RECIST)或CA-125变化测量的)，导致客观响应(包括部分响应，PR，或完全响应，CR)，延长总体存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状(例如如通过FOSI评估的)。
本文中的治疗剂的“固定”或“平坦”剂量指不管患者的重量(WT)或体表面积(BSA)施用于人患者的剂量。因此，固定或平坦剂量不是以mg/kg剂量或mg/m2剂量，而是以治疗剂的绝对量提供的。
“容器”指可用于容纳或装载药物组合物或组合物的物体。本文中的容器的例子包括管形瓶，注射器，静脉内袋，等。
“静脉内袋”或“IV袋”为可容纳可经患者的静脉施用的溶液的袋。在一个实施方案中，溶液为盐水溶液(例如约0.9％或约0.45％NaCl)。任选地，IV袋是自聚烯烃或聚氯乙烯形成的。
“管形瓶”为适合于容纳液体或冻干制备物的一种容器。在一个实施方案中，管形瓶为单次使用管形瓶，例如带塞子的20-cc单次使用管形瓶。
“包装插页”为奉食品和药物管理局(FDA)或其它管理机构之命，必须放置在每一种处方药物的包装内部的传单。传单通常包括药物的商标，它的通用名，和它的作用机制；陈述它的适应症，禁忌症，警告，预防措施，不利作用，和剂量形式；而且包括关于施用的推荐剂量，时间，和路径的用法说明。
“药物组合物”为包含可安全施用于人患者的药学活性药物(例如帕妥珠单抗和变体形式，诸如本文中公开的那些)和一种或多种“药学活性赋形剂”(例如缓冲剂，稳定剂，张力调节剂，防腐剂，表面活性剂，等)的组合物。例如，此类组合物可以是液体的或冻干的。
“重组”蛋白质为已经由遗传修饰宿主细胞(诸如中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞)生成的蛋白质。
“制造规模”指以商业规模(例如12,000升(L)或更多)使用得到FDA或其它管理机构批准的商业性工艺生产蛋白质药物(例如抗体)。
“纯化”指一个或多个纯化步骤，诸如蛋白A层析，离子交换层析，等。
“分离的”变体指通过一种或多种纯化或分析规程已经与主要种类或野生型抗体分开的变体。此类分离的变体可评估它的生物学活性和/或效力。
II.抗体组合物
(i)主要种类抗体
本文中的抗体组合物包含结合HER2的抗体(HER2抗体)，任选人源化HER2抗体。例如，本文中的人源化抗体可包含掺入人可变重域中的非人高变区残基且可进一步在选自下组的位置包含框架区(FR)替代：69H，71H和73H，利用Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中列出的可变域编号系统。在一个实施方案中，人源化抗体在位置69H，71H和73H中的两个或全部包含FR替代。
本文中的一种例示性感兴趣人源化抗体包含VHCDR残基：
-GFTFTDYTMX(SEQIDNO：17)，其中X优选为D或S，例如GFTFTDYTMD(SEQIDNO：23)，作为CDR-H1；
-DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQIDNO：18)，作为CDR-H2；和/或-NLGPSFYFDY(SEQIDNO：19)，作为CDR-H3，任选包含那些CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰本质上维持或改善抗体的亲和力。例如，供本发明的方法使用的抗体变体可在上述可变重CDR序列中具有自约一处至约七处或约五处氨基酸替代。可通过亲和力成熟制备此类抗体变体，例如如下文所述。
人源化抗体可包含VLCDR残基：
-KASQDVSIGVA(SEQIDNO：20)，作为CDR-L1；
-SASYX1X2X3，其中X1优选为R或L，X2优选为Y或E，且X3优选为T或S(SEQIDNO：21)，例如SASYRYT(SEQIDNO：24)，作为CDR-L2；和/或
-QQYYIYPYT(SEQIDNO：22)，作为CDR-L3，
例如，在前一段中的那些可变重域CDR残基之外。
此类人源化抗体任选包含上述CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰本质上维持或改善抗体的亲和力。例如，感兴趣抗体变体可在上述可变轻CDR序列中具有自约一处至约七处或约五处氨基酸替代。可通过亲和力成熟制备此类抗体变体。
本申请还涵盖结合HER2的亲和力成熟抗体。亲本抗体可以为人抗体或人源化抗体，例如包含分别为SEQIDNO：7和8的可变轻和/或可变重序列(即包含帕妥珠单抗的VL和/或VH)的。帕妥珠单抗的一种亲和力成熟变体优选以优于鼠2C4或帕妥珠单抗亲和力的亲和力(例如改善自约2或约4倍，至约100倍或约1000倍的亲和力，例如如使用HER2ECDELISA评估的)结合HER2受体。用于替代的例示性可变重CDR残基包括H28，H30，H34，H35，H64，H96，H99，或两个或更多个(例如这些残基中的2个，3个，4个，5个，6个，或7个)的组合。用于改变的可变轻CDR残基的例子包括L28，L50，L53，L56，L91，L92，L93，L94，L96，L97或两个或更多个的组合(例如这些残基中的2个至3个，4个，5个或直至约10个)。
涵盖各种形式的人源化抗体或亲和力成熟抗体。例如，人源化抗体或亲和力成熟抗体。或者，人源化抗体或亲和力成熟抗体可以为完整抗体，诸如完整IgG1抗体。
优选，HER2抗体(主要种类HER2抗体及其抗体变体任一或二者)为结合HER2的亚域II，比曲妥珠单抗更加有效地抑制HER二聚化，和/或结合HER2的异二聚体结合位点的。本文中主要种类抗体的优选实施方案为包含SEQIDNO：3和4中的可变轻和可变重氨基酸序列，且最优选包含SEQIDNO：11或15中的轻链氨基酸序列和SEQIDNO：12或16中的重链氨基酸序列的。
(ii)未配对半胱氨酸变体
本文中的实施例1和3描述帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体。用于分离，表征，和量化此类变体的分析性测定法包括特异性评估链内二硫键(不同于链间二硫键)的测定法，例如抗体片段(例如Fab片段)的疏水相互作用层析(HIC)分析(如实施例1中的)，完整抗体的HIC(如实施例1中的)，带不同标签的抗体的肽作图分析(如实施例3中的)，和/或反相高效液体层析(RP-HPLC)(如本文中的实施例3中的)，和Zhang等人，Anal.Chem.84(16)：7112-7123(2012)中的。
通常，帕妥珠单抗的优势形式在其两个Fab域的全部两个VL域中包含Cys23和Cys88之间的二硫键。见图6。
本文中的一种未配对半胱氨酸变体，异二聚体变体，在其两个Fab区中仅一个的可变轻(VL)域中缺乏Cys23/Cys88二硫键。见图20(b)。这测定为占优势的未配对半胱氨酸变体。
本文中的又一种未配对半胱氨酸变体，同二聚体变体，在其全部两个Fab区中缺乏Cys23/Cys88二硫键。见图20(c)。
在一个实施方案中，组合物中未配对半胱氨酸变体(包括同二聚体和异二聚体变体)的量为≤约25％，例如如通过Fab疏水相互作用层析(HIC)测定的。
在一个实施方案中，组合物中同二聚体变体的量为≤4.9％，如通过完整抗体的HIC测定的。
在一个实施方案中，组合物中异二聚体变体的量为自约13％至约18％，例如如通过完整抗体的HIC测定的。
组合物任选进一步包含一种或多种下文所述别的变体。
本发明还关注分离的帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸。此类分离的未配对半胱氨酸变体可包含异二聚体变体和/或同二聚体变体或由异二聚体变体和/或同二聚体变体组成。此类变体可使用HIC或其它纯化方法来分离的，且可进行生物学测定法，诸如效力测定法(使用HER2阳性乳腺癌细胞)，如下文实施例1中的。
(iii)无岩藻糖基化变体
本文中的实施例2和4描述帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体并演示如何基于组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗的百分比测定ADCC活性。
在一个实施方案中，本发明关注包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为大于组合物的2％。见例如下文表9中的anti2C4907-2和运行1。
在一个备选实施方案中，本发明关注包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中无岩藻糖基化变的量为组合物的自0.9至4.1％。例如，无岩藻糖基化变体的这种量可使用实施例4中经过验证的CE-LIF测定法来量化。
任选地，组合物进一步包含未配对半胱氨酸变体(先前部分中描述的异二聚体和/或同二聚体)和/或下文要描述的别的变体。
(iv)LMWS和HMWS
本发明进一步关注帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)和/或帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)，或是分离的形式或是在包含变体和主要种类抗体的组合物中。可使用多种技术来分离，表征，和量化LMWS和HMWS，包括但不限于大小排阻高效液体层析(SE-HPLC)和/或毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)。
使用SE-HPLC测定法(例如如实施例5中的)，组合物中主要种类帕妥珠单抗和HMWS或LMWS的量可以为：
主峰：≥约96％，例如≥约96.7％，≥约97.3％，例如≥约97.4％。
HMWS：≤约2％，例如≤约1.7％，例如≤约1.5％，例如≤约1.4％，例如≤约0.8％。
LMWS：≤约2％，例如≤约1.6％，例如≤约1.2％，例如≤约0.6％。
使用NR-CE-SDS测定法(例如如实施例5中的)，组合物中主要种类帕妥珠单抗和HMWS或LMWS的量可以为：
主峰：≥约95％，例如≥约96.0％，例如≥约97.8％。
HMWS：≤约1％，例如≤约0.6％。
LMWS：≤约4％，例如≤约3.4％。
例如，如通过CE-SDS测定的，主峰或主要种类帕妥珠单抗(排除LMWS和HMWS)的量可以为约95％至约99％，例如自约96.0％至约97.8％，例如自约95.3％至约97.3％主峰。
