DE102008013899A1

DE102008013899A1 - Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine bei konstantem Gehalt von pCO2 im Medium

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Publication number: DE102008013899A1
Application number: DE102008013899A
Authority: DE
Inventors: Detlef Eisenkraetzer; Jochen Gaetgens; Alexander Jockwer; Christian Klinger; Thomas Noll; Barbara Sueess
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2008-03-12
Filing date: 2008-03-12
Publication date: 2009-09-17
Also published as: US20110159539A1; JP5487124B2; WO2009112250A1; EP2283120A1; EP2283120B1; JP2011512852A; ES2408979T3; US8460895B2; CN101970646A; CA2716577A1

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids in einer im Zitratzyklus modifizierten eukaryontischen Wirtszelle, wobei das Verfahren das Züchten der eukaryontischen Wirtszelle in einem geeigneten Medium unter Bedingungen umfasst, die die Expression des Polypeptids erlauben, wobei der Gehalt an gelöstem CO2 (pCO2) im Medium auf einem konstanten Wert im Bereich von 5% bis 25% gehalten wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids in einer im Zitratzyklus modifizierten eukaryontischen Wirtszelle, wobei die Zelle in einem Medium kultiviert wird, dessen Gehalt an gelöstem CO₂ (pCO₂) auf einem konstanten Wert im Bereich von 5% bis 25% gehalten wird.
Die Herstellung von therapeutischen Proteinen im Tonnenmaßstab für spezifische Therapien stellt neue Anforderung an Expressions- und Produktionssysteme. Hauptsächliche Anwendung als Expressionssysteme finden u. a. tierische Zellkultursysteme. Die Fähigkeit tierischer Zellen, Proteine korrekt zu falten und posttranslational zu modifizieren, ist Voraussetzung vor allem für klinische Anwendungen im Menschen. Mittlerweile werden fast 70% aller rekombinanten Proteine in der Pharmaindustrie in tierischen Zellen hergestellt, davon die meisten in CHO-(Chinese Hamster Ovary)Zellen (Wurm, 2004). Im Vergleich zu mikrobiologischen Systemen zeichnen sich tierische Zellkulturprozesse jedoch durch höhere Generationszeiten und geringere Endzelldichten in Fermentationen aus. Damit sind Produkttiter und Raum-Zeit-Ausbeuten geringer als bei mikrobiellen Prozessen. Eine Möglichkeit, diesen Nachteil zu kompensieren, ist das metabolic engineering, d. h., die Kontrolle des Zellwachstums und die Minimierung der Apoptose, des programmierten Zelltods über genetische Veränderungen der produzierenden Zellen. Zusätzlich zu genetischen Ansätzen behaupten sich Kultivierungskontrollstrategien weiterhin als sinnvolle Optimierungsansätze mit oftmals unterschätztem Potential. So kann auch auf Glykosyslierung, Kohlenstoffstoffwechsel, Zellwachstum und Zelltod effizient über verfahrenstechnische Kontroll- und Regelstrategien, als auch über Kulturmedienzusammensetzungen eingewirkt werden.
Somit ist neben der Entwicklung von metabolisch optimierten Zelllinien das Ziel der Prozessentwicklung, durch optimale Milieubedingungen und Prozessführungsstrategien das Potential einer vorhandenen Zelllinie bestmöglich auszuschöpfen. Neben bereits gut beherrschbaren Prozessparametern wie Sauerstoffgehalt oder Temperatur finden heute zunehmend auch komplexere Einflussgrößen wie der Gehalt an gelöstem Kohlenstoffdioxid in Prozessführungsstrategien Beachtung. CO₂ reichert sich als Endprodukt in tierischen Zellkulturprozessen physikalisch gelöst und chemisch dissoziiert als Hydrogencarbonat in wässrigen Kulturmedien an. Aufgrund der Entwicklung zu Hochzelldichteverfahren mit tierischen Zellen in Fed Batch Prozessen resultieren heute zusammen mit den industriell verwendeten großvolumigen Fermentern und den dort vorherrschenden hydrostatischen Drücken CO₂-Partialdrücke von 150–200 mm Hg, welche damit fünfmal über den zellphysiologischen Werten von 31–54 mm Hg liegen. Für solch hohe pCO₂-Konzentrationen wurden nachteilige Effekte auf Wachstum und Produktivität für Hybridoma, NS0, CHO, BHK und Insektenzellen berichtet. In industriellen Großfermentern ist die Akkumulation von CO₂ ein limitierender Faktor. Das Austreiben von gelöstem CO₂ aus dem Kulturmedium stellt die Verfahrenstechnik vor große Herausforderungen. Auf der einen Seite muss die Sauerstoffversorgung der kultivierten Zellen sichergestellt werden. Stellgrößen, um den Sauerstoffübergang in die Flüssigphase zu erhöhen, sind z. B. Rührergeschwindigkeiten und Gasvolumenströme. Diese können aber wegen auftretenden z. T. zellschädigenden Scherkräften und Schaumbildung nicht beliebig variiert werden.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, ein optimiertes Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen in eukaryontischen Wirtszellen bereitzustellen, das die vorstehend beschriebenen Nachteile überwindet, d. h., bei dem stets ein Optimum an physikalisch gelöstem CO₂ im Medium gewährleistet ist.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen. Die zu der vorliegenden Erfindung führende Strategie verfolgte den Ansatz der pCO₂-Sollwertregelung bei gleichzeitiger Regelung von Gelöst-Sauerstoff, pH-Wert und Reaktorüberdruck. Dieser rationale Ansatz der entkoppelten Regelung möglichst vieler Parameter, die mit der pCO₂-Problematik in Zusammenhang gebracht werden, führte zu dem überraschenden Ergebnis, dass bei konstant gehaltenem pCO₂ mit einem Wert im Bereich von 5% bis 25% gelöstem CO₂ unerwartet hohe Steigerungen der Ausbeuten an rekombinant produziertem Protein. Außerdem wirkte sich die Regelung der pCO₂-Konzentrationen über die gesamte Fermentationsdauer positiv auf die Viabilitäten der Kulturen aus und ermöglichte eine verlängerte stationäre Hochzelldichtephase. Die einzelnen Ergebnisse der in der zu der vorliegenden Erfindung führenden Strategie bei Anwendung in Kultivierungen tierischer Zellen sind nachstehend nochmals zusammengefasst:
(a) pCO₂-Regelung
Auf Basis einer in situ sterilisierbaren pCO₂-Sonde wurde für die Untersuchungen ein pCO₂-Regler entwickelt, der industriellen Ansprüchen genügt und erfolgreich in die Entwicklungsfermentation implementiert wurde. Dieser pCO₂-Regler ermöglicht bei gleichzeitiger, unabhängiger Regelung des pO₂ und des pH-Werts sowohl eine pCO₂-statische Kulturführung, als auch die Generierung von pCO₂-Sollwertprofilen. Anwendungen in Fed Batch und Chemostat Betriebsweisen im 1 L und 10 L Maßstab wurden erfolgreich etabliert. Die Regelungsbandbreite beträgt 1.5–25.0% pCO₂. Industrielle Fragestellungen können dadurch für den Parameter pCO₂ im Kleinmaßstab bearbeitet werden.
(b) Überdruckregelung
Ein Überdruckregler wurde für die Maßstäbe 1 L (bis 150 mbar Überdruck) und 10 L (bis 1000 mbar Überdruck) entwickelt, der unabhängig von den Reglern für pCO₂, pO₂ und pH-Wert anwendbar ist. Fragestellungen der Maßstabsübertragung in industriellen Bioprozessen (hydrostatische Druck, Mischzeit) sind dadurch im Kleinmaßstab abbildbar.
(c) pH-Korrekturmittel
Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Na₂CO₃ zur basischen pH-Korrektur eine erhöhte Lebendzelldichte, eine verlängerte viable Kulturdauer und dadurch eine erhöhte Raum-Zeit-Ausbeute eines monoklonalen Antikörper-Fusionsproteins in CHO-Kulturen erzielt.
(d) Druckregulierte Probeentnahme
Die druckregulierte Probe-Entnahmevorrichtung ermöglicht die Behandlung von Fermentationsproben unter Bioreaktorbedingungen (Temperatur, Überdruck, pCO₂). Intrazelluläre Vorgänge (z. B. intrazellulärer pH-Wert) können dadurch erstmalig unter Bioprozessbedingungen untersucht werden.
(e) Einfluss des pCO₂ auf den intrazellulären pH-Wert von CHO-Zellen
Durch den entwickelten pCO₂-Regler zusammen mit der druckregulierten Probeentnahme konnte erstmalig die zweiphasige Reaktion des intrazellulären pH-Werts auf pCO₂-Wertänderungen im Kulturmedium beobachtet werden. Der „chemische Effekt” als unmittelbarer Effekt bedingt nach dem Dissoziationsgleichgewicht von CO₂ in wässrigen Lösungen eine kurzfristige Änderung (Ansäuerung des Cytosols bei pCO₂-Anstieg, Alkalisierung des Cytosols bei pCO₂-Absättigung) des intrazellulären pH-Werts. Ihm entgegengesetzt ist eine langfristige und permanente Reaktion der Zelle, der „physiologische Effekt”. Diese Superkompensation der durch den „chemischen Effekt” bewirkten Auslenkung des intrazellulären pH-Werts konnte in vitro als auch in situ (Chemostat) erstmalig beobachtet werden. Je stärker der pCO₂-Gradient war, desto stärker fiel die Änderung des intrazellulären pH-Werts aus.
(f) Erkenntnisse aus pCO₂-geregelten Bioprozessen mit rekombinanten CHO-Zelllinien

• Eine statische pCO₂-Sollwertregelung erhöht die Prozessrobustheit.
• pCO₂-Sollwertprofile können zusammen mit zellphysiologischen Untersuchungen unter Bioprozessbedingungen zur rationalen Bioprozessentwicklung eingesetzt werden.
• Die pCO₂-Spiegel) stehen in direktem Zusammenhang mit dem intrazellulärem pH-Wert.
• Der intrazellulärer pH-Wert steht in Zusammenhang mit der Zellzyklusphasenverteilung.
• Ein steigender Gradient zwischen extrazellulärem pH-Wert und intrazellulärem pH-Wert begünstigt die Bildung und Ausschleusung von Laktat.
• Über die pH-Regelung des Kulturmediums hinaus kann über eine pCO₂-Regelung bei pH-statischen Bioprozessen über den intrazellulären pH-Wert die Laktatbildung beeinflusst werden, auch unter glukoselimitierten Prozessbedingungen.
• Die rekombinante Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2, die die cytosolische Pyruvatcarboxylase exprimiert, zeigte einen pCO₂-sensitiven Energiestoffwechsel. Durch Erhöhung des geregelten statischen pCO₂-Spiegels konnte über eine Erhöhung des intrazellulären pH-Werts im Kulturverlauf der oxidative Stoffwechsel intensiviert werden. Darüber hinaus zeigte mit Erhöhung des statisch geregelten pCO₂-Spiegels eine verlängerte viable Kulturdauer, eine effiziente Arretierung des Zellzyklus in der G1G0-Phase, eine gesteigerte zellspezifische Produktivität und eine Erhöhung der Raumzeitausbeute um 100%.
• Eine verlängerte Kulturdauer ist bei statisch pCO₂-geregelten Bioprozessen primär dem erhöhten pCO₂-Spiegelt zuzuordnen, nicht der Osmolalität.
• Die Prozessoptima der geregelten pCO₂-Spiegel) sind bei 15% pCO₂ zu finden.
• Die Regelung des pCO₂ und damit die Verhinderung der Akkumulation von CO₂ im wässrigen Medium von Bioprozessen erlaubt auch in HCO₃ ^–-gepufferten Medien eine zuverlässige online Bestimmung des respiratorischen Quotienten RQ in Zellkulturprozessen mit Abgasanalytik.

