KR101436219B1

KR101436219B1 - 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법

Info

Publication number: KR101436219B1
Application number: KR1020127013424A
Authority: KR
Inventors: 레인하드 프란체; 치카시 히라시마; 토마스 린크; 요시노리 다카기; 신야 다쿠마; 유리코 츠다
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게; 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2014-09-01
Also published as: KR20170110167A; JP2022116264A; EP3202785B1; ES2622366T3; KR20160084500A; TWI670375B; JP2020058371A; KR20190031342A; BR112012009828B8; TWI675104B; TW201619392A; JP2015128436A; JP2013507979A; BR112012009828A8; TW201125976A; BR112012009828B1; US20200181669A1; KR20190060877A; EP3202785A1; TW202116354A

Abstract

a) 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 포함하는 진핵 세포를 제공하는 단계, b) 배양 배지에서 상기 진핵 세포를 배양하는 단계로서, 이때 시간 단위 당 상기 배양 배지 중의 사용가능한 글루코스의 양이 일정하게 유지되고 시간 단위 당 상기 배양 배지 중의 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 양의 80% 미만으로 제한되는, 단계, 및 c) 배양물로부터 상기 면역글로불린을 회수하는 단계를 포함하는, 면역글로불린을 제조하는 방법이 본원에서 보고되어 있다.

Description

글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF A GLYCOSYLATED IMMUNOGLOBULIN}

세포에서 면역글로불린을 제조하는 분야의 방법이 본원에서 보고되는데, 이때 제조된 면역글로불린의 글리코실화 패턴은 배양 조건에 의거하여 변경될 수 있다.

최근 몇 년간, 면역글로불린의 제조는 꾸준히 증가되었고 면역글로불린은 가까운 장래에 다양한 질환의 치료에 사용가능한 가장 큰 치료제 군이 될 것이다. 면역글로불린의 영향은 그들의 특정 표적 인식 및 결합 기능뿐만 아니라 항원/Fc-수용체 결합과 동시에 또는 항원/Fc-수용체 결합 후 특정 효과의 활성화를 포함하는 그들의 특이성으로부터 나온다.

특정 표적 인식 및 결합은 면역글로불린의 가변 영역에 의해 매개된다. 면역글로불린 분자의 다른 부분으로부터 유래되는 효과는 번역 후 변경(posttranslational modification), 예컨대, 글리코실화 패턴이다. 번역 후 변경은 면역글로불린의 효능, 안정성, 면역원성 잠재력, 결합 등에 영향을 미친다. 이와 관련하여 보체-의존적 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC) 및 아폽토시스의 유도가 설명되어야 한다.

면역글로불린의 글리코실화 패턴, 즉 부착된 당구조의 사카라이드 조성 및 수는 생물학적 성질에 강한 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(예를 들면, 문헌[Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16] 참조). 포유동물 세포에 의해 생성된 면역글로불린은 2 내지 3 질량%의 탄수화물을 함유한다(문헌[Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557]). 이것은 예를 들면, 클래스 G의 면역글로불린(IgG)의 경우 마우스 유래의 IgG에서 2.3 올리고사카라이드 잔기(문헌[Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394]) 및 인간 유래의 IgG에서 2.8 올리고사카라이드 잔기(문헌[Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457])와 동등하고, 이들 잔기 둘다 일반적으로 Fc-영역에 위치하고, 나머지 잔기들은 가변 영역에 위치한다(문헌[Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31]).

클래스 G의 면역글로불린의 Fc-영역에서 올리고사카라이드 잔기는 아스파라긴 잔기인 아미노산 잔기 297(Asn²⁹⁷로서 표시됨)에서 N-글리코실화를 통해 도입될 수 있다. 추가 N-글리코실화 부위가 다중클론 IgG 분자의 15 내지 20%에서 Fab-영역에 존재한다는 것이 밝혀졌다(문헌[Youings, A., et al., Biochem. J., 314 (1996) 621-630]; 예를 들면, 문헌[Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940] 또한 참조). 불균질한, 즉 비대칭 올리고사카라이드 가공(processing)으로 인해, 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 면역글로불린의 다수의 이소형(isoform)이 존재한다(문헌[Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845]; 문헌[Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399]; 및 문헌[Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748]). 현재, 올리고사카라이드의 구조 및 분포는 둘다 고도로 재생가능하고(즉, 비무작위적이고) 부위 특이적이다(문헌[Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292]).

면역글로불린의 일부 특성, 예를 들면, 열 안정성 및 가용성(문헌[West, C.M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20]), 항원성(문헌[Turco, S.J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339]), 면역원성(문헌[Bradshaw, J.P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351]; 문헌[Feizi, T. and Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987) 1-11]; 및 문헌[Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72]), 제거 속도/ 순환 반감기(문헌[Ashwell, G. and Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554]; 문헌[McFarlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135]; 문헌[Baenziger, J.U., Am. J. Path. 121 (1985) 382-391]; 문헌[Chan, V.T. and Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62]; 문헌[Wright, A., et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355]; 문헌[Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182]; 문헌[Zukier, L.S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908]), 및 생물학적 특이적 활성(문헌[Jefferis, R. and Lund, J., in Antibody Engineering, ed. by Capra, J.D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128])은 Fc-영역의 글리코실화와 직접적으로 관련되어 있다(예를 들면, 문헌[Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292]; 문헌[Lund, J., et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969]; 문헌[Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119]; 및 문헌[Wright, A. and Morrison, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402] 참조).

글리코실화 패턴에 영향을 미치는 인자, 예를 들면, 발효 배지 중의 태아소 혈청의 존재(문헌[Gawlitzek, M., et al., J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131]), 완충 조건(문헌[Muthing, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334]), 용해된 산소 농도(문헌[Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31]; 문헌[Kunkel, J.P., et al., J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71]; 및 문헌[Lin, A.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350]), 올리고사카라이드의 위치 및 구조뿐만 아니라 숙주 세포 유형 및 세포 성장 상태(문헌[Hahn, T.J. and Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987]; 및 문헌[Jenkins, N., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981]), 세포 뉴클레오티드 당 대사(문헌[Hills, A.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251]), 영양분 제한(문헌[Gawlitzek, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544]; 및 문헌[Hayter, P.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335]), 특히 글루코스 제한(문헌[Tachibana, H., et al., Cytotechnology 16 (1994) 151-157]), 및 세포외 pH(문헌[Borys, M.C., et al., Bio/Technology 11 (1993) 720-724])가 조사되었다.

증가된 올리고만노스 구조 및 절두된(truncated) 올리고사카라이드 구조는 예를 들면, NS0 골수종 세포에서 면역글로불린의 재조합 발현에 의해 관찰되었다(문헌[Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399]; 및 문헌[Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735]). 글루코스 결핍 조건 하에 글리코실화의 변경, 예컨대, 보다 작은 전구체 올리고사카라이드의 부착 또는 올리고사카라이드 부분의 완전한 부재가 CHO 세포, 뮤린 3T3 세포, 래트 간암 세포, 래트 신장 세포 및 뮤린 골수종 세포에서 관찰되었다(문헌[Rearick, J.I., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 6255-6261]; 문헌[Davidson, S.K. and Hunt, L.A., J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468]; 문헌[Gershman, H. and Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780]; 문헌[Baumann, H. and Jahreis, G.P., J. Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949]; 문헌[Strube, K.-H., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771]; 및 문헌[Stark, N.J. and Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609]). 낮은 글루타민/글루코스 농도에 의거한 방법이 문헌[Wong, D.C.F., et al., Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177]에 의해 보고되었다.

일본 특허출원 제62-258252호는 포유동물 세포의 관류 배양을 보고하는 반면, 미국 특허 제5,443,968호는 단백질 분비 세포의 유가(fed-batch) 배양 방법을 보고한다. 국제 특허출원 공개 제WO 98/41611호에서, 세포를, 낮은 락테이트 생성을 특징으로 하는 대사 상태에 적응시키는 데에 효과적인 세포 배양 방법이 보고되어 있다. 물질을 제조하기 위한 세포 배양 방법은 국제 특허출원 공개 제2004/048556호에 보고되어 있다. 문헌[Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534]은 포유동물 세포가 글루코스의 부재 하에 항온처리되었을 때 만노스-9 함유 구조 대신에 만노스-5 함유 구조를 단백질에 전달한다고 보고한다. 글루코스 제한 동안 pCO₂의 의존성이 CHO 세포 성장, 대사 및 IgG 생성에 영향을 미친다는 것은 문헌[Takuma, S., et al. in Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488]에 의해 보고되어 있다.