任选地，LMWS包含通过NR-CE-SDS(见例如实施例5)获得的“峰6”或由通过NR-CE-SDS(见例如实施例5)获得的“峰6”组成。此类峰6可测定为组合物的约0.9％至约2.3％，例如约2％至约2.3％。
(v)帕妥珠单抗的峰1和峰2片段
本发明进一步关注帕妥珠单抗的峰1片段和/或峰2片段，或是分开的或分离的形式，或是在包含片段和主要种类抗体的组合物中。可使用多种技术来分离，表征，和量化峰1和峰2，包括但不限于大小排阻高效液体层析(SE-HPLC)和/或毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)，包括R-CE-SDS和NR-CE-SDS。在一个实施方案中，通过R-CE-SDS来分开和/或分析峰1和峰2，例如如实施例5和6中描述的，而且校正峰面积(CPA)提供组合物中的％峰1或峰2。
使用R-CE-SDS测定法(例如如实施例5和6中的)，组合物中峰1的量为≤5％(例如自0.13％至0.41％CPA)且组合物中峰2的量为≤1.0％(例如自0.47％至0.74％CPA)。
(vi)别的变体
本文中的组合物任选包含帕妥珠单抗的别的变体，诸如美国专利7,560,111(Kao等人)和/或WO2009/099829(Harris等人)中记载的那些。
此类别的变体的例子包括但不限于下述任一项或多项：糖化变体，二硫化物还原变体，不可还原变体，脱酰胺变体，唾液酸化变体，VHS-变体，C末端赖氨酸变体，甲硫氨酸氧化变体，无岩藻糖基化变体，G1糖基化变体，G2糖基化变体，和非糖基化重链变体。
例如，组合物可包含酸性变体(见WO2009/099829，Harris等人)，其中组合物中的酸性变体可包括糖化变体，脱酰胺变体，二硫化物还原变体，唾液酸化变体，和不可还原变体中的一项，两项，三项，四项，或五项。优选，组合物中所有酸性变体的总量为小于约25％。在一个实施方案中，糖化变体，脱酰胺变体，二硫化物还原变体，唾液酸化变体，和不可还原变体占组合物中的酸性变体的至少约75-80％。
可通过各种方法来评估酸性变体，但优选的此类方法包括下述一项，两项，三项，四项，或五项：离子交换层析(IEC)，其中在IEC(例如用于评估唾液酸化变体)之前，之后，和/或期间用唾液酸酶处理组合物，还原CE-SDS(例如用于评估二硫化物还原变体)，非还原CE-SDS(例如用于评估不可还原变体)，硼酸盐层析(例如用于评估糖化变体)，和肽作图(例如用于评估脱酰胺变体)。
组合物任选包括氨基末端前导延伸变体。优选，氨基末端前导延伸在抗体变体的轻链上(例如在抗体变体的一条或两条轻链上)。本文中的抗体变体可在任一条或多条其重或轻链上包含氨基末端前导延伸。优选地，氨基末端前导延伸在抗体的一条或两条轻链上。氨基末端前导延伸优选包含VHS-或由VHS-组成(即VHS-变体)。可通过各种分析技术检测组合物中氨基末端前导延伸的存在，包括但不限于N末端序列分析，用于电荷异质性的测定法(例如阳离子交换层析或毛细管区带电泳)，质谱术，等。组合物中抗体变体的量通常范围为自构成用于检测变体的任何测定法(优选阳离子交换分析)的下检测限度的量至小于主要种类抗体的量的量。通常，组合物中约20％或更少(例如自约1％至约15％，例如自5％至约15％，和优选自约8％至约12％)的抗体分子包含氨基末端前导延伸。优选使用阳离子交换分析测定此类百分比量。
涵盖主要种类抗体和/或变体的别的氨基酸序列改变，包括但不限于在一条或全部两条其重链上包含C末端赖氨酸残基的抗体(此类抗体变体可以自约1％至约20％的量存在)，具有一个或多个氧化的甲硫氨酸残基的抗体(例如包含氧化的Met-254的帕妥珠单抗)，等。
此外，除上文讨论的无岩藻糖基化变体和唾液酸化变体之外，主要种类抗体或变体可包含别的糖基化变异，其非限制性例子包括包含附着于其Fc区的G1或G2寡糖结构的抗体，包含一条或两条非糖基化重链的抗体，等。
III.制造和分析方法
依照本发明的一个实施方案，提供用于评估帕妥珠单抗组合物的方法，其包括下述一项，两项，三项，或四项：(1)测量组合物中未配对半胱氨酸变体的量，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸，和/或(2)测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量，和/或(3)测量组合物中帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)的量，和/或(4)测量组合物中帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)的量。任选地，对包含帕妥珠单抗及其变体的组合物实施所有四种分析性测定法。
本发明还关注用于生成组合物的方法，其包括：(1)生成包含帕妥珠单抗及一种或多种其变体的组合物，并(2)对如此生成的组合物进行一种或多种分析性测定法以评估本文中的变体的量。分析性测定法可评估及量化下述任一项或多项的量：(i)在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体和/或(ii)在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的异二聚体变体和/或(iii)在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的同二聚体变体和/或(iv)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体和/或(v)帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)和/或(vi)帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)，和/或(vii)帕妥珠单抗的峰1片段和/或(viii)帕妥珠单抗的峰2片段。如此，可分析这些变体中的一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种或八种。
任选地，分析性测定法评估，量化，或分离未配对半胱氨酸变体，包括异二聚体和/或同二聚体变体。例如，分析性测定法可包括抗体片段(例如Fab片段)或完整抗体(见例如实施例1)的疏水相互作用层析(HIC)，肽作图分析(见例如实施例3)，或反相高效液体层析(HPLC)(见例如实施例3)。
在一个实施方案中，组合物中未配对半胱氨酸变体(异二聚体和/或同二聚体变体)的量为≤约25％，如通过Fab疏水相互作用层析(HIC)测定的。
在一个实施方案中，组合物中同二聚体变体的量为≤4.9％，如通过完整抗体的疏水相互作用层析(HIC)测定的。
在一个实施方案中，组合物中异二聚体变体的量为自约13％至约18％，如通过完整抗体的疏水相互作用层析(HIC)测定的。
任选地，分析性测定法评估，量化，或分离无岩藻糖基化变体。无岩藻糖基化的量可用于测定或量化组合物的生物学活性，例如ADCC。
另外，方法包括评估帕妥珠单抗组合物的生物学活性，其包括测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗变体的量以测定组合物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，并确认无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量在自约0.9％至约4.1％的范围中。例如，方法包括使用毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)测量无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量。
任选地，用于评估无岩藻糖基化的分析性测定法为毛细管电泳(CE)，包括毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)，见下文实施例2和4。无岩藻糖基化变体的量任选为组合物的自约0.9至约4.1％(例如如通过实施例4中的CE-LIF测量的)。在一个实施方案中，无岩藻糖基化变体的量为大于组合物的2％(例如如通过实施例4中的CE-LIF测量的)。
任选地，分析性测定法评估，量化，或分离帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)和/或高分子量种类(HMWS)。例示性测定法包括SE-HPLC和/或CE-SDS(见例如下文实施例5)。
在一个实施方案中，分析性测定法包括SE-HPLC(例如实施例5中的)，而且如此分析的组合物中主要种类帕妥珠单抗，HMWS或LMWS的量测定为：
主要峰：≥约96％，例如≥约96.7％，≥约97.3％，例如≥约97.4％。
HMWS：≤约2％，例如≤约1.7％，例如≤约1.5％，例如≤约1.4％，例如≤约0.8％。
LMWS：≤约2％，例如≤约1.6％，例如≤约1.2％，例如≤约0.6％。
在一个实施方案中，分析性测定法包括CE-SDS(例如实施例5中的)，而且如此分析的组合物中主要种类帕妥珠单抗和HMWS或LMWS帕妥珠单抗的量测定为：
主要峰：≥约95％，例如≥约96.0％，例如≥约97.8％。
HMWS：≤约1％，例如≤约0.6％。
LMWS：≤约4％，例如≤约3.4％。
在一个实施方案中，通过NR-CE-SDS评估组合物，而且发现主峰或主要种类帕妥珠单抗(排除LMWS和HMWS)的量为如此分析的组合物的自约95％至约99％，例如自约96.0％至约97.8％，例如自约95.3％至约97.3％。
在一个实施方案中，通过CE-SDS(见例如实施例5)评估组合物中“峰6”的量，而且峰6LMWS的量测定为如此分析的组合物的约0.9％至约2.3％，例如约2％至约2.3％。
在一个实施方案中，通过R-CE-SDS(见例如实施例5和6)评估组合物中峰1和/或峰2的量，而且峰1的量测定为≤5％(例如自0.13％至0.41％CPA)而且峰2的量测定为≤1.0％(例如自0.47％至0.74％CPA)。
方法任选进一步包括将纯化的组合物与一种或多种药学可接受赋形剂组合以生成药物组合物。另外，药物组合物可放置入容器中，与包装插页(例如印有指导其使用者使用药物组合物来治疗癌症的处方信息)一起包装以生成制品。