Beschreibung der Figuren
1: Schematischer Regelkreis des entwickelten kaskadierten pCO₂-Reglers
Sollwertunterschreitung des pCO₂: PID 1 regelt Öffnungsweite des im Ratiomodus installierten CO₂-MFC (0–5 L·h^–1) bis zum Erreichen des Sollwerts. Sollwertüberschreitung des pCO₂: PID 1 schließt zunächst CO₂-MFC und öffnet bei weiterhin bestehender positiver Sollwertabweichung über PID 2 zusätzlichen N₂-MFC (0–15 L·h^–1) (Regler-Kaskade).
2: Geregelte Gelöstgaskonzentrationen pO₂ und pCO₂ über Ratiobegasung und maximierten CO₂-Austrag durch erhöhte Begasungsrate im 10 L-Rührkesselreaktor
50 mbar Überdruck, 0.15 M NaCl, 37°C, 200 rpm, pH ungeregelt.
3: Geregelte Gelöstgaskonzentrationen pO₂ und pCO₂ über Ratiobegasung und maximierten CO₂-Austrag durch erhöhte Begasungsrate im 10 L-Rührkesselreaktor bei 750 mbar Überdruck
0.15 M NaCl, 37°C, 200 rpm, pH ungeregelt.
4: Schematisches Prozessleitbild der implementierten Überdruckregelstrecke im Biostat ES
5: Dynamische Sollwertführung der Regelgrößen Gelöstkohlendioxidkonzentration pCO₂ (durchgehend) und Überdruck p (gestrichelt) im 10 L-Rührkesselreaktor
Biostat ES, B. Braun International; industrielles Produktionsmedium, Standardfermentationsparameter) durch entwickelte PID-Regler in der Prozessleitsoftware LabView.
6: Titrationsprofil der pH-Korrektur auf pH 7.2 mit 1 M NaOH bei einem Sollwertsprung von 5% pCO₂ auf 15% pCO₂
Biostat ES, Ratiobegasung 30 L·h^–1, 10 L Arbeitsvolumen, wässrige Pufferlösung mit NaHCO₃/NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ analog industriellem Produktionsmedium, 37°C, 750 mbar Überdruck
7: Titrationsprofil der pH-Korrektur auf pH 7.2 mit 1 M Na₂CO₃ bei einem Sollwertsprung von 5% pCO₂ auf 15% pCO₂
Biostat ES, Ratiobegasung 30 L·h^–1, 10 L Arbeitsvolumen, wässrige Pufferlösung mit NaHCO₃/NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ analog industriellem Produktionsmedium, 37°C, 750 mbar Überdruck
8: Kumulativer Eintrag der 1 M Basen zur pH-Korrektur bei einem Sollwertsprung von 5% pCO₂ auf 15% pCO₂
Biostat ES, Ratiobegasung 30 L·h^–1, 10 L Arbeitsvolumen, wässrige Pufferlösung mit NaHCO₃/NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ analog industriellem Produktionsmedium, 37°C, 750 mbar Überdruck
9: Fed Batch Fermentation mit konstant 5% (v/v) CO₂ in der Begasungsmischung und pH-Korrekturmitteln NaOH bzw. Na₂CO₃
Lebendzelldichten ZDL, Viabilitäten VIA, Produkttiter PRO (1 L, CHO-MUC1, 150 mbar Überdruck pH 7.2, 200 rpm, Membranbegasung).
10: Fed Batch Fermentation mit variablen CO₂-Anteilen in der Begasungsmischung und pH-Korrekturmitteln NaOH bzw. Na₂CO₃
Lebendzelldichten ZDL, Viabilitäten VIA, Produkttiter PRO (1 L, CHO-MUC1, 150 mbar Überdruck pH 7.2, 200 rpm, Membranbegasung; s. a. 11).
11: Glukose- und Laktatkonzentrationen bei Fed Batch Kultivierung der Zelllinie CHO-MUC1 mit pH-abhängigen variablen CO₂-Anteilen in der Begasungsmischung
1 L, CHO-MUC1, 150 mbar Überdruck pH 7.2, 200 rpm, Membranbegasung; s. a. 10.
12: Osmolalitäten OSM und Lebendzelldichten ZDL einer Fed Batch Fermentation
1 L, CHO-MUC1, 150 mbar Überdruck pH 7.2, 200 rpm, Membranbegasung.
13: Kombinierte Parameter zur Charakterisierung der unterschiedlichen Probeentnahmeverfahren am Biostat ES (10 L)
offene, geschlossene Lagerung: vollständig medienbefüllte Reaktionsröhrchen (50 mL, Falcon); entwickelte Probeentnahmevorrichtung: vollständig medienbefüllte, gasdichte und verschlossene Spritze ohne Überdruck.
14: CO₂-Verlust bei unterschiedlichen Probeentnahmearten unter atmosphärischem Druck am Biostat ES
(0.15 M NaCl, 630 mbar Überdruck), in situ und off-line pCO₂-Messung YSI bzw. AVL Compact 3; vollständig medienbefüllte Reaktionsröhrchen (50 mL, Falcon)
15: In situ CO₂-Gleichgewichtskonzentrationen (Biostat ES) für verschiedene Überdrücke (A), zeitabhängige CO₂-Konzentrationen in der Probe nach Entnahme durch gasdichte Spritze und anschließende überdrucklose Lagerung (B)
0.15 M NaCl, 37°C, sonst Standardfermentations-Bedingungen im Rührkessel.
16: Foto der druckregulierten Probeentnahmeeinheit am Biostat ES mit Bezeichnung der im Text beschriebenen Bauteile
17: Transparente Halteeinheit (1) der entwickelten druckregulierten Probeentnahmevorrichtung mit drei verschiedenen Spritzen (2–4) für unterschiedliche Probevolumina und Adapterhülse (5) für passgenauen Einsatz der Spritzen in die Halterung
Probenvolumen sind durch Arretierung der hinteren Begrenzungsplatte (6) voreinstellbar.
18: Aufsicht auf die Halteeinheit der entwickelten druckhaltenden Probeentnahmevorrichtung mit installierter Spritze
19: Vergleich der in situ CO₂-Konzentrationen (in situ YSI; off-line AVL Compact 3) im zellhaltigen Produktionsmedium am Ende einer Fermentation mit 750 mbar Überdruck der CHO-MUC1 Zelllinie
Lagerung der Proben bei 37°C und unbewegt über Messzeitraum; vollständig medienbefüllte Reaktionsröhrchen (50 mL, Falcon)
20: Durchflusszytometrische pH_i-Messungen nach 25 min. (A, B) bzw. 50 min. (C) druckloser Inkubation mit dem Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1; Fluoreszenzen (FL2, FL3) bzw. deren Intensitätsverhältnisse (Ratio)
Erläuterungen siehe Text.
21: Durchflusszytometrische pH_i-Messungen nach 25 min. isobarer Inkubation in der entwickelten druckregulierten Probeentnahmevorrichtung mit dem Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1 (D) bzw. nach isobarer Lagerung (25 min.) und anschliessender druckloser Inkubation (25 min.) mit dem Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1 (E); Fluoreszenzen (FL2, FL3) bzw. deren Intensitätsverhältnisse (Ratio)
Erläuterungen siehe Text.
22: Kurzfristig intrazellulär alkalisierender Effekt unterschiedlicher pCO₂-Abreicherungen im Medium auf die darin kultivierte CHO-MUC1-Zelllinie
CO₂-Abreicherung durch Begasung der SNARF-1 gefärbten Zellsuspension in vitro mit Luft zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Inkubation. Gesamtinkubationsdauer vor durchflusszytometrischer Bestimmung des intrazellulären pH-Werts und Absättigungsdauer durch Begasung mit Luft für alle Proben identisch.
23: Initialer intrazellulär alkalisierender Effekt bei Abreicherung von Gelöst-CO₂ aus dem Kulturmedium auf die darin kultivierte CHO-MUC1-Zelllinie (< 5 min) und anschließende Azidifizierung des Zytosols durch physiologischen Effekt (< 40 min)
CO₂-Abreicherung durch Begasung der SNARF-1 gefärbten Zellsuspension in vitro mit Luft zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Inkubation. Gesamtinkubationsdauer vor durchflusszytometrischer Bestimmung des intrazellulären pH-Werts und Absättigungsdauer durch Begasung mit Luft für alle Proben identisch.
24: Zweiphasige pH_i-Verläufe bei unterschiedlichen Start-pCO₂-Konzentrationen von 5%, 7% und 10%. Initialer intrazellulär alkalisierender Effekt bei Abreicherung von Gelöst-CO₂ aus dem Kulturmedium auf die darin kultivierte CHO-MUC1-Zelllinie (chemischer Effekt) und nachfolgende Superkompensation der Alkalisierung durch physiologischen Effekt unter den Ausgangs-pH_i
CO₂-Abreicherung durch Begasung der SNARF-1 gefärbten Zellsuspension in vitro mit Luft zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Inkubation. Gesamtinkubationsdauer vor durchflusszytometrischer Bestimmung des intrazellulären pH-Werts und Absättigungsdauer durch Begasung mit Luft für alle Proben identisch.
25: pCO₂-geregelter kontinuierlicher Prozess (1.0 L, D = 0.8 d^–1, pH 7.0, Korrekturmittel Na₂CO₃ 1 M) mit pCO₂-Sprüngen von 2.5% auf 5.0%, bzw. von 5.0% auf 10%
26: Lebendzellzahlen ZDL und Viabilitäten VIA bei 5%, 15%, 25% bzw 5–15% pCO₂
CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
27: G0G1 Phasenanteile der Zellzyklusverteilungen bei Prozessen mit unterschiedlichen pCO₂-Sollwertregelungen
CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
28: Wendepunkt im Zellzyklusphasenanteil G0G1, zugehöriger pCO₂-Wert und intrazellulärer pH-Wert pH_i im pCO₂-Industrieprofil
5–15%, CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen.
29: G0G1-Phasenanteil und intrazellulärer pH-Wert pH_i bei 25% pCO₂
CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
30: Spezifische Glutaminverbrauchsraten qGLN bei unterschiedlichen pCO₂-Sollwertprofilen
CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
31: Spezifische Ausbeutekoeffizienten Y bezüglich Glutamat GLT pro Glutamin GLN
CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
32: Zellspezifische Laktatbildungsraten qLAC bei unterschiedlichen pCO₂-Sollwertprofilen
CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
33: Laktatbildung LAC bei unterschiedlichen pCO₂-Sollwertprofilen
CHO-MUC1, 10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
34: Produkttiter PRO MUC1-IgG
10 L Fed Batch, 750 mbar Überdruck, Standardfermentationsbedingungen
35: Glukoselimitierter Chemostatbetrieb (1 L) der Zelllinie CHO-MUC1
Zellspezifische Laktatbildung qLAC erhöht durch pH-Regelung bzw. pCO₂-Sollwerterhöhung; spezifische Wachstumsrate μ, Durchflussrate D.
36: Glukoselimitierter Chemostatbetrieb (1 L) der Zelllinie CHO-MUC1
Glukose-, Laktat- bzw. Glutaminkonzentrationsverläufe (GLC, LAC bzw. GLN)
37: (a) herkömmlicher Stoffwechselweg vom Substrat Glukose über Pyruvat zu Laktat; (b) Ermöglichung der Umsetzung von Pyruvat und Hydrogencarbonat zu Oxalacetat und Einschleusung von nachfolgendem Malat in den Tricarbonsäurezyklus (TCA) durch die cytosolische Pyruvatcarboxylase PYC2; modifiziert nach (Irani, 1999)
38: Fed-Batch Kultivierungen der Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2: Verlauf der Lebendzelldichten (geschlossen) und pCO₂-Konzentrationen (offen), Regelung des pCO₂ auf 5% und 15% bzw. keine Regelung des pCO₂
39: Lebendzelldichten ZDL und Viabilitäten VIA bei ungeregelten und geregelten pCO₂-Konzentrationen von 5% bzw. 15% im 1 L-Fed Batch der Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2: pCO₂-Regelung ermöglicht längere Produktionszeit mit hochviablen Zellen.
40: Osmolalität OSM und kumulativer Laugeneintrag (1 M Na₂CO₃) bei ungeregeltem pCO₂, geregelten 5% bzw. 15% pCO₂
Stärkerer Laugeneintrag während der exponentiellen Wachstumsphase bei ungeregeltem pCO₂ im Vergleich zu den pCO₂-geregelten Prozessen; vergleichbarer Osmolalitätsverlauf bei allen Prozessen.
41: In den einzelnen Bioprozessen akkumulierte Laktatkonzentrationen LAC
pCO₂-Regelung beugt schneller und hoher Laktatbildung vor.
42: Zellspezifische Laktatbildungsraten qLAC
Laktatverstoffwechselung bei ungeregeltem pCO₂ (ab 180 h) und geregelten 5% pCO₂ (ab 220 h) beobachtbar; keine Verstoffwechselung von Laktat bei geregelten 15% pCO₂.
43: Zellspezifische Produktbildungsraten SPR des rekombinanten Wachstumsfaktors hGM-CSF bei unterschiedlichen pCO₂-Prozessbedingungen
Inverses Verhalten bei pCO₂-ungeregeltem Prozess gegenüber pCO₂-geregelten Prozessen: Abnahme der SPR bei Eintritt in die stationäre Wachstumsphase bei fehlender pCO₂-Regelung; dagegen starker Anstieg der SPR bei geregelten 5% bzw. 15% pCO₂.
44: Absolute Endkonzentrationen des produzierten Wachstumsfaktors hGM-CSF bei Fermentationsende (80% Viabilität der Kultur) für das jeweilige pCO₂-Profil
45: Zellzyklusverteilungsratio S/(G0G1), zellspezifische Produktbildungsrate SPR und intrazellulärer pH-Wert pH_i im Verlauf einer pCO₂-ungeregeltem Fed Batch Kultivierung der Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2
Absinken des pH_i nach Start der Zufütterung um etwa 0.3, Anstieg des pH_i mit Eintritt in stationäre Wachstumsphase.
46: Zellzyklusverteilungsratio S/(G0G1), zellspezifische Produktbildungsrate SPR und intrazellulärer pH-Wert pH_i im Verlauf einer auf 5% pCO₂ geregelten Fed Batch Kultivierung der Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2
Absinken des pH_i nach Start der Zufütterung um etwa 0.4, Anstieg des pH_i und der SPR bei Eintritt in stationäre Wachstumsphase.
47: Zellzyklusverteilungsratio S/(G0G1), zellspezifische Produktbildungsrate SPR und intrazellulärer pH-Wert pH_i im Verlauf einer auf 15% pCO₂ geregelten Fed Batch Kultivierung der Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2
Kein Absinken des pH_i nach Start der Zufütterung, geringes anfängliches Absinken des pHi Anstieg bei Eintritt in die stationäre Wachstumsphase, danach Anstieg mit der SPR.
48: Zellspezifische Produktivitäten und Zellzyklusphasenanteile G0G1 der Fed-Batch Prozesse mit ungeregeltem bzw. auf 5% und 15% pCO₂ geregelten pCO₂
1 L Maßstab, Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2, Standardfermentationsbedingungen
49: OUR, CPR und RQ des Fed-Batch Prozesses mit geregelten 5% pCO₂
CHO-hGM-CSF-PYC2, 1 L Fed Batch, Standardfermentationsbedingungen
50: OUR, CPR und RQ des Fed-Batch Prozesses mit geregelten 15% pCO₂
CHO-hGM-CSF-PYC2, 1 L Fed Batch, Standardfermentationsbedingungen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids in einer im Zitratzyklus modifizierten eukaryontischen Wirtszelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Züchten der eukaryontischen Wirtszelle in einem geeigneten Medium unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben, wobei der Gehalt an gelöstem CO₂ (pCO₂) im Medium auf einem konstanten Wert im Bereich von 5% bis 25% gehalten wird; und
(b) Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle oder aus dem Medium.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine sehr hohe Produktkonzentration erreicht, was zur Senkung der Aufarbeitungskosten führt. Die Erhöhung des Produktliters ermöglicht somit die Produktion einer gewünschten Menge an Produkten in einem kleineren Kultivierungsvolumen, was zu geringeren Investitionskosten führt.
Der Fachmann kennt Gene, deren Produkte in den Zitratzyklus involviert sind und ist somit in der Lage, im Zitratzyklus modifizierte eukaryontische Wirtszellen, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, herzustellen (sieh, z. B., Irani et al. (1999), Chen et al. (2001), Paredes et al. (1999), Bell et al. (1995)). Darüber hinaus kann er auf Wirtszellen mit solchen Modifikationen zurückgreifen, die bereits über öffentlich zugängliche Quellen erhältlich sind. Der Fachmann kennt darüber hinaus auch geeignete Kultivierungsbedingungen und Medien zur Züchtung solcher Zellen sowie Bedingungen unter denen das, das gewünschte rekombinante Protein exprimierende Gen möglichst stark exprimiert wird. Zur Erzielung eines konstanten Gehalts an gelöstem CO₂ im Medium kann der Fachmann vorzugsweise auf die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Regeleinheiten zurückgreifen.
Der hier verwendete Begriff „konstanter Wert” bedeutet, dass der Gehalt an gelöstem CO₂ nicht mehr als 20% von dem gewünschten bzw. programmierten Sollwert abweicht, d. h. beispielsweise bei einem Sollwert von 10% im Bereich von 8–12% liegt.
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann mit verschiedenen eukaryontischen Produktionszellinien durchgeführt werden. Die Modifikation im Zitratzyklus, vorzugsweise genetische Modifikation, kann beispielsweise durch Insertion von zusätzlichen Genen des gleichen Organismus oder eines anderen Organismus in die DNA, oder einen Vektor erfolgen, oder in der Verstärkung bzw. Abschwächung der Aktivität bzw. Expression eines Gens durch Einbringen eines wirksameren Promotors, zum Beispiel aus CMV erfolgen oder durch entsprechende Mutationen im kodierenden Bereich des Gens, die zur Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäureresten führen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Wirtszelle eine tierische Zelle, vorzugsweise Säugerzelle, oder Insektenzelle. Solche Zellen, insbesondere Zellen zur effizienten Produktion rekombinanter Polypeptide, sind dem Fachmann bekannt. Folgende Ziellinien können beispielhaft genannt werden: Säugerzellen, wie CHO Ziellinien, wie zum Beispiel CHO-K1, BHK, wie BHK-21, Hybridoma, NS/0, andere Myelomazellen und Insektenzellen oder andere höhere Zellen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Zellen, die nicht vorzugsweise wachstumsgekoppelt produzieren.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Wirtszelle eine im Zitratzyklus modifizierte Wirtszelle. Die einzelnen Stoffwechselwege des Zitratzyklus sind schon seit langem bekannt, sowie die beteiligten Gene und deren Regulation. Somit kann der Fachmann die gewünschte(n) Modifikation(en) gemäß Standartverfahren durchführen. Eine besonders bevorzugte im Zitratzyklus modifizierte Wirtszelle ist eine Zelle, die eine cytosolische Pyruvatcarboxylase exprimiert, vorzugsweise eine cytosolische Pyruvatcarboxlayse aus Saccharomyces cerevisiae (PYC2, Isoenzym 2). Das diese Carboxylase kodierende Gen sowie geeignete Expressionsvektoren zur Transformation eukaryontischer Zellen sind z. B. in US-Patent Nr. 6,706,524 und Stucka et al. (1991) beschrieben; s. a. Wagner, 1998; Irani, 1999; Bollati Fogolin, 2003; WO 00/46378 .
Besonders bevorzugt für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Zellinie CHO-hGM-CSF-PYC2, deren Herstellung ebenfalls in US-Patent Nr. 6,706,524 detailliert beschrieben ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Polypeptide, wie Glykoproteine, Fusionsproteine, Antikörper und deren Fragmente, Interferone, Cytokine, vorzugsweise hGM-CSF, Wachstumsfaktoren, z. B. Erythropoetin (EPO), Hormone etc. in hoher Ausbeute rekombinant gewonnen werden.
Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der Gehalt an gelöstem CO₂ durch geeignete Maßnahmen wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben konstant gehalten wird. Der Fachmann kann – in Abhängigkeit von der verwendeten Ziellinie – den besonders geeigneten Gehalt an CO₂ innerhalb des Bereichs von 5% bis 25% mittels Routineversuchen bestimmen. Vorzugsweise liegt der konstant zu haltende Gehalt an gelöstem CO₂ (pCO₂) im Bereich von 10% bis 20%, noch mehr bevorzugt im Bereich von 12,5% bis 17,5%.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in allgemein bekannten Verfahrensweisen durchgeführt werden, z. B. als Batch-, Fed-Batch-, chemostatischer Prozess oder als Perfusionskultur, wobei Fed-Batch-Verfahren bevorzugt sind. Dabei können alle gängigen Arten von Kulturgefäßen, wie zum Beispiel Rührkessel, verwendet werden. Vorzugsweise sollte das Kultursystem hohe Zelldichten ermöglichen.
Als Kulturmedium kann prinzipiell jedes für das Züchten eukaryontischer Zellen geeignete Medium eingesetzt werden. Für die Kultivierung von Säugerzellen können auch Medien basierend auf bekannten Rezepturen, wie zum Beispiel IMDM, DMEM oder Ham's F12 eingesetzt werden, die u. U. so auf die erfindungsgemäße Verfahrensweise optimiert wurden, dass keine Limitierung hinsichtlich bestimmter Einzelkomponenten auftritt. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass einzelne Komponenten höher konzentriert werden. Generell ist es auch möglich, bei Bedarf einzelne Nährstoffe separat vom Medium zu dosieren.
Der pH-Bereich liegt vorzugsweise zwischen 6,7–7,7, besonders bevorzugt zwischen 7–7,3. Jedoch sind auch andere pH-Bereiche denkbar. Der Temperaturbereich liegt vorzugsweise zwischen 35°C–38,5°C, besonders bevorzugt bei 37°C, z. B. für Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen. Es sind aber auch andere Temperaturbereiche denkbar, wie beispielsweise < 35°C im Fall von Nicht-Säugerzellen.
Zur Konstanthaltung des Gehalts an gelöstem CO₂ im Medium wird dieser vorzugsweise über einen Regelkreis mit einem kaskadierten pCO₂-Regler über Massendurchflussventile (MFC) konstant gehalten wird, beispielsweise so wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Besonders bevorzugt und vorteilhaft ist eine Vorgehensweise, bei der über die MFC (a) bei einer Sollwertunterschreitung des pCO₂ im Medium der CO₂-Anteil in der Zuluft erhöht wird, (b) bei einer Sollwertüberschreitung des pCO₂ im Medium der CO₂-Anteil in der Zuluft verringert wird, und (c) bei einer Sollwertüberschreitung, die durch Verringerung des CO₂-Anteils in der Zuluft nicht ausreichend kompensierbar ist, der kaskadierte Regler, vorzugsweise in Kombination mit Schritt (b), ein zusätzliches MFC zur Einleitung von N₂ öffnet.
Beispiel 1
Material und Methoden
(A) Zelllinien
Alle verwendeten Zelllinien sind auf suspendierte Kultivierung in serumfreien Medien adaptiert worden.
(1) CHO-MUC1
Die in dieser Erfindung verwendete CHO-MUC1-Zelllinie basiert auf einer CHO-K1-Zelllinie von ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, USA) (CCL-61). Mittels Elektroporation wurde diese in konfluenter Kultur mit dem rekombinanten Plasmid MUC1-IgG2a-pcDNA3 (Link et al., 2004) transfiziert. Das unter der konstitutiven Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors (CMV) stehende Konstrukt vermittelt neben der Resistenz gegen das Antibiotikum Geneticin (G418) auch die Expression des MUC1-IgG2a-Fusionsproteins. Der extrazelluläre Teil des humanen brustkrebsassoziierten Mucin-Glykoproteins MUC1 (C-terminal) ist dabei über eine Enterokinaseschnittstelle an den Fc-Teil eines murinen Immunglobulins der Subklasse 2a (IgG2a) fusioniert (N-terminal) und wird so ins Medium sekretiert. Selektion und anschließende Subklonierung ergaben den Klon CHO-MUC1-IgG2a-PH3931-16TR, der in dieser Erfindung eingesetzt wurde (Link 2003). Diese Zelllinie weist eine Geniticinresistenz bis zu einer Konzentration von 400 μg mL^–1 auf.
(2) CHO-hGM-CSF-PYC2
Klone der rekombinanten CHO-hGM-CSF-PYC2 Zelllinien wurden freundlicherweise von M. Bollati Fogolin (GBF mbH, Braunschweig) zur Verfügung gestellt. Generiert wurden diese durch Kotransfektion der rekombinanten CHO-K1-hGM-CSF Zelllinie (Bollati Fogolin, 2001) mit den Plasmiden pCMVSHE-PYC2, welches das für die cytosolische Pyruvatcarboxylase aus Hefe kodierende Gen enthält (Wagner 1998; Irani 1999), und pHMR272, das für Hygromycinresistenz kodiert. Für die in dieser Erfindung durchgeführten Untersuchungen wurde der Klon CHO-hGM-CSF-PYC2-4D5 eingesetzt (Bollati Fogolin, 2003). Die Zelllinie sekretiert den rekombinanten, glykosylierten „humanen Granulozyten-Makrophagen stimulierenden Faktor” (hGM-CSF) ins Kulturmedium und weist eine Hygromycinresistenz bis zu einer Konzentration von 250 μg mL^–1 auf.
(3) CHO-hGM-CSF
Als Referenz zu dem PYC2-exprimierenden Klon dient die Zellpopulation, die aus analoger Transfektion der CHO-hGM-CSF Zelllinie allein mit dem Plasmid pHMR272 und anschließender Selektion hervorging. Diese Mischpopulation unterschiedlicher Einzelklone weist eine Hygromycinresistenz bis zu einer Konzentration von 250 μg mL^–1 auf. (Bollati Fogolin, 2003).
(B) Kulturmedien
Für Stammhaltung und Selektion wurden die vorstehend genannten Antibiotika in entsprechenden Konzentrationen eingesetzt.