진핵 세포에 의해 생성된 폴리펩티드의 글리코실화 패턴에서 만노스-5 당구조의 양은 배양 과정에서 세포에 제공된 글루코스의 양에 근거하여 변경될 수 있다는 것이 발견되었다. 사용가능한 글루코스의 양을 감소시킴으로써, 예를 들면, 글루코스 제한도(DGL(degree of glucose limitation)) 값을 1.0부터 보다 작은 값, 예를 들면, 0.8, 0.6, 0.5, 0.4 또는 0.2로 변화시킴으로써 글리코실화 패턴에서 만노스-5 당구조 양의 변경을 달성할 수 있다. DGL 값 또는 각각 시간 단위 당 사용가능한 글루코스의 양은 시간 단위 당 정해진 감소된 값에서 일정하게 유지되어야 한다. 본원에서 보고된 제1 양태는

a) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 진핵 세포를 제공하는 단계;

b) 글루코스 제한도(DGL)가 일정하게 유지되고 DGL이 0.8 미만인 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계; 및

c) 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계

를 포함하는, 진핵 세포에서 폴리펩티드, 한 실시양태에서 면역글로불린을 제조하는 방법으로서, 이때 만노스-5 당구조를 갖는 폴리펩티드의 분율이 만노스-5 당구조를 갖는 폴리펩티드의 양, 폴리펩티드 G(0) 이소형의 양, 폴리펩티드 G(1) 이소형의 양 및 폴리펩티드 G(2) 이소형의 양을 포함하는 합계의 10% 이하인, 방법이다.

한 실시양태에서, DGL은 0.8 내지 0.2의 범위 내에서 일정하게 유지된다. 추가 실시양태에서, DGL은 0.5 내지 0.4의 범위 내에서 일정하게 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 만노스-5 당구조를 갖는 폴리펩티드의 분율은 만노스-5 당구조를 갖는 폴리펩티드, 폴리펩티드 G(0) 이소형, 폴리펩티드 G(1) 이소형 및 폴리펩티드 G(2) 이소형을 포함하는 합계의 8% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 면역글로불린, 한 실시양태에서 클래스 G 또는 E의 면역글로불린이다.

본원에서 보고된 또 다른 양태는

a) 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계;

b) 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계로서, 이때 시간 단위 당 상기 배양 배지 중의 사용가능한 글루코스의 양이 일정하게 유지되고 시간 단위 당 상기 배양 배지 중의 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 양의 80% 미만으로 제한되는, 단계; 및

c) 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 면역글로불린을 회수하는 단계

를 포함하는, 면역글로불린을 제조하는 방법이다.

한 실시양태에서, 시간 단위 당 배양 배지 중의 사용가능한 글루코스의 양은 일정하게 유지되고 80 내지 20%의 범위 내의 값으로 제한된다. 추가 실시양태에서, 상기 범위는 60 내지 40%이다. 또 다른 실시양태에서, 배양 배지 중의 세포는 배양 배지 중의 생존 세포이다.

본원에서 보고된 양태의 한 실시양태에서, 진핵 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO 세포, HEK 세포, BHK 세포, 하이브리도마 세포, PER.C6(등록상표) 세포, 곤충 세포 및 Sp2/0 세포로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 진핵 세포는 CHO 세포이다. 본원에서 보고된 양태의 또 다른 실시양태에서, 배양은 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.2의 범위 내의 pH 값에서 수행된다.

본원에서 보고된 양태의 또 다른 실시양태에서, 배양은 연속 또는 유가 배양이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법들은 폴리펩티드를 정제하는 최종 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 6 내지 20일 또는 6 내지 15일 동안 배양된다. 추가 실시양태에서, 세포는 5 내지 8일 동안 배양된다.

본원에서 보고된 또 다른 양태는 면역글로불린을 포함하는 조성물로서, 본원에서 보고된 방법에 의해 제조된 조성물이다.

한 실시양태에서, 면역글로불린은 항-IL-6R 항체이다. 추가 실시양태에서, 항-IL-6R 항체는 토실리주마브(Tocilizumab)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-IL-6R 항체에 부착된 만노스-5 당구조는 8% 이하이다. 추가 실시양태에서, 만노스-5 당구조는 6% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 만노스-5 당구조는 4% 이하이다. 추가 실시양태에서, 항-IL-6R 항체에 부착된 G(0) 당구조는 40 내지 46%이고, 항-IL-6R 항체에 부착된 G(2) 당구조는 9 내지 11%이다.

도 1은 DGL 조절을 사용하여 유가 방식에서 생존 세포 밀도(a) 및 세포 생존율 프로파일(b)을 보여준다. 빈 원: 8 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 채워진 삼각형: 10 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 빈 사각형: 12 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도.
도 2는 면역글로불린 제조에 있어서 유가 방식에서 DGL의 시간 경과를 보여준다. 원: 8 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 삼각형: 10 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 사각형: 12 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도.
도 3은 면역글로불린 제조에 있어서 유가 방식에서 DGL에 의거한 공급 프로파일을 보여준다. 원: 8 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 삼각형: 10 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 사각형: 12 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도.
도 4는 DGL 조절에서 유가 방식에 의한 면역글로불린 제조 프로파일을 보여준다. 빈 원: 8 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 채워진 삼각형: 10 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 빈 사각형: 12 x 10⁵개 세포/㎖의 초기 세포 밀도; 채워진 작은 원: 일정한 공급 방법: FR = 0.02 g 글루코스/h(조절).
도 5는 세포의 유가 배양 동안 DGL의 시간 경과를 보여준다. 마름모: 단일 공급물 매일 공급; 사각형: 이중 공급물 매일 공급; 삼각형: 단일 공급물 프로파일 공급; X: 이중 공급물 프로파일 공급.

a) 0.8 미만(즉, 시간 단위 당 사용가능한 글루코스의 양이 일정하고 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양의 80% 이하임)의 일정한 DGL에서 배양 배지에서 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 면역글로불린을 회수하는 단계

를 포함하는, 면역글로불린을 제조하는 방법이 본원에서 보고된다.

본원에서 보고된 방법을 사용하여 면역글로불린을 수득할 수 있는데, 이때 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 양은 조정된 DGL 값에 의존하고, 상기 양은 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 양, 면역글로불린 G(0) 이소형의 양, 면역글로불린 G(1) 이소형의 양 및 면역글로불린 G(2) 이소형의 양의 합계의 분율이다. 한 실시양태에서, 상기 DGL은 0.8 내지 0.2이다. 이 실시양태에서, 상기 분율은 10% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 DGL은 0.6 내지 0.4이다. 이 실시양태에서, 상기 분율은 6% 이하이다. 본원에서 보고된 방법을 사용하여 면역글로불린을 수득할 수 있는데, 이때 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 분율은 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 양, 면역글로불린 G(0) 이소형의 양, 면역글로불린 G(1) 이소형의 양 및 면역글로불린 G(2) 이소형의 양을 포함하는 합계의 10% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 분율은 액체 크로마토그래피 방법에서 측정된 면적% 분율이다. 한 실시양태에서, 상기 DGL은 0.8 내지 0.2의 범위 내에서 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 DGL은 0.6 내지 0.2의 범위 내에서 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 DGL은 0.6 내지 0.4의 범위 내에서 유지된다. 한 실시양태에서, 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양은 5회 이상의 배양에 근거하여 측정된, 모든 화합물들이 과량으로 사용될 수 있는, 즉 어떠한 화합물도 세포의 성장을 제한하지 않는 배양에서 사용되는 글루코스의 평균 양이다. 한 실시양태에서, 상기 분율은 배양의 7일째 날에 측정된다.