IV.药物组合物
通过混合具有期望纯度的组合物与任选的药学可接受赋形剂(Remington'sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编(1980))来制备包含帕妥珠单抗及其变体的药物组合物供贮藏，通常是冻干配制剂或水溶液的形式。还涵盖抗体晶体(参见美国专利申请2002/0136719)。药学可接受赋形剂在采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括：缓冲剂，诸如乙酸组氨酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
冻干抗体配制剂记载于每个专利No.6,267,958，美国专利No.6,685,940和美国专利No.6,821,515，通过援引明确收入本文。一种例示性曲妥珠单抗药物组合物是无菌的，白色至浅黄色的，不含防腐剂的冻干粉，用于静脉内(IV)施用，包含440mg曲妥珠单抗，400mgα,α-海藻糖二水合物，9.9mgL-组氨酸-HCl，6.4mgL-组氨酸，和1.8mg聚山梨酯20。20mL含有1.1％苄醇作为防腐剂的注射用抑菌水(BWFI)的重建产生含有21mg/mL曲妥珠单抗，处于pH大约6.0的多剂溶液。
一种用于治疗用途的例示性帕妥珠单抗药物组合物在20mM乙酸组氨酸，120mM蔗糖，0.02％聚山梨酯20，pH6.0中包含30mg/mL帕妥珠单抗。一种备选帕妥珠单抗配制剂包含25mg/mL帕妥珠单抗，10mM组氨酸-HCl缓冲剂，240mM蔗糖，0.02％聚山梨酯20，pH6.0。
要用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这通过穿过无菌滤膜过滤容易实现。
V.治疗性应用和用途
本文中的组合物可用于治疗癌症，诸如HER2阳性乳腺癌，例如转移性或局部复发性，不可切除乳腺癌，或从头IV期疾病，如免疫组织化学(IHC)3+和/或荧光原位杂交(FISH)扩增比≥2.0定义的。任选地，群体中的患者尚未接受在先处理或已经在辅助疗法后复发，基线时具有≥50％的左心室射血分数(LVEF)，和/或具有0或1的东部合作肿瘤学小组性能状态(EasternCooperativeOncologyGroupperformancestatus)(ECOGPS)。
在一个备选实施方案中，组合物可用于治疗早期HER2阳性乳腺癌，例如与曲妥珠单抗和化疗组合，其中化疗包含基于蒽环类抗生素的化疗或基于卡铂的化疗。在一个实施方案中，化疗包含基于蒽环类抗生素的化疗，例如包含5-FU，表柔比星，和环磷酰胺(FEC)。在一个备选实施方案中，化疗包含基于卡铂的化疗，例如包含紫杉烷(例如多西他赛)，卡铂加/曲妥珠单抗(例如TCH方案)。在一个实施方案中，组合物与基于蒽环类抗生素的化疗或基于卡铂的化疗并行施用，例如其中以3周周期施用帕妥珠单抗，曲妥珠单抗和化疗，在每个周期的第1天施用帕妥珠单抗，曲妥珠单抗和化疗。本文中涵盖的早期HER2阳性乳腺癌疗法包括新辅助和辅助疗法。
在还有另一个实施方案中，组合物可用于治疗HER2阳性胃癌，任选与曲妥珠单抗和化疗，诸如铂(例如顺铂)和/或氟嘧啶(例如卡培他滨和/或5-氟尿嘧啶(5-FU))组合。
在备选实施方案中，组合物可用于治疗HER2阳性乳腺癌，任选与曲妥珠单抗和长春瑞滨组合。依照这个实施方案的乳腺癌任选为转移性的或局部晚期的。任选地，患者先前没有在转移性设定中接受系统性非激素抗癌疗法。
在另一个方面，组合物用于治疗患者中的HER2阳性乳腺癌，包括对患者施用组合物，曲妥珠单抗，和芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑或来曲唑)。依照这个实施方案，乳腺癌为晚期乳腺癌，包括激素受体阳性乳腺癌，诸如雌激素受体(ER)阳性和/或孕酮受体(PgR)阳性乳腺癌。任选地，患者先前没有在转移性设定中接受系统性非激素抗癌疗法。这种治疗方法任选进一步包括对患者施用诱导化疗(例如包含紫杉烷)。
在另一个方面，组合物用于治疗低HER3癌症，诸如卵巢癌，原发性腹膜癌，或输卵管癌。参见例如美国专利7,981,418(Amler等人)和美国专利公开文本US-2006-0013819-A1(Kelsey，S.)。
依照已知方法对人患者施用抗体和化疗治疗。本文中的实施例中描述具体施用时间表和配制剂。
依照本发明的一个特定实施方案，施用大约840mg(加载剂量)帕妥珠单抗，接着是一剂或多剂大约420mg(维持剂量)帕妥珠单抗。优选约每3周施用维持剂量，总共至少2剂，直至临床进展性疾病，或不可管理的毒性，例如自6至20剂。还涵盖更长的治疗期，包括更多的治疗周期。
依照癌症为胃癌的另一个特定实施方案，对于所有治疗周期以840mg的剂量施用帕妥珠单抗。
VI.制品
本文中的制品的一个实施方案包含装有本文中的组合物或药物组合物的容器，诸如管形瓶，注射器，或静脉内(IV)袋。任选地，制品进一步包含印有描绘如何依照本文中的先前部分使用组合物的处方信息的包装插页。
VII.生物材料的保藏
下述杂交瘤细胞系已经保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209，USA)(ATCC)：
抗体名称ATCCNo.保藏日期
4D5ATCCCRL104631990年5月24日
2C4ATCCHB-126971999年4月8日
通过下述非限制性实施例例示本发明的更多详情。通过援引明确将说明书中的所有引文的公开内容收入本文中。
实施例1：帕妥珠单抗的Cys23/Cys88未配对半胱氨酸变体及其表征
帕妥珠单抗是一种基于人IgG1(κ)框架的人源化单克隆抗体(单抗)。该重组抗体是由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生成的，而且包含具有链间和链内二硫键的两条重链(每条449个氨基酸残基)和两条轻链(每条214个氨基酸残基)。图3A和3B中分别显示帕妥珠单抗的轻链和重链序列。完整帕妥珠单抗的计算分子量为145,197Da(仅肽链，不含重链C末端赖氨酸残基)。
每条重链的CH2域还具有一个在Asn299处的保守糖基化位点。
帕妥珠单抗与曲妥珠单抗()的不同在于轻链(12处氨基酸差异)和重链(29处氨基酸差异)的互补决定区(CDR)，和它结合人表皮生长因子受体2(p185HER2)上的不同表位的事实。帕妥珠单抗对人上皮细胞上的HER2受体的结合阻止HER2与HER受体家族的其它成员(包括EGFR，HER3，HER4)形成复合物和形成HER2同二聚体。通过阻断复合物形成，帕妥珠单抗抑制配体启动的细胞内信号传导，其经由两种主要信号途径，丝裂原活化的蛋白质(MAP)激酶和磷酸肌醇3激酶(PI3K)，分别导致对细胞增殖和存活的抑制。
这个实施例关注帕妥珠单抗的一种未配对半胱氨酸变体的鉴定和表征：在抗体的一条或全部两条轻链中包含未配对半胱氨酸的Cys23/Cys88未配对半胱氨酸变体。
使用Ellman氏试剂测量游离氢硫基，显示0.1-0.3摩尔每摩尔蛋白质的反应性游离氢硫基含量。疏水相互作用层析(HIC)分析和肽图分析揭示一条或全部两条轻链上的Cys23和Cys88处的未配对半胱氨酸残基。使用木瓜蛋白酶HIC，发现在使用商业制造工艺生成的帕妥珠单抗材料中含有这些位点处的游离氢硫基的Fab变体的水平为12.7％-13.5％。完整抗体的HIC分析指示两种主要形式为78％-85％野生型帕妥珠单抗和13.4％-18.4％帕妥珠单抗异二聚体(一个臂上的未配对半胱氨酸对)。
材料和方法
测试的组合物：这个实施例描述当前的帕妥珠单抗参照标准批次anti2C4907-2和运行1(代表III期临床材料)和五个III期/商业性批次(运行3-7)的表征，均是与以12,000升(L)规模使用商业性工艺生成的。还进行与先前的参照标准批次anti2C4-900-1(它是I/II期临床材料的代表)的比较。
测试的组合物为在20mM乙酸L-组氨酸，120mM蔗糖，和0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH6.0中以30mg/mL在商业配制剂中配制的原料药(drugsubstance)批次。早先在10mM盐酸L-组氨酸，240mM蔗糖，和0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH6.0中以25mg/mL在临床开发中配制批次anti2C4-900-1。
通过非还原肽图分析和质谱术进行的二硫键分析：为了在非还原条件下使帕妥珠单抗变性并烷基化任何埋藏的游离氢硫基基团，配制缓冲液中的大约0.5mg帕妥珠单抗与变性缓冲液(有8MGdHCl，10mMN-乙基马来酰亚胺(NEM)，0.1M乙酸钠，pH5.0组成)混合，然后于37℃温育3小时。使用NAP-5柱将溶液缓冲液交换入600μL0.1MTris，1mMCaCl2，pH7.0中。将乙腈(ACN)添加至每份样品以实现10％的浓度。以1:10(w/w)的酶对底物比于37℃进行胰蛋白酶消化16小时。使用下文为亚硫酸盐解胰蛋白酶图描述的方法通过RP-HPLC将所得肽分开。
亚硫酸盐解胰蛋白酶肽图：为了生成帕妥珠单抗肽图，还原和亚硫酸盐解半胱氨酸残基后用胰蛋白酶消化该蛋白质。将帕妥珠单抗的等分试样(1mg)添加至360mMTrisHClpH8.6，6M盐酸胍(GdHCl)，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，13mM亚硫酸钠，和38mM连四硫酸钠以还原和亚硫酸盐解半胱氨酸残基。将样品于37℃温育20分钟。将亚硫酸盐解样品加载到PD-10柱上，并用10mMTris，0.1mMCaCl2，pH8.3洗脱。缓冲液交换后，添加20μL10％辛基-B-葡萄糖苷溶液和20μL1mg/mL胰蛋白酶。将样品于37℃温育5小时。用25μL10％三氟乙酸(TFA)淬灭消化反应。使用Zorbax300SBC8柱(4.6mmx150mm)通过RP-HPLC将所得肽分开。于初始条件保持5分钟后，用线性梯度57分钟中自0％至17％溶剂B，于149分钟至32％溶剂B，于162分钟至45％溶剂B，并于173分钟至95％溶剂B将肽分开。在179分钟时，于100％溶剂A将柱再条件化25分钟，总运行时间204分钟。溶剂A由水中的0.1％TFA组成，而溶剂B由乙腈中的0.08％TFA组成。将柱维持于37℃，并以流速0.5mL/min洗脱。于214nm和280nm监测洗脱概况。使用LTQORBITRAPTM质谱仪通过分开的消化物混合物的液体层析质谱(LC-MS)分析测定胰蛋白酶肽的质量。