(1) ProCHO4-CDM
Für die Kultivierung der CHO-MUC1-Zelllinie in Stammhaltung und Kleinfermentersystem (1 L, Applikon) zu Voruntersuchungen des Einflusses der pH-Titrationsmittel wurde das kommerziell erhältliche serum- und proteinfreie Medium ProCHO4-CDM (Biowhittaker Europe) eingesetzt. Das Medium hat einen Glukosegehalt von 4.30 gL^–1 und enthält 5.00 gL^–1 HEPES. Supplementiert wurden NaHCO₃. (final 3.78 gL^–1), Glutamin (final 4.1 mM), Hypoxanthin (final 0.1 mM) und Thymidin (final 0.1 mM). Der pH-Wert des Mediums wurde auf pH 7.0 eingestellt.
(2) Industrielles Produktionsmedium (Roche Diagnostics GmbH)
Dieses Medium wurde für alle Zelllinien nach Vorgaben mit Reinstwasser (SQ, Millipore) zubereitet und supplementiert. Alle Medien wurden auf pH 7.0 durch Titration mit 4 M NaOH eingestellt. Nach Sterilfiltration (0.2 μm) und Steriltest (72 h, RT) wurden diese serumfreien Medien bis zu einem Monat aufbewahrt (4°C). Die Glukosekonzentration des Hauptfermentationsmediums beträgt 8.0 g L^–1. Für die Fütterungsbetriebsweise wurde ein Medienkonzentrat hoher Glukosekonzentration verwendet.
(C) Off-Line Analytik
(1) Zellzahl-, Viabilitäts- und Sterilitätsbestimmung
Die aus den entsprechenden Suspensionskulturen täglich entnommenen Proben wurden mikroskopisch auf Kontamination (Bakterien, Pilze) untersucht. Die Bestimmung der Zellzahl und Viabilität erfolgten manuell (Lichtmikroskopie) und automatisch (ViCell XR, BeckmanCoulter, Krefeld). Der Anteil lebender Zellen wurde anhand der Ausschlussmethode mit einer 0.5%-igen (w/v) Typanblaulösung bestimmt. Für die Bestimmung toter Zellen wurde die Zellsuspension 1:1 mit der 0.2%-igen Trypanblaulösung versetzt, vorsichtig gemischt und die Anzahl gefärbter Zellen durch Auszählen von acht Großquadraten in einer Zählkammer nach Neubauer (Tiefe 0.100 mm, Hämacytometer) bei 100-facher Vergrößerung unter einem Lichtmikroskop bestimmt. Durch Subtraktion der resultierenden Totzellkonzentration von der Gesamtzellkonzentration ergibt sich die Konzentration der lebenden Zellen in Suspension. Ihren Anteil an der Gesamtzellkonzentration bezeichnet man als Viabilität. Dieses Messprinzip wurde im ViCell XR automatisiert. Die Mischung mit Trypanblau und die Diskriminierung zwischen lebenden und toten Zellen erfolgt hierbei über das Kontrastverhältnis. Eine integrierte Kamera führte dafür die Bilder der computergestützten Analyse zu.
(2) Medienanalytik
Im Medium enthaltene Substrat-, Metabolit- und Produktkonzentrationen sind durch die folgend beschriebenen Methoden aus den zellfreien Medienüberständen (10 Min., 200 g) der Kultivierungen zugänglich. Die kurzfristige Lagerung der zellfreien Überstände erfolgte bei –80°C. Falls nicht anders beschrieben erfolgen alle Messungen und Kalibrierungen nach Maßgabe des jeweiligen Geräteherstellers.
Glukose
Zur Bestimmung des Glukosegehalts in Kulturüberständen wurde ein automatischer Glukoseanalysator (EBIO Compact, Eppendorff, Hamburg) eingesetzt. Die Messung basiert auf einem gekoppelten enzymatisch-elektrochemischen Prozess, bei dem das durch die immobilisierte Glukose-Oxidase neben Glukonsäure freigesetzte Wasserstoffperoxid an einer Pt/AgCl/Ag-Elektrode amperometrisch gemessen wird. Der durch die Oxidation des Wasserstoffperoxids zu Sauerstoff resultierende Elektrodenstrom ist der Wasserstoffperoxidkonzentration und somit der Glukosekonzentration in der Probe direkt proportional.
Laktat
Laktat wird ebenfalls in einem Analysator (Yellow Springs Instruments, Ohio, USA) nach einem elektro-enzymatischen Prinzip quantifiziert. Mittels immobilisierter Laktatoxidase wird Laktat zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid umgesetzt. Letzteres kann wie bei der Glukosebestimmung quantifiziert werden.
Glutamin und Glutamat
Die simultane Quantifizierung von Glutamin und Glutamat erfolgt nach dem bei der Glukosebestimmung beschriebenen Prinzip mit zwei immobilisierten Enzymen auf unterschiedlichen Sensoren. Glutamatoxidase katalysiert die Umsetzung von Glutamat mit Sauerstoff zu α-Ketoglutarat und Wasserstoffperoxid unter Abspaltung von Ammoniak. Am Glutaminsensor führt die Glutaminase zunächst zu Bildung von Glutamat, welches dann analog umgesetzt wird. Der Glutaminsensor detektiert somit auch freies Glutamat in der Lösung, welches durch den Analysator berücksichtigt wird.
Osmolalität
Ein Maß für die Anzahl der in Lösung befindlichen Teilchen pro Masseneinheit des Lösungsmittels ist die Osmolalität. Entionisiertes Wasser gefriert definitionsgemäß bei 0°C unter Normalbedingungen. Eine darauf bezogene Gefrierpunktserniedrigung von 1.858 K entspricht einer Osmolalität von 1 osmol/kg. Die Messung der Osmolalität durch das verwendete Gefrierpunktosmometer beginnt mit der Abkühlung der Probe auf –7.0°C. Die unterkühlte Lösung wird durch einen Impfkristall zur Kristallisation gebracht und die entstehende Wärmemenge bis zum Gefrierpunkt gemessen. Diese Differenz zum reinen Lösungsmittel Wasser ist direkt proportional zur Osmolalität der Probe.
Aminosäuren
Die Konzentrationen freier Aminosäuren im Kulturüberstand wurden durch eine Umkehrphasen-HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) bestimmt (Büntemeyer, 1988). Für die Durchführung der Analysen wurde ein vollautomatisches HPLC-System D450 (Kontron Instruments, Echingen) mit zwei Hochdruckpumpen (Typ 420), einer automatischen Probenaufgabe (Typ 460) sowie einem Fluoreszenzdetektor (Typ SFM 25) und einer rechnergestützten Auswerteeinheit (KromaSystem 2000, Vers. 1.60) durchgeführt. Die Trennung fand auf einer RP₁₈-Säule (Ultrasphere ODS, 150 mm × 4.6 mm, Partikelgröße 5 μm, Beckman, München) mit Oktadecylsilikat als stationäre Phase statt. Dieser war eine weitere RP₁₈-Säule (Hypersil ODS, 10 mm × 4.6 mm, Partikelgröße 10 μm, Techlab, Erkerode) zur Erhöhung der Standzeit vorgeschaltet. Vor der Auftrennung erfolgte eine Derivatisierung der Aminosäuren mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA) (Sigma, Deisenhofen) (Lim, 1987; Büntemeyer, 1991). Die primären Aminogruppen der Aminosäuren reagieren im alkalischen Milieu (pH > 9) mit OPA und 3-Mercaptopropionsäure zu fluoreszierenden Isoindolderivaten (2.1). Der Nachweis erfolgte bei einer Emmissionswellenlänge von 450 nm nach Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 340 nm.
Die zellfreien Kulturüberstände (500 μL) wurden mit Trichloressigsäure (100 μL, 36% w/v) gemischt und die präzipitierten Proteine sedimentiert (10 Minuten, 15000 g). Die Mittelphase wurde entnommen (250 μL) und neutralisiert (12.5 μL NaOH 1 M). Diese Stammlösung wurde in geeigneter Vorverdünnung und Alkalisierung mit Natriumboratpuffer (0.4 M, pH 9.5) der Derivatisierung zugeführt, welche aufgrund der Instabilität der Isoindolderivate erst unmittelbar vor der HPLC-Trennung durch automatische Zugabe des Derivatisierungsreagenzes (50 mg OPA in 1 mL Methanol, 100 μL 3-Mercaptopropionsäure und 9 ml 0.6 M Natriumboratpuffer, pH 10.4) zur Probe geschah.
Der für die HPLC-Trennung der Aminosäurederivate verwendete Gradient (Büntemeyer, 1991) verlief vom polareren (99% v/v 0.1 M Natriumacetat pH 7.5, 1% v/v Tetrahydrofuran) zum unpolareren Puffer (30% 0.085 M Natriumacetat pH 5.2, 70% Methanol), wodurch alle Aminosäuren außer Cystein und Prolin quantifiziert werden konnten. Prolin als sekundäres Amin reagiert nicht und Cystein bildet ein nicht-fluoreszierendes Derivat mit OPA.
(3) MUC1-IgG2a ELISA
Der von der in dieser Arbeit kultivierten CHO-MUC1-Zelllinie produzierte MUC1-IgG2a-Antikörper ist ein Vertreter des murinen Immunglobulins G (IgG), dessen H-Kette vom γ-Typ und dessen Subklasse 2a ist. Dieser ist N-terminal an das MUC1 gebunden, wodurch mit dem Nachweis eines Moleküls dieses Antikörpers immer auch ein Molekül des fusionierten MUC1 detektiert wird. Zur Vermeidung des nachweises von unvollständig translatiertem Produkt wurden nur Zellviabilitäten von mehr als 80% berücksichtigt. Die quantitative Bestimmung von MUC1-IgG2a im Kulturüberstand erfolgte durch ELISA.
Die Quantifizierung des MUC1-IgG-Fusionsproteins erfolgt in Anlehnung an die von Link 2003 durchgeführten Arbeiten (Parker, 1990; Link, 2003). Als adsorbierende Festphase für die MUC1-IgG-Quantifizierungen durch ELISA wurden 96-Loch-Immunoplatten (F96 Maxisorp, Nunc, Wiesbaden) verwendet. Der an der Festphase adsorbierte Fangantikörper war ein kommerziell erhältlicher goat-anti-mouse-IgG (M-8642, Sigma, Deisenhofen), der durch Immunisierung von Ziege gegen das murine IgG gewonnen wurde. Der gelieferte Antikörper (1 mg) wurde in PBS gelöst (25 mL, final 40 μg mL^–1), aliquotiert (1 mL) und bei –20°C gelagert. Vor Gebrauch wurde er in PBS auf 3 μg mL^–1 verdünnt. Als bestimmbare Antigene wurden zum einen die auf MUC1-IgG2a zu quantifizierenden Kulturüberstände eingesetzt und zum anderen ein MUC1-IgG2a-Standard. Dieser Standard wurde vor Einsatz im ELISA auf 1 μg mL^–1 in Verdünnungspuffer vorverdünnt.
Als enzymmarkierter Antikörper diente das alkalische-Phosphatase-Konjugat goat-anti-mouse-IgG-AP des verwendeten Fangantikörpers (A-5153, Sigma, Deisenhofen), der als substratumsetzendes Enzym alkalische Phosphatase (AP) trägt und spezifisch an die schwere γ-Kette des murinen IgG bindet. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Das Substrat p-Nitrophenolphosphat (pNPP, N-2770, Sigma, Deisenhofen) wurde durch die alkalische Phosphatase zu gelbem p-Nitrophenol umgesetzt, welches photometrisch bestimmt wurde. Die Extinktion der resultierenden Färbung wurde in einem spektrophotometrischen Analysegerät ausgelesen (405 nm, Wallac Victor², Perkin Elmer Life Sciences, Bad Wildbach) Zur Beschichtung der Maxisorp-Immunoplatten mit dem Fangantikörper goat-anti-mouse-IgG wurde dieser in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert (je 100 μL). Die Testplatte wurde danach verschlossen inkubiert (4°C, 14 h) und nach anschließendem Ausklopfen mit Waschpuffer gespült (10-mal) und trockengeschlagen. Zur Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen des Fangantikörpers wurden in jede Vertiefung der Platte Blockierungspuffer gegeben (je 200 μL) und die Platte abgedeckt inkubiert (37°C, 2 h). Danach wurde die Platte mit Waschpuffer gewaschen (3-mal) und trockengeklopft.
Die zu analysierenden zellfreien Kulturproben wurden zunächst zentrifugiert (15000 g, 3 Minuten) und der resultierende Überstand als produkthaltige Probe für die weitere Analyse benutzt. Um bei der Auswertung der Farbreaktion vergleichbare resultierende Intensitäten durch Standards und Proben zu erhalten und über diese auf die Produktkonzentration rückschließen zu können, erfolgte eine geeignete Vorverdünnung in Verdünnungspuffer. Als Absättiger unspezifischer Bindungsstellen diente das im Verdünnungspuffer enthaltene BSA. In Vorverdünnungsplatten (96-well, Nunc, Wiesbaden) – aufgeteilt von A1 bis H12 – wurden nun für eine jeweilige Doppelbestimmung der Proben (Spalten 3–12) und des Standards (Spalten 1 und 2) 280 μL pro Vertiefung in Reihe H pipettiert. Dann wurde eine schrittweise 1:2 Verdünnung durch Überführen von jeweils 140 μL in die Vertiefungen der nächsten Reihe, in denen jeweils 140 μL Verdünnungspuffer vorlagen, vorgenommen.
Die Vertiefungen der beschichteten Testplatte werden analog der Vorverdünnungsplatte in Reihen steigender Verdünnung mit je 100 μL der vorverdünnten Proben und Standards beschickt und abgedeckt inkubiert (37°C, 1 h).
Zur Abgleichung des Spektrophotometers gegen eine Blindprobe wurden die beiden unteren rechten Vertiefungen nur mit Verdünnungspuffer behandelt. Anschließend wurde nach Ausklopfen mit Waschpuffer gespült (10-mal) und die Platte trocken geklopft. Im folgenden Schritt wurde zunächst der enzymmarkierte Antikörper goat-anti-mouse-IgG-AP 1:1000 in Verdünnungspuffer aufgenommen und dann jeweils in die Vertiefungen der Testplatte pipettiert (je 100 μL). Es erfolgte eine erneute Inkubation (37°C, 1 h) und anschließendes Waschen mit Waschpuffer (10-mal) nach vorherigem Ausklopfen der Testplatte. Alle folgenden Arbeitsschritte erfolgten zügig im Dunkeln aufgrund der Lichtempfindlichkeit des Substrats pNPP. Die Umsetzung des p-Nitrophenylphosphats durch die antikörpergebundene alkalische Phosphatase zum gelben Produkt wurde durch Zugabe von Substrat in jede Vertiefung der Testplatte initiiert (100 μL). Es erfolgte eine Inkubation der Platte in Dunkelheit (Raumtemperatur, 10–30 Minuten), bis eine intensive Gelbfärbung (Extinktion von 0.7–0.8) in der Vertiefung des umgesetzten Standards erkennbar ist. Die Auswertung der Farbintensitäten erfolgte spektrophotometrisch bei 405 nm.
(4) hGM-CSF ELISA
Zum Nachweis des Cytokins hGM-CSF wurde ein kompetitiver ELISA (Bollati Fogolin, 2002) verwendet. Als adsorbierende Festphase für die hGM-CSF-Quantifizierungen durch ELISA wurden 96-Loch-Immunoplatten (F96 Maxisorp, Nunc, Wiesbaden) verwendet. Sowohl zur Beschichtung der Maxisorp-Platten wie auch als Konzentrationsstandard wurde kommerziell erhältliches, rekombinantes unglykosyliertes hGM-CSF (Leucomax, Wirkstoff: Molgramostim, Scheringh-Plough Corporation, Kenilworth, NJ, USA) aus E. coli eingesetzt. Als Primärantikörper wurde ein monoklonaler mouse-anti-GM-CSF-Antikörper (M7E10) (Etcheverrigaray, 1998) eingesetzt, der freundlicherweise von Frau Bollati Fogolin (GBF mbH, Braunschweig) bereitgestellt wurde. Dieser ist gegen eine Dömane des hGM-CSF gerichtet, die unabhängig vom Glykosylierungsstatus des Proteins zugänglich ist. Als enzymmarkierter Antikörper diente ein Peroxidase-Konjugat goat-anti-mouse-IgG-HRP, das als substratumsetzendes Enzym Meerrettich-Peroxidase (engt horseradish peroxidase, HRP) trägt und spezifisch an das Fab₂-Fargment des murinen IgG-Primärantikörpers bindet (Dianova 115-035-072, 0.8 mg mL^–1). Das Substrat 1,2-Phenylendiamin-dihydrochlorid (OPD, Fluka) wurde durch die Meerrettich-Peroxidase zu einem orangefarbigen Endprodukt nach Abstoppen der Enzymreaktion umgesetzt. Die Extinktion wurde photometrisch bestimmt. Die Extinktion der resultierenden Färbung wurde in einem spektrophotometrischen Analysegerät ausgelesen (492 nm, Messzeit 1 Sekunde/Vertiefung, Wallac Victor², Perkin Elmer Life Sciences, Bad Wildbach).
Zur Beschichtung der Maxisorp-Immunoplatten mit dem hGM-CSF aus E. coli als Konkurrenz zum glykosylierten hGM-CSF aus dem Fermentationsüberstand wurde dieser in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert (je 16.5 ng in 100 μL Beschichtungspuffer). Die Testplatte wurde danach in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre verschlossen inkubiert (37°C, 1 h, danach 4°C, 14 h) und nach anschließendem Ausklopfen mit Waschpuffer gespült (10-mal) und trockengeschlagen. Zur Ermittlung der Standardkurve wurden Verdünnungen des unglykosylierten hGM-CSF-Standards im Bereich 200–0.195 ng mL^–1 in Verdünnungspuffer vorgenommen. Die Proben aus den Kulturüberständen wurden seriell 1:2 ebenfalls in Verdünnungspuffer verdünnt und mit den vorbereiteten Standards in die einzelnen Vertiefungen der beschichteten Mikrotiterplatte pipettiert (je 100 μL). Als Kontrolle der vollständigen Bindung ohne Konkurrenz von hGM-CSF-haltigem Standard oder Kulturüberstand dient reiner Verdünnungspuffer. In die mit Proben und Standards beschickten Vertiefungen der Platte wurde nun der Primärantikörper M7E10 (1:100 000 in Verdünnungspuffer, je 100 μL) gegeben und inkubiert (37°C, 1 h). Nach Entfernen der Lösung und Waschen der Platte mit Waschpuffer (7-mal) wurde mit dem Konjugat-Antikörper (1:5000 in Verdünnungspuffer, je 100 μL) inkubiert (37°C, 1 h). Nach erneutem Waschen der Platte (7-mal) wurde durch Zugabe der unmittelbar frisch angesetzten Färbelösung die Enzymreaktion gestartet. Nach 15 Minuten Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von Stopplösung (je 50 μL) angehalten und die resultierende Extinktion bei einer Wellenlänge von 492 nm (je 1 s) ausgelesen.
(5) Durchflusszytometrische Zellanalytik
Die entsprechend vorbereiteten Proben wurden im Durchflusszytometer FACSCalibur Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) und der Anwendungssoftware CellQuest 3.3 (beides Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) vermessen. Die off-line Analyse der Daten erfolgte mit der Software CellQuest 3.3, ModFit und FCSassist 1.0 auf G4 Apple Macintosh Computer.
Zellzyklusphasenverteilung
Zur Bestimmung der einzelnen Zellphasen (G1, S, G2, M) wurde die als Einzelzellsuspension vorliegende Kulturprobe vom Überstand befreit (200 g, 7 min) und zweimal in eiskaltem PBS gewaschen (200 g, 7 min). Das resultierende Pellet wurde unter intensivem Schütteln tropfenweise mit einer Mischung (–20°C) aus 80% (v/v) Methanol (reinst, Merck) in PBS resuspendiert und inkubiert (4°C, 2 h–2 Monate). Danach wurden die Zellen pelletiert (200 g, 7 min), anschließend in einer Mischung aus 0.1% (w/v) Saponin (Roth) in PBS resuspendiert und zweimal gewaschen (200 g, 7 min). Resuspension von 4 × 10⁶ Zellen in 1 ml Färbelösung (0.1% w/v Saponin, 1 mg mL^–1 RNase S (Sigma), 0.02 mg mL–1 Propidiumiodid (Sigma)) und Inkubation (RT, 30 min) ergaben ein pinkfarbenes Zellpellet. Der enzymatische Abbau der RNA wurde zunächst durch Lagerung auf Eis gestoppt und dann wurden die gefärbten Zellen der Durchflusszytometrie zugeführt. Die Messung erfolgte gemäß Herstellerangaben und Protokollen der einschlägigen Literatur zur Durchflusszytometrie (Melamed, 1990; Givan, 1992; Shapiro, 1994; BD_Biosciences 2000).
Intrazellulärer pH-Wert
Der intrazelluläre pH-Wert (pH_i) tierischer Zellen hängt mit verschiedenen zellulären Funktionen zusammen. Änderungen in Zellwachstum, Metabolismus und Proteinproduktion, sowie in Enzymaktivitäten, Transportmechanismen, Proliferationsinduktion und Erhaltungsenergiebedarf gehen mit Unterschieden im pH_i einher (Madshus, 1988; Grinstein, 1989). Die Regelung des pH_i ist demnach von fundamentaler biologischer Bedeutung für die Zelle. Die isoelektrischen Punkte vieler biologisch wichtiger Makromoleküle in der Zelle liegen in der Nähe des physiologischen Werts von pH 7, so dass relativ kleine Änderungen in der Protonenkonzentration bereits große Auswirkungen auf Konformationen und Interaktionen der Proteine und Nukleinsäuren haben können. Um einer Ansäuerung des Cytosols entgegenzuwirken, werden Protonen H⁺ direkt aus der Zelle transportiert oder Hydrogenkarbonationen HCO₃ ^– in die Zelle eingeschleust, um die Protonen im Cytosol zu neutralisieren. Für diese pH_i-Regulation stehen tierischen Zellen unterschiedliche Mechanismen zur Verfügung (Madshus, 1988; Reusch, 1995): Na⁺/H⁺ Austauscher, Na⁺ abhängiger und -unabhängiger Cl-/HCO₃ ^– Antiporter, Na⁺/HCO₃ ^– Symporter, H⁺ translozierende ATPasen (Protonenpumpen) Abweichend vom externen pH (pH_e), der sich bei tierischen Zellkulturen zwischen Werten von 6.6–7.4 befindet, ist es der Zelle durch die o. g. Mechanismen möglich, interne pH-Werte aktiv aufrecht zu erhalten, die von den externen pH-Werten um 0.1–0.5 pH-Einheiten abweichen. So besitzen die Zellorganellen distinkte pH-Werte, um ihre biologischen Funktionen wahrzunehmen. Ebenso sind empfindlich regulierte pH-Gradienten wichtig für posttranslationale Proteinsortierung und -prozessierung. Störungen dieser intrazellulären Regelung können in Zellkulturen durch Anhäufung von organischen Säuren und Basen wie z. B. Laktat, Ammonium oder CO₂ im Kulturmedium auftreten. Es wurden auch Zusammenhänge zwischen pH_i und Zellzyklusphasen beschrieben. Demnach lässt sich allgemein ein alkalischerer pH-Wert im Cytosol messen, wenn sich die Zelle in einer metabolisch aktiven Phase des Zellzyklus befindet (S- bzw. G2-Phase) (Welsh and Al-Rubeai, 1996).
Der intrazelluläre pH-Wert kann durchflusszytometrisch unter Verwendung eines pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs bestimmt werden, der in der Zelle angeregt wird. Der in dieser Erfindung verwendete Fluoreszenzfarbstoff 5'(und 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'on vereinfacht oft Carboxyseminaphtorhodafluor-acetoxymethylester bzw. Carboxy-SNARF-1-AM, folgend SNARF-1 genannt) ist eine schwache Säure mit einem PK_a-Wert von 7.3–7.4 bei 37°C und zeigt bei Anregung mit Licht der Wellenlänge von 488 nm zwei Fluoreszenzsignalmaxima unterschiedlicher Wellenlängen (FL2: 580 nm, FL3: 640 nm, 3–7) (C-1270, Molecular Probes). Das relative Verhältnis dieser Emissionsmaxima zeigt eine pH-abhängige Verschiebung und ermöglicht somit die Messung des pH_i unabhängig von der angeregten Farbstoffmenge in der Zelle.
Als Acetoxymethylesterderivat ist der Fluoreszenzfarbstoff zellmembrangängig und wird im Cytosol von unspezifischen Esterasen hydrolysiert. Diese freie Form des Fluorophors verbleibt in der Zelle und kann dort zur Emission angeregt werden. Zur Bestimmung des intrazellulären pH-Werts muss eine Kalibrierungskurve durch Implizieren bekannter pH_i-Werte erstellt werden. Dies muss aus derselben Zellpopulation vorgenommen werden, aus der auch die zu vermessende Probe stammt (Owen 1991; Owen, Carango et al. 1992). Dabei ist auf die Erhaltung der Reaktorbedingungen während der Probenvorbereitung ebenso besonderer Wert zu legen, um repräsentative pH_i-Werte zu erhalten, wie auch auf die Wahl der Kalibrierungsmethode (Cherlet, Franck et al., 1999; Bond and Varley, 2005; Jockwer, Gätgens et al., 2005).
In der vorliegenden Erfindung wurde zur Kalibrierung des intrazellulären pH-Werts die Pseudo-Null-Punkt-Kalibrierungsmethode verwendet, die sich der Auslenkung des stationären pH_i durch Versetzen der Zellen mit bekannten Mischungsverhältnissen schwacher Säure und Base bedient. Das resultierende Fluoreszenzverhältnis spiegelt danach den neuen pH_i wider. Wenn nun die molare Konzentration der Mischung aus schwacher Säure und Base ausreichend hoch war, ergibt eine weitere Zugabe derselben Mischung keine Änderung im Fluoreszenzverhältnis mehr und damit auch keine Änderung im pH_i, so dass der ausgelenkte pH_i einen neuen Pseudo-Null-Punkt darstellt, der Gleichung 3-3 erfüllt. Versetzt man die mit dem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff beladenen Zellen mit konzentrierten Mischungen unterschiedlicher molarer Verhältnisse von schwacher Säure zu schwacher Base, kann man eine Kalibrierungskurve erstellen, indem man den Pseudo-Null-pH gegen die erzielten Fluoreszenzverhältnisse aufträgt. Diese Kalibrierungsmethode lässt sich durchflusszytometrisch reproduzierbar und schnell umsetzen, ist unabhängig von der intrazellularen K⁺-Konzentration und somit für fermentationsbegleitende Analytik geeignet.