본 발명을 수행하는 데 있어서 유용한 당업자에게 공지된 방법 및 기법은 예를 들면, 문헌[Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons]; 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)]; 문헌[Glover, N.D. (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985)]; 문헌[Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1986)]; 문헌[Miller, J.H. and Calos, M.P. (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987)]; 문헌[Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, N.Y., W.H. Freeman and Co (1992)]; 문헌[Winnacker, E.L., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers (1987)]; 문헌[Celis, J. (ed.), Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998)]; 및 문헌[Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)]에 기재되어 있다.

재조합 DNA 기술의 사용은 폴리펩티드의 많은 유도체의 제조를 가능하게 한다. 이러한 유도체는 예를 들면, 치환, 변이 또는 교환에 의해 개별 또는 여러 아미노산 위치에서 변경될 수 있다. 유도체화는 예를 들면, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 이러한 변경은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다(문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (2001)]; 및 문헌[Hames, B.D. and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England]).

용어 "핵산"은 폴리펩티드를 코딩하는 천연 핵산 분자 또는 부분적으로 또는 전체적으로 비천연 핵산 분자를 의미한다. 핵산은 단리되거나 화학적 수단에 의해 합성되는 DNA 단편으로 구축될 수 있다. 핵산은 또 다른 핵산, 예를 들면, 발현 플라스미드 또는 진핵 세포의 게놈/염색체 내로 통합될 수 있다. 용어 "플라스미드"는 셔틀(shuttle) 플라스미드 및 발현 플라스미드를 포함한다. 전형적으로, 플라스미드는 원핵 세포에서 상기 플라스미드의 복제 및 선별을 위해 각각 복제 기점(예를 들면, ColE1 복제 기점) 및 선별 마커(예를 들면, 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성 유전자)를 포함하는 원핵 증식 단위체(unit) 또한 포함할 것이다. 예를 들면, 폴리펩티드의 아미노산 서열을, 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 상응하는 핵산으로 전환시키는 절차 및 방법이 당업자에게 잘 공지되어 있다. 따라서, 핵산은 개별 뉴클레오티드로 구성된 그의 핵산 서열 및 또한 그에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 특징으로 한다.

용어 "발현 카세트"는 세포에서/세포로부터 적어도 함유된 구조 유전자의 발현 및 임의적으로 분비를 위해 필요한 요소들, 예컨대, 프로모터, 폴리아데닐화 부위, 및 3'- 및 5'-비번역된 영역을 함유하는 핵산을 의미한다.

용어 "유전자"는 예를 들면, 폴리펩티드의 발현에 필요한, 염색체 또는 플라스미드 상의 분절(segment)을 의미한다. 코딩 영역 이외에, 유전자는 프로모터, 인트론, 및 하나 이상의 전사 종결자(terminator)를 포함하는 다른 기능성 요소들을 포함한다. "구조 유전자"는 신호 서열을 갖지 않은 유전자의 코딩 영역을 의미한다.

용어 "발현"은 세포 내에서의 구조 유전자의 전사 및 번역을 의미한다. 세포 내에서의 구조 유전자의 전사 수준은 상기 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양에 의거하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 선택된 핵산으로부터 전사되는 mRNA는 PCR 또는 노던 혼성화에 의해 정량될 수 있다(예를 들면, 상기 문헌[Sambrook et al.] 참조). 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 다양한 방법, 예를 들면, ELISA에 의해, 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성의 측정에 의해, 또는 이러한 활성과 무관한 방법, 예컨대, 상기 폴리펩티드를 인식하여 결합하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅 또는 방사성면역분석의 사용에 의해 정량될 수 있다(예를 들면, 상기 문헌[Sambrook et al.] 참조).

용어 "세포"는 폴리펩티드, 한 실시양태에서 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 도입되어 있는 세포를 의미한다. 용어 "세포"는 플라스미드/벡터의 증식을 위해 사용되는 원핵 세포 및 구조 유전자의 발현을 위해 사용되는 진핵 세포 둘다를 포함한다. 한 실시양태에서, 면역글로불린의 발현을 위한 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6(등록상표) 세포 및 하이브리도마 세포로부터 선택된다. 추가로, 진핵 세포는 곤충 세포, 예컨대, 모충 세포(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), sf 세포), 초파리 세포(드라소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)), 모기 세포(애데스 애깁티(Aedes aegypti), 애데스 알보픽터스(Aedes albopictus)) 및 누에 세포(봄빅스 모리(Bombyx Mori)) 등으로부터 선택될 수 있다.

용어 "폴리펩티드"는 천연적으로 또는 합성적으로 제조된, 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 의미한다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있다. 100개 초과의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드, 또는 1개 초과의 폴리펩티드를 포함하는 공유 응집체 및 비공유 응집체는 "단백질"로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 비아미노산 성분, 예컨대, 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 비아미노산 성분은 폴리펩티드가 생성된 세포에 의해 폴리펩티드에 부가될 수 있고 세포의 유형에 따라 달라질 수 있다. 본원에서 폴리펩티드는 N-말단 방향으로부터 C-말단 방향으로 그의 아미노산 서열의 관점에서 정의된다. 상기 폴리펩티드에의 부가물, 예컨대, 탄수화물 기는 일반적으로 특정되지 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.

용어 "이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩티드"는 주어진 세포 내에서 천연적으로 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩티드, 또는 DNA 분자의 집단 또는 폴리펩티드의 집단을 의미한다. 특정 세포에 대한 이종 DNA 분자는, DNA가 비숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되는 한, 상기 세포의 종으로부터 유래된 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들면, 세포의 DNA 분절, 예를 들면, 프로모터를 포함하는 세포의 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 비세포 DNA 분절, 예를 들면, 폴리펩티드를 코딩하는 비세포 DNA 분절을 함유하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자인 것으로 간주된다. 마찬가지로, 이종 DNA 분자는 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된 내인성 구조 유전자를 포함할 수 있다. 이종 DNA 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 "이종" 폴리펩티드이다.

용어 "발현 플라스미드"는 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 구조 유전자를 포함하는 핵산을 의미한다. 전형적으로, 발현 플라스미드는 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)를 위한 복제 기점 및 선별 마커를 포함하는 원핵 플라스미드 증식 단위체; 진핵 선별 마커; 및 프로모터, 하나 이상의 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결자를 차례대로 각각 포함하는, 원하는 구조 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현은 통상적으로 프로모터의 조절 하에 있고, 이러한 구조 유전자는 상기 프로모터에 "작동가능하게 연결"된다. 유사하게, 조절 요소 및 코어 프로모터는 상기 조절 요소가 상기 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동가능하게 연결되어 있다.

용어 "단리된 폴리펩티드"는 폴리펩티드와 공유결합되어 있지 않은 관련된 세포 성분들, 예컨대, 탄수화물, 지질 또는 다른 단백질성 또는 비단백질성 불순물을 본질적으로 갖지 않은 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 단리된 폴리펩티드 제제는 일부 실시양태에서 폴리펩티드를 고도로 정제된 형태로, 즉 약 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 95% 초과의 순도 또는 99% 초과의 순도로 함유한다. 특정 단백질 제제가 단리된 폴리펩티드를 함유하는지를 확인하는 한 방법은 상기 제제의 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 상기 겔의 코마시에 브릴리안트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 후 단일 밴드의 출현에 의한 확인이다. 그러나, 용어 "단리된"은 동일한 폴리펩티드가 대안적인 물리적 형태, 예컨대, 이량체, 또는 대안적으로 글리코실화된 또는 유도체화된 형태로 존재하는 것을 배제하지 않는다.