通过Ellman氏分析的游离氢硫基含量：将帕妥珠单抗样品缓冲液交换入反应缓冲液(100mM磷酸钾，1mMEDTA，8M脲，pH8)中，并调节至导致标准曲线范围内的游离硫醇浓度的浓度。在反应缓冲液中制备二硫代硝基苯(DTNB)的溶液(10mM)和半胱氨酸标准曲线(0和100μM之间的八个点)。在96孔板上，将165μL样品或标准品添加至一式三份孔。通过添加10μLDTNB，然后温育30分钟来启动反应。温育后，使用SPECTRAMAX读板仪于412nm测量吸光度。使用自标准曲线获得的线性方程计算游离硫醇的浓度。使用自分光光度计获得的于280nm的吸光度测定蛋白质的浓度。以摩尔游离硫醇每摩尔帕妥珠单抗报告游离硫醇。
木瓜蛋白酶HIC：对于木瓜蛋白酶消化的帕妥珠单抗样品，用羧肽酶B(CpB)去除C末端赖氨酸后用木瓜蛋白酶消化样品。使用PolyPropylAspartamide柱(4.6mmx100mm，3μm)通过HIC将Fab和Fc域分开。溶剂A由1.6M硫酸铵，20mM磷酸钾，pH6.05组成，而溶剂B由20mM磷酸钾，pH6.05组成。用梯度自3至6分钟自0％至18％溶剂B，于21分钟至24％溶剂B将分析物分开。将柱维持于25℃，流速0.8mL/min。于280nm监测洗脱概况。
完整抗体的HIC：使用PolyPropylAspartamide柱(9.4mmx100mm， 3μm)通过HIC将完整帕妥珠单抗样品分开。溶剂A由1.0M硫酸铵，20mM磷酸钾，pH6.05组成，而溶剂B由20mM磷酸钾，pH6.05组成。用12％溶剂B等度25分钟将分析物分开。将柱维持于30℃，流速2mL/min。于280nm监测洗脱概况。
SDS-PAGE及肽质量指纹：通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析还原和非还原帕妥珠单抗样品二者。通过在SDS-PAGE样品缓冲液存在下于60±2℃加热5-10分钟使样品(5μg)变性，非还原样品有碘乙酰胺。在80mM二硫苏糖醇(DTT)存在下于60℃±2℃使样品还原15-20分钟。在4％-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶中将变性样品分开，并用SYPROTMRuby染料染色以获得蛋白质条带样式。与帕妥珠单抗样品一起，凝胶上包括分子量标准品和SYPROTMRuby染料灵敏度标准品(2ng/道和8ng/道牛血清清蛋白(BSA))。
肽质量指纹是一种用于蛋白质鉴定的分析技术。对凝胶加载10μg商业性参照标准批次anti2C4907-2和运行5。将通过SDS-PAGE分开的所有条带通过胰蛋白酶切割成肽。用BRUKERTM基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱术(MALDI-TOFMS)精确测量各肽的绝对质量。使用肽质量列表通过搜索蛋白质序列来鉴定蛋白质。通过肽质量指纹鉴定非还原和还原帕妥珠单抗二者中所有观察到的条带。
通过生物测定法的效力：帕妥珠单抗效力方法通过测量帕妥珠单抗抑制人HER2表达性乳腺癌细胞系增殖的能力来评估它的效力。在一种典型测定法中，对96孔微量滴定板接种乳腺癌细胞并在增湿温箱中温育。温育后，去除培养基，并将不同浓度的帕妥珠单抗参照标准，测定法对照，和样品添加至板。然后将板温育，并使用氧化还原染料间接量化可存活细胞的相对数目。使用530nm的激发和590nm的发射测量荧光。在它的氧化状态是蓝色的且不发荧光，但是被细胞的细胞内环境还原成高度发荧光的粉色形式(Page等人，Int.J.Oncol.3：473-476(1993))。颜色和荧光的变化与可存活细胞的数目成正比。将以相对荧光单位(RFU)表述的结果针对帕妥珠单抗浓度作图，并使用平行线程序来评估帕妥珠单抗样品相对于参照标准的抗增殖活性。
结果
二硫键的指派：帕妥珠单抗中有32个半胱氨酸，形成16个二硫键，其中4个是链间，12个是链内连接。然而，由于该分子的多聚体性质，只有9个独特二硫键。用胰蛋白酶消化天然蛋白质以实现所有二硫化物连接肽的释放。图7中显示各帕妥珠单抗批次的层析概况。商业性参照标准批次anti2C4907-2的消化物的反相LC-MS分析产生所有预期二硫化物连接肽对(表2)。
表2：通过LC-MS鉴定的二硫化物连接的肽对
注意：等号(＝)代表二硫键。
H＝重链；L＝轻链；LC-MS＝高效液体层析质谱术；T＝胰蛋白酶肽。
a见图9和10。
b单同位素质量(MH+)。
c推断二硫化物。T19H二聚体指派不包括Cys228＝Cys228和Cys231＝Cys231二硫化物的验证。
d这种二硫化物连接对的存在已经经由使用不切割T19L和T20L的备选酶Lys-C得到确认。
通过鉴定来自二硫化物还原后肽对的预期肽进一步确认鉴定的肽(图8及图9和10中的扩展视图)。重链肽T19H的二聚体(T19H＝T19H)鉴定为含有两个二硫键；推断出Cys228＝Cys228和Cys231＝Cys231对的鉴定。通过LC-MS检测到一个二硫化物对，T18H＝T20L，但是接近空隙体积洗脱，而且在紫外线(UV)层析图上不能作为独特峰鉴定。这个二硫化物对的存在得到Lys-C消化物的LC-MS分析的进一步确认，其中观察到肽T18H＝T19L-T20L。没有找到意料之外的连接。一个二硫键是部分未配对的，如下文讨论的。
游离氢硫基分析：正确折叠的帕妥珠单抗中的所有半胱氨酸残基应当参与二硫键。使用Ellman氏测定法(Ellman，G.，Arch.Biochem.Biophys.82：70-77(1959))(一种用于测量肽和蛋白质的游离氢硫基含量的方法)来测定帕妥珠单抗中是否存在反应性未修饰(游离)硫醇。对所有材料评估游离硫醇(未配对半胱氨酸残基)含量，表3中汇总结果。
表3：游离硫醇含量，通过Ellman氏测定法
批次名称 摩尔游离硫醇每摩尔帕妥珠单抗
anti2C4-900-1 0.06
anti2C4907-2 0.15
运行1 0.28
运行3 0.16
运行4 0.17
运行5 0.16
运行6 0.16
运行7 0.14
注意：在8M脲存在下通过Ellman氏测定法测定游离硫醇水平。
在分析的所有批次中均观察到大约0.1-0.3摩尔游离硫醇每摩尔帕妥珠单抗。在8M脲缺失下，在测试的所有材料中游离硫醇水平低于量化限度(QL；大约0.1摩尔游离硫醇每摩尔蛋白质)，指示在非变性条件下帕妥珠单抗分子中存在的游离硫醇(即未配对半胱氨酸)是埋藏的，Ellman氏试剂不可及的。
CpB和木瓜蛋白酶消化后通过HIC的帕妥珠单抗材料的分析揭示Fc和Fab峰之间一个另外峰，其鉴定为含有Cys23和Cys88处的未配对半胱氨酸残基的Fab变体(图11和12，标记为游离硫醇Fab)。此鉴定通过LC-MS胰蛋白酶肽作图得到确认，其中在NEM存在下对样品进行变性，之后进行还原和胰蛋白酶消化。在各帕妥珠单抗批次间测量使用木瓜蛋白酶HIC方法的游离硫醇Fab变体的程度，发现与使用当前的工艺是一致的(表4)。
表4：Cys23/Cys88未配对半胱氨酸Fab变体的相对量，如通过木瓜蛋白酶HIC测定或计算完整抗体变体
注意：通过未配对半胱氨酸Fab峰面积除以未配对半胱氨酸Fab+Fab的峰面积获得百分比未配对半胱氨酸Fab峰。
*如下文所述计算。
通过木瓜蛋白酶HIC测定法，使用商业性工艺生成的材料的值范围为自12.7％至13.5％，而参照标准批次2C4-900-1(I/II期)的值略微较低，为9.4％。
来自木瓜蛋白酶HIC的％Fab变体转换成估算％完整抗体变体：含有未配对半胱氨酸的Fab片段的相对量可用于计算异二聚体或同二聚体形式的未配对半胱氨酸变体的相对分布。如果木瓜蛋白酶HIC测定法显示10％(或x％)来自帕妥珠单抗的Fab片段含有Cys23/Cys88处的未配对半胱氨酸，那么应当自每50个帕妥珠单抗分子释放10个含有未配对半胱氨酸的Fab片段，因为木瓜蛋白酶消化50个抗体应当产生100个Fab片段。假设这10个Fab片段来自10个不同帕妥珠单抗分子，那么含有一个具有Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的Fab的帕妥珠单抗的相对量为大约20％，即50个帕妥珠单抗分子中的10个(或2x％)。更精确地，如果考虑具有两个含有Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的Fab的帕妥珠单抗的可能性，那么帕妥珠单抗异二聚体未配对半胱氨酸变体的相对量应当为2×10％×90％＝18％(或2×x％×[100-x]％)。另外，同二聚体未配对半胱氨酸变体帕妥珠单抗的相对量应当处于10％×10％＝1％(或x％×x％)。在这种情况中，含有2个任一Fab上没有未配对半胱氨酸的Fab的帕妥珠单抗的相对量应当处于90％×90％＝81％(或[100-x]％×[100-x]％)。
另外，可通过HIC直接量化野生型同二聚体(无未配对半胱氨酸)和异二聚体(一个Fab上有未配对半胱氨酸)。完整抗体的HIC将帕妥珠单抗分开成两个主峰(图13)，它们通过LC-MS胰蛋白酶肽作图鉴定为野生型同二聚体(无游离硫醇)和异二聚体(一个Fab上有游离硫醇对)。还收集次要前肩峰，并通过木瓜蛋白酶HIC表征为主要是同二聚体(全部两个Fab上的游离硫醇对，大约40％)和具有Fc氧化的帕妥珠单抗。使用完整抗体的HIC，对于使用当前工艺生成的材料，帕妥珠单抗估算含有大约17％-18％异二聚体，而使用I/II期工艺的为13％(表5)。不受任一理论束缚，有可能的是通过商业性工艺生成的未配对半胱氨酸变体的量升高(相对于I/II期工艺)可源自蛋白质(即VL域)折叠速率比硫醇氧化(二硫化物形成)速率更快发生，如此在变体中诱捕游离半胱氨酸。
表5：完整未配对半胱氨酸变体的相对量，如通过完整帕妥珠单抗的HIC测定的。
注意：通过各个峰面积除以所有三个峰的总峰面积获得百分比相对峰。
既然通过HIC观察到帕妥珠单抗的轻链上的Cys23/Cys88处的一对未配对半胱氨酸，那么在抗增殖测定法测试未配对半胱氨酸变体每种的纯化级分。纯化含有未配对半胱氨酸的Fab，并估算具有降低的效力(估算效力为相对于天然Fab的～50％)(表6)。
表6：未配对半胱氨酸Fab变体的抗增殖