Zur repräsentativen Probeentnahme aus (drucküberlagerten) Bioreaktoren und Kultivierungen mit definierten Gelöstgaskompositionen wurde eigens eine spezielle Probeentnahmevorrichtung (Jockwer, Gätgens et al. 2005) entwickelt, die Ergebnis dieser Erfindung ist. Diese erhält die für den Zeitraum der Farbstoffaufnahme pH_i-relevanten Parameter wie pCO₂, Druck, pH und Temperatur, so dass die Zellprobe unter reproduzierbaren Reaktorbedingungen angefärbt wird. Der so gemessene pH_i repräsentiert demnach die realen Bedingungen im Bioreaktor besser als herkömmliche Methoden. Parallel zur Anfärbung der Probe wurde jeweils eine ungefärbte Probe derselben Population unter identischen Bedingungen zur Kontrolle mitgeführt. Lösungen und Puffer

HEPES-Puffer (N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethansulfonsäure])	(10 mM)
	2.383 g L^–1	HEPES	(10 mM)
	7.802 g L^–1	NaCl	(133.5 mM)
	0.298 g L^–1	KCl	(4 mM)
	0.166 g L^–1	NaH₂PO₄·H₂O	(1.2 mM)
	0.144 g L^–1	MgSO₄	(1.2 mM)
	1.981 g L^–1	α-D-Glukose	(11 mM)
	0.294 g L^–1	CaCl2·2H2O	(2 mM)
	pH 7.4, steril filtrieren, Lagerung 4°C
Farbstoff SNARF-1 (Carboxyseminaphtorhodafluor-acetoxymethylester)	(2 mM)
	50 μg	Carboxy-SNARF-1-AM (C-1272, Molecular Probes, Leiden, Niederlande)
	44 μL	DMSO
Buttersäure BA (n-Butansäure)	1 M
	4.6 mL	Buttersäure 10.9 M (pK_a = 4.82, Sigma)
	ad 50 mL	H₂O
	pH 7.4, steril filtrieren, Lagerung 4°C
Trimethylamin TMA	1 M
	12.3 mL	Trimethylamin 4.06 M (pK_a = 9.8, Sigma)
	ad 50 mL	H₂O
	pH 7.4, steril filtrieren, Lagerung 4°C
HDFBS
	10% (v/v)	dialysiertes FBS in HEPES-Puffer

Tabelle 1: Pseudo-Null Kalibrierungslösungen (Chow, Hedley et al., 1996)

6-fach Konzentrat BA/TMA [mM]	0.5 log ([BA]/[TMA])	BA [μL]	TMA [μL]	HDFBS [ml]
6/96	–0.6	60	960	8.98
6/24	–0.3	60	240	9.70
6/6	0	60	60	9.88
24/6	0.3	240	60	9.70
96/6	0.6	960	60	8.98

Vor der Probeentnahme aus dem entsprechenden Kultursystem mit der entwickelten Entnahmevorrichtung (Jockwer, Gätgens et al., 2005) wurden die 6-fach konzentrierten Pseudo-Null-Kalibrierungslösungen (Tab. 3-1) in Messbehälter des Durchflusszytometers vorgelegt (je 200 μL), diese gasdicht verschlossen und weiterhin kühl gelagert (4°C). Die beiden Kalibrierungslösungen des größten und des kleinsten Mischungsverhältnisses an Säure zu Base wurden je zweifach angesetzt, um die Messbereiche des Durchflusszytometers einzustellen. Für die zu bestimmende Probe wurden 3 Messbehälter mit HDFBS (je 200 μL) analog behandelt. Vor der Probeentnahme aus dem Kultursystem wurden in der vorinkubierten Probeentnahmevorrichtung (37°C) 22 μL des Fluoreszenzfarbstoffs vorgelegt. Die Anfärbung der Zellen im esterasefreien Kulturmedium startete durch Vermischung der Zellsuspension während der isobaren und gasdichten Probeentnahme und wurde im Dunkeln unter Schütteln fortgeführt (jeweiliger Reaktordruck, 25 min, 37°C). Nach 15-minütiger Inkubation werden die Kalibrierungs- und Messlösungen weiterhin verschlossen und gasdicht auf Reaktortemperatur gebracht (Wasserbad, 37°C). Direkt nach Ende der Inkubation der Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff unter Reaktorbedingungen werden diese der Drucküberprüfung und Gelöstgasanalyse (Compact 3, Roche Diagnostics GmbH) zugeführt und unmittelbar danach in den entsprechenden Mess- bzw. Kalibrierungspufferlösungen suspendiert (je 200 μL) und nach 10 sec im Durchflusszytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson) vermessen. Dabei wird zuerst eine Doppelbestimmung der zu ermittelnden Probe in Messpuffer (HDFBS) durchgeführt, dann erst werden die gefärbten Zellen seriell in den jeweiligen Kalibrierungspuffern vermessen. Im Anschluss an die durchflusszytometrische Messung der jeweiligen Probe wurde diese sofort der Messung des externen pH-Werts zugeführt (Compact 3, Roche Diagnostics GmbH).
Der Zeitraum zwischen Öffnung der Probeentnahmevorrichtung und Gelöstgasanalyse der gefärbten und ungefärbten Zellen in Kulturmedium ist kleiner als 5 Sekunden, der Zeitraum bis zum Ende der durchflusszytometrischen Messung der Probe ist kleiner als 90 Sekunden. Zwischen Ende der Fluoreszenzanalyse und Bestimmung des externen pH-Werts vergehen 15 Sekunden. Diese Behandlung in Zusammenhang mit der entwickelten (druckhaltenden) Probeentnahmevorrichtung ergibt einen repräsentativen pH_i-Wert (s. a. Kap. 4.2) (Chow, Hedley et al., 1996).
Messung
Die durchflusszytometrische Messung der Fluoreszenz zur Ermittlung des pH-Werte erfolgt erfolgt nach Vorgaben der Hersteller des Geräts (FACSCalibur, Becton Dickinson), des Farbstoffs (Carboxy-Snarf-1-AM, Molecular Probes, Leiden, Niederlande), sowie nach einschlägiger Literatur (Chow and Hedley, 1997).

Im Folgenden sind die allgemeinen Grundeinstellungen aufgeführt, die für die jeweilige Probe optimiert werden müssen.

Messfenster 1:	SSC/FSC (Punktwolke, Skalierung doppelt linear, gesamte Zellpopulation)
Messfenster 2:	Zählereignisse (linear)/FL2 (log.)(Histogramm)
Messfenster 3:	Zählereignisse (linear)/FL3 (log.)(Histogramm)
Messfenster 4:	Zählereignisse (linear)/Fluoreszenzverhältnis (FL3/FL2)

Tote Zellen und Agglomerate wurden ebenso wie ungenügend gefärbte Zellen durch geeignete Grenzen von der Messung ausgeschlossen. Da Messfenster 4 am vorliegenden Messgerät nicht in Echtzeit realisierbar ist, wird zur Berechnung des Fluoreszenzverhältnisses das Programm FCSassist 1.0 (Becton Dickinson) benutzt. Die Auswertung wird mit dem Programm CellQuest 3.3 (Becton Dickinson) durchgeführt. Eine Auftragung des ”Mittleren Fluoreszenzintensitätsverhältnisses” (MFI) gegen den jeweils induzierten pH_i-Wert nach Gleichung 3-3 ergibt die Kalibrierungskurve, aus der sich der pH_i der Probe errechnen lässt.
(6) Gelöstgase, pH-Wert und abhängige Parameter
Das Blutgasmessgerät AVL Compact 3 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) wird zur direkten Bestimmung der Gelöstgase CO₂ und O₂, des pH-Werts, sowie der davon anhängigen Errechnung der Konzentrationen von Hydrogenkarbonat und „Gesamt-CO₂” aus zellhaltigen Kulturproben (> 55 μL, 37°C) nach Herstellervorgaben benutzt (Roche 2003). Das Gerät bestimmt nach Aufgabe der entsprechenden physiologischen Probe die o. g. Parameter automatisch. Dafür sind in einer temperierten Messkammer folgende miniaturisierte Elektroden installiert:

• pH-Referenzelektrode
• pH-Messelektrode
• pO₂-Messelektrode
• pCO₂-Messelektrode

Die direkte pCO₂-Messung ist eine Modifikation der pH-Messung. Durch eine innenundurchlässige Membran gelangt nur gasförmiges CO₂ in den Messpuffer, dessen pH-Wert durch das dissoziierte CO₂ verändert, gemessen und nach Verstärkung als pCO₂-Wert [mmHg] angezeigt wird. Eine Umrechnung in [%] pCO₂ bzw. pO₂ erfolgt separat nach automatischer Erfassung des Atmosphärendrucks, die bei mit jeder Probenmessung durchgeführt wird. Durch angeschlossene Kalibriergase und Pufferlösungen kalibriert und reinigt sich das Gerät selbsttätig nach definierten Zyklen.
(D) Kultivierung tierischer Zellen
Alle Arbeiten wurden unter Einhaltung der geltenden Arbeitsvorschriften und Verordnungen zum Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen der Sicherheitsstufe S1 durchgeführt.
(E) Bioreaktorkultivierung
Alle Untersuchungen wurden in kommerziell erhältlichen Rührkesselreaktoren der Arbeitsvolumina 1 L (Applikon Biotek, Knüllwald) bzw. 10 L (B. Braun Biotech International, Melsungen) unter steriltechnischen Bedingungen durchgeführt. Sämtliche Messwerte wurden über Messverstärker und A/D-Wandler (SMP-Interface, Siemens) an den Prozessrechner übertragen und durch die Prozessleitsoftware LabView (National Instruments, USA) verarbeitet und gespeichert. Folgende Prozessparameter waren während der Kulturdauer bei beiden Systemen identisch und konstant geregelt.
Standardfermentationsbedingungen (1 L & 10 L Reaktoren):

Rührerdrehzahl 200 rpm
Temperatur 37°C
Gelöstsauerstoffsättigung 40% (bezogen auf Luft)
pH 7.0
Ratio-Begasung (1 L Reaktor: 2.4–5.0 Lh^–1; 10 L Reaktor: 30–45 Lh^–1)

Die Mischung der Reinstgasanteile von Stickstoff (N₂), Sauerstoff (O₂) und Kohlenstoffdioxid (CO₂) zur Aufrechterhaltung der geregelten Gelöstsauerstoffkonzentration pO₂ bei konstanter Begasungsrate wird als „Ratio-Modus” bezeichnet.
(1) Messung der Prozessparameter
Gelöstsauerstoff pO₂
Die in situ Messung der Gelöstsauerstoffkonzentration in den verschiedenen wässrigen Lösungen erfolgte durch Sauerstoffelektroden nach Clark (InPro 6000, Mettler Toledo, Urdorf, CH).
Gelöstkohlenstoffdioxid pCO₂
Die in situ Messung der Gelöstkohlenstoffdioxidkonzentration in den verschiedenen wässrigen Lösungen und während der Fermentationen erfolgte durch die kommerziell erhältliche Sonde YSI 8500 von Yellow Springs Instruments (Yellow Springs, USA) bzw. für vergleichende Messungen im zellfreien System mit der Sonde InPro 5000 von Mettler Toledo (Urdorf, CH). Beide Geräte wurden im Anzeigemodus [% CO₂] betrieben. Dabei bezieht sich die Angabe [%] auf die unter Kalibrationsbedingungen eingestellten Gleichgewichtbedingungen zwischen Anteil CO₂ [%] in der Begasungsmischung und wässrigem Kulturmedium bei Standardfermentationsbedingungen (37°C).
Aus den verwendeten Kalibrationsbedingungen errechnen sich zusammen mit den Anzeigewerten CO₂ [%] die Gleichgewichtskonzentrationen des gelösten CO₂ während des Prozesses. Der Ausdruck pCO₂ [%] wird hier analog zu anderen Publikationen dieser Fachrichtung synonym zu „Gelöstkonzentration” und „Partialdruck” von CO₂ benutzt, obwohl die absoluten Konzentrationen des tatsächlich gelösten CO₂ im Kulturmedium erst daraus berechnet werden müssen (Zhangi, Schmelzer et al., 1999; Pattison, Swamy et al., 2000; Schmelzer, deZengotita et al., 2000). 1% Sättigung entspricht etwa 7,5 mm Hg, 10% etwa 75 mm Hg.
Abgasanalytik
Die Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxidquantifizierung in der wasserfreien Abluft beider Prozesse wird durch den Abgasanalysator Xentra 4900 (Servomex, Hamm) realisiert. Die Messung des Sauerstoffanteils erfolgt paramagnetisch (0–100% v/v), die des Kohlendioxids infrarot-spektroskopisch (0–25% v/v).
Der pH-Wert wird durch eine pH-Einstabmesskette mit Gelelektrolyt gemessen (Applisens, Niederlande). Im Gegensatz zu herkömmlichen pH-Elektroden mit Flüssigelektrolyt weist die verwendete pH-Elektrode nach dem Autoklavieren einen Innendruck auf, der ein Eindringen von Fremdstoffen durch die Glasmembran und die die damit verbundene Elektrodendrift erheblich verringert. Die pH-Elektrode wird vor Einbau und Sterilisation gemäß den Herstellerangaben bei zwei definierten pH-Werten (pH 4.00 und pH 6.96) bei 37°C kalibriert. Vor Fermentationsbeginn wurde die korrekte Funktionalität durch externe Vergleichsmessung im Blutgasanalysator (Kap. 3.3.4) sichergestellt. Die Messung des Prozessüberdrucks wird durch zwei im Deckel des Kulturgefäßes installierte Druckpastenelektroden (B. Braun International, Melsungen; Bioengineering AG, Wald, CH) realisiert. Durch ein im Sondenkranz verbautes PT 100 Widerstandsthermometer des Reaktorherstellers wird zu allen Betriebszeiten die Temperatur im Kulturgefäß gemessen.
(F) Mathematische Methoden
Bei der Kultivierung und Fermentation werden durch analytische Methoden Parameter ermittelt, die die Beschreibung von Wachstum und metabolischen Raten zulassen. Im Gegensatz zu mikrobiellen Systemen werden in der tierischen Zellkultur Zelldichten angegeben. Die Biotrockenmasse ist allgemein nicht von Interesse.
Die Viabilität beschreibt den Anteil an Lebendzelldichte ZDL an der Gesamtzelldichte ZDG:
Alle in dieser Erfindung ermittelten zelldichteabhängigen Werte beziehen sich auf die Lebendzellzahl ZDL. Es kann davon ausgegangen werden, dass nicht-viable Zellen nicht maßgeblich zum Stoffumsatz beitragen. Die Viabilität ist ein Maß für den Zustand einer Kultur. Die Wachstumsrate WTR gibt an, wie viele Teilungen in einem Zeitintervall ablaufen.

WTR: = Teilungsrate, h^–1
n: = Anzahl der Teilungsschritte im Zeitraum t₂-t₁
t: = Zeit, h

Aus der Anzahl der Teilungsschritte ergibt sich die Zunahme der Zellzahl wie folgt. N2 = N1·2n (Gl. 3-8)

N: = Zellzahl, Gesamt bzw. Lebendzellzahl
n: = Anzahl der Teilungsschritte

Aufgelöst nach n und in Gl. 3-8 eingesetzt ergibt sich für die Wachstumsrate:
Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit μ wird durch den Bezug der Wachstumsgeschwindigkeit auf die Lebendzelldichte gebildet.

μ: = Spezifische Wachstumsgeschwindigkeit, h^–1
ZDL: = Zelldichte lebend, Zellen mL^–1.
t: = Zeit, h

Für die Zunahme der Lebendzellzahl gilt:
Somit ergibt sich für μ:
Spezifische Substratverbrauchsraten können für diskontinuierliche Verfahren einfach berechnet werden. Bei gepulster Zufütterung (Bolus) in Fed Batch Prozessen können dieselben Zusammenhänge verwendet werden, da die Dauer der Zufütterung (kleiner 15 s bei den Experimenten in dieser Erfindung), und damit der Substratverbrauch in diesem Zeitraum durch die kultivierten Zellen gegen Null geht. Durch die Zufütterung entstehende Änderungen an Substraten, Metaboliten und Fermentervolumen müssen jedoch sämtlich erfasst und mathematisch bereinigt werden. (Zell-)Spezifische Verbrauchs- und Bildungsraten sind oft die einzige Möglichkeit, unterschiedliche Prozesse vergleichbar zu machen.
Es gilt:

qS: = spezifische Substratverbrauchsrate, mol Zelle^–1 h^–1
S: = Substratkonzentration, mol L^–1
t: = Zeit, h
ZDL: = Zelldichte lebend, Zellen/mL

Die mittlere Zellzahl im Zeitintervall Δt = (t₂ – t₁) wird durch das logarithmische Mittel bestimmt, wenn zwischen den Probenahmezeitpunkten ein ausreichend großes Zeitintervall liegt:

ZDL: = mittlere Zellzahl lebend, Zellen mL^–1

Die Integration von Gl. 3-13 und Berücksichtigung von Gl. 3-14 liefert:
Analog zur spezifischen Substratverbrauchsrate berechnet sich die spezifische Produktbildungsrate:

SPR: = qPRO = spezifische Produktbildungsrate, g Zelle^–1·h^–1
PRO: = Produktkonzentration, g L^–1

Ausbeutekoeffizient
Das Verhältnis spezifischer Verbrauchs- bzw. Bildungsraten von Substraten bzw. Produkten wird durch Ausbeutekoeffizienten Y angegeben.

Y(A/B): = Ausbeutekoeffizient für A bezogen auf B
qA: = zellspezifische Rate für Stoff A, mol Zelle 1 h^–1
qB: = zellspezifische Rate für Stoff B, mol Zelle^–1 h^–1

Chemostat
Bei kontinuierlicher Kulturführung ist der Volumenstrom in den Reaktor gleich dem Volumenstrom aus dem Reaktor. Beim Chemostat enthält der entnommene Volumenstrom die gesamte Größenverteilung der Zellen im Reaktor. Das Kulturvolumen ist konstant. Bei der Berechnung der Raten muss die Durchflussrate D berücksichtigt werden.

D: = Durchflussrate, h^–1
F: = Fluss, L h^–1
V_R: = Kulturvolumen, L

Die durchschnittliche Aufenthaltszeit eines Volumenelements im Reaktor ist als Verweilzeit τ definiert.

τ: = Verweilzeit, h

Die Durchflussrate ist demnach der Kehrwert der Verweilzeit.
Für den Chemostat ist im Gleichgewicht demnach die Wachstumsrate über die Durchflussrate einstellbar, es gilt μ = D.
Für den Substratverbrauch in kontinuierlichen Systemen bei konstanten Kulturvolumina gilt:

S_i: = Substratkonzentration in der Kultur, mol L^–1
S₀: = Substratkonzentration im Zulauf, mol L^–1
Q_S: = volumetrische Verbrauchsrate, mol h^–1

Um die spezifische Substratverbrauchsrate zu berechnen, wird noch die Zellzahl in Form des logarithmischen Mittels mit einbezogen.

qS: = spezifische Substratverbrauchsrate, mol Zelle^–1 h^–1
S_1,2: = Substratkonzentration für t_1,2, mol L^–1

Die spezifische Produktivität errechnet sich analog zur Substratverbrauchsrate:

qPRO: = spezifische Produktbildungsrate, g Zelle^–1 h^–1
PRO_1,2: = Produktkonzentration für t_1,2, g L^–1

Die momentane Raum-Zeit Ausbeute in kontinuierlichen Prozessen berechnet sich wie folgt:

RZA: = Raum-Zeit-Ausbeute g L^–1d^–1

Sauerstoffaufnahmerate OUR
Aufgrund der relativ geringen Wachstumsraten von tierischen Zellkulturen, der in dieser Erfindung verwendeten hohen Volumenströme zur Begasung der Kultur und der hohen Regelgüte des entwickelten PID-Reglers für Gelöstsauerstoff, können für die Sauerstoffbilanzierungen Gleichgewichtszustände angenommen werden (Frahm, Blank et al., 2002). Somit ist die Sauerstoffaufnahmerate OUR gleichzusetzen mit der Sauerstofftransferrate OTR von der Gasphase in die Flüssigphase und ergibt sich aus Gl. 3-25,
mit

= volumenbezogener Sauerstoffübergangskoeffizient, h^–1
= Sauerstoffkonzentration in der Begasungsmischung, mol·L^–1
= geregelte Gelöstsauerstoffkonzentration, mol·L^–1

Die Gelöstsauerstoff- und Gelöstkohlendioxidkonzentration, sowie die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen der Begasungsmischung sind Regel- bzw. Stellgrößen und werden vom Prozessleitsystem erfasst. Der volumenbezogene Sauerstoffübergangskoeffizient wurde für die entsprechenden Prozessbedingungen zuvor experimentell bestimmt.
Kohlendioxidproduktionsrate CER
Durch die geregelten pCO₂-Werte bei gleichzeitiger pH-Regelung im Kulturmedium findet dort keine Anreicherung von CO₂ statt. Somit kann analog zum Gelöstsauerstoff bilanziert werden (Frahm, Blank et al. 2002).
mit

= volumenbezogener Kohlendioxidübergangskoeffizient, h^–1
= Sättigungskonzentration von Kohlendioxid im Medium, mol·L^–1 (errechnet aus Kohlendioxidkonzentration der Abluft)
= geregelte Gelöstkohlendioxidkonzentration, mol·L^–1

Respiratorischer Quotient RQ
Das Verhältnis von zellspezifischer Kohlendioxidbildungsrate qCER zu zellspezifischer Sauerstoffaufnahmerate qOUR wird als respiratorischer Quotient RQ bezeichnet.