면역글로불린은 일반적으로 5개의 상이한 클래스로 분류된다: IgA(클래스 A의 면역글로불린), IgD, IgE, IgG 및 IgM. 이들 클래스들 사이에서 면역글로불린들은 그들의 전체 구조 및/또는 아미노산 서열에서 상이하지만 동일한 구축 블록을 갖는다. 완전한 면역글로불린은 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드(약어: 경쇄) 및 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드(약어: 중쇄)를 각각 포함하는 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 구축된다. 그 다음, 상기 쇄들은 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 경쇄에서, 상기 영역 둘다가 하나의 도메인으로 구성되는 반면, 중쇄에서 가변 영역은 하나의 도메인으로 구성되고 불변 영역은 5개 이하의 도메인(N-말단 방향으로부터 C-말단 방향으로)을 포함한다: C_H1-도메인, 임의적으로 힌지(hinge) 영역 도메인, C_H2-도메인, C_H3-도메인 및 임의적으로 C_H4-도메인. 면역글로불린은 Fab-영역 및 Fc-영역으로 분할될 수 있다. 전체 경쇄, 중쇄 가변 도메인 및 C_H1-도메인은 Fab-영역(단편 항원 결합-영역)으로서 지칭된다. Fc-영역은 C_H2-도메인, C_H3-도메인 및 임의적으로 C_H4-도메인을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 의미한다. 코딩 면역글로불린 유전자는 상이한 불변 영역 유전자뿐만 아니라 다수의 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 용어 "면역글로불린"은 단일클론 항체 및 이의 단편, 예컨대, 단리된 중쇄 또는 중쇄 불변 영역뿐만 아니라, 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 C_H2-도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드도 포함한다. 본원에서 보고된 방법의 한 실시양태에서, 면역글로불린은 완전한 면역글로불린이고, 또 다른 실시양태에서 면역글로불린은 완전한 면역글로불린의 Fc-영역이다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체이다.

용어 "면역글로불린 단편"은 면역글로불린 델타, 엡실론 또는 알파 중쇄의 하나 이상의 C_H2-도메인, 및/또는 면역글로불린 엡실론 또는 델타 중쇄의 C_H3-도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. C_H2-도메인 또는 C_H3-도메인 내의 N-글리코실화 모티프 Asn-Xaa-Ser/Thr가 변화되지 않은 유도체 및 이의 변이체도 포함된다.

용어 "면역글로불린 접합체"는 비면역글로불린 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 델타, 엡실론 또는 알파 중쇄의 하나 이상의 C_H2-도메인, 및/또는 면역글로불린 엡실론 또는 델타 중쇄의 C_H3-도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 여기에서 C_H2-도메인 또는 C_H3-도메인 내의 N-글리코실화 모티프 Asn-Xaa-Ser/Thr는 변화되지 않는다.

면역글로불린 중쇄의 C_H2-도메인의 Asn²⁹⁷(IgG, IgE) 또는 Asn²⁶³(IgA), 및/또는 면역글로불린 중쇄의 C_H3-도메인의 Asn³⁹⁴, Asn⁴⁴⁵ 또는 Asn⁴⁹⁶(IgE, IgD)에 부착된 올리고사카라이드들은 이안테나(biantennary) 구조를 갖는다(Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394). 즉, 이들은 말단 GlcNAc 잔기에서 임의적으로 Fuc(α1-6) 연결을 갖는 Man(α1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc→Asn의 코어 구조로 구성된다. 2개의 외부 아암(arm)은 하기 식으로 표시되는 코어 구조의 말단 만노스에 연결된다:

Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)→Man, 및

Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)→Man

상기 식에서, 말단 갈락토스 잔기는 임의적 잔기이다(Man = 만노스, GlcNAc = N-아세틸 글루코스, Gal = 갈락토스; Fuc = 푸코스).

면역글로불린의 글리코실화 부위

면역글로불린 클래스	당구조가 부착될 수 있는 잔기
IgG	Asn²⁹⁷
IgE	Asn²⁵⁵, Asn²⁹⁷, Asn³⁶¹, Asn³⁷¹, Asn³⁹⁴
IgA	Asn²⁶³, Asn⁴⁵⁹
IgD	Asn⁴⁴⁵, Asn⁴⁹⁶
IgM	Asn³⁹⁵

용어 "면역글로불린 G(0) 이소형의 양, 면역글로불린 G(1) 이소형의 양 및 면역글로불린 G(2) 이소형의 양"은 면역글로불린의 아스파라긴(Asn)에 N-연결된 상이한 이종 이안테나 올리고사카라이드의 양의 합계를 의미한다. 상기 G(2) 이소형은 올리고사카라이드 구조의 각각의 외부 아암 상에서 말단 갈락토스 잔기를 갖고, 상기 G(1) 이소형은 (α1-6) 또는 (α1-3) 연결된 외부 아암 상에서 갈락토스 잔기만을 보유하고, 상기 G(0) 이소형은 2개의 외부 아암 상에서 갈락토스 잔기를 보유하지 않는다.

용어 "만노스-5 당구조"는 삼안테나(triantennary) 구조를 형성하는 5개의 만노스 잔기 및 2개의 N-아세틸 글루코스 코어 잔기를 포함하거나 이들 잔기들로 구성된 폴리펩티드의 Asn 잔기에 연결된 올리고만노스-구조를 의미한다.

본원에서 보고된 한 양태는

a) 면역글로불린을 코딩하는 하나 이상의 핵산(들)을 포함하는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 이때 시간 단위 당 상기 배양 배지 중의 사용가능한 글루코스의 양이 일정하게 유지되고 시간 단위 당 배양물 중의 진핵 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 양의 80% 미만의 값으로 제한되는, 단계; 및

b) 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 면역글로불린을 회수하여 면역글로불린을 제조하는 단계

를 포함하는, 면역글로불린을 제조하는 방법이다.

이 방법에 의해, 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린을 10% 이하로 포함하는 면역글로불린이 수득된다. 상기 10%는 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 양, 면역글로불린 G(0) 이소형의 양, 면역글로불린 G(1) 이소형의 양 및 면역글로불린 G(2) 이소형의 양의 합계에 의거하여 계산된다.

본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "글루코스 제한도" 및 이의 약어 "DGL"은 배양물 중의 단일 세포의 현재 글루코스 소비 비속도(specific glucose consumption rate) 대 상기 단일 세포 또는 동일한 종류의 단일 세포의 최대 공지된 글루코스 소비 비속도의 비율을 의미한다. 글루코스 제한도는 하기 수학식 1로서 정의된다:

[수학식 1]

상기 식에서,

qGlc는 단일 세포의 현재 글루코스 소비 비속도이고;

qGlc_최대는 이 단일 세포 또는 동일한 종류의 단일 세포의 최대 공지된 글루코스 소비 비속도이다.

상기 DGL은 DGL_유지와 1 사이에서 달라질 수 있고, 이때 DGL_유지(0초과 내지 1 미만)는 완전한 성장 제한을 의미하고, 1은 제한 또는 완전한 글루코스 과잉이 없음을 의미한다.

폴리펩티드, 예를 들면, 면역글로불린에의 당구조의 도입은 번역 후 변경이다. 각각의 세포의 글리코실화 절차의 불완전함으로 인해, 상이한 당구조를 포함하는 글리코실화 패턴을 갖는 모든 발현된 폴리펩티드가 수득된다. 따라서, 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드의 상이하게 글리코실화된 형태, 즉 동일한 아미노산 서열을 갖는 상이하게 글리코실화된 형태를 포함하는 조성물의 형태로 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 수득된다. 예를 들면, 당구조를 완전히 결여하는 폴리펩티드, 상이하게 가공된 당구조를 갖는 폴리펩티드 및/또는 상이하게 구성된 당구조를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 개별 당구조의 합계는 글리코실화 패턴으로서 표시된다.

한 당구조는 만노스-5 당구조(고-만노스, Man5, M5 또는 올리고-만노스로도 표시됨)이다. 만노스-5 당구조를 갖는 재조합적으로 제조된 폴리펩티드의 분율은 연장된 배양 시간에 따라 또는 글루코스 결여 조건 하에 증가되는 것으로 보고되어 있다(문헌[Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735]; 및 문헌[Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534]).