帕妥珠单抗样品和条件 均值％活性(n＝2) ％差异
天然Fab 100 N/A
未配对半胱氨酸-Fab 50a 67
注意：相对于天然Fab报告百分比活性。
a估算效力值。剂量响应曲线是不平行的，而且较低的平台没有会聚。
另外，通过HIC分离出三种完整形式(野生型同二聚体，含有游离硫醇的异二聚体，和含有未配对半胱氨酸的同二聚体)并用抗增殖效力测定法测试。见表7。
表7：全长帕妥珠单抗未配对半胱氨酸变体级分的抗增殖活性
注意：相对于帕妥珠单抗参照标准(批次anti2C4907-2)报告百分比活性。
a该级分含有大约40％含有未配对半胱氨酸的同二聚体和60％异二聚体或野生型同二聚体混合物。
这些数据证明以商业性规模制造的组合物中存在帕妥珠单抗的一种未配对半胱氨酸变体。这个实施例中的HIC方法(评估Fab片段或完整抗体)或下文实施例3中的肽作图是可用于评估帕妥珠单抗组合物中未配对半胱氨酸变体的存在和数量的测定法。
实施例2：无岩藻糖基化帕妥珠单抗组合物及其表征
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞介导的免疫的一个方面，效应器细胞通过它积极裂解已经结合抗原特异性抗体的靶细胞。帕妥珠单抗在用HER23+细胞测试时展现ADCC活性，但是用HER21+细胞观察到很少的活性(图14)。
使用毛细管电泳测量帕妥珠单抗I期和III期参照标准中无岩藻糖基化的水平。与具有较低G0-F(0.8％)的I期参照标准相比，帕妥珠单抗III期参照标准中较高水平的无岩藻糖基化材料(G0-F＝2.2％)与观察到的较高的ADCC活性相关(图15)。还制备并测试一种酶促脱糖基化帕妥珠单抗，显示无对FcγRIIIa的结合和无ADCC活性(表8)。
表8：脱糖基化帕妥珠单抗的生物学活性
注意：相对于帕妥珠单抗参照标准(批次anti2C4907-2)报告百分比活性。
ADCC＝抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
这些数据显示测量G0-F(无岩藻糖基化)帕妥珠单抗是一种用于量化帕妥珠单抗的ADCC活性的有效手段。量化无岩藻糖基化的实验如下。
通过毛细管电泳(CE)进行的寡糖分析：使用蛋白A固相提取亲和尖(PHYTIPSTM)和一种自动化液体操作系统纯化帕妥珠单抗样品(250-500μg)。使用12mM盐酸，pH2.0自蛋白A树脂洗脱帕妥珠单抗样品，并使用10μL50mM琥珀酸钠中和。将所得样品与2.5U/mLPNGaseF一起于37℃温育15小时。通过将溶液于95℃加热5分钟来沉淀蛋白质，并通过离心去除。将含有释放的寡糖的上清液溶液真空干燥。将释放的聚糖用含有氰基硼氢钠的15％乙酸溶液中的8-氨基芘-1,2,6-三磺酸(APTS)于55℃衍生化2小时。使用氩离子激光(488nm激发，520nm发射)和N-CHO包被的毛细管(50μmx50cm)，用配备有荧光检测模块的毛细管电泳(CE)系统实施对衍生化的聚糖的分析。运行缓冲液为40mMε-氨基-n-己酸/乙酸，pH4.5，0.2％羟丙基甲基纤维素(HPMC)。通过0.5psi的压力将样品注射入毛细管中。于20kV实施分开，并将毛细管温度维持于20℃。
帕妥珠单抗在该分子的Fc部分的CH2域中在Asn299处含有N-连接的寡糖位点。用PNGaseF处理并用APTS标记后，使用CE对每个批次测定在这个位点处发现的中性寡糖的相对分布。
图16中显示来自释放的，衍生化的寡糖的CE分析的电泳图，图17中是扩展视图概况。表9中对分析的材料汇总帕妥珠单抗中寡糖的相对量。
表9：帕妥珠单抗中寡糖结构的分布(百分比峰面积)
批次名称 G0-F G0-GlcNAc Man5 G0 G1a G2
anti2C4-900-1 0.8 2.7 1.2 72.1 20.4 2.0
anti2C4907-2 2.2 0.8 0.3 63.6 27.6 3.0
运行1 2.5 1.6 0.2 62.4 29.1 3.4
运行3 1.7 1.2 0.3 70.3 23.4 2.2
运行4 1.8 1.8 0.3 75.4 18.3 1.4
运行5 1.4 1.0 0.4 71.8 22.4 2.1
运行6 1.1 1.0 0.2 73.3 21.3 1.9
运行7 1.2 0.8 0.2 69.7 24.5 2.5
注意：由于舍入，加起来的总％可能不是正好100％。另外，总百分比峰面积中可能已经包括次要种类(<0.5％)，但是这个表中没有报告。
a两种G1异构体的和(见图17)。
具有G0结构的寡糖是所有材料中占优势的种类(62％-75％)。与当前的参照标准批次anti2C4907-2和运行1(62％-64％)相比，G0糖型在运行3-7和先前的参照标准批次2C4-900-1中略微更加丰富(70％-75％)。作为两个峰观察到G1糖型，对应于末端半乳糖在双触角结构的任一分支上的两种异构体。组合这两个峰的面积以确定G1糖型的相对量。对于所有材料，G1和G2糖型分别占释放的寡糖的大约18％-29％和1％-3％。在电泳图中还观察到自其它寡糖结构产生的峰(均以3％或更少存在)。这些结构包括G0-F(缺乏核心岩藻糖的G0)，G0-GlcNAc(缺乏一个GlcNAc的G0)，Man5，和其它次要糖型(Ma和Nashabeh，Anal.Chem.71：5185-92(1999))。帕妥珠单抗上的寡糖结构与在CHO衍生单抗(Ma和Nashabeh，同上)和天然发生人免疫球蛋白(Flynn等人，Mol.Immunol.47：2074-82(2010))中找到的那些一致。
实施例3：用于评估未配对半胱氨酸变体的肽作图和RP-HPLC
材料：实验中使用的材料和装置包括：3-[N-吗啉代]丙磺酸(MOPS；Sigma-Aldrich)，N-乙基马来酰亚胺(d0-NEM；ThermoScientific，Rockford，Il)，N-乙基马来酰亚胺(d5-NEM；CambridgeIsotopeLaboratories，Andover，MA)，L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich)，胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)，三氟乙酸(TFA；Fisher，FairLawn，NJ)，乙腈(ACN，Burdick&Jackson，Muskegon，MI)。不经进一步纯化，以收到的那样使用所有化学品和试剂。
抗体的差异N-乙基马来酰亚胺(NEM)标记：差异NEM标记方法容许抗体中早就存在的游离硫醇用d0-NEM标记且剩余二硫桥用d5-NEM还原和标记。对于初始d0-NEM标记，将100μL抗体(3mg/mL)与400μL含有6.25mMd0-NEM的变性缓冲液(7.5MGdnHCl，pH5)温和混合并于37℃温育2小时。将20μL半胱氨酸(125mM)添加至样品并于37℃温育15分钟以灭活剩余d0-NEM。为了还原抗体中的剩余二硫桥，将10μLTCEP(0.5M)添加至样品并于37℃温育30分钟。然后将70μLd5-NEM(171mM)添加至样品并于37℃温育2小时以标记通过还原二硫桥产生的游离硫醇。使用NAP-5柱对0.5mL差异NEM标记样品进行缓冲液交换，并用0.6mLMOPS缓冲液(20mMMOPS，0.5mMTCEP，pH7)洗脱。
抗体的肽图分析：将差异NEM标记样品用胰蛋白酶以1:50(w/w)胰蛋白酶:抗体比于37℃消化2小时。用10％TFA淬灭消化。使用Agilent1200HPLC系统(Agilent，PaloAlto，CA)将胰蛋白酶消化的差异NEM标记样品分开。采用孔径的JupiterC18柱(250x2mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)进行样品的层析分开。注射体积为95μL，且柱温度为55℃。流动相A为水中的0.1％TFA且流动相B为90％ACN(v/v)中的0.08％TFA。初始条件设置于100％流动相A并保持样品注射后的头3分钟。流动相B在接下来的20分钟里提高至10％，然后进一步提高至40％直至160分钟和100％直至162分钟，均在线性梯度上。流动相B保持于100％直至170分钟。将柱以100％流动相A再平衡直至195分钟。流速保持于0.28mL/min。
将来自HPLC的流出液直接连接至以阳离子模式运转的LTQORBITRAPTM质谱仪的电喷射离子化源。喷射电压为4.5kV，且毛细管温度为300℃。以数据依赖性方式运转质谱仪，从而在MS和MS/MS模式之间自动转换。在分辨率设置为m/z400处R＝60,000的FT-Orbitrap中自m/z300至m/z2000获取调查全扫描MS谱。以35％的标准化碰撞能量及30ms的活化时间和2.5m/z单位的分离宽度使用碰撞诱导解离(CID)在线性离子阱中将五个最强的离子片段化。启用动态排除(DE)功能以减少数据冗余和容许选择低强度离子进行数据依赖性MS/MS扫描。动态排除参数如下：重复持续时间为30秒，排除表大小为500，排除持续时间为90秒，低排除质量宽度为0.76，高排除质量宽度为1.56，和重复计数为2。使用XCALIBURTM软件实施数据分析。
使用上文所述方法分析当前的帕妥珠单抗参照标准批次anti2C4907-2。发现10.9％的T2L肽(通过胰蛋白酶消化生成且含有Cys23)和8.3％的T7L肽s(通过胰蛋白酶消化生成且含有Cys88)标记有d0-NEM。因为在这个实验中只有未配对半胱氨酸标记有d0-NEM，所以这些结果提示anti2C4907-2中大约10％的Cys23和Cys88不是通过二硫键连接的(即10％未配对半胱氨酸变体)。使用一种与上文所述相似的计算方法将百分比未配对半胱氨酸Fab变体转换成百分比未配对半胱氨酸完整变体，估算出anti2C4907-2中18％的帕妥珠单抗分子是异二聚体未配对半胱氨酸变体，1％的帕妥珠单抗分子是同二聚体未配对半胱氨酸变体，而81％是野生型同二聚体形式(无未配对半胱氨酸)。这些结果与来自Fab片段或完整帕妥珠单抗任一的HIC分析的结果大体一致。
有限内切蛋白酶Lys-C消化生成Fab：经由有限Lys-C消化规程生成MAbA的Fab片段。简言之，将MAbA(1mg/ml)与Lys-C酶以1:400比在100mMTris，pH7.6中混合，然后将混合物于37℃温育30分钟。用pH5.5，350mM乙酸钠和8M盐酸胍中的NEM标记反应混合物。用下文所述RP-HPLC方法分析消化物。