RQ: = respiratorischer Quotient
qCER: = zellspezifischer Kohlendioxidbildungsrate, mol Zelle^–1 h^–1
qOUR: = zellspezifischer Sauerstoffaufnahmerate, mol Zelle^–1 h^–1

Beispiel 2
Optimierung pCO₂-assoziierter Prozessparameter
In industriellen Zellfermentationsanlagen herrschen aufgrund der unterschiedlichen Reaktorbauhöhen von Rührkesselreaktoren hydrostatische Drücke bis 350 mbar im Bodenbereich (Füllhöhe 3.5 m). Aus steriltechnischen Gründen überlagert man diese Fermenter noch zusätzlich mit Überdrücken von bis zu 300 mbar, so dass in Produktionsfermentern von 10 m³ Arbeitsvolumen Gesamtüberdrücke von bis zu 650 mbar im Bodenbereich herrschen können. Unter diesem Überdruck reichert sich das von den Zellen produzierte CO₂ im Medium an und kann bei Hochzelldichte-Fermentationen inhibierende Spiegel erreichen, wenn der Austrag des Gelöstkohlendioxids nicht über die Begasung optimiert wurde.
Zur Simulation des Produktionsmaßstabs und zur entkoppelten Untersuchung der beteiligten Parameter Druck und Gelöstkohlendioxidgehalt – synonym als pCO₂ bezeichnet – auf Bioprozesse mit tierischen Zellen wurde für diese ein Reglersystem analog zur Gelöstsauerstoffkonzentration pO₂ etabliert. Dabei sollte die Regelung des Gelöstkohlendioxidgehalts im Medium unter verschiedenen Druckbedingungen möglich sein, wobei die Stellgrößen des pCO₂-Regelkreises auf industrielle Bioreaktoren übertragbar sein sollten. Begasungsraten, Rührergeschwindigkeiten und Kulturmedien orientierten sich deshalb an industriellen Parametern.
(A) Regelung des Gelöstkohlendioxidgehalts im Kulturmedium
(1) Aufbau und Funktionsweise der pCO₂-Regelung
Die verwendeten Reaktorsysteme waren standardmäßig mit submerser Ratiobegasung ausgestattet. Deren CO₂-Massendurchflussregelventile (mass flow controller MFC, Typ Brooks 5850 E CO₂, 0–5 L·h^–1) wurden von implementierten PID-Reglern im Prozessleitsystem LabView (Texas Instruments) zur pCO₂-Regelung angesteuert. Zusätzlich wurde nur beim 10 L-Rührkesselreaktor ein N₂- Massendurchflussregelventil (Brooks 5850 TR N₂, 0–15 L·h^–1) in der Begasungsstrecke installiert, um den Begasungsvolumenstrom zur pCO₂-Absättigung von 30 L·h^–1 auf maximal 45 L·h^–1 erhöhen zu können. Die Messung der Regelgröße pCO₂ im Medium erfolgte mit einer in situ pCO₂-Sonde YSI 8500 (Yellow Springs Instruments) diskontinuierlich alle 15 Sekunden (Kap. 3.5.3.2).
Die im Prozessleitsystem (LabView, National Instruments, USA) für die Regelgröße pCO₂ implementierten PID-Regler arbeiten kaskadiert (1). Im Fall einer positiven pCO₂-Sollwertabweichung wird der Anteil des CO₂ in der Ratiobegasung durch den Regler PID 1 entsprechend verringert (1). Gelingt es Regler PID 1 trotz vollständig geschlossenem CO₂-MFC nicht, bei einer positiven Sollwertabweichung den pCO₂-Sollwert einzuregeln (z. B. durch produziertes CO₂ der Zellen), steuert der kaskadierte Regler PID 2 ein zusätzliches N₂-Massendurchflussventil an und erhöht den Gesamtvolumenstrom der Begasung um maximal 15 L·h^–1 angemessen (1).
Der hier beschriebene pCO₂-Regler eignet sich damit für eine Sollwertregelung der Gelöstkohlendioxidkonzentration. Mit diesem pCO₂-Regler ist es nun möglich, definierte pCO₂-Werte über den gesamten Kulturverlauf einzustellen und deren Einfluss auf die kultivierten Zellen zu untersuchen. Nach dem Henry'schen Gesetz ist die Löslichkeit eines Gases in einer Flüssigkeit seinem Partialdruck in der darüber stehenden Gasphase proportional. Durch den Regler ist über die Erhöhung des CO₂-Anteils in der Zuluft somit eine Anreicherung des CO₂ im Medium möglich. Mit fortschreitender Kulturdauer und Anstieg der Zelldichte im Reaktor steigt der Anteil des durch die Zellen produzierten CO₂ im Medium. Darauf wird durch eine Reduktion des CO₂-Anteils in der Zuluft durch den Regler reagiert. Ist nun die volumetrische Kohlendioxidproduktionsrate (CER) der kultivierten Zellen so hoch, dass durch eine vollständige Reduktion des CO₂-Anteils in der Zuluft bis auf Null der pCO₂-Sollwert nicht mehr erreicht werden kann, so steigert der kaskadierte Regler den Gesamtvolumenstrom der Begasung und damit den CO₂-Austrag aus der flüssigen in die gasförmige Phase.
(2) Regelgüte der pCO₂- und pO₂-Regelung
Der erhöhte Gasvolumenstrom durch Stickstoffzugabe in der Zuluft zum verbesserten CO₂-Austrag wirkt als Störgröße auf die Sauerstoffregelung. Über die folgend gezeigten Sollwertführungen wurde die Eignung der pCO₂-Regelung zusammen mit der pO₂-Regelung sowohl im 1 L- als auch im 10 L-Maßstab untersucht. Das Zusammenwirken dieser Regler mit dem pH-Regler unter Einsatz verschiedener Titrationsmittel wird nachstehend beschrieben.
Die Startparameter der Reglereinstellungen wurden nach den Empfehlungen von Ziegler und Nichols bestimmt (Rake, 1993). Dazu wurden die PID-Regler beider Regelkreise als reine P-Regler konfiguriert (Vorhaltezeit T_V = 0, Nachstellzeit T_N = ∞). Durch Variation des Proportionalbereichs X_P bis zur kritischen Kreisverstärkung des jeweiligen Regelkreises erhält man X_P,krit. Die Dauer einer Regelschwingung bei X_P,krit entspricht der Zeit T_krit. Tabelle 2: Empfohlene Reglerparameter nach Ziegler und Nichols am Stabilitätsrand

PID-Anteile Einstellwerte

P XP ≈ 1.7 X_P,krit

I T_N ≈ 0.5 T_krit

D T_V ≈ 0.12 T_krit
Durch eine geeignete Sollwertführung (Tab. 2) beider Regelkreise wurde nun die Regelgüte für den Einsatz in Fermentationen tierischer Zellen optimiert. Beide Regelkreise arbeiten unabhängig voneinander mit minimalen Einschwingzeiten und Regelabweichungen. Der Einfluss des erhöhten Volumenstroms auf die Gelöstsauerstoffregelung bei erhöhtem CO₂-Austrag konnte minimiert werden (4-2 und 4-3).
Tabelle 3: Sollwertprofil für die Qualifizierung der Regelgüte in Fig. 2 und Fig. 3
Die absolute Regelabweichung liegt für Gelöstsauerstoff bei Sollwertsprüngen (die unter Kultivierungsbedingungen so nicht vorkommen) im Betrieb mit geringem Überdruck (50 mbar) bei weniger als 2%. Analog beläuft sich diese für den Gelöstkohlendioxidgehalt auf < 1% (absolut) bei für den fermentativen Betrieb unüblichen Sollwertsprüngen um absolut 5–10% (2). Auch bei drucküberlagertem Reaktor (750 mbar) zur Simulation großer Füllhöhen industrieller Produktionsanlagen und den damit erhöhten Löslichkeiten von CO₂ und O₂ in der Flüssigphase ist die Güte der implementierten Regelungen ausreichend für tierische Zellkulturprozesse (3).
Bei der gemäß Tabelle 3 gestalteten Sollwertführung zeigt allein der Gelöstsauerstoffwert kurzzeitig geringes Überschwingverhalten (< 4% absolut), wenn der Gesamtvolumenstrom zum Austrag des Gelöst-CO₂ erhöht wird (3). Die Regelung des pCO₂ war mit Abweichungen von < 1% (absolut) sehr genau. Durch eine zeitabhängige Sollwertführung des pCO₂ konnten definierte Profile aus Produktionsfermentern im Kleinmaßstab abgebildet werden.
Im Folgenden wurden die hier beschriebenen pCO₂- und pO₂-Regler für die entkoppelte Regelung zusammen mit dem implementierten Überdruckregler optimiert, um Großfermenter bezüglich dieser Prozessparameter abbilden zu können.
(B) Überdruckregler
Das Bestreben zu großvolumigeren Produktionsanlagen hält auch in der tierischen Zellfermentation an, so dass zur Simulation der verschiedenen hydrostatischen Druckverhältnisse aus industriellen Produktionsmaßstäben ein Druckregelsystem bis 1000 mbar Überdruck für den in dieser Erfindung verwendeten Stahl-Rührkesselreaktor (10 L Arbeitsvolumen, B. Braun, Kap. 3.5.2) entwickelt wurde. Dieser sollte unabhängig von den Reglern für pCO₂, pO₂ und pH-Wert definierte Sollwertprofile regeln können.
(1) Aufbau und Funktionsweise
Auf der insterilen Seite der Abluftstrecke des Fermenters wurde ein Druckregelventil (Brooks pressure controller, Typ 5866 Series, 0–68 L·h^–1) installiert. Die Öffnungsweite war Stellgröße für den entwickelten PID-Druckregler im Prozessleitsystem (LabView). Die Regelgröße wurde auf der Innenseite des Reaktordeckels durch einen Druckpastensensor gemessen und an das Prozessleitsystem übermittelt. Durch den schnellen Druckabfall selbst bei geringen Öffnungsweiten des Druckregelventils gegenüber dem langsamen Druckanstieg durch die geringe Begasungsrate bei geschlossenem Druckregelventil war die Regelstrecke innerhalb der geforderten Toleranz nicht auszuregeln. Deshalb wurde zusätzlich im weiteren Verlauf der Abluftstrecke in Richtung Abgasanalysegerät ein Membranventil, dessen Ventilstellung manuell voreingestellt werden konnte, installiert (4).
Der so entwickelte Aufbau mit zusätzlichem Membranventil besitzt die folgenden Vorteile:

• Sicherheitsreserve: Aufrechterhaltung eines einstellbaren Minimaldrucks bei Ausfall des Druckregelventils während des Betriebs
• Hinreichende Trägheit der Regelstrecke trotz sub-optimaler Durchflussrate des Druckregelventils (max. möglicher Ventildurchfluss 68 L·h^–1, maximale Begasungsrate 45 L·h^–1)