진핵 세포에 의해 제조된 폴리펩티드의 글리코실화 패턴에서 만노스-5 당구조의 양은 배양 과정에서 상기 세포에 제공된 글루코스의 양에 의거하여 변경될 수 있다는 것이 발견되었다. 글루코스의 양을 감소시킴으로써, 즉 DGL 값을 1.0부터 보다 작은 값, 예를 들면, 0.8, 0.6, 0.5, 0.4 또는 0.2의 값으로 변화시킴으로써 글리코실화 패턴에서 만노스-5 당구조 양의 변경을 달성할 수 있다는 것이 발견되었다. 한 실시양태에서, DGL 값은 범위 내의 일정한 값, 예컨대, 0.8 내지 0.2 또는 0.6 내지 0.4에서 일정하게 유지된다. 즉, 폴리펩티드, 한 실시양태에서 면역글로불린의 제조는 글리코실화 패턴에서 정해진 양의 만노스-5 당구조를 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해 제한된 양의 글루코스가 배양된 세포에 의해 사용될 수 있는 조건 하에 수행될 수 있다. 시간 단위 당 사용가능한 글루코스의 양이 시간 단위 당 세포, 한 실시양태에서 대수적으로 성장하는 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양의 80% 이하인, 즉 DGL이 0.8 이하인 배양은 만노스-5 당구조의 양이 1.0의 DGL을 사용하는 배양에 비해 변화되어 있는 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드를 제공한다는 것이 발견되었다. 한 실시양태에서, 세포 밀도는 생존 세포 밀도이다. 추가로, 수득된 폴리펩티드 수율은 증가된다.

용어 "시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양"은 임의의 영양분 제한 없는 배양에서 대수 성장기에서 최적 성장 조건 하에 단일 세포에 의해 시간 단위 당 최대로 소비되거나, 사용되거나 또는 대사되는 글루코스의 양을 의미한다. 따라서, 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양은 임의의 영양분 제한 없는 배양에서 대수 성장기에서 최적 성장 조건 하에 세포에 의해 시간 단위 당 대사되는 글루코스의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 당의 사용가능한 양의 추가 증가는 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양을 추가로 증가시키지, 즉 변화시키지 않을 것이다. 이 양은 단일 세포의 글루코스 소비의 최대 수준을 정의한다. 이것은 세포의 유전적으로 변경된 버전이 훨씬 더 높은 최대 글루코스 소비 수준을 갖지 않을 것임을 의미하지 않는다. 대안적으로, 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양은 이전 배양 및 모니터링된 데이터에 의거하여 측정될 수 있다.

본원에서 보고된 과정은 특히 수행하기 간편하고 측정 및 조절을 위한 최소한의 노력과 관련되어 있고 특히 경제적이다.

제한, 예를 들면, 불충분한 영양분 공급이 없는 경우, 배양된 세포는 비경제적인 방식으로 최대 속도로 성장하고 영양분을 소비한다. 소비되는 배양 배지 영영분들 중 하나는 세포의 대사를 위한 에너지 및 구축 블록을 생성하기 위해 상기 배양된 세포에 의해 대사되는 글루코스이다. 과량의 글루코스의 존재 하에, 세포의 대사는 글루코스를 위한 최대 전환(turnover) 속도에서 실시된다. 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양은 예를 들면, 제한된 글루코스를 사용하는, 즉 세포에 의해 사용될 수 있는 글루코스의 양보다 더 적은 시간 단위 당 사용가능한 글루코스의 양을 사용하는 배양에서 사용될 동일한 배양 조건의 사용을 통해 또는 상기 배양 조건 하에 배양된 대수적으로 성장하는 세포에 의한 과량의 글루코스 존재 하에서의 글루코스 소비로부터 측정될 수 있다. 이 최대량은 고정된 시간 범위의 초기 및 말기에서 세포 밀도 및 글루코스 농도를 측정함으로써 용이하게 계산될 수 있다. 상기 값은 정상적으로 0.006 내지 190 mmol/h/10⁹개 세포이다(문헌[Baker, K.N., et al., Biotechnol. Bioeng. 73 (2001) 188-202]; 국제 특허출원 공개 제WO 98/41611호; 문헌[Muthing, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334]; 및 국제 특허출원 공개 제WO 2004/048556호). 한 실시양태에서, qGlc_최대는 pH 7.0에서 표준 과정 조건 하에 약 0.142 mmol/h/10⁹개 세포이다.

한 실시양태에서, 본원에서 보고된 방법은 시간 단위 당 사용가능한 글루코스의 양이 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양의 80% 이하(0.8 ≥ DGL > 0)로 일정하게 유지되는 조건 하에, 한 실시양태에서 사용가능한 글루코스의 양이 60% 이하(0.6 ≥ DGL > 0), 또 다른 실시양태에서 50% 이하(0.5 ≥ DGL > 0), 또 다른 실시양태에서 약 40%에서 일정하게 유지되는 조건 하에 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "약"은 값이 정확한 값이 아니고 상기 값이 10% 이하로 달라질 수 있는 범위의 단지 중심점임을 의미하고, 즉 용어 "약 40%"는 44 내지 36%(DGL = 0.44 내지 0.36)의 범위를 의미한다.

한 실시양태에서, 시간 단위 당 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양의 80 내지 10%(0.8 ≥ DGL ≥ 0.1)의 범위 내에서 일정하게 유지되는, 시간 단위 당 사용가능한 글루코스의 양을 사용하여 배양을 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 사용가능한 글루코스의 양은 60 내지 10%(0.6 ≥ DGL ≥ 0.1)의 범위 내에서 일정하게 유지된다. 추가 실시양태에서, 사용가능한 글루코스의 양은 50 내지 10%(0.5 ≥ DGL ≥ 0.1)의 범위 내에서 일정하게 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 사용가능한 글루코스의 양은 45 내지 20%(0.45 ≥ DGL ≥ 0.2)의 범위 내에서 일정하게 유지된다. 또한, 한 실시양태에서, 사용가능한 글루코스의 양은 80 내지 60%(0.8 ≥ DGL ≥ 0.6)에서 유지된다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 DGL이 약 0.4의 값에서 일정하게 유지되는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이때 상기 배양은 1.0 내지 0.5의 DGL로 개시되고 상기 DGL을 약 0.4의 값으로 하강되고 그 후 상기 DGL을 일정하게 유지하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 DGL의 하강은 100시간 이내에 달성된다. 용어 "DGL을 일정하게 유지하는 것" 및 이의 문법적 등가어는 DGL 값이 일정한 시간 동안 유지되는 것, 즉 상기 DGL 값의 변경이 상기 값의 10% 이내에 있음을 의미한다(예를 들면, 도 2 참조).

면역글로불린은 제조 후에 직접적으로 또는 세포의 붕해 후에 회수된다. 한 실시양태에서, 회수된 면역글로불린은 당업자에게 공지된 방법에 의해 정제된다. 다양한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합된-방식 교환), 티오친화성 흡착(예를 들면, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드의 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산의 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들면, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질의 사용), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고 단백질 정제를 위해 널리 사용된다(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102]).

예를 들면, 면역글로불린의 정제 과정은 일반적으로 다단계 크로마토그래피 부분을 포함한다. 제1 단계에서, 비면역원성 폴리펩티드는 예를 들면, 단백질 A 또는 G를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 면역글로불린 분획으로부터 분리된다. 그 후, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 개별 면역글로불린 클래스를 분리하고 제1 컬럼으로부터 함께 용출된 단백질 A의 잔류물을 제거할 수 있다. 마지막으로, 크로마토그래피 단계를 사용하여 다량체 및 동일한 클래스의 단편들로부터 면역글로불린 단량체를 분리한다.

일반적인 크로마토그래피 방법들 및 이들의 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5^th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)]; 문헌[Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)]; 문헌[Poole, C. F. and Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991)]; 문헌[Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice (1982)]; 문헌[Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)]; 또는 문헌[Ausubel, F. M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1990)]을 참조한다.

한 실시양태에서, 회수된 면역글로불린은 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린, 면역글로불린 G(0) 이소형, 면역글로불린 G(1) 이소형 및 면역글로불린 G(2) 이소형의 양의 합계인 한 집단의 양에 대한 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 양을 특징으로 한다. 본원에 보고된 방법에 의해, 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 양은 한 실시양태에서 상기 집단의 10% 이하이고, 또 다른 실시양태에서 상기 집단의 8% 이하이고, 추가 실시양태에서 상기 집단의 6% 이하이다.