RP-HPLC条件：在配备有二元梯度泵，自动取样器，温度控制柱隔室，和二极管阵列检测仪的AGILENT1200TMHPLC系统(PaloAlto，CA，USA)上实施RP-HPLC分析。该系统包括以75℃和1ml/min运行的Pursuit3联苯反相柱(150x4.6mm，3μm，Varian，LakeForest，CA，USA)。使用280nm处的吸光度监测分开。流动相由水中的0.1％TFA(流动相A)和ACN中的0.09％TFA(流动相B)组成。38分钟方法始于自32％至36％流动相B的3分钟梯度，接着是至42％流动相B的18分钟线性梯度。将柱以95％流动相B清洗5分钟并以32％流动相B平衡10分钟。
通过有限Lys-C消化生成的游离硫醇Fab的RP-HPLC分析(图18)指示游离硫醇Fab为13％左右，与实施例1中的HIC一致。NEM标记的游离硫醇Fab变得更加疏水，因此与游离硫醇Fab相比更晚洗脱(图18)且进一步确认游离硫醇的存在。还可见图19，其中肽作图确认游离硫醇Fab。
实施例4：通过CE-LIF进行的无岩藻糖基化量化
这个实施例描述经过完全验证的用于量化无岩藻糖基化帕妥珠单抗变体的毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)测定法。对上文实施例2中公开的方法的修饰包括：无机器人样品制备，无蛋白A纯化步骤(确保样品间一致的蛋白质浓度)，和电泳参数(缓冲剂赋形剂浓度)的变化。
在该测定法中，将帕妥珠单抗样品使用配制缓冲液稀释至10mg/mL，并缓冲液交换入肽-N-聚糖酶F(PNGaseF)消化物缓冲液中。然后用PNGaseF酶促释放天冬酰胺连接的寡糖。随后用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)(一种带负电荷的荧光团)衍生化释放的聚糖。APTS给所有聚糖提供三个负电荷，这容许它们进行快速电泳分析。使用经过包被的毛细管(这降低电渗流)通过CE分析含有过量衍生化试剂和APTS聚糖缀合物的混合物。以激发波长488nm和发射带通滤光器520nm使用氩离子激光用激光诱导荧光系统监测分开。
使用该测定法，图21中显示相关图(correlationplot)。使用该相关图(％ADCC＝30.133+12.439x，其中x＝％G0-F)和ADCC范围40-135％，帕妥珠单抗的最终规格对应于0.9-4.1％G0-F。
如此，使用这种经过验证的CE-LIF测定法，有可能评估帕妥珠单抗组合物以确认就ADCC而言的生物学活性在期望范围内(40-135％ADCC活性＝0.9-4.1％G0-F)。
实施例5：帕妥珠单抗高分子量种类(HMWS)，低分子量种类(LMWS)及其表征
通过SE-HPLC和CE-SDS分析帕妥珠单抗以测定高分子量种类(HMWS)(通常是二聚体)和低分子量种类(LMWS)的量。HMWS在稀释后没有差异，提示聚集体是不可解离的。分析性超速离心(AUC)和SE-HPLC结果之间就HMWS量化而言有较好的一致性，显示没有大小排阻层析遗漏或低估主要HMWS的证据。
材料和方法
测试的帕妥珠单抗组合物：这个实施例描述当前的帕妥珠单抗参照标准批次anti2C4907-2和运行1(代表III期临床材料)和五个III期/商业性批次(运行3-7)的表征，均是以12,000升(L)规模使用商业性工艺生成的。
分离的HMWS：为了制备代表性的HMWS用于生物学表征，将来自运行3的一个帕妥珠单抗批次注射到制备性HPLC系统上，其使用制备性SE-HPLC柱(TSKG3000SW，21.5mmx600mm)和4.5mL/min的与上文所述相同的等度流动相。对高分子量种类进行级分收集，随后缓冲液交换入配制缓冲液中。HMWS通过随后的SE-HPLC分析显示是70％纯的，其余主要是主峰。还收集主峰，显示是100％纯的。
分离的LMWS：为了制备分离的LMWS，如上，用木瓜蛋白酶消化来自运行3的一个批次号，并使用制备性HPLC进行级分收集。占优势的形式通过完整ESI-MS分析验证是Fc和Fab。LMWS通过随后的分析性SE-HPLC显示是99％纯的。还使用木瓜蛋白酶处理制备分离的Fab变体，并通过制备性IE-HPLC收集。Fab变体通过随后的分析性SE-HPLC显示是100％纯的。
SE-HPLC：用流动相(0.2M磷酸钾，pH6.2，0.25M氯化钠)将帕妥珠单抗的等分试样稀释至10mg/mL。在等度洗脱的TSKG3000SWXL柱(7.8mmx300mm)上将样品分开。流速为0.5mL/min，且柱温为环境温度。于280nm监测洗脱概况。为了通过多角度光散射(MALS)进行的检测，顺序使用与WYATTDAWNHELEOTMMALS检测仪(使用658nm激光，17台检测器)和WYATTOPTILABTMRex折射率检测仪在线连接的两个柱将帕妥珠单抗样品分开。
CE-SDS：用5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚氨基酯(一种荧光染料)衍生化每个帕妥珠单抗批次。使用NAP-5柱去除游离染料后，通过添加40mM碘乙酰胺并于70℃加热5分钟来制备非还原样品。为了分析还原样品，将衍生化帕妥珠单抗与十二烷基硫酸钠(SDS)和1MDTT混合至终浓度1％SDS(v/v)。然后将样品于70℃加热20分钟。在使用50μm内径x31.2cm熔融石英毛细管的CE系统上分析制备的样品，贯穿分析维持于20℃。通过10kV40秒电动注射将样品导入毛细管中。以反极性(阴性至阳性)模式以恒定电压15kV进行分开，使用CE-SDS运行缓冲液作为筛分介质。使用于488nm运转的氩离子激光进行荧光激发，于560nm监测所得发射信号。
结果和讨论
SE-HPLC提供关于天然蛋白质的分子大小分布的定量信息。图25中显示各帕妥珠单抗批次的SE-HPLC概况，而图26中显示各概况的扩展视图。表10中列出大小排阻峰的相对峰面积分布。
表10：帕妥珠单抗的相对大小分布，通过大小排阻层析
注意：由于舍入，加起来的总百分比可能不是正好100％。
HMWS＝高分子量种类；LMWS＝低分子量种类。
a自参照标准anti2C4907-2获得的值。
对于所有材料，在主峰中洗脱的帕妥珠单抗的比例超过99％。高分子量种类(HMWS)的量范围为自0.1％至0.2％，而低分子量种类(LMWS)为≤0.1％。所有批次展示相似的层析概况。纯化的HMWS级分(包括二聚体和更高聚集体)显示具有相对于参照标准批次anti2C4907-2的46％效力。
对保持于30℃的未掺水和稀释的样品二者实施SE-HPLC以对帕妥珠单抗HMWS检查可能源自稀释和/或延长暴露于升高的室温的快和慢解离聚集体二者。在稀释和/或加热的参照标准批次anti2C4907-2中没有看到HMWS含量与对照相比的减少。
对参照标准批次anti2C4907-2实施的SE-HPLC分开组合MALS确认SE-HPLC主峰是单体，分子量大约150kDa。
使用沉降速度模式中的AUC来表征帕妥珠单抗样品中存在的HMWS。沉降速度是一种不依赖于大小排阻层析，在固体柱基质缺失下测量样品中HMWS的水平的技术。对具有渐增水平的HMWS的帕妥珠单抗样品实施AUC以确定SE-HPLC是否能够一致的检测所有主要帕妥珠单抗HMWS，这通过将通过沉降速度测定的聚集体的水平和种类与通过SE-HPLC测定的那些比较来进行。通过沉降速度表征范围为自0.2％至7.2％总HMWS(通过SE-HPLC测定)的五份样品，在表11和图27中标记为A-E。
这些样品由一份代表性帕妥珠单抗成品药批次(标记为A)和四份HMWS富集的样品组成。选择HMWS富集的样品代表多种降解机制(暴露于光，暴露于酸性pH，和纯化的IE-HPLC碱性变体)。
SE-HPLC对样品A，B，C和E显示一个HMWS主峰，而对样品D显示两个HMWS峰(图27)。对于样品A，B，C和E，AUC显示仅一个沉降系数为约9.1S的HMWS峰。在样品D中，AUC显示两个沉降系数为约9.1S和10.8S的HMWS峰。通过AUC检测的HMWS与SE-HPLC结果一致；两种方法均在样品D中显示一种主要降解产物，较小水平的更大HMWS。
表11中呈现这些样品来自两种方法的定量结果的比较。
表11：AUC和SE-HPLC结果的比较
注意1：样品A由一个代表性帕妥珠单抗成品药批次组成，样品B由以1.2毫勒克斯小时进行光暴露的一个帕妥珠单抗批次组成，样品C由以3.6毫勒克斯小时进行光暴露的一个帕妥珠单抗批次组成，样品D由于pH3.2进行酸处理的一个帕妥珠单抗批次组成，而样品E由来自IE-HPLC的纯化的碱性变体组成。
注意2：相应的SE-HPLC层析图见图27。
AUC＝分析性超速离心；HMWS＝高分子量种类；RSD＝相对标准偏差；SE-HPLC＝大小排阻高效液体层析。
a样品A和B具有低于AUC技术的量化限度的HMWS水平。
对于样品C，D，和E，通过两种技术测量的百分比HMWS有较好的一致性。样品A和B中存在的低水平的HMWS阻止通过具有3.7％的估算量化限度的AUC(Gabrielson和Arthur，Methods54：83-91(2011))对该种类的精确量化。SE-HPLC和AUC之间百分比HMWS的表观分歧反映这一点(表11)。在一系列HMWS水平之间评估相关性。相关系数(Lin，L.，Biometrics45：255-68(1989))计算为0.97(n＝5)，指示AUC和SE-HPLC之间对于HMWS量化较好的一致性(图28)。
这些结果确认SE-HPLC在对帕妥珠单抗测量HMWS方面是稳健的。
SE-HPLC能够检测和通过AUC精确量化观察到的所有HMWS种类。
通过SE-HPLC，SDS-PAGE，和CE-SDS分析的基于大小的异质性在各批次间是一致的。SE-HPLC测定法对测试的所有批次显示相似水平的HMWS(0.1％-0.2％)和LMWS(0.0％-0.1％)。通过SDS-PAGE分析对还原和非还原样品产生的条带样式是一致的，就像通过CE-SDS生成的电泳概况。
在一个实施方案中，通过SE-HPLC评估的主要种类帕妥珠单抗和HMWS变体和LMWS变体的量如下：
≥96％主峰，例如≥96.7％主峰，例如≥97.3％主峰，例如≥97.4％主峰。
≤2％HMWS，例如≤1.7％HMWS，例如≤1.5％HMWS，例如≤1.4％HMWS，例如≤0.8％HMWS。
≤2％LMWS，例如≤1.6％LMWS，例如≤1.2％LMWS，例如≤0.6％LMWS。