Eine Installation und manuelle Druckeinstellung durch das Membranventil allein war aufgrund der benötigten variablen Begasungsraten für die pCO₂-Regelung nicht möglich.
(2) Regelgüte der Überdruckregelung
Es wurde eine Regleroptimierung nach Ziegler und Nichols durchgeführt (Rake, 1993). Die Einsatzfähigkeit der Überdruckregelung eines statischen Sollwerts bei gleichzeitiger Regelung von pCO₂-Sollwertprofilen wurde darüber hinaus um eine automatische, prozesszeitabhängige Sollwertführung ergänzt. Diese ermöglichte die Erstellung definierter Überdruckprofile, um z. B. die in großvolumigen Produktionsfermentern vorherrschenden Mischungsprofile zu simulieren. Durch Mischzeiten von z. T. mehreren Minuten ergeben sich in diesen Reaktoren Mischungsprofile abweichend vom Modell des homogen durchmischten Reaktors und einhergehend damit unterschiedliche räumliche Positionen der suspendierten Zellen im hydrostatischen Druckprofil. 5 zeigt exemplarisch ein zeitabhängiges Druckprofil im 10 L-Rührkessel in Anlehnung an ein Druckprofil eines Produktionsfermenters. Gleichzeitig ist eine dynamische pCO₂-Sollwertführung gezeigt, die unabhängig vom eingestellten Druckprofil realisierbar ist.
Die Regelung des intermittierenden Sollwerts des Reaktorüberdrucks p (je 30 min. bei 750 mbar und 1 h bei 450 mbar) zwischen den Prozesszeiten t = 20 h und t = 26 h zeigt eine hohe Regelgüte (±30 mbar), ohne signifikante Auswirkungen auf die Sollwertführung der Gelöstkohlendioxidkonzentration zu haben (< 1% absolut) (5). Dies ist insbesondere vor dem Hintergrund der steigenden Löslichkeit des CO₂ bei Druckanstieg wichtig. Ebenso zeigen Änderungen des pCO₂-Sollwerts im zeitlichen Verlauf keine Änderung der Überdruckregelgüte (5), obwohl z. B. zur Erniedrigung des pCO₂-Gehalts im Fermentermedium durch erhöhten Stickstoffeinstrom der Gesamtgasvolumenstrom in den Fermenter um 50% erhöht wurde. Sollwerte zwischen 1.5–25% pCO₂ bei bis zu 1000 mbar Überdruck konnten mit diesem Setup eingestellt und ausgeregelt werden.
Es zeigte sich, dass die Sauerstoff-, Druck- und pCO₂-Regelung unabhängig voneinander mit hoher Regelgüte möglich ist. Trotz konstanter, niedriger Rührerdrehzahl ist der Sauerstoffeintrag für tierische Zellkulturen ausreichend. Durch geeignete Sollwertführung ist die Simulation der Anreicherung von CO₂ über den Prozessverlauf möglich. Ebenso kann ein Profil zur Simulation von Druckänderungen durch hydrostatische Effekte in hohen Produktionsreaktoren eingestellt. Insgesamt ist es also möglich, die bestehenden Anforderungen an die betrachteten industriellen Prozessparameter dynamisch umzusetzen.
(C) pH-Korrekturmittel
Kultivierte Zelllinien produzieren im Überschussstoffwechsel erhebliche Mengen Laktat und andere organische Säuren, die zusammen mit dem ins Medium abgegebenem CO₂ den pH-Wert des Kulturmediums im Prozessverlauf erniedrigen. Der Einfluss des pH-Werts im Medium auf Zellphysiologie und Produktqualität (z. B. von sezernierten Glykoproteinen) ist hinreichend untersucht worden. In optimierten Prozessen korrigiert man deshalb den pH-Wert des Mediums in bestimmten Bandbreiten, meist zwischen pH 6.6 und pH 7.4, durch Zugabe unterschiedlicher Basen zur kultivierten Zellsuspension. Verbreitet sind NaOH, das für CIP (clean in place)-Prozesse an den meisten validierten Produktionsanlagen verfügbar ist, und Na₂CO₃, bzw. NaHCO₃, das als Pufferkomponente in den meisten Zellkulturmedien enthalten ist. Oft wird der Begasungsluft von Zellkulturprozessen in der Startphase CO₂ beigemischt, um den pH-Wert des Mediums zu erniedrigen. So stellt sich selbst bei NaHCO₃-freien Medien ein Gleichgewicht zwischen zudosiertem CO₂ in der Begasung und dem wässrigen Kulturmedium ein.
Negative Effekte der pH-Korrektur können sich in großvolumigen Produktionsanlagen bei Zugabe starker Basen über den Kopfraum ergeben. Dabei wurden aufgrund hoher Mischzeiten bis zu mehreren Minuten pH-Gradienten von bis zu 0.8 pH-Einheiten zwischen Eintropfstelle und pH-Messpunkt beschrieben (Langheinrich and Nienow, 1999). Ebenso haben die Einstellungen des pH-Reglers große Auswirkungen auf Zelldichte und Induktion von Apoptose im Kulturgefäß (Osman, Birch et al., 2001; Osman, Birch et al., 2002).
(1) Einfluss des pH-Korrekturmittels auf ein zellfreies System
Es wurden die basischen pH-Korrekturmittel NaOH und Na₂CO₃ bei unterschiedlichen, simulierten Zellkulturbedingungen aber identischen Reglereinstellungen verglichen (6 und 7). Ihr Einfluss auf Kultivierung einer CHO-Zelllinie im Fed Batch Betrieb wird nachstehend gezeigt.
Unter identischen pH-Reglereinstellungen am Biostat ES wurden in selbigem geregelte 5% pCO₂ in einem wässrigem Phosphat/Hydrogenkarbonatpuffergemisch eingestellt (30 L·h^–1, 37°C, 200 rpm, 750 mbar Überdruck). Es resultierte ein pH-Startwert von 7.28. Dann wurde durch eine Sollwertänderung im Prozessleitsystem ein pCO₂-Sprung von 5% pCO₂ auf 15% pCO₂ provoziert und simultan die pH-Regelung gestartet. Der pH-Sollwert wurde dabei auf 7.2 mit NaOH (1 M, 6) bzw. Na₂CO₃ (1 M, 7) geregelt. Diese Versuchsbedingungen simulierten eine zeitlich beschleunigte Anreicherung des von den Zellen produzierten CO₂ im Medium und die gegen die damit verbundene Ansäuerung gerichtete pH-Korrektur mit der jeweiligen Base (6 und 7).
Bei Verwendung von NaOH zur pH-Korrektur wurden für die pCO₂-Sollwertänderung 2.6 h und 26 Dosierungen benötigt (6). Daraus ergibt sich eine Dosierungsfrequenz von 10 h^–1. Bei Verwendung von Na₂CO₃ zur pH-Korrektur verringerte sich die pCO₂-Einstellzeit um 60°% auf 1.6 h (7). Das durch das Na₂CO₃ zusätzlich eingetragene CO₂ bewirkt parallel zum pCO₂-Regler eine Aufsättigung des Gelöst-CO₂. Die Dosierungsfrequenz (8 h^–1) ist im Vergleich zu NaOH vermindert. Die Tendenz des verminderten Basenverbrauchs bei Verwendung von Na₂CO₃ an Stelle von NaOH ist anhand des kumulativen Dosierungsprofils in 8 veranschaulicht. Für den beschriebenen pCO₂-Sollwertsprung benötigt man zur pH-Regelung die doppelte Menge 1 M NaOH. Ingesamt wurden 220 g 1 M NaOH (0.21 mol) im Gegensatz zu 110 g 1 M Na₂CO₃ (0.1 mol) in den Reaktoreingetragen (8).
Der Eintrag an Natrium-Ionen ist demnach bei beiden Titrationsmitteln identisch. Ein negativer Effekt auf die Zellkultur durch potentiell unterschiedliche osmotische Effekte durch Einsatz der beschriebenen Basen kann bei pCO₂-Regelung somit ausgeschlossen werden. Da der Endzustand beider Titrationssysteme aufgrund der Gleichgewichtsbedingungen identisch ist, können die Basen NaOH und Na₂CO₃ durch folgende Effekte unterschiedlich auf kultivierte Zellen wirken: Anzahl der Dosierungen, Frequenz der Dosierungen, Störungen des CO₂-Gleichgewichts extrazellulär & intrazellulär.
Osman et al. untersuchten den Einfluss von pH-Störungen auf die Maus-Myeloma-Zelllinie GS-NS0 in Satzkulturen (Osman, Birch et al., 2002). Dabei setzten sie die Zellen mehrfach hintereinander pH-Anstiegen auf pH 8.0 aus, wie sie auch durch suboptimale Durchmischung in Produktionsfermentern bei Zugabe von starken Basen wie NaOH bzw. Na₂CO₃ auftreten (Langheinrich and Nienow 1999). Sie stellten fest, dass mit steigender Anzahl von pH-Auslenkungen auf pH 8.0 die Zellviabilität abnimmt. Ebenso erniedrigte eine steigende Frequenz der Basenzugabe auf pH 9.0 die Zellviabilität erheblich (Osman, Birch et al., 2002). Da bei Einsatz von NaOH als pH-Korrekturmittel in dieser Erfindung beide von Osman et al. beschriebenen Effekte zum Tragen kommen (Erhöhung von Dosierungsfrequenz und -anzahl), sind ähnlich negative Effekte auf kultivierte Zellen zu erwarten. Im Gegensatz zu unter o. g. pCO₂-geregelten Bedingungen erzielten Ergebnissen muss angenommen werden, dass der negative Effekt von NaOH bei Verzicht auf eine pCO₂-Regelung wesentlich stärker auf die Zellphysiologie wirkt.
Es ist anzunehmen, dass die starke Störung des CO₂-Gleichwichts im Kulturmedium durch Titration mit NaOH (verlängerte pCO₂-Einregelzeit, vgl. 6 und 7) sich ebenso auf das Zytosol der im Kulturmedium befindlichen Zellen auswirken kann. Diese Hypothese wird durch die Ergebnisse gestützt, die bei der Entwicklung der druckregulierten Probeentnahmevorrichtung in dieser Arbeit präsentiert werden und denen, die nachstehend zum Einfluss der pH-Titrationsmittel auf kultivierte tierische Zellen im Kleinmaßstab gezeigt werden.
(2) Einfluss des pH-Korrekturmittels auf Fed-Batch Kultivierungen einer CHO-K1 Zelllinie im 1 L-Maßstab
Die vorstehenden Beobachtungen der Einflüsse von NaOH und Na₂CO₃ sollten in Fed Batch Kultivierungen der Zelllinie CHO-MUC1 im Kleinfermentersystem (1 L Applikon) evaluiert werden. Der beschriebene Kleinfermenter wurde im Fed Batch Modus mit Membranbegasung und Überdruck betrieben, um die hydrostatischen Druckeffekte größerer Reaktoren zu simulieren. Die Druckhalteeinheit (Fa. Bioengineering) arbeitete autark und der Druck wurde manuell durch ein Rückhalteventil hinter dem Abluftfilter eingestellt. Die Druckmessung erfolgte auf der sterilen Seite mit einem eigens angefertigten Adapterstück durch einen piezosensitiven Drucksensor. Während der Vorfermentation der Zellen im Reaktor wurde ein Überdruck von 60 mbar aufrecht gehalten, um kleine Fermenter der industriellen Anzucht zu simulieren. Durch eine Teilernte des Fermentervolumens, Erhöhung des Drucks auf 150 mbar und Einsatz eines Haupfermentationsmediums wurde der Hauptproduktionsprozess (100 L) simuliert. Durch Zufütterungsmedium wurde der Glukosegehalt über 1.0 g L^–1 und der Glutamingehalt zwischen 0.8 g L^–1 und 1.0 g L^–1 gehalten.
Nachstehend sind die erzielten Lebendzelldichten und Viabilitäten über den Prozessverlauf in den 9 und 10 für verschiedene CO₂-Profile der Begasungsmischung dargestellt. Die in 9 dargestellten Ergebnisse wurden mit einem konstanten Anteil von 5% (v/v) CO₂ in der Begasungsmischung realisiert. Zur manuellen pH-Regelung auf pH 7.2 wurde hingegen für die Fermentation dargestellt in 10 der CO₂-Anteil in der Begasungsmischung sukzessive reduziert.
Für beide CO₂-Begasungsmodi lassen sich höhere Lebendzelldichten, verlängerte Kultivierungsdauern und höhere Produktkonzentrationen bei Verwendung von Na₂CO₃ statt NaOH erzielen (9 und 10). Die Laktatkonzentrationen zeigen für beide verwendeten pH-Korrekturmittel einen stetigen Anstieg über den gesamten Prozessverlauf (11).
Die resultierenden zellspezifischen Laktatbildungsraten sind demnach bei Verwendung von NaOH als Base höher als bei Verwendung von Na₂CO₃ (errechnete Daten nicht gezeigt). Osmolalitäten über dem Schwellenwert von 400 mOsmol kg^–1 korrelieren bei Verwendung von NaOH als Korrekturmittel mit einer Verlangsamung des Zellwachstums, bei Einsatz von Na₂CO₃ hingegen wachsen die Zellen auch weiterhin exponentiell, um erst später in die stationäre Wachstumsphase einzutreten (12). Hochosmolare Prozesse, wie sie in der Literatur zur Produktivitätssteigerung beschrieben sind (Kim, Kim et al., 2002), lassen sich nach den hier gezeigten Ergebnissen durch Verwendung von Na₂CO₃ statt NaOH als pH-Korrekturmittel weiter optimieren. Besonders zusammen mit dem entwickelten pCO₂-Regler lassen sich voraussichtlich solche Prozesse noch weiter bezüglich Zellmetabolismus, -physiologie und Produktbildung verbessern. Für die weiteren Kultivierungen in dieser Erfindung wurde auf Basis dieser Ergebnisse ausschließlich Na₂CO₃ als pH-Korrekturmittel verwendet.
Beispiel 3
Druckregulierte Probeentnahme zur fermentations-begleitenden Messung zellphysiologischer Parameter in drucküberlagerten Fermentationen tierischer Zellen
Industrielle Fermentationen tierischer Zellen finden, wie bereits zuvor beschrieben, im Großmaßstab statt, dessen hydrostatischer Druck zusammen mit dem steriltechnisch aufgegebenen Überdruck nach dem Henry'schen Gesetz eine gesteigerte Löslichkeit von im Kulturmedium befindlichen Gasen bedingt. Besonders das von den Zellen produzierte und ins wässrige Medium abgegebene Kohlendioxid löst sich im Vergleich zu Sauerstoff ungefähr 25-mal besser unter analogen Bedingungen. (Bailey and Ollis, 1986). Die damit verbundene und leicht messbare Änderung des pH-Werts im Kulturmedium kann durch Verwendung geeigneter Puffersysteme und den Einsatz von pH-Korrekturmitteln minimiert werden. Da es sich bei CO₂ um ein kleines, unpolares Molekül handelt, kann dieses relativ ungehindert die Membran tierischer Zellen passieren und somit auch den intrazellulären pH-Wert beeinflussen (Thomas, 1995).
Zur fermentationsbegleitenden Analytik werden üblicherweise in bestimmten Zeitabständen zellhaltige Proben aus der Kultur entnommen. Bei konventionellen Probeentnahmeverfahren aus drucküberlagerten Fermentationen wird nach dem Stand der Technik ein im Bodenbereich angebrachtes Ventil geöffnet und durch den Überdruck im Kulturgefäß ein bestimmtes Volumen der zellhaltigen Probe in einen geeigneten Behälter druckfrei entlassen. Die damit verbundene Entspannung der Zellsuspension bedingt eine zeitabhängige Entgasung derselben. Die tatsächlich vorliegenden Gelöstgaskonzentrationen in den korrespondierenden Fermentern können folglich nach der konventionellen Probeentnahme durch Blutgasanalysatoren nur unzureichend repräsentiert werden (s. u.).
In den folgenden Beispielen werden zu dieser Thematik Untersuchungsergebnisse dargestellt, die zusätzlich zu den extrazellulären Änderungen im Medium den Einfluss des Probeentnahmeverfahrens auf den intrazellulären pH-Wert der darin befindlichen Zellen herausstellen. Die Entwicklung einer Vorrichtung zur druckregulierten Probeentnahme und ihre Notwendigkeit zur Anwendung bei kulturbegleitender Analytik des intrazellulären pH-Werts tierischer Zellen im Großmaßstab bzw. drucküberlagerten Fermentationen werden dargestellt.
(A) Konstruktion und Entwicklung einer druckregulierten Probeentnahmevorrichtung
(1) Qualifizierung durch in situ und off-line pCO₂-Messungen
Zur Untersuchung des Einflusses unterschiedlicher Probeentnahmeverfahren auf die Gelöstgaskonzentrationen im Medium – nach dem Stand der Technik und mit der entwickelten Vorrichtung – wurden im 10 L-Reaktor Biostat ES verschiedene Gelöstkohlendioxidkonzentrationen und Drücke eingestellt, um so die verschiedenen Bedingungen in industriellen Großfermentern zu simulieren. Dies geschah durch Begasung des entsprechenden Mediums mit definierten Kohlendioxidanteilen in der Begasungsmischung unter Standardfermentationsbedingungen (Ratiobegasung 30 L·h^–1, 37°C, 200 rpm) und den ansonsten in Beispiel 2(E) angegebenen Parametern. Der pH-Wert wurde hierbei nicht durch Zugabe von Base korrigiert. Die durch den ansteigenden Totaldruck erhöhte CO₂-Konzentration im Medium befand sich für die Messungen im Gleichgewicht mit der Gasphase (Abgasanalyse. Xentra 4900, Servomex). 13 zeigt die Parameter, aus deren Kombination sich die 30 durchgeführten Experimente ergaben.
Die Messungen des Gelöstkohlendioxidanteils erfolgte unter Verwendung von in situ pCO₂-Sonden (Yellow Springs Instuments, USA) bzw. nach Probenahme off-line durch einen Blutgasanalysator (AVL Compact 3, Roche Diagnostics GmbH). In 14 sind exemplarische Ergebnisse für 0.15 M NaCl als wässriges Medium gegeben.
Dabei wird der relativ große Verlust von Gelöst-CO₂ zwischen in situ Messwerten und den herkömmlichen Probeentnahmeverfahren deutlich (ΔpCO₂ = 30%).
Der geringere CO₂-Verlust bei Verwendung der verschlossenen Spritze ist primär auf die geringere Vermischung mit der CO₂-freien Raumluft zurückzuführen, die bei den herkömmlichen Probenahmen unweigerlich auftritt. Die Probenahme erfolgte mit der Spritze durch einen sterilen Adapter, der direkt an das Probeentnahmeventil des Reaktors angeschlossen werden konnte (16). Der Innendruck des Reaktors bewegte dabei den gasdicht eingearbeiteten Stempel der in einer Halterung untergebrachten Spritze gegen atmosphärischen Druck bis zur voreingestellten Begrenzung (17 und 18). Vergleichende Ergebnisse dieser favorisierten Probeentnahmeart bei unterschiedlichen Reaktorüberdrücken zeigt 15. Eine weitere Reduktion des CO₂-Verlustes durch Modifikationen dieser Probeentnahmeart wurde weiter verfolgt.
Bereits durch die Verwendung dieser spritzenbasierten Reaktorprobeentnahmetechnik kann der Verlust der Gelöstgaskonzentrationen (ΔpCO₂) von 30% auf 20% minimiert werden.
Die Aufrechterhaltung des im Reaktor zum Probenahmezeitpunkt vorherrschenden Überdrucks in der Probeentnahmevorrichtung sollte nun den Gelöstgasverlust weiterhin minimieren. Zur kontinuierlichen Messung des Probendrucks wurde dafür ein piezo-elektrischer Druckaufnehmer in die Probeentnahmestrecke integriert und mit einem Digitaldisplay verbunden (16).
Die Druckmessung war so auch nach der Abkoppelung der Probeentnahmeeinheit vom Reaktor möglich. Eine Regelung des angezeigten Probendrucks auf Reaktorniveau und somit die isobare Entnahme der Probe erfolgte manuell durch ein entsprechend langsames Entlassen der (Zell-)Suspension aus dem drucküberlagerten Fermenter in die daran gekoppelte Probeentnahmeeinheit (16). Die angebrachten Rändelschrauben erlaubten eine feine Nachjustierung des Probendrucks nach Abkopplung der Einheit vom Reaktor (16–18). Die so entwickelte druckregulierte Probeentnahmevorrichtung (DPN) hielt die Gelöstgaskonzentrationen in der zellfreien Probe über einen Zeitraum von mehreren Stunden auf Reaktorniveau (Klinger, 2006). 17 und 18 zeigen eine photographische Abbildung der Halteeinheit für unterschiedliche Probenvolumina, die durch Spritzen und Adapterhülsen realisiert wurden bzw. ein Aufsicht auf die Halteeinheit mit installierter Spritze.
Die entwickelte DPN konnte zu diesem Entwicklungsstand aufgrund der steriltechnischen Bauweise zur Probeentnahme in drucküberlagerten Fermentationen tierischer Zellen eingesetzt und qualifiziert werden. Durch die Sterilkupplungen (Fa. Stäubli, Schweiz) ergaben sich zusammen mit dem heißdampfsterilisierbaren Probeentnahmeventil am Bioreaktor keine Einschränkungen in der steriltechnischen Betriebsweise des Rührkessels (Qualifizierungen nicht gezeigt).
19 zeigt exemplarisch die off-line gemessenen CO₂-Konzentrationen nach herkömmlichen Probenahmeverfahren im Vergleich zum entwickelten druckregulierten Probeentnahmeverfahren am Ende einer drucküberlagerten Fed Batch Kultur der CHO-MUC1-Zelllinie. Obwohl die Gelöstkohlendioxidkonzentrationen sich direkt nach der Probeentnahme in den unterschiedlichen Gefäßen nicht sonderlich unterscheiden, fällt die Konzentration des Gelöst-CO₂ in den herkömmlichen Entnahmearten bereits in den ersten 12 Minuten um 20% ab. Eine repräsentative Messung des Gelöst-CO₂ in drucküberlagerten Fermentationen ist demnach bei Anwendung herkömmlicher Probeentnahmetechniken nur bei unmittelbarer Messung mit einem Blutgasanalysator möglich.
Einen wesentlichen Vorteil bietet hierbei die Verwendung der entwickelten Probeentnahmevorrichtung unter Beibehaltung von Reaktordruck und -temperatur. Diese erhält über einen Lagerungszeitraum von einer Stunde die Reaktorausgangskonzentration des Gelöst-CO₂ (19). Dabei war die Gelöstsauerstoffkonzentration zu keinem Zeitpunkt limitierend (Klinger, 2006). Durch die Aufrechterhaltung von Druck und pCO₂-Konzentrationen des Reaktors außerhalb desselben ermöglicht die entwickelte druckregulierte Probeentnahmevorrichtung mittelfristige Probenbehandlung (< 1 h) unter Bioreaktorbedingungen.
Der in 19 untersuchte Zeitraum ist insbesondere optimal für die Behandlung der zellhaltigen Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff, wie dies z. B. für die Messung des intrazellulären pH-Wertes erforderlich ist. Die grundsätzlichen Zusammenhänge zwischen pCO₂-Level im Kulturmedium und dem intrazellulären pH-Wert werden in Beispiel 4 gezeigt, die mit der hier beschriebenen Probeentnahmevorrichtung erzielten Ergebnisse in pCO₂-geregelten Fermentationen finden sich in den Beispielen 5 bis 7.
Im Folgenden sind exemplarische Ergebnisse durchflusszytometrischer Untersuchungen zu zellphysiologischen Qualifizierungen der unterschiedlichen Probeentnahmeverfahren dargestellt.
(2) Qualifizierung anhand durchflusszytometrischer Messungen
Die durchflusszytometrische Bestimmung des intrazellulären pH-Werts berücksichtigte in den herkömmlichen Protokollen nach dem Stand der Technik die Einhaltung der Reaktorbedingungen (Temperatur, pH-Wert, Medienbestandteile, Gelöstgaskonzentrationen, Druck) nur zum Teil. Insbesondere der Probeentnahme aus drucküberlagerten Fermentationen und der damit verbundenen Entgasung des Mediums und ihrer Einflüsse auf die Physiologie der in der Probe enthaltenen Zellen wurde wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Aus den folgenden Ergebnissen ist ersichtlich, dass, obwohl in den extrazellulären Messwerten pH und pCO₂ keine detektierbaren Änderungen im Medium nach Probenahme vorliegen, darin suspendierte Zellen bereits maßgeblich von den physiologischen Bedingungen im Bioreaktor abweichen können.
Durch den Einsatz der entwickelten Probeentnahmevorrichtung in durchflusszytometrischen Bestimmungen können intrazelluläre pH-Werte gemessen werden, die den physiologischen Zustand der untersuchten Zellen im Bioreaktor wesentlich besser repräsentieren als nach dem Stand der Technik. Die folgenden 20 und 21 zeigen Ergebnisse aus durchflusszytometrischen pH_i-Messungen, die ohne (20) bzw. mit druckregulierter Probeentnahme (21) erzielt wurden. In den jeweils rechts gezeigten Teilabbildungen 2 und 3 sind die Intensitäten der entsprechenden Fluoreszenzen (FL2-H bzw. FL3-H) gegen die Zellgröße aufgetragen. Die Teilabbildungen 1 auf der linken Seite zeigen den Ratio-Peak, der sich aus den Verhältnissen der Fluoreszenzintensitäten FL3/FL2 ergibt. Dieses Verhältnis bestimmt den pH_i nach den Kalibrationswerten. Seine Höhe wird durch die Zählereignisse pro Detektionskanal bestimmt.
Zur Bestimmung des pH_i-Werts einer CHO-Zellpopulation im drucküberlagerten Fermenter nach dem Stand der Technik wurde zunächst steril eine Probe unter Entspannung auf Atmosphärendruck entnommen und diese wie vorstehend beschrieben mit dem Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1 für 25 Minuten inkubiert. Die darauf folgende Messung im Durchflusszytometer ergab die unter 20A und B gezeigten Fluoreszenzintensitätsverhältnisse. Dabei ist in 20A1 ein Doppel-Peak erkennbar, der auf zwei Zellpopulationen unterschiedlicher Fluoreszenzintensität basiert (20A2 und A3). Die eindeutige Zuordnung der Peaks zum ursprünglichen pH_i-Wert der Population im Reaktor ist trotz Auswahl geeigneter Grenzen für die Einzel-Peaks (20B, obere Populationen) nicht möglich.