본원에 보고된 방법은 일부 실시양태에서 연속 배양, 유가 배양 또는 이들의 조합 배양, 예를 들면, 유가 배양으로서 개시되고 연속 배양으로 후속 교차되는 배양으로서 수행될 수 있다. 추가로, 본원에 보고된 방법은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 한 실시양태에서, DGL 값이 1.0 미만인 조건 하에, 즉 예를 들면, 글루코스의 사용가능한 양이 시간 단위 당 배양물 중의 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양의 80% 이하인 조건 하에 배양하기 전에, 과량의 글루코스, 즉 1.0의 DGL 값을 사용하여 배양을 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 배양은 예를 들면, 예정된 세포 밀도, 예를 들면, 한 실시양태에서 10⁵개 세포/㎖의 세포 밀도를 수득하기 위해 표준 배양 배지, 예를 들면, 1 내지 10 g/l 배양 배지에 함유된 글루코스의 양으로 개시된다. 추가 실시양태에서, 배양은 과량의 글루코스, 즉 1.0의 DGL의 존재 하에 개시되고, 배양물 중의 세포에 의해 시간 단위 당 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양의 80% 이하인, 시간 단위 당 글루코스의 양이 첨가된다. 또 다른 실시양태에서, 배양 배지에 존재하는 글루코스의 양이 배양에서 예비설정된 값 이하로 떨어지면 공급이 개시된다. 마지막 두 경우, 배양물 중의 사용가능한 글루코스의 양은 배양물 중의 세포의 대사에 의해 감소된다.

한 실시양태에서, 시간 단위 당 사용가능한 또는 첨가되는 글루코스의 양으로서 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양 미만인 글루코스의 양은 본원에서 보고된 방법에서 동일한 값에서, 즉 일정하게 유지된다. 예를 들면, 시간 단위 당 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양의 50%의 양이 사용가능한 경우, 이 양은 제한된 글루코스 공급이 수행되는 방법의 모든 시간 단위에서 사용가능하다. 이 값은 상대적인 값이라는 점이 지적되어야 한다. 생존 세포 밀도가 배양 동안 변화되고(즉, 생존 세포 밀도가 초기에 증가하고 최대치에 도달하고 그 후 다시 떨어짐), 사용가능한 글루코스의 절대적인 양은 그에 따라 변화되므로, 상기 값은 절대 생존 세포 밀도에 의존하는 상대적인 값이다. 상대적인 값은 일정하게(즉, 예를 들면, 80%에서) 유지되지만 절대 기준 값은 변화되므로(즉, 예를 들면, 증가하는 생존 세포 밀도), 상대적인 절대 값도 변화된다(즉, 80%의 증가하는 값도 증가함).

용어 "시간 단위 당"은 고정된 시간 범위, 예컨대, 1분, 1시간, 6시간, 12시간 또는 24시간을 의미한다. 한 실시양태에서, 시간 단위는 12시간 또는 24시간이다. 본원에서 사용된 용어 "시간 단위 당 사용가능한 글루코스의 양"은 1) 고정된 시간 범위의 초기에 배양의 배양 배지에 함유된 글루코스의 양과 2) 시간 단위 동안 첨가된, 즉 공급된 글루코스의 양의 합계를 의미한다. 따라서, 일정한 양의 글루코스가 세포 배양 배지, 예를 들면, 배양 용기에 첨가되고, 이것은 고정된 시간 범위의 초기에서 배양 배지 중의 글루코스의 양을 예정된 양까지 증가시킨다. 이러한 양의 글루코스는 예를 들면, 고체로서 첨가될 수 있거나, 물에 용해될 수 있거나, 완충제에 용해될 수 있거나, 또는 영양분 배지에 용해될 수 있고, 이때 물 및 완충제는 글루코스를 함유하지 않을 것이다. 첨가될 글루코스의 양은 배양 용기 내의 배지에 존재하는 글루코스의 양에 의해 사용가능한 수준으로 감소되는 글루코스의 양에 상응한다. 상기 양의 글루코스를 첨가하는 과정은 단일 첨가로서, 작은 동등한 분획의 다중 첨가로서, 또는 전술된 바와 같은 시간 단위 동안 연속적 첨가로서 수행될 수 있다.

본원에서 보고된 방법은 임의의 유형의 배양 및 임의의 배양 규모에 적합하다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 상기 방법은 연속 공정 또는 유가 공정을 위해 사용되고, 또 다른 실시양태에서, 배양 부피는 100 ㎖ 내지 50,000 ℓ 이하, 또 다른 실시양태에서 100 내지 10,000 ℓ이다. 본원에서 보고된 방법은 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린이 10% 이하, 8% 이하 또는 6% 이하인 면역글로불린을 제조하는 데 있어서 유용하다. 한 실시양태에서, 상기 면역글로불린은 면역글로불린 G 또는 E이다. 본원에서 보고된 방법은 진핵 세포를 포함하고, 이때 상기 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편의 중쇄를 코딩하는 핵산, 및 면역글로불린 또는 이의 단편의 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 진핵 세포는 CHO 세포, NS0 세포, BHK 세포, 하이브리도마 세포, PER.C6(등록상표) 세포, Sp2/0 세포, HEK 세포 및 곤충 세포로부터 선택된다.

당업자는 배지 조성 및 성분뿐만 아니라 글루코스의 양 이외에 최적 성장을 위해 상이한 세포들에 의해 요구되는 영양분 농도도 인식하고 있고 세포의 배양을 위해 적합한 배지를 선택할 것이다(예를 들면, 문헌[Mather, J.P., et al., in Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2 (1999) 777-785] 참조).

한 실시양태에서, 본원에서 보고된 방법에 따라 배양물 중의 세포에게 사용가능해야 하는 글루코스의 양은 배양의 일정 시점에서 배양 용기 내에서 통상적으로 달성될 수 있는 생존 세포 밀도를, 상기 배양 용기의 부피 및 시간 단위 당 대수적으로 성장하는 세포에 의해 최대로 사용될 수 있는 글루코스의 양으로 곱하고 의도된 DGL로 곱함으로써 계산된다. 보다 상세하게는, 배양물 중의 글루코스 농도의 경과 및 실제 시점 이전에 배양물 중의 세포 밀도의 경과로부터 글루코스 농도 및 세포 밀도의 향후 경과가 예측된다. 이 예측을 사용하여, 의도된 DGL를 달성하기 위해 배양물에 첨가되어야 하는 글루코스의 양을 하기 수학식 2로 계산한다:

[수학식 2]

(첨가될 글루코스[pg 글루코스/㎖/h]) = (현재 세포 밀도[세포/㎖]) x (세포의 최대 글루코스 소비 속도[pg 글루코스/세포/h]) x (DGL 값) - 배양 용기 내의 배지에 존재하는 글루코스의 양

한 실시양태에서, 배양물의 pH 값은 pH 6.5 내지 pH 7.8이다. 또 다른 실시양태에서, pH 값은 pH 6.9 내지 pH 7.3이다. 추가 실시양태에서, pH 값은 pH 7.0 내지 pH 7.2이다. 실시예 1에 요약된 바와 같이, 일정한 공급 방법에서 7.0의 pH 값을 사용하는 제한된 글루코스 공급과 조합되었을 때 M5 함량이 7.2의 pH 값에 비해 정해진 값, 즉 8% 미만으로 효율적으로 조절될 수 있음이 발견되었다. 7.0 또는 7.2의 pH 값에서 유가 방법의 배양에서, DGL 조절 방법을 사용하여 M5 함량을 5.5% 미만으로 조절할 수 있음이 발견되었다. 배양물의 pH 값을 감소시킴으로써 DGL 값의 하강으로 인한 M5 양의 증가가 저해될 수 있음이 발견되었다.

한 실시양태에서, 배양은 27 내지 39℃의 온도, 또 다른 실시양태에서 35 내지 37.5℃의 온도에서 수행된다.

본원에서 보고된 방법을 사용하여 당구조를 함유하는 임의의 폴리펩티드, 예컨대, 면역글로불린, 인터페론, 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 플라스미노겐 활성화자, 에리쓰로포이에틴 등을 제조할 수 있다.