通过SE-HPLC纯化的帕妥珠单抗HMWS和LMWS级分均展现与主峰和有完全效力的对照相比降低的抗增殖活性。除显示更低FcRn结合的LMWS外，所有大小变体显示与对照相比相当的HER2结合活性和FcRn结合活性。
既然LMWS样品含有2/3Fab片段和1/3Fc片段，那么预期较低的抗增殖和FcRn结合活性。HMWS显示较高的FcγRIIIa(CD16)V158结合活性，但是较低的ADCC活性。LMWS显示较低的FcγRIIIa(CD16)V158结合活性，而且对这种变体没有观察到ADCC活性(表12)。
表12：帕妥珠单抗主峰，HMWS，和LMWS的生物学活性
注意：相对于帕妥珠单抗参照标准(批次anti2C4907-2)报告的百分比活性。ADCC＝抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；HMWS＝高分子量种类；LMWS＝低分子量种类。
aLMWS样品由2/3Fab和1/3Fc片段组成。显示的值反映基于分子量(Fab＝47644Da，Fc＝52800Da，和全长抗体＝148088Da)的nM/nM调整。
b帕妥珠单抗参照标准(批次anti2C4907-2)具有2.2％的G0-F水平，而对照样品具有1.7％的G0-F。结果尚未校正无岩藻糖基化材料水平的差异。
毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)：CE-SDS及激光诱导荧光(LIF)检测分析是一种高灵敏度测定法，提供在变性条件下定量评估蛋白质的分子大小分布的手段。在非还原样品的CE-SDS分析(图29)中，帕妥珠单抗像由96％-98％总峰面积组成的主要峰及代表LMWS和HMWS的次要峰一样迁移。对于测试的所有材料，通过这种技术测定的HMWS的量为0.6％。其余种类像LMWS一样迁移，如图30(扩展视图)中显示的。样品加热诱导的片段化随烷基化而最小化(SalasSolano等人，Anal.Chem.78：6583-6594(2006))。表13中列出通过CE-SDS分开的种类的相对分布。
表13：非还原帕妥珠单抗的相对分布，通过CE-SDS(百分比峰面积)
注意：由于舍入，加起来的总％可能不是正好100％。
CE-SDS＝毛细管电泳十二烷基硫酸钠；HMWS＝高分子量种类。
观察到一种轻微差异，其中峰6自参照标准批次anti2C4-900-1(I/II期工艺)中的0.9％升高至参照标准批次anti2C4907-2，运行1，和运行3-7的1.7％-2.3％。
在一个实施方案中，通过NR-CE-SDS分开或分离的帕妥珠单抗主峰(排除LMWS和HMWS)为自约95％至约99％，例如自约96.0％至约97.8％。任选地，HMWS的量为≤1％，例如≤0.6％，而LMWS的量为≤4％，例如≤3.4％，如通过CE-SDS分开或分离的。
实施例6：帕妥珠单抗片段化的检测和量化
这个实施例的目的是为帕妥珠单抗片段的检测评估大小排阻层析(SE-HPLC)，还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(R-CE-SDS)，和非还原CE-SDS(NR-CE-SDS)方法。
材料和方法
下文汇总这项研究中评估的样品。这些包括已经进行可能导致片段化升高的各种加压条件的帕妥珠单抗样品。
·参照标准(2C4907-2)
·热加压(42天，40℃)
·酸处理(pH3.2，1天，40℃)
·加速稳定性(30天，40℃，然后贮藏于大约5℃)
·实时成品药(DP)稳定性(T＝0和T＝548天且贮藏于大约5℃)和相应原料药(DS)
以下述可报告值如上文实施例5所述进行SE-HPLC：LMWS，主峰，HMWS，和所有其它超出量化限度(LOQ)的显著峰。
以下述可报告值依照上文实施例5进行还原CE-SDS(R-CE-SDS)：峰1，LC，峰2，峰3，NGHC，HC，峰5，不完全还原，和其它超出LOQ的显著峰。
如上文实施例5所述进行非还原CE-SDS(NR-CE-CDS)，其中通过自SDS络合步骤消除二硫苏糖醇(DTT)，样品制备排除抗体还原步骤以容许非还原分析。
图31A-B，图32A-B，和图33A-B分别为，以及表14，15，和16中分别呈现通过SE-HPLC，NR-CE-SDS，和R-CE-SDS获得的定性结果。
峰鉴定基于Hunt&Nashabeh，AnalyticalChemistry71：2390-2397(1999)；和Ma&Nashabeh，ChromatographiaSupplement53：S75-S89(2001)。对于NR-CE-SDS分析，通常包括峰2之后的一个小峰，在数据报告期间作为峰2的一部分。对于这项研究，作为峰2a分开报告这个小峰以区别该片段与轻链(LC)。
表14：SE-HPLC定量数据(％峰面积)
HMWS(％) 主峰(％) LMWS(％)
2C4907-2 0.18 99.77 0.04
热 0.40 98.96 0.64
酸处理 7.09 92.65 0.26
加速稳定性 0.26 99.23 0.51
DP稳定性 0.19 99.68 0.13
表15：NR-CE-SDS定量数据(％CPA)
LC＝轻链，HC＝重链，L＝轻，H＝重
表16：R-CE-SDS定量数据(％CPA)
峰1 LC 峰2 峰3 NGHC HC 峰5 不完全还原
2C4907-2 0.31 25.30 0.92 2.44 2.81 66.82 0.48 0.91
热 0.54 26.16 1.12 3.13 2.81 64.54 0.27 1.43
酸处理 0.38 25.04 5.58c 2.77 2.41 62.91 0.19 0.71
加速稳定性 0.51 25.01 0.98 2.99 3.16 66.10 0.25 1.03
DP定性 0.19 26.34 0.69 3.21 2.83 65.93 0.24 0.57
NGHC＝非糖基化重链，HC＝重链
数据评估：比较有关片段的百分比峰面积(或百分比校正峰面积，％CPA，用于CE-SDS)以确定CE-SDS方法是否与SE-HPLC相比提供非冗余信息。有关片段包括具有未知结构的峰，或已知含有自切割多肽链衍生的产物的那些。这些片段不同于抗体产品中存在的和通过CE-SDS通常观察到的可解离的未成二硫键的重和/或轻链片段。片段峰必须与其它峰解析开以实现灵敏的检测和精确的量化。
检测小片段的能力：在R-CE-SDS和NR-CE-SDS分析二者中均能观察到小片段，而且在两种测定法均命名为峰1。这些峰保留相同的总体形状和迁移时间，而且在两种测定法中在加压条件下相似地增大。因此，峰1推测在两种测定法中含有相同种类。两种CE-SDS测定法均能够检测小片段，如表17中记录的。
检测通过酸水解(酸剪切)生成的片段的能力：延长的酸暴露条件能生成片段，特别是在Asp-Pro序列(帕妥珠单抗重链残基272-273)处，如酸处理样品的质谱分析所支持的，其显示29039Da(HC1-272)和21513Da(具有G0聚糖的HC273-448)处的质量。这些形式的理论质量分别为29031Da和21510Da。基于这些形式的预期迁移时间，在酸处理样品的还原CE-SDS分析中能清楚地看到一个对应的峰(峰2，图34)，但是在非还原测定法中是在低得多的水平(较低信号)检测到的。可以假定在NR-CE-SDS测定法中，峰2片段推测是二硫化物连接的，并因此未检测到。既然酸处理样品中通过R-CE-SDS检测到的峰2水平(5.58％)超出对此样品通过SE-HPLC检测到的总LMWS(0.26％)，那么可以得出结论，SE-HPLC也不足以检测这些形式。因此，还原CE-SDS测定法是本文中呈现的唯一能够检测因酸水解而生成的片段化的测定法，如表17中记录的。
检测Fab/DesFab片段的能力：通过SE-HPLC检测的LMWS和来自非还原CE-SDS测定法的峰3之间有较好的线性相关性(r2＝0.97)(图35)。经由用酶促生成的Fab进行的共洗脱研究，LMWS鉴定为含有Fab片段。类似地，经由分别用酶促生成的Fab和DesFab进行的共迁移研究(Ma&Nashabeh，同上)，鉴定NR-CE-SDS测定法中的峰3和峰5。生成Fab形式的重链切割产生desFab峰，所以推测它相对于Fab片段处于等价摩尔数量(对应于2:1质量比)，如此，关于这种形式的信息也能通过SE-HPLC间接获得，如表17中记录的。
表17：通过SE-HPLC，NR-CE-SDS，和R-CE-SDS检测片段的能力
片段 SE-HPLC NR-CE-SDS R-CE-SDS
小片段CE-SDS峰1 未知 是 是
酸剪切(R-CE-SDS峰2) 否 否 是
Fab/DesFab 是/(间接) 是 否
还原CE-SDS峰3：R-CE-SDS峰3对于帕妥珠单抗是独特的，而且尚未在其它抗体的CE-SDS分析中观察到。扩展表征结果支持如下结论，即峰3不是产品变体或杂质，而是对帕妥珠单抗特异性的方法诱导人造物，由可解离形式的LC-LC二聚体组成。采用多种技术来表征峰3。
通过配有UV和LIF检测的R-CE-SDS观察到峰3，提示它不是染料标记或样品制备人造物。
在通过R-CE-SDS分析时，纯化的帕妥珠单抗轻链级分产生具有为LC理论大小大约2倍的表观MW的峰3。
在电泳条件包括较高毛细管温度时没有观察到峰3，而且在这些条件下没有观察到其它共迁移片段。
单氨基酸突变的研究鉴定出LCCDR1和CDR2中与LC-LC二聚体形成有关的三个氨基酸残基。当这三个残基任一用另一种氨基酸替换时，峰3完全解离且不再通过还原CE-SDS观察到。
SDS-PAGE分析偶联MALDI-TOF蛋白质质量指纹(PMF)确认帕妥珠单抗中不存在宿主细胞蛋白质，也没有以通过CE-SDS观察到的水平检测到类似条带。
总之，这些结果支持峰3的鉴定是对帕妥珠单抗特异性的，方法诱导的LC-LC二聚体。
讨论
对自这项研究获得的数据的评估指示：
(1)关于片段的检测，NR-CE-SDS与SE-HPLC相比确实提供非冗余信息。
(2)通过NR-CE-SDS方法获得的非冗余片段化信息(与SE-HPLC相比)也能使用R-CE-SDS方法获得。
如表16中显示的，还原测定法检测源自原料药制造期间可发生的低pH暴露的切割产物。表18含有对帕妥珠单抗参照标准，III期材料(n＝3)和使用商业性制造工艺生成的批次(n＝39)的还原CE-SDS峰1和峰2获得的值。使用3.2的k值为峰1和峰2计算95/99容许区间(TI)，并呈现于表18。峰1的95/99容许区间为0.0至0.4％CPA。峰2的95/99容许区间为0.3至0.9％CPA。