Bei Betrachtung derselben Probe nach insgesamt 50 Minuten (4–20C) zeigt sich die Fluoreszenz der Zellpopulation vollständig verschoben, die aufgrund ihrer Homogenität einen Einzel-Peak des korrespondierenden Fluoreszenzintensitätsverhältnisses bedingt (20C1). Dieser Einzel-Peak repräsentiert den Endzustand einer zeitabhängigen Änderung der fluoreszierenden Zellpopulation, bei der intermediär die in 20A observierte Doppelpopulation auftritt.
Diese Annahme sollte durch die Verwendung der druckregulierten Probeentnahme zur Inkubation der isobar entnommenen Reaktorprobe mit dem Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1 im Folgenden bestätigt werden. Vergleicht man die Teilpopulationen hoher Fluoreszenzintensität (Punktwolkendarstellungen in 20A2, A3), sowie die Lagen der korrespondierenden Ratio-Peaks (20A1) nach isobarer Inkubation in der druckregulierten Probeentnahmevorrichtung mit denen aus der drucklosen Inkubation nach herkömmlicher Probenahme (Punktwolkendarstellungen in 21D2 und D3 bzw. Ratio-Peak 20D1), so werden folgende Unterschiede deutlich. Es zeigt sich im Gegensatz zur drucklosen Inkubation (nach dem Stand der Technik) auch nach 25-minütiger Inkubation eine homogene fluoreszierende Zellpopulation (21D2 und D3) und ein entsprechend singulärer Ratio-Peak (21D1). Inkubiert man dieselbe Probe für weitere 25 Minuten ohne Überdruck, so verlagert sich die gesamte fluoreszierende Zellpopulation analog zur Drucklosen (vgl. 21E2 und E3; 21C2 und C3). Die endgültigen Lagen der Einzel-Peaks nach insgesamt 50 Minuten sind dann identisch (vgl. 21E1 und 20C1), spiegeln aber nicht den realen pH_i der Zellpopulation im Reaktor wider.
Dies unterstützt die Theorie, dass die Zellpopulation aus dem Reaktor während der drucklosen Inkubation nach Entspannung eine zeitabhängige pH_i-Änderung widerfährt, messbar durch inhomogene Verschiebung der Fluoreszenzpopulationen und transienten Ratio-Doppelpeak. Diese intrazellulären Änderungen sind messbar, bevor extrazelluläre Parameter wie pH oder pCO₂ signifikante Messwertänderungen zulassen und können demnach die Messung des intrazellulären pH-Werts der Zellpopulation im drucküberlagerten Fermenter beträchtlich verfälschen.
Der durch die (intrazelluläre) Entgasung zeitabhängig auftretende Subpeak (20A1 linker Peak) wurde von Al-Rubeai (Welsh and Al-Rubeai, 1996) der nicht viablen Zellpopulation zugeordnet. Bei den dort gemachten Untersuchungen ergäbe sich demnach eine auffällige Korrelation zwischen dem Anteil der nicht viablen Zellen und der durch einen analogen Sub-Peak repräsentierten Zellpopulation. Dies kann durch die hier gezeigten Ergebnisse nicht bestätigt werden. Vielmehr besaßen die für die o. g. Untersuchungen verwandten Zellpopulationen Viabilitäten > 95% und befanden sich in der exponentiellen Wachstumsphase ohne Limitierungen. Frühe apoptotische Signale, die mit einer Azidifizierung des Cytosols einhergehen, können als Ursache des hier gezeigten Ratio-Doppelpeaks (20, A1 linker Peak) ausgeschlossen werden. Diese würden danach für die bioverfahrenstechnische Umsetzung bedeuten, dass die observierten Druckschwankungen der herkömmlichen Probeentnahme analog z. B. bei repetitiven (Fed) Batch Verfahren im Großmaßstab massiv Apoptose auslösen würden, was nicht beobachtbar ist. Der hier observierte Ratio-Doppelpeak ist transient und demnach lediglich auf die drucklose Probeentnahme bzw. Inkubation und resultierender Entgasung der Zellen in Suspension zurückzuführen.
Zwar wurden Ratio-Doppelpeaks auch unter Einsatz der druckregulierten Probeentnahme in dieser Erfindung beobachtet, allerdings erst dann am Ende von (Fed) Batch Kulturen, wenn messbare Viabilitätsabnahmen zu verzeichnen sind (Daten nicht gezeigt). Diese gehen dann einher mit späten Phasen der Apoptose, welche in parallel angewandter Durchflusszytometrie mittels DNA-Quantifizierung gemessen wurden (Sub-G1 Peak bei Zellzyklusanalyse durch DNA-Bruchstücke).
Die hier gezeigten Ergebnisse sprechen somit für die Notwendigkeit der isobaren Probeentnahme bei drucküberlagerten Fermentationen, um die intrazellulären pH-Werte der Reaktorpopulation korrekt bestimmen zu können.
Beispiel 4
Auswirkungen des Gelöstkohlendioxidgehalts auf den intrazellulären pH-Wert tierischer Zellen
Physikalisch gelöstes CO₂ als Stoffwechselprodukt kultivierter Zellen kann als kleines, unpolares Molekül relativ ungehindert die Zellmembran passieren, ohne spezifische Transporter zu benötigen (Thomas, 1995). Es befindet sich aber innerhalb der Zelle wie auch im extrazellulären wässrigen Medium im Gleichgewicht mit Hydrogenkarbonat, für welches der Zelle aktive Transportsysteme zur Verfügung stehen (Hu, Seth et al., 2007). Die Konzentrationsänderung einer dieser Spezies bedingt also immer auch eine entsprechende Änderung der anderen am Gleichgewicht beteiligten Spezies und damit auch des pH-Werts. Finden solche Konzentrationsänderungen von Gelöst-CO₂ bzw. Hydrogenkarbonat im Kulturmedium der Zellen statt, so hat dies stets auch zeitabhängige Auswirkungen auf den intrazellulären pH-Wert (pH_i) der Zellen. Die Aufrechterhaltung des physiologischen Milieus und damit der intrazellulären Prozesse realisiert die Zelle durch Regulation des pH_i unter Nutzung von Transportern in der Zellmembran, teils unter energieverbrauchenden Bedingungen (Madshus, 1988; Reusch, 1995).
Nachstehend werden die Zusammenhänge zwischen dem pCO₂-Gehalt des Kulturmediums und des pH_i der darin kultivierten Zellen untersucht. Die CHO-MUC1-Zelllinie wurde bei geregelten pCO₂-Werten im Reaktorsystem kultiviert (Chemostat, 1 L), eine Probe unter Beibehaltung der Reaktorbedingungen entnommen und dem jeweiligen Experiment entsprechend mit dem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff zur Bestimmung des pH_i inkubiert. Die Konzentrationen des pCO₂ in der Probe wurden offline bestimmt (AVL Compact 3) und der intrazelluläre pH-Wert mittels Durchflusszytometrie gemessen.
(A) In vitro Effekte des pCO₂ auf den pH_i
Die pCO₂-Absättigungen auf die entsprechenden pCO₂-Level im Medium wurden durch Luftbegasung der gefärbten Zellsuspension (AVL Compact 3) unmittelbar (< 5 s) vor der durchflusszytometrischen pH_i-Messung erreicht. Die Auswirkungen auf den intrazellulären pH-Wert durch unterschiedliche pCO₂-Absättigungen im Kulturmedium in vitro zeigt 22. Die parallelen Verläufe der aus unterschiedlichen Reaktorproben erzielten Kurven weisen auf einen direkten Zusammenhang zwischen pCO₂-Konzentrationen im Medium, das die Zellen umgibt und deren intrazellulären pH-Werten hin. Je größer die CO₂-Absättigung im Kulturmedium ausfiel, desto stärker wurde das Zytosol der darin befindlichen Zellen kurzfristig alkalisiert.
Das beobachtete Phänomen der kurzfristigen intrazellulären Alkalisierung bei Abreicherung von Gelöst-CO₂ im Kulturmedium kann auf dessen chemische Gleichgewichtsverschiebung zurückgeführt werden. Wird das im Medium physikalisch gelöste CO₂ entfernt, welches im Gleichgewicht mit Hydrogenkarbonat und Protonen steht, so bedingt dies einen Anstieg des pH-Werts, da sich vermehrt Hydrogenkarbonat und Hydroniumionen verbinden, um austretendes CO₂ unter Abspaltung von Wasser zu ersetzen. Diese Gleichgewichtsverschiebung findet gleichsam im Zytosol statt, so dass bei sinkender pCO₂-Konzentration im Medium ein Anstieg des gemessenen pH_i-Werts resultiert, wie er in 22 gezeigt ist. Dieser kurzzeitige Effekt wird nachfolgend als „chemischer Effekt” der Änderungen des Gelöst-CO₂-Gehalts auf den intrazellulären pH-Wert bezeichnet.
Wie durch folgende Untersuchungen gezeigt wird, reagiert eine viable Zelle aktiv auf diese Umgebungsänderung. Auf eine Auslenkung aus ihrem physiologischen Gleichgewichtszustand, wie es in 22 durch Entfernung des Gelöst-CO₂ aus dem Kulturmedium gezeigt ist, reagieren die Zellen durch neben dem dort beschriebenen kurzfristigen chemischen Effekt auch immer mit einem „physiologischen Effekt” (23). Ein zweistufiger Verlauf des pH_i konnte bei allen Versuchen beobachtet werden. (23 und 24). Dabei folgte der kurzfristigen Alkalisierung des Zytosols durch CO₂-Abreicherung im Kulturmedium stets eine Phase der Azidifizierung desselben, was der CO₂-Gleichgewichtsverschiebung konträr ist. Bereits 30–40 Minuten nach CO₂-Abreicherung des Kulturmediums in vitro sank der intrazelluläre pH-Wert der Population unter den Ausgangswert ab (23 und 24). Dabei sind keine signifikanten Änderungen des extrazellulären pH-Werts im verwendeten Zellkulturmedium messbar (23), während der intrazelluläre pH-Wert die o. g. zweiphasige Änderung durchläuft. Der extrazelluläre pH-Wert bleibt dabei konstant.
Diese Superkompensation der pH_i-Auslenkung war bei unterschiedlichen Ausgangswerten des pCO₂ zu beobachten (24), wobei der pCO₂-Gradient zwischen Anfangskonzentration im Kulturmedium und Endwert nach CO₂-Abreicherung den Grad der intrazellulären Alkalisierung über den „chemischen Effekt” bestimmt (24).
Die in der zweiten Phase beobachtete Superkompensation mit Azidifizierung unter den Ausgangswert des intrazellulären pH kann mit aktiven Transportvorgängen durch die Zellmembran korreliert werden. Wie bereits vorstehend diskutiert, existieren mehrere relevante Transporter in CHO-Zellen, die für die Regulation des pH_i verantwortlich sind. Diese sorgen vor Störung des Gelöst-CO₂ über ein Fließgleichgewicht für die Regulation des intrazellulären pH-Werts. Eine anknüpfende Diskussion dieses Phänomens wird im folgenden Beispiel geführt, in dem die in situ Effekte einer CO₂-Anreicherung im Kulturmedium auf den zytosolischen pH-Wert untersucht werden.
(B) In situ Effekte des pCO₂ auf den pH_i
Die beobachteten in vitro Effekte der zeitabhängigen Zellantwort auf die CO₂-Abreicherung im Kulturmedium (23 und 24) sollten in situ im geregelten Kleinfermentersystem (Applikon 1 L) nachgestellt werden. Dazu wurde während einer kontinuierlichen Chemostatkultivierung das pCO₂-Sollwertprofil stufenweise angehoben. Die resultierenden pH_i-Werte sind in 25 mit der Lebendzelldichte über der Prozesszeit aufgetragen.
Wie aus 25 zu erkennen, treten die o. g. in vitro beobachteten Effekte der kurzfristigen Alkalisierung und langfristigen Azidifizierung des Zytosols nach Verringerung des pCO₂-Levels im Kulturmedium auch entgegengesetzt bei sprunghafter Anreicherung des Kulturmediums im Kleinfermenter in situ auf. Hierbei lassen sich dementsprechend kurzfristige Ansäuerung und langfristige Alkalisierung als Reaktionen der Zelle auf die sprunghaften Anstiege der gelösten CO₂-Konzentrationen im Medium beobachten. Bemerkenswert ist, dass die langfristigen Alkalisierungen der Zellen nach dem pCO₂-Sprung auf einen höheren Wert (25) im weiteren Kulturverlauf auf diesem Level bestehen bleiben (jeweils +0.1 pH_i-Einheiten bei Sprung von 2.5% auf 5.0% bzw. bei Sprung von 5.0% auf 10.0% pCO₂ im Medium). Somit scheint der intrazelluläre pH-Wert in direktem Zusammenhang mit dem pCO₂-Level des Kulturmediums zu stehen, da im Chemostatbetrieb über diesen Parameter hinaus konstante Kultivierungsbedingungen herrschen. Damit bietet sich die Möglichkeit, den pH_i der Zellen mit beschriebenen Konsequenzen auf Physiologie und Metabolismus über die pCO₂-Konzentration im Kulturmedium zu beeinflussen.
In der Literatur sind bis heute nur unvollständige Untersuchungen hierzu beschrieben. Darin wurden zwar kontinuierliche Prozesse bezüglich des Einflusses des pCO₂ auf tierische Zellen untersucht, allerdings anhand von Verfahren mit Zellretention, die keine konstante Zellpopulation (Größenverteilung, Zellzyklus-Phasenverteilung, metabolische Verbrauchs- und Bildungsraten) garantieren konnten Generell beobachtete Phänomene sind Alkalisierung des Zytosols bei beschleunigtem Zellwachstum und generell intensiviertem Metabolismus bzw. saurerer pH_i bei ruhenden Zellen (Engasser, Marc et al., 1996; Welsh and Al-Rubeai, 1996). Der hier untersuchte Chemostat-Betrieb mit Zellaustrag über die gesamte Größenverteilung und konstanter Zelldichte eignet sich zusammen mit dem entwickelten pCO₂-Regler erstmals für detailliertere zellphysiologische und metabolische Untersuchungen der Zellen im Gleichgewichtszustand. Die Auswirkungen des pCO₂-Gehalts im Medium auf den pH_i können dadurch von der Änderung, die aufgrund von Zellwachstum und Zellzyklusphasenverteilung z. B. im Satzbetrieb oder im Betrieb mit Zellrückhaltung und verbundener Größenselektion entstehen, entkoppelt werden.
Wu et al. haben bereits in den frühen 1990er Jahren die computergestützte Einzelzellsimulation der intrazellulären pH-Regulation in CHO-Zellen begonnen (Wu, 1993). Das darin postulierte „reguläre Modell” für Zellwachstum in suspendierten Batch-Kulturen beschreibt demnach pH_i-Werte für Gleichgewichtszustände und alkalische Auslenkungen in CHO-Zellen zufrieden stellend, bedarf aber Modifikationen bezüglich der Beschreibung des pH_i nach transienter Ansäuerungen der Zellen. Die Modifikationen, die von den Autoren dafür genannt werden, beschreiben die Eigenschaft von CHO-Zellen, den Na⁺/H⁺-Antiporter bei akuter Ansäuerung des Zytosols zu aktivieren und nach Erreichung eines neuen Gleichgewichtszustands die Aktivität dieses Antiporters wieder auf ein basales Niveau abzusenken, auch wenn der zytosolische pH noch saurer als der Ausgangs-pH ist. Die o. g. Befunde aus dem pH- und pCO₂-geregelten Chemostatbetrieb sind den Modifikation des pH_i-Regulationsmodells von Wu konträr. Der von Wu beschriebene Effekt ähnelt stark dem in dieser Erfindung beschriebenen „chemischen Effekt”, womit sich kurzfristige pH_i-Änderungen in solchen Simulationen erklären ließen. Allerdings überwiegt nach Erreichung eines neuen in situ Gleichgewichtszustandes im geregelten System der „physiologische Effekt” mit Superkompensation durch aktive Transportprozesse, auch durch Aktivierung des Na⁺/H⁺-Antiporters, wie von Wu postuliert. Eine entsprechende Berücksichtigung dieses „physiologischen Effektes” in dynamischen Simulationsmodellen von tierischen Zellen ist anzustreben.
Beispiel 5
pCO₂-geregelte Fed-Batch Kultivierungen der Zelllinie CHO-MUC1 im 10 L-Maßstab
Die in den vorstehenden Beispielen gewonnenen Erkenntnisse aus dem Einfluss der verschiedenen pH-Korrekturmittel, der Reaktionen des intrazellulären pH-Werts in vitro und in situ auf den pCO₂ und die verfahrenstechnische Implementierung der Regelstrategien für pCO₂ und Überdruck werden im Folgenden zusammengeführt. Dafür wurde der 10 L Bioreaktor Biostat ES mit der Modellzelllinie CHO-MUC1 unter industriellen Bedingungen (Überdruck-, pCO₂-Profile, Medium, Betriebsweise) benutzt. Das Inokulum wurde nach dem Revitalisieren in Spinner-Flaschen bis zu einem Arbeitsvolumen von einem Liter bei 5% CO₂ im Inkubator kultiviert. Die Lebendzelldichte im 10 L Reaktor nach der Inokulation war 1.5 × 10⁵ Zellen mL^–1. Alle folgenden Fermentationen im 10 L Maßstab wurden unter den in Beispiel 1(E) genannten Standardfermentationsbedingungen mit konstantem Leistungseintrag durchgeführt. Der Schaumbildung wurde durch manuelle Zugabe von Antischaummittel (Dow Medical Grade C) entgegengewirkt. Der Überdruck im Fermenter wurde auf 750 mbar, die pCO₂-Werte auf konstante 5%, 15%, 25% bzw. ein Profil von 5–15% geregelt. Das dynamische Sollwertprofil von 5–15% pCO₂ sollte die Anreicherung von CO₂ im Kulturmedium über den Fermentationsverlauf in industriellen Produktionsprozessen simulieren. 25% pCO₂ sollten nach den gängigen Literaturmeinungen eine schädigende Wirkung von CO2 auf die kultivierten Zellen haben (Kimura and Miller, 1996; Pattison, Swamy et al., 2000; deZengotita, 2002).
In allen Kultivierungen wurden durch die tägliche gepulste Zufütterung die Konzentrationen der Leitsubstrate Glukose und Glutamin zwischen 2–5 g L^–1 bzw. 0.5–1.0 g L^–1 gehalten, Aminosäurelimitationen wurden so vermieden.
Abbruchkriterium für die Fermentationen war eine Viabilität unter 80%, um nicht fälschlicherweise unvollständig translatiertes oder durch zelleigene Proteasen geschädigtes Fusionsprotein im ELISA nachzuweisen.
(A) Wachstumsverhalten
In 26 sind Wachstumsverhalten und Viabilitäten für die unterschiedlichen pCO₂-Regelprofile gezeigt. Daraus ist folgende Tendenz erkennbar. Ein schnelleres Anwachsen der Kulturen im Bioreaktor erfolgte generell bei geringeren pCO₂-Werten, wenn diese auf konstante Sollwerte geregelt wurden. Die maximale erreicht Lebendzelldichte ist bei 5% pCO₂ am höchsten (1.3 × 10⁷ mL^–1) und am schnellsten erreicht (150 h). Ein Einbruch der Viabilität erfolgt hier vergleichbar früh, sodass die Kulturdauer erheblich verkürzt ist (< 200 h). Auffällig ist der Wachstumsverlauf der Kultur mit dem pCO₂-Profil, welches einen Verlauf in einem Industriefermenter der Produktionsstufe simuliert (s. a. 28 mit pH_i). Der pCO₂-Wert verläuft hierbei von 5% (Start) bis 15% (ab 190 h) und die zugehörige Wachstumskurve verläuft zwischen denen von konstant geregelten 5% und 15% pCO₂ (26). Die Kultur bei 25% pCO₂ wächst langsamer an, erzielt dann aber höhere viable Zelldichten als die mit 15% pCO₂. Es ist also bei 25% pCO₂ noch kein toxischer Effekt festzustellen, eine weitere Erhöhung des pCO₂ war aufgrund der technischen Gegebenheiten nicht realisierbar. Viabilitätsverläufe und Absterberaten sind für alle konstant geregelten pCO₂-Werte vergleichbar (26).
(B) Zellzyklusphasenverteilung
Im Folgenden werden die Zellzyklusverläufe der G0G1-Phasenanteile der Kultivierungen mit unterschiedlichen pCO₂-Sollwertprofilen untersucht (27). Auffällig ist hier der vergleichbar hohe G0G1-Anteil bei 15% pCO₂, der von 150 h bis zum Abbruch der Kultur ansteigt und damit eine fortschreitende Arretierung der Zellen widerspiegelt.
Der Verlauf der G0G1-Phasenanteile für die Kultivierung mit dem pCO₂-Profil von 5–15% ist bis 150 h dem der auf konstant 5% pCO₂ geregelten Kultur analog. Danach ähnelt dieser Verlauf dem von 15% pCO₂. Allerdings folgt für dieses pCO₂-Industrieprofil dann bei ca. 170 h ein besonders ausgeprägter Wendepunkt, der G0G1-Anteil nimmt wieder ab. Dies korreliert mit einem pCO₂-Wert von 13% (28). Eine weitere Erhöhung des pCO₂-Werts auf 15% und Fixierung auf diesem Niveau bringt keinen weiteren Anstieg des G0G1-Phasenanteils (28). Der seit Kulturbeginn auf konstante 15% pCO₂ geregelte Prozess zeigt hingegen einen weiteren Anstieg des G0G1-Phasenanteils bis zum Prozessende (27).
(1) Konsequenz für die Verfahrensentwicklung
Es wäre nun zu prüfen, ob in diesem Fall bei einer statischen pCO₂-Sollwertregelung auf 13% (Wendepunkt G0G1-Phasenanteil) von Beginn der Kultivierung an ein höherer G0G1-Anteil erzielbar wäre. Ein dynamisches pCO₂-Sollwertprofil – wie hier angewandt oder in ähnlicher Form – ist demnach für zell(linien)spezifische pCO₂-Optimierungen nützlich, z. B. durch die Anwendung der hier gezeigten Wendepunktmethode auf Verlauf der Zellzyklusphasenverteilungen oder andere Zellparameter (z. B. pH_i, spezifische Raten). Das hier gezeigte pCO₂-Sollwertprofil ist im Gegensatz zu industriellen Großfermentern, dessen Profil es simulieren soll, durch die Regelung mit CO₂-Zugabe über Begasung von außen auferlegt. In Produktionsfermentern stammt das sich im Medium anreichernde CO₂ von den Zellen selbst. Es ist also deshalb möglich, dass ein korrespondierendes pH_i-Profil entsprechend anders aussehen kann. Auch diese könnte allerdings unter Anwendung der in dieser Erfindung entwickelten druckkontrollierten Probenahmevorrichtung analog analysiert werden.
(C) Intrazellulärer pH-Wert
Da der pH_i-Wert nachweislich durch die pCO₂-Regelstrategie beeinflussbar ist, sollten sich auch Auswirkungen auf die Zellzyklusphasenverteilung ergeben. Zum Vergleich sind in 29 G0G1-Anteile und pH_i-Werte für den auf konstante 25% pCO₂ geregelten Prozess dargestellt. Hier ist ein mit dem Wendepunkt im G0G1-Phasenanteilsverlauf einhergehender Ansäuerungsprozess im Zytosol erkennbar (200 h). Wendepunkte im pH_i-Verlauf gehen also für die untersuchte CHO-K1-Zelllinie mit Wendepunkten im G0G1-Zellzyklusverlauf einher.
Hierbei findet die Zelle in ihrer Umgebung über den gesamten Kulturverlauf einen konstanten pCO₂-Wert vor. Der pH_i steigt kontinuierlich bis auf einen Wert von 7.35 an, um dann am Wendepunkt des Verlaufs des G0G1-Phasenanteils kontinuierlich bis auf pH 7.0 abzufallen. Ein kurzzeitiges Alkalisieren vor Einbruch der Viabilität und Abbruch der Kultur ist ebenfalls erkennbar.
Insgesamt liegt bei diesem hohen pCO₂-Level der G0G1-Anteil bereits am Anfang der Kultur vergleichbar hoch (27), was sich im langsamen Anwachsverhalten widerspiegelt. Der G0G1-Phasenanteil verläuft über die gesamte Fermentation innerhalb einer schmalen Bandbreite (50–60% G0G1-Anteil).
Da auch intrazelluläre Enzymaktivitäten pH-Abhängigkeiten besitzen, ist die Beeinflussung des intrazellulären pH über den pCO₂ und dessen jeweilige Regelstrategie ein wichtiger zu optimierender Prozessparameter. Bresnahan und Dittmer haben z. B. erhöhte spezifische Antikörperproduktivitäten in Zusammenhang gebracht mit erhöhtem intrazellulärem pH bzw. Zellzyklussarretierung in der späten G1-Phase (Bresnahan, Boldogh et al., 1996; Dittmer and Mocarski, 1997). Die Entkopplung von pCO₂-Level von pH-Wert des Kulturmediums und von der Osmolalität kann erstmalig mit dem in dieser Erfindung entwickelten Reglern untersucht werden.
Zusammenhänge des pCO₂ mit dem zentralen Zellstoffwechsel sollen im Folgenden untersucht werden.
(D) Glutamin- und Glutamtstoffwechsel
Die Glutaminaufnahmerate ist mit steigendem pCO₂ leicht erhöht, besonders deutlich bei 25% pCO₂ (30). Ähnliche Anfangsverläufe der spezifischen Aufnahmeraten von Glutamin sind für 5% pCO₂ und 5–15% pCO₂ zu erkennen, wie auch schon für den G0G1-Phasenanteil beobachtet (27).
Durch die in 31 dargestellten Ausbeutekoeffizienten von Glutamat zu Glutamin kann man annehmen, dass diese vermehrte Glutaminaufnahme bei den auf konstant hohe pCO₂-Werte geregelten Prozessen weniger zur Glutamatbildung beiträgt. Die Y(GLT/GLN), die das Verhältnis von gebildetem Glutamat GLT zu verbrauchtem Glutamin GLN ins Verhältnis setzen, sind im Durchschnitt mit Erhöhung des konstanten pCO₂-Regelwertes geringer und zeigen zudem unterschiedliche Kurvenverläufe. Mit fortschreitendem Prozessverlauf ist bei 5% pCO₂ eine kontinuierliche Steigerung des Ausbeutekoeffizienten auf hohem Niveau erkennbar, wohingegen bei 25% pCO₂ nur eine leichte Steigerung auf vergleichbar niedrigem Niveau zu beobachten ist. Einen eher konstanten Ausbeutekoeffizienten mit leicht sinkender Tendenz über den Prozessverlauf zeigt der Prozess bei 15% pCO₂. Der Verlauf des entsprechenden Ausbeutekoffizienten bei ansteigendem pCO₂-Sollwertprofil (5–15%) zeigt hingegen ein uneinheitliches Bild (31). Das lokale Maximum des Ausbeutekoeffizienten bei 170 h fällt mit dem zuvor identifizierten Wendepunkt des G0G1-Phasenanteils zusammen (vgl. 31 mit 28).
(E) Laktatstoffwechsel
Die zellspezifischen Lakatbildungsraten zeigen die in 32 dargestellten Charakteristika, woraus die entsprechend in 33 gezeigten kumulativen Laktatkonzentrationsverläufe resultieren. Auffällig hierbei ist der zellspezifische Verlauf bei 25% pCO₂, mit einem Anstieg in der exponentiellen Wachstumsphase (70 h–120 h) und erneut am Ende der Kultur (> 200 h). Die restlichen untersuchten Fermentationen zeigen insgesamt eine Abnahme der zellspezifischen Laktatbildungsraten mit fortschreitender Kulturdauer. Die Fermentation bei 15% pCO₂ zeigt in der stationären Wachstumsphase die höchste spezifische Laktatbildung.
(F) Produktbildung
Die Produktbildungen für die auf Werte zwischen 5% und 25% pCO₂ konstant geregelten Prozesse zeigen keine Unterschiede im Verlauf, sondern lediglich, bedingt durch die unterschiedlichen Prozessdauern, in der finalen Antikörperkonzentration MUC1-IgG. Auffällig ist die wesentlich höhere Produktivität des Prozesses, der auf ein ansteigendes pCO₂-Sollwertprofil geregelt wurde (34).
(G) Konsequenzen für die Verfahrensentwicklung
Insgesamt lässt sich also durch eine pCO₂-Regelung auf konstante Spiegel die Prozessrobustheit unter den hier gezeigten Bedingungen erhöhen. Potential für eine zelllinienspezifische Optimierung liegt nach den hier gezeigten Ergebnissen vor allem in angepassten pCO₂-Sollwertprofilen. Dabei konnte unter möglichst konstanten Prozessbedingungen (z. B. Leistungseintrag, Überdruck, Temperatur, pH-Wert) die Produktivität durch ein ansteigendes pCO₂-Profil erhöht werden. Der entwickelte pCO₂-, sowie der Überdruckregler wurden erfolgreich simultan im 10 L Bioreaktor in Fed Batch Prozessen für verschiedene industrierelevante Fragestellungen eingesetzt. Die mit dem pCO₂-Regler erzielten Ergebnisse zeigen großes Potential für die Optimierung von industriellen Zellkulturprozessen über Einflussnahmen auf folgende Parameter: intrazellulärer pH-Wert, Zellzyklusverteilung, Zentralstoffwechsel (z. B. Glukose, Laktat, Glutamin, Glutamat), Apoptose/Kulturdauer.
Beispiel 6
Chemostatkultur der Zelllinie CHO-MUC1-IgG: pCO₂-Sollwertregelung bei Glukoselimitierung und „metabolic shift”
Die erkannten Unterschiede im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel durch die verschiedenen pCO₂-Sollwertprofile wurden im Chemostatbetrieb (1 L) genauer untersucht.
In dem in Beispiel 1(E) beschriebenen 1 L Bioreaktor wurde die rekombinante CHO-K1-Zelllinie CHO-MUC1-IgG im Chemostatbetrieb kultiviert. Die Begasung erfolgte dabei durch ein L-förmiges Begasungsrohr (Applikon), das die Begasungsmischung unter dem Propellerrührer mit konstantem Volumenstrom in das Medium einbrachte (2.4 Lh^–1). Die Zellsuspension wurde dabei über ein Tauchrohr in Bodennähe entfernt, um über den Kopfraum frisches Medium zur Konstanthaltung des Reaktorvolumens kontinuierlich zuzugeben. Die entsprechenden Durchflussraten D und Wachstumsraten μ sind in 35 gezeigt, die Lebendzelldichte lag im Fließgleichgewicht bei 7.5 (±1) × 10⁶ mL^–1
In der Batch Phase (< 120 h) wird das Substrat Glukose verbraucht und die Kultur zum metabolic switch gebracht, um die Laktatremetabolisierung einzuleiten. Glutamin steht in dieser Phase als alternative Kohlenstoffquelle ausreichend zur Verfügung, es lagen keine Aminosäurelimitationen vor. Nach stufenweiser Erhöhung der Durchflussrate D mit steigender Lebendzellzahl wurde die pH-Regelung bei 230 h gestartet (von pH 6.6 auf pH 7.0 durch 1 M Na₂CO₃). Die bis dahin vorherrschende Lakatatremetabolisierung wurde dadurch aufgehoben und es fand eine vermehrte Laktatbildung statt.
Im glukoselimitierten Chemostatbetrieb wurden die zellspezifischen Laktatbildungsraten im Verlauf geringer. Die Wachstumsrate blieb hingegen gleich der Durchflussrate (35). Findet nun in diesem Fließgleichgewicht ein Sollwert-Sprung von geregelten 10% pCO₂ auf 20% pCO₂ statt (420 h), so verdreifacht sich über die folgenden 150 h die zellspezifische Laktatbildungsrate und die Glutaminaufnahme nimmt ab (36). An dieser Stelle der Gradienten zwischen internem und externem pH-Wert kann auf Basis der Erkenntnisse dieser Erfindung über eine optimierte pCO₂-Sollwertführung (auch in Kombination mit einer pH-Sollwertführung im Kulturmedium) auf den pH_i und damit direkt auf den Laktattransport und -metabolismus eingewirkt werden.
Beispiel 7
pCO₂-geregelte Fed-Batch Kultivierungen der Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2 im 1 L-Maßstab
Wie bisher in dieser Erfindung nachgewiesen, hat neben dem pH-Wert des Kulturmediums der pCO₂ und seine Sollwertführung erheblichen Einfluss auf den Zentralstoffwechsel, auch unter glukoselimitierten Bedingungen. Zudem ist eine genaue Kenntnis des intrazellulären pH-Werts unerlässlich für einen metabolisch und energetisch optimierten Zellkulturprozess. Da insbesondere der metabolic switch zur Lakatremetabolisierung effiziente Stoffwechselwege mit verbundener Produktivitätssteigerung in rekombinanten Zelllinien eröffnen kann, ist diesbezüglich für industrielle Verfahren eine hohe Robustheit anzustreben. Deshalb sollte in den hier beschriebenen Experimenten die Kombination der hier entwickelten pCO₂-Verfahrenstechnik (pCO₂ process engineering) mit einer über metabolic engineering optimierten und gleichzeitig pCO₂-sensitiven CHO-Zelllinie vorgenommen werden. Es ist also ein empfindlicher Abgleich der Regelstrategien im Fermenter mit dem gewünschtem Zellstoffwechsel nötig. Hierbei gilt es u. a. auch den Leistungseintrag zu berücksichtigen. In dieser Untersuchung wurde der Parameter der Gasleerrohrgeschwindigkeit zum Regeln und Steuern des pCO₂ gewählt. Greift hingegen der Rührer darüber hinaus in die Regelkaskade von pO₂ und pCO₂ zusätzlich ein, ist der Einfluss des Leistungseintrags entsprechend dem hier gezeigten Versuchsaufbau in einem analogen Ansatz zu untersuchen. Eine Trennung der verfahrenstechnischen Parameter vom Einfluss der Kulturmedienzusammensetzung ist bei solchen Untersuchungen stets zu beachten.
Da bisher direkte Einflüsse der pCO₂-Regelung auf den Laktatstoffwechsel erkannt werden konnten, wird hier eine über metabolic engineering bezüglich Laktatstoffwechsel optimierte Zelllinie eingesetzt. Die Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2 besitzt eine zytosolisch aktive Pyruvatcarboxylase, die ebenfalls auf den Zentralstoffwechsel einwirkt (Wagner, 1998; Irani, 1999; Bollati Fogolin, 2001; Bollati Fogolin, 2003) (37). Durch den pCO₂-Regler sollte es nun erstmals möglich sein, die Hydrogenkarbonat-Konzentration in der Zelle, und damit die Konzentration eines Substrats der Pyruvatcarboxylase, über den pCO₂-Spiegel im Medium gezielt zu verändern und so in den Zentralstoffwechsel einzugreifen.
Durch die Fed Batch Fermentation der Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2, die den Wachstumsfaktor hGM-CSF ins Medium sezerniert, sollte folgend im 1 L-Maßstab der Einfluss verschiedener geregelter pCO₂-Konzentrationen auf Parameter wie Zellphysiologie und -metabolismus, sowie auf den intrazellulären pH und die Produktivität untersucht werden. Durch konstante Kultivierungsbedingungen analog zum 10 L-Maßstab können die Ergebnisse mit denen der Antikörper-produzierenden Zelllinie CHO-MUC1 verglichen werden. Die in dieser rekombinanten Zelllinie zytosolisch aktive Pyruvatcarboxylase aus S. cerevisae, die die anaplerotische Umsetzung von Pyruvat mit Hydrogencarbonat zu Oxalacetat katalysiert, kann zytosolisch vorliegendes Hydrogenkarbonat für die Zelle über den Zitronensäurezyklus metabolisch nutzbar machen (37b).
Nach Analyse der metabolischen Flüsse in BHK-PYC-Zellen, die die rekombinante zytosolische Pyruvatcarboxylase exprimieren (Paul, 2006), war der Fluss der rekombinanten cytosolischen Pyruvatcarboxylase unter den dort untersuchten Prozessbedingungen sehr niedrig. Im Folgenden sollte sowohl eine pCO₂-Konzentrationsabhängigkeit als auch eine dadurch bedingte pH_i-Abhängigkeit dieses Metabolismusweges untersucht werden. Dieser Ansatz wurde als zielführend betrachtet, da die Hydrogenkarbonat-Konzentration für die Umsetzung des zytosolischen Pyruvats zu Oxalacetat ein wichtiger Parameter ist und nach den hier erzielten Ergebnissen durch die (geregelten) pCO₂-Level im Kulturmedium, (und damit auch im Zytosol) beeinflussbar sein sollte. Auch über den Sekundärparameter pH_i, der ebenfalls nach der hier gezeigten Ergebnislage über den pCO₂-Level beeinflussbar ist, sind Einflussnahmen auf den neu eingeführten Stoffwechselweg in der Modellzelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2 z. B. über die pH-Abhängigkeit der Pyruvatcarboxylase- und Laktatdehydrogenase-Aktivität vorstellbar.
(A) Prozessbedingungen
Eine Abhängigkeit der zellulären Parameter vom geregelten pCO₂-Level wurde untersucht. Das Inokulum wurde wie vorstehend beschrieben bei 5% CO₂ im Inkubator herangezogen. Alle verwendeten Inokulumskulturen hatten Viabilitäten über 95%. Im 1 L-Rührkesselreaktor wurden die Standardfermentationsbedingungen verwendet (Beispiel 1(E)). Die Glukosekonzentration wurde durch sterile Boluszugabe (max. 5% v/v; 1–2 d^–1) einer konzentrierten Zufütterungslösung zwischen 2–5 gL^–1 gehalten. Dadurch konnte einer Glukoselimitierung als auch dem Crabtree-Effekt (auch: negativer Pasteur-Effekt), der ab einer Glucosekonzentration von ca. 10 gL^–1 eintritt, vorgebeugt werden. Die Glutaminkonzentration wurde analog zwischen 0.5–1.0 gL^–1 gehalten und Aminosäurelimitationen vermieden. Über den gesamten Kulturverlauf wurden konstante pCO₂-Werte von 5% bzw. 15% eingeregelt. Als Referenzlauf diente eine Kultivierung mit ungeregelter pCO₂-Konzentration (38). Dabei wurde pH-Sollwertabweichungen des Kulturmediums durch angepasste Zumischung von CO₂ in der Begasungsluft als auch durch geregelte Zugabe von Natriumkarbonatlösung (1 M) entgegengewirkt. Durch verstärkte Bildung saurer Metabolite (z. B. Laktat) im Kulturverlauf wird der CO₂-Anteil in der Zuluft bei dieser CO₂-basierten pH-Regelung reduziert, kann jedoch ein Absinken der pCO₂-Konzentration im Medium unter physiologische Konzentrationen (< 5%) bedingen. Bei dem hier verwendeten Aufbau mit konstanter Begasungsrate ist dies bereits zu beobachten (38) und dürfte bei sukzessiver Erhöhung der Begasungsrate, welche zur Erhöhung des Sauerstoffeintrags in das Kulturmedium angewandt wird, nochmals verstärkt werden.
(B) Lebendzelldichten und Viabilität
Die viablen Zelldichten und Viabilitäten sind in 39 gezeigt. Es lassen sich dabei folgende Tendenzen erkennen. Alle Kulturen erreichen etwa nach der gleichen Zeit die stationäre Wachstumsphase (170 h; 7 Tage). Die maximalen viablen Zelldichten unterscheiden sich für die unterschiedlichen pCO₂-Profile nicht erheblich (9–11 × 10⁶ mL^–1). Der spätere Eintritt in die stationäre Phase bei geregelten 15% pCO₂ kann auf die anfänglich niedrigere Viabilität der Kultur nach der Inokulation des Rührkessels zurückzuführen sein. Möglicherweise wirkt sich der Übergang der Zellen aus der Vorkultur mit 5% CO₂ in das auf 15% pCO₂ äquilibrierte Kulturmedium im Reaktor auf die Viabilität zunächst negativ aus. Auswirkungen dieser pCO₂-Sprünge auf die Zellen sind in Beispiel 4 untersucht worden. Es zeigte sich, dass sich die Regelung der pCO₂-Konzentrationen über die gesamte Fermentationsdauer positiv auf die Viabilitäten der Kulturen auswirkt und eine verlängerte stationäre Hochzelldichtephase ermöglicht, verglichen mit dem Prozess nach dem Stand der Technik, in dem der pCO₂ nicht geregelt wird. Je höher der geregelte pCO₂-Wert, desto länger ist die Kultur viabel. Das Optimum liegt dabei für die untersuchte rekombinante CHO-K1-Zelllinie näher an 15% als an 5% pCO₂.
(C) Laugeneintrag und Osmolalitäten
Die Einstellung des initialen, geregelten pCO₂-Werts bei Inokulation erfolgte unter gleichzeitiger Regelung des pH-Werts. Dem sinkenden pH-Wert durch das eingetragene CO₂ für hohe pCO₂-Werte wurde demnach mit einem Eintrag von Natriumkarbonatlösung entgegengewirkt. Dies bedingte einen höheren initialen Laugeneintrag in den Fermenter mit 15% pCO₂, wie in 40 zu erkennen ist. Der Prozess ohne pCO₂-Regelung benötigt hingegen anfänglich keine Lauge, da zunächst der Azidifierung des Mediums durch Reduktion des CO₂-Anteils in der Zuluft entgegengewirkt werden kann (40). Während bei geregelten 5% pCO₂ und geregelten 15% pCO₂ der Laugeneintrag zwischen der Prozesszeit 80–180 h pro Zeitintervall identisch ist (paralleler Kurvenverlauf), ist in dieser Zeit der Laugeneintrag beim pCO₂-ungeregelten Prozess stark erhöht. Danach wird lediglich beim Prozess mit 15% pCO₂ noch Lauge bis zum Prozessende benötigt (40), was auf einen weiterhin aktiven Stoffwechsel der kultivierten Zellen schließen lässt. Die finalen Osmolalitäten aller dargestellten Prozesse sind hingegen identisch und zeigen einen analogen Verlauf über den Prozesszeitraum (40). Die verlängerte Prozessdauer durch höhere Viabilitäten ist damit nicht an die Osmolalität gekoppelt, sondern primär dem geregelten pCO₂-Spiegel zuzuordnen.
(D) Laktatstoffwechsel
Auch bei der Laktatbildung der verschiedenen Prozesse ist eine Abstufung zu erkennen (41). Der pCO₂-ungeregelte Prozess bildet bereits von Prozessbeginn an mehr Laktat und erreicht, verglichen mit den anderen Prozessen, ein höheres Konzentrationsmaximum. Es folgt mit abnehmender Laktatakkumulation der auf 5% pCO₂ geregelte Prozess, gefolgt von dem auf 15% pCO₂ geregelten.
Unabhängig von den geregelten Glukose- bzw. Glutaminkonzentrationen, die alle über die gesamten Fed Batch Prozessverläufe zwischen 2.0–5.0 gL^–1 bzw. 0.5–1.0 gL^–1 gehalten wurden (Daten nicht gezeigt), ist in den Prozessen mit ungeregeltem pCO₂-Verlauf und dem mit geregelten 5% pCO₂ eine Laktat-Verstoffwechselung mit Eintritt in die stationäre Phase zu beobachten (ab 180 h bzw. 220 h, 42). Der auf 15% pCO₂ geregelte Prozess zeigt dieses Diauxie-Verhalten nicht so stark ausgeprägt. Seine zellspezifische Lakatatbildungsrate ist über den gesamten Kultivierungsverlauf im positiven Bereich (42), trotzdem ist die Laktatakkumulation in diesem Prozess am geringsten (41).
Diese Beobachtungen lassen folgende Schlussfolgerungen zu: Die verwendete Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2 zeigt im untersuchten Fed Batch Prozess geringere maximale Laktatkonzentrationen bei geregelten pCO₂-Werten (Reduktion um 30% bei 15% pCO₂ verglichen mit pCO₂-ungeregeltem Prozess). Die mit Eintritt in die stationäre Phase beobachtete Remetabolisierung von Laktat ist bei höheren Laktatkonzentrationen ausgeprägter. Diese Änderung im Metabolismus ist nicht an eine Glukose- oder Glutaminlimitierung gekoppelt. Der Zentralstoffwechsel, hier am Beispiel der Laktatbildung gezeigt, kann demnach durch die Regelung des pCO₂ beeinflusst werden. Eine Steigerung der Stoffwechseleffizienz kann in diesem rekombinanten Zellsystem mit zytosolischer Pyruvatcarboxylase durch Erhöhung des pCO₂ im Kulturmedium (vorzugsweise durch eine geeignete Regelung und Steuerung realisiert, wie hier gezeigt) erzielt werden.
(E) Produktbildung
Die spezifische Produktbildungsrate unterscheidet sich bei verschiedenen, geregelten pCO₂-Werten deutlich (43). Gegenüber dem pCO₂-ungeregelten Prozess sind die spezifischen Produktbildungsraten bei kontinuierlich geregeltem pCO₂ stark erhöht: bei geregelten 15% pCO₂ gegenüber dem Prozess mit geregelten 5% pCO₂ um durchschnittlich 15% (43). Durch die Regelung des pCO₂ auf konstante 15% ergibt sich somit bei der verwendeten Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2 aus der erhöhten spezifischen Produktbildungsrate und der verlängerten Prozessdauer eine Maximierung des hGM-CSF-Produkttiters um 100% (44)
(F) pH_i, Zellzyklusphasenverteilung und spezifische Produktivität
Im Folgenden sollte die Ursache der erhöhten Produktivität bei erhöhten geregelten pCO₂-Konzentrationen untersucht werden. Dazu wurden die intrazellulären pH-Verläufe, spezifische Produktivitäten und ausgewählte Zellzyklusphasenverteilungen der einzelnen Fermentationen mit unterschiedlichen pCO₂-Profilen gegenüber gestellt.
In Beispiel 4 wurde deutlich gezeigt, welche Auswirkungen der pCO₂ auf den pH_i hat. pCO₂-Sprünge im Kulturmedium des Prozesses bedingen demnach immer eine zweiphasige Änderung des intrazellulären pH-Werts. In den folgenden Abbildungen (45–47) sind die Verläufe der intrazellulären pH-Werte (vor gepulster Zufütterung), der spezifischen Produktivitäten und der Verhältnisse der Prozentsätze von Zellen in der S-Phase zu Zellen in der G0G1-Phase (S/(G0G1)) gezeigt.
In der Fed Batch Kultivierung mit ungeregeltem pCO₂ (45) fällt die erste Zufütterung mit dem Absinken des pH_i um 0.3 Einheiten zusammen. Mit Eintritt in die stationäre Wachstumsphase steigt der pH_i wieder an. Die SPR bleibt verglichen mit den pCO₂-geregelten Prozessen extrem niedrig. Auch der pH_i bleibt über die gesamte Kultivierung auf einem extrem niedrigen Level (pH_i < 7.1).
Bei der auf 5% pCO₂ geregelten Kultur (46) fällt der pH_i unabhängig vom Eintritt in die stationäre Wachstumsphase durch die erste Zufütterung um etwa 0.3 Einheiten. Der Eintritt in die stationäre Wachstumsphase geht einher mit einem Anstieg des pH_i um 0.5 Einheiten. Die SPR steigt in der stationären Wachstumsphase ebenfalls stark an. Ingesamt liegt der pH_i auf einem höheren Level als bei der pCO₂-ungeregelten Kultur (45), schwankt aber stärker als bei dem auf 15% pCO₂ geregelten Prozess (47). Zudem zeigt der Anstieg des S/(G0G1) Verhältnisses am Ende der stationären Wachstumsphase eine unvollständige Arretierung des Zellzyklus an.
Bei der auf 15% pCO₂ geregelten Kultur (47) fällt der pH_i nach der ersten Zufütterung – im Gegensatz zu den Kultivierungen bei ungeregeltem bzw. auf 5% geregelten pCO₂ – nicht ab. Auch nach Eintritt in die stationäre Wachstumsphase sinkt der pH_i nur geringfügig und kurzzeitig ab. Insgesamt zeigt diese Kultivierung bei geregelten 15% pCO₂ die geringsten Schwankungen der pH_i-Werte und darüber hinaus das höchste pH_i-Niveau im Kulturverlauf. Zudem kann hierbei ein konstant niedriges Zellzyklusphasenverhältnis S/(G0G1) ab ca. 200 h beobachtet werden, was einer erfolgreichen Arretierung des Zellzyklus entspricht (47). Die dadurch verlängerte viable Kulturdauer bewirkt zusammen mit der ansteigenden SPR während der stationären Wachstumsphase den höchsten Endprodukttiter in dieser Kultivierungsreihe (44).
Zusammenfassend sind für die Prozesse mit unterschiedlichen pCO₂-Profilen die zellspezifischen Produktivitäten mit den Zellzyklusphasenanteilen der Zellen in der G0G1-Phase in 48 gezeigt.
Folgende Ergebnisse kann man danach für die gezeigten Fermentationen mit unterschiedlichen pCO₂-Profilen für die untersuchte Zelllinie CHO-hGM-CSF-PYC2 zusammenfassen: Ein ansteigender pH_i korreliert mit erhöhtem G0G1-Phasenanteil kultivierter Zellen. Ein erhöhter G0G1-Phasenanteil geht einher mit einem Anstieg der zellspezifischen Produktivität. Je höher der geregelte pCO₂-Sollwert über den Prozessverlauf, desto höher ist der Phasenanteil G0G1 in der stationären Wachstumsphase.
Die Erhöhung der spezifischen Produktivität durch Arrest von Zellen in der G0/G1-Phase ist in der Literatur beschrieben. Eine 3-fach höhere spezifische Produktbildungsrate wurde z. B. bei Einsatz von AMP (Adenosinmonophosphat) beobachtet, da die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase arretiert wurden und dadurch in eine lange stationäre Phase übergingen.
Die hier verfolgte Prozessstrategie der pCO₂-Regelung erbringt für CHO-hGM-CSF-PYC2 eine über 10-fach höhere hGM-CSF Produktkonzentration (bei geregelten 15% pCO₂) im Vergleich zu der Temperaturabsenkungsstrategie von Bollati et al. (Bollati Fogolin, 2003). Nach den hier gewonnenen Erkenntnissen kann man annehmen, dass auch dort durch die Absenkung der Temperatur eine gesteigerte Löslichkeit des CO₂ im Kulturmedium vorlag und damit einen Anteil an der gesteigerten Produktivität über verlängerte Prozessdauer und verlängerte G0/G1-Phase vorgelegen haben kann. Ähnliche Effekte durch Temperaturabsenkung wurden bereits beschrieben (Bloemkolk, 1992; Moore, 1997; Kaufmann, 1999). Auch wenn natürlich beim verwendeten Fed Batch Verfahren im Gegensatz zum Batch Verfahren Limitierungen des Substrats verhindert werden können, und damit eine verlängerte Prozessdauer erreicht werden kann, ist nach der vorliegenden Datenlage ein erhöhter, geregelter pCO₂ ein Hauptfaktor für höhere spezifische Produktbildungsraten. Wahrscheinlich hängt diese Steigerung mit der erhöhten Löslichkeit von CO₂ im Kulturmedium zusammen.
(G) Zellatmung
Durch die in dieser Erfindung entwickelte Messung und Regelung des pCO₂ im Kulturmedium wurde zusammen mit der pH-Regelung einer Anreicherung von CO₂ in der Flüssigphase entgegengewirkt (Beispiel 2). Damit war es möglich, Bilanzierungen des CO₂ über Zu- und Abluft vorzunehmen. Setzt man die Sauerstoffaufnahmerate (OUR, Oxygen uptake rate) mit der Kohlendioxidproduktionsrate (CER, carbon dioxide evolution rate) ins Verhältnis, so erhält man den Respirationsquotienten (RQ, respiratory quotient). Eine vollständige Veratmung von Glukose zu CO₂ ergäbe einen RQ = 1. Ein RQ > 1 träte nur bei Gärung Lipid- oder Proteinanabolismus auf, ein RQ < 1 hingegen weist auf die unvollständige