본원에서 보고된 방법에서 배양은 포유동물 세포 배양을 위한 임의의 교반 또는 진탕 배양 장치, 예를 들면, 발효기 유형의 탱크 배양 장치, 에어 리프트(air lift) 유형의 배양 장치, 배양 플라스크 유형의 배양 장치, 회전 플라스크 유형의 배양 장치, 미세운반체 유형의 배양 장치, 유동화된 층 유형의 배양 장치, 중공 섬유 유형의 배양 장치, 롤러 병 유형의 배양 장치 또는 팩킹된 층 유형의 배양 장치를 사용함으로써 수행될 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에서 보고된 방법은 15일 이하 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 배양은 6 내지 15일 동안 수행된다. 한 실시양태에서, 면역글로불린은 항-IL-6R 항체이다.

본원에서 보고된 방법은 예를 들면, 유럽 특허 제0 409 607호, 유럽 특허 제0 628 639호, 미국 특허 제5,670,373호 또는 미국 특허 제5,795,965호(온전히 그대로 본원에 참고도 도입됨)에 보고된 인간 인터루킨-6 수용체(IL-6R)에 대한 항체의 사용에 의해 예시되는데, 이는 상기 항체 및 이를 발현하는 세포주가 본 발명의 시점에서 본 발명자들의 실험실에서 충분한 양으로 사용될 수 있었기 때문이다. 이것은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.

하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 사용될 수 있고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 기재된 절차에 대한 변경을 가할 수 있음이 이해될 것이다.

실시예

재료 및 방법

세포주:

재조합적으로 제조된 면역글로불린의 만노스-5 당구조의 양이 변경될 수 있는 예시적 CHO 세포주는 유럽 특허 제0 409 607호 및 미국 특허 제5,795,965호에 따른 항-IL-6 수용체 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 CHO 세포주이다. 상기 재조합 CHO 세포의 배양을 위해, 본 발명의 방법에 따른 글루코스 보충이 수행될 수 있는 한, 임의의 배양 배지가 사용될 수 있다. 예시적 배양 배지는, 배양 배지 성분 대 글루코스의 질량 비율이 채택되는 한, 본원에서 보고된 방법에 적합하게 변경된 IMDM, DMEM 또는 햄스(Ham's) F12 배지 또는 이들의 조합물이다. 마찬가지로, 배양 배지로부터 글루코스를 배제하고 글루코스를 배양물에 별도로 첨가할 수 있다.

배양:

항-IL-6R 항체를 발현하는 CHO 세포를 1 또는 2 ℓ 발효 용기에서 배양하였다. 공급 배지는 15 내지 40 g/ℓ 글루코스를 함유하였다. 글루코스는 예를 들면, 400 g/ℓ 글루코스를 함유하는 별도의 농축된 용액에 의해 공급될 수 있었다. pH 7.0 내지 pH 7.2의 범위 내의 pH 값에서 배양을 수행하였다.

당구조의 측정:

IgG 글리코실화 패턴의 분석을 위해 문헌[Kondo, A., et al., Agric. Biol. Chem. 54 (1990) 2169-2170]에 따른 방법을 사용하였다. 상기 IgG는 소규모 단백질 A 컬럼을 사용하여 배양 배지의 원심분리된 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 IgG의 올리고사카라이드를 N-글리코시다제(glycosidase) F(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임 소재)를 사용하여 방출시키고 환원 말단에서 2-아미노 피리딘으로 표지하였다. 표지된 올리고사카라이드를 역상 크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 각각의 정점(peak)을 상기 올리고사카라이드에 대한 질량 분광분석 및 표준물 둘다로 분류하였다.

글루코스 측정:

제조자의 매뉴얼에 따라 한 방법으로 YSI 2700 셀렉트(SELECT)(상표명) 분석기(YSI, 미국 오하이오주 옐로우 스프링스 소재)를 사용하여 글루코스 농도를 측정하였다.

생존 세포 밀도 측정:

자동 영상 처리 및 분석 시스템(세덱스(CEDEX)(등록상표); 이노베이티스(Innovatis), 독일 소재) 및 트립판 블루 염료-배제 방법을 사용하여 생존 세포 밀도를 측정하였다.

실시예 1

항체 생성 및 만노스-5 당구조(M5) 함량에 대한 DGL 조절 및 pH의 효과

국제 특허출원 공개 제WO 92/19759호(미국 특허 제5,795,965호, 미국 특허 제5,817,790호 및 미국 특허 제7,479,543호에 상응함)의 실시예 10에 보고된 인간 연장 인자 Iα 프로모터를 사용하여 일본 미심사 특허 공개 제99902/1996호의 참조예 2에 기재된 방법에 따라 제조된, 인간화된 항-인간 IL-6 수용체 항체(토실리주마브, 로액템라(RoACTEMRA)(등록상표))를 생성하는 CHO 세포 균주를 사용하여 시험을 수행하였다.

일정한 절대적인 양 공급 방법에서, 면역글로불린 생성에 대한 pH 조절의 효과가 관찰되었다. 표 2는 일정한 공급 방식에서 항체 올리고사카라이드 생성 및 M5 함량에 대한 pH 조절의 효과를 보여준다.

일정한 절대적인 양 공급 방식에서 pH 조절의 효과

번호	샘플 적용[일]	pH 설정점	DGL	상대적인 항체 농도[%]	M5 함량[%]
1	7	7.0	0.80-0.45	90.1	3.6
2	7	7.0	0.49-0.21	100	5.4
3	7	7.2	0.73-0.35	135.1	11.7
4	7	7.2	0.69-0.30	120	10.8
5	7	7.2	0.35-0.29	127	25.2
6	7	7.2	0.64-0.25	122.5	8.7

pH 7.0에서, 만노스-5 당구조(M5)의 양은 5.5% 미만으로 조절되었다. DGL 값은 세포 밀도의 변화로 인해 0.80에서 0.21로 하강하였다. 다른 한편으로, pH 7.2에서, M5 양은 8.7%와 25.2% 사이에서 변동되었고 pH 7.0에서의 M5 양보다 더 높았다. pH 7.2에서 DGL 값은 0.73부터 0.25까지 변화하였다. 더욱이, 이 경우, pH 7.2에서 면역글로불린 생성은 120%(pH 7.0과 비교할 때 상대적인 값)를 초과하였다. 일정한 절대적인 양 공급 방법에서 보다 높은 면역글로불린 생성은 8% 초과의 보다 높은 M5 함량을 유도하였다. 따라서, 일정한 절대적인 양 공급 방법에서 pH 7.0 조절을 사용하여 M5 함량을 pH 7.2 조절 방법에 비해 보다 낮은 값, 즉 8% 미만으로 효율적으로 조절할 수 있었다.

DGL 조절 방법(= 일정한 상대적인 양 공급 방법)은 다양한 pH 값에서 유가 방식에 의한 면역글로불린 제조에도 사용되었고, M5 함량이 분석되었다. 하기 표 3은 2일째 또는 3일째 날에서의 공급 개시 후 DGL 조절 및 pH가 면역글로불린 생성 및 M5 함량에 미치는 효과를 보여준다.

유가 방식에서 DGL 및 pH 조절의 효과

번호	샘플 적용[일]	pH 설정점	DGL	상대적인 항체 농도[%]	M5 함량[%]
1	7	7.0	0.8	102.7	2.9
2	7	7.0	0.6	96.2	2.7
3	7	7.0	0.4	100.0	3.3
4	7	7.0	0.3	91.1	3.9
5	7	7.0	0.2	83.0	4.0
6	7	7.2	0.6	100.9	4.4
7	7	7.2	0.4	90.1	5.3

pH 7.0에서, 0.2 내지 0.8의 DGL의 범위에서 DGL 조절 방법을 적용하였다. 그 결과, M5 함량은 4.0% 이하로 조절되었다. 다른 한편으로, pH 7.2에서, DGL 값은 0.4 내지 0.6의 범위에서 작동되었다. 이때, M5 함량은 5.5% 미만으로 조절될 수 있었다.

실시예 2

상이한 DGL 값들을 사용하는 배양

항-IL-6R 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 CHO 세포의 배양을 상이한 DGL 값들을 사용하여 수행하였다. 결과는 하기 표 4에 요약되어 있다.