表18：测试的43批次的R-CE-SDS定量数据(％CPA)
n 批次 峰1(％CPA) 峰2(％CPA)
1 anti2C4907-2 0.31 0.92
2 SSF0001 0.25 0.63
3 SSF0002 0.20 0.62
4 SSF0003 0.27 0.60
5 VV0002 0.27 0.47
6 VV0003 0.28 0.49
7 VV0004 0.25 0.51
8 VV0005 0.41 0.55
9 VV0006 0.27 0.50
10 VV0007 0.29 0.50
11 VV0008 0.30 0.53
12 VV0009 0.26 0.54
13 VV0013 0.19 0.54
14 VV0018 0.17 0.56
15 VV0020 0.17 0.58
16 VV0021 0.18 0.62
17 VV0023 0.14 0.62
18 VV0024 0.13 0.64
19 VV0025 0.18 0.69
20 VV0026 0.13 0.58
21 VV0028 0.17 0.60
22 VV0029 0.18 0.61
23 VV0031 0.18 0.65
24 VV0032 0.16 0.69
25 VV0033 0.18 0.69
26 VV0034 0.18 0.67
27 VV0035 0.17 0.59
28 VV0036 0.17 0.67
29 VV0037 0.19 0.74
30 VV0038 0.19 0.71
31 VV0039 0.19 0.73
32 VV0040 0.19 0.70
33 VV0041 0.18 0.72
34 VV0042 0.19 0.73
35 VV0043 0.19 0.61
36 VV0044 0.20 0.67
37 VV0046 0.20 0.62
38 VV0047 0.22 0.66
39 VV0048 0.22 0.63
40 VV0049 0.20 0.69
41 VV0050 0.18 0.49
42 VV0051 0.16 0.63
43 VV0052 0.18 0.60
本文中对原料药释放选择峰1≤0.5％和峰2≤1.0％的最终接受标准。
因为帕妥珠单抗原料药是冷冻贮藏的，所以对DS稳定性会预期无变化。另外，基于在T＝0和T548d二者对成品药获得的R-CE-SDS数据(表19)，对任何命名种类没有观察到显著变化。
表19：DP稳定性样品的R-CE-SDS定量数据(％CPA)
NGHC＝非糖基化重链，HC＝重链

Claims (27)

1.一种包含帕妥珠单抗(Pertuzumab)及其未配对半胱氨酸变体的组合物，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸。
2.权利要求1的组合物，其中未配对半胱氨酸变体是在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的异二聚体变体。
3.权利要求1的组合物，其中未配对半胱氨酸变体是在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的同二聚体变体。
4.前述权利要求任一项的组合物，其中帕妥珠单抗和未配对半胱氨酸变体各自包含分别在SEQIDNO：7和8中的可变轻和可变重氨基酸序列。
5.前述权利要求任一项的组合物，其中帕妥珠单抗和未配对半胱氨酸变体各自包含在SEQIDNO：11或15中的轻链氨基酸序列和在SEQIDNO：12或16中的重链氨基酸序列。
6.前述权利要求任一项的组合物，其进一步包含一种或多种别的帕妥珠单抗变体，其中别的变体选自下组：无岩藻糖基化变体，低分子量种类(LMWS)，高分子量种类(HMWS)，糖化变体，二硫化物还原变体，不可还原变体，脱酰胺变体，唾液酸化变体，VHS-变体，C末端赖氨酸变体，甲硫氨酸氧化变体，G1糖基化变体，G2糖基化变体，和非糖基化重链变体。
7.前述权利要求任一项的组合物，其中组合物中未配对半胱氨酸变体的量为≤约25％，通过Fab疏水相互作用层析(HIC)测定。
8.权利要求3的组合物，其中组合物中同二聚体变体的量为≤4.9％，通过完整抗体的疏水相互作用层析(HIC)测定。
9.权利要求2的组合物，其中组合物中异二聚体变体的量为自约13％至约18％，通过完整抗体的疏水相互作用层析(HIC)测定。
10.权利要求1至9任一项的组合物，其已经进行分析性测定法以确认组合物中未配对半胱氨酸变体的量为≤约25％，通过Fab疏水相互作用层析(HIC)测定。
11.一种包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为组合物的0.9-4.1％。
12.权利要求11的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为大于组合物的2％。
13.一种包含帕妥珠单抗，帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)，和帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)的混合物的组合物，其中LMWS的量为≤1.6％且HMWS的量为≤1.7％，通过大小排阻高效液体层析(SE-HPLC)测定。
14.一种包含帕妥珠单抗，峰1，和峰2的混合物的组合物，其中峰1的量为≤0.5％且峰2的量为≤1.0％，通过还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(R-CE-SDS)测定法测量。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1至14任一项的组合物和一种或多种药学可接受赋形剂。
16.一种制品，其包含其中装有权利要求15的药物组合物的容器，和印有指导其使用者使用药物组合物来治疗癌症患者的处方信息的包装插页。
17.一种治疗具有癌症的患者的方法，其包括对癌症患者施用权利要求1至14任一项的组合物或权利要求15的药物组合物。
18.权利要求17的方法，其中癌症为乳腺癌，胃癌，卵巢癌，HER2阳性癌症，或低HER3癌症。
19.一种用于评估帕妥珠单抗组合物的方法，其包括：(1)测量组合物中未配对半胱氨酸变体的量，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸；(2)测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量；或(3)测量组合物中帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)或高分子量种类(HMWS)的量。
20.权利要求19的方法，其包括(1)，(2)，和(3)中的两项或三项。
21.一种用于评估帕妥珠单抗组合物的生物学活性的方法，其包括测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗变体的量以测定组合物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，并确认无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量在自约0.9％至约4.1％的范围中。
22.权利要求21的方法，其包括使用毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)测量无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量。
23.一种用于生成组合物的方法，其包括：(1)生成包含帕妥珠单抗及一种或多种其变体的组合物，并(2)对如此生成的组合物进行分析性测定法以评估其中变体的量，其中变体包含：(i)在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体；(ii)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体；(iii)帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)；或(iv)帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)。
24.权利要求23的方法，其中(1)包括以制造规模自重组中国仓鼠卵巢(CHO)表达帕妥珠单抗和变体并纯化组合物。
25.一种分离的帕妥珠单抗变体，其中分离的变体包含：(a)如下的帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中变体为在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的异二聚体变体；(b)如下的帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中变体为在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的同二聚体变体；(c)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体；(d)帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)；或(e)帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)。
26.一种用于评估帕妥珠单抗组合物的片段化的方法，其包括通过还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(R-CE-SDS)测定法测量组合物中峰1和峰2的量并确认峰1的量为≤5％且峰2的量为≤1.0％。
27.一种用于生成组合物的方法，其包括：(1)生成包含帕妥珠单抗及一种或多种其片段的组合物，和(2)对如此生成的组合物进行分析性测定法以评估组合物中峰1和峰2的量。
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