면역글로불린 생성 및 M5 함량에 대한 DGL 조절 값의 효과

번호	샘플 적용 [일]	DGL	상대적인 항체 농도[%]	M5 함량[%]	G(0) 함량[%]	G(1) 함량[%]	G2 함량[%]
1	7	0.6-0.5	107.3	3.5	38.4	46.7	11.4
2	7	0.4	111.0	3.5	38.8	46.9	10.8
3	7	0.2	111.5	4.5	40.1	45.2	10.1
4	8	일정한 공급	100.0	5.9	43.8	42.0	8.3

일정한 공급과 비교할 때, 0.4 내지 0.6의 DGL 값을 사용하는 조절된 DGL 방법은 감소된 만노스-5 함량을 보여준다.

실시예 3

상이한 공급 방법들을 사용하는 배양

항-IL-6R 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 CHO 세포의 배양을 한 DGL 값을 사용하되 상이한 공급 방법들을 사용하여 수행하였다. 결과는 하기 표 5에 요약되어 있다.

생존율 및 생존 세포 밀도에 대한 공급 방법의 효과

번호	샘플 적용 후[h]	DGL	공급	조절	생존율[%]	생존 세포 밀도 [x10⁶개 세포/㎖]
1	112	0.4	단일	매일	71	5.1
2	115	0.4	이중	매일	75	5.8
3	115	0.4	단일	프로파일	73	4.9
4	115	0.4	이중	프로파일	70	5.1

단일 공급물 실험에서, 모든 영양분들 및 글루코스를 함유하는 단일 공급물을 사용하였다. 이중 공급물 실험에서, 하기 2개의 공급물을 사용하였다: 제1 공급물은 15 g/ℓ의 저농도로 모든 영양분들 및 글루코스를 함유하고, 제2 공급물은 고농도의 글루코스를 함유한다. 이들 상이한 공급물 실험들은 공급 속도를 매일 조절하면서 한 세트에서 수행되었고 보다 앞선 배양에서의 생존 세포 밀도 변화 판독기에 의거한 예정된 프로파일 후 또 다른 세트에서 수행되었다. 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 생존율 및 생존 세포 밀도는 사용된 공급 방법과 무관하게 필적할만하다.

실시예 4

유가 방식에 의한 면역글로불린 제조를 위한 글루코스 제한도( DGL ) 조절

CHO 세포(8.0 내지 12 x 10⁵개 세포/㎖)를 전술된 바와 같은 혈청 무함유 배양 배지에 접종하였다. 상기 세포를 37℃, 98% 상대습도 및 10% CO₂ 대기에서 성장시켰다. 유가 배양에서, 글루코스를 함유하는 배지의 공급을 배양 개시로부터 2일째 또는 3일째 날에 주발효기에 공급되도록 개시하였다. 상기 공급 방법은 미국 특허출원 공개 제2006/0127975 A1호에 따라 글루코스 제한도(DGL)를 조절하는 방법을 따랐다. DGL은 글루코스가 상기 세포들을 위해 자유롭게 사용가능할 때 최대 공지된 글루코스 소비 비속도에 대한 관찰된 글루코스 소비 비속도의 비율로서 정의될 수 있다(DGL = Q(glc)/Q(glc)_최대, 이때 Q(glc) = 현재 관찰된 글루코스 소비 비속도; Q(glc)_최대 = 상기 세포들에 대한 최대 공지된 글루코스 소비 비속도).

도 1은 배양물의 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 프로파일을 보여준다. DGL은 도 2에 도시된 바와 같이 다양한 세포 밀도에서 0.4 내지 0.5의 값이 되도록 조절되었다. 공급 속도는 해당 시점에서의 세포 밀도에 따라 하루에 1회 또는 2회 변화되었다. 도 3은 유가 방식에 의한 DGL에 의거한 공급 프로파일을 보여준다. 공급 속도는 세포 밀도에 따라 0.8 ㎖/h와 1.6 ㎖/h 사이에서 변화되었다. 적용된 이 공급 방법에 의해, 면역글로불린 생성 프로파일이 도 4에 도시된 바와 같이 수득되었다. 10 x 10⁵개 세포/㎖ 및 12 x 10⁵개 세포/㎖의 접종 크기를 사용하였을 때, 면역글로불린 생성은 거의 동일하였고 표 6에 나타낸 바와 같이 7일째 날에 일정한 공급 방법에서의 면역글로불린 생성의 120%를 초과하였다(0.02 g 글루코스/h의 공급 속도). 초기 세포 밀도의 20% 차이에도 불구하고, DGL 조절 방법을 사용하여 거의 동등한 면역글로불린 역가를 수득할 수 있었다. 더욱이, 접종 크기가 8.0 x 10⁵개 세포/㎖로 설정되었을 때, 공급 개시 시점의 20시간 지연에도 불구하고, 수득된 면역글로불린은 7일째 날에 110%(상대적인 값)를 초과하였다. 이들 결과에서, DGL 조절 방법은 다양한 접종 크기에서 안정한 면역글로불린 생성을 달성할 수 있었다.

실시예 5

올리고사카라이드의 만노스-5 당구조 및 갈락토실화에 대한 DGL 조절의 효과

DGL 조절을 사용하는 유가 배양에 의해 제조된 면역글로불린의 글리코실화 패턴을 분석하였다. 표 6은 일정한 공급 방법(공급 속도: 0.02 g의 글루코스/h)과 비교된, DGL 조절된 유가 배양으로부터 수득된 면역글로불린에 대한 올리고사카라이드 분석의 결과를 보여준다. 8.0 x 10⁵개 세포/㎖의 접종 크기에서, 만노스-5 당구조(M5)의 함량은 2.8%이었다. 10 x 10⁵개 세포/㎖ 및 12 x 10⁵개 세포/㎖의 접종 크기에서, M5 함량은 각각 4.1% 및 3.8%이었다. 모든 배양 조건에서, DGL 조절 방법은 M5 함량을 5.0% 미만으로 조절할 수 있었다.

한편, 각각의 조건에서, 면역글로불린 G(0) 이소형 및 면역글로불린 G(2) 이소형은 각각 40 내지 46% 및 9.0 내지 11%의 범위에서 조절되었다.

면역글로불린 생성 및 글리코실화 패턴에 대한 DGL 조절 값의 효과

번호	샘플 적용[일]	DGL	접종 세포 밀도 [x10⁵개 세포/㎖]	상대적인 항체 농도[%]	M5 함량[%]	G(0) 함량[%]	G(1) 함량[%]	G(2) 함량[%]
1	7	일정한 공급	10	100.0	3.5	45.7	41.5	9.2
2	7	0.4	8	112.5	2.8	41.7	44.7	10.8
3	7	0.4	10	122.6	4.1	42.9	43.1	9.8
4	7	0.4	12	127.1	3.8	45.5	41.5	9.1

Claims

a) 배양 배지에서 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계로서, 이때 배양 배지 중의 단일 세포의 현재 글루코스 소비 비속도(specific glucose consumption rate) 대 동일한 종류의 세포의 최대 공지된 글루코스 소비 비속도의 비율이 0.6 내지 0.4의 범위 내에서 일정하게 유지되는, 단계; 및
b) 배양물로부터 상기 면역글로불린을 회수하는 단계
를 포함하는, 면역글로불린 제조에서 만노스-5 당구조를 갖는 면역글로불린의 양을 감소시키는 방법.
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제 1 항에 있어서,
배양이 유가(fed-batch) 배양임을 특징으로 하는, 방법.
제 6 항에 있어서,
배양이 유가 배양이고, 이때 공급이 배양의 2일째 또는 3일째에 개시됨을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
배양이 pH 6.5 내지 7.5의 pH 값에서 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
제 8 항에 있어서,
배양이 pH 6.9 내지 7.3의 pH 값에서 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
제 9 항에 있어서,
배양이 pH 6.95 내지 7.05의 pH 값 또는 pH 7.15 내지 pH 7.25의 pH 값에서 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
면역글로불린이 클래스(class) G 또는 클래스 E의 면역글로불린임을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
진핵 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, 하이브리도마 세포, PER.C6(등록상표) 세포, 곤충 세포 및 Sp2/0 세포를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
제 12 항에 있어서,
진핵 세포가 CHO 세포임을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
숙주 세포의 배양이 6 내지 20일 동안 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
면역글로불린이 항-인터루킨-6 수용체(anti-IL-6R) 항체임을 특징으로 하는, 방법.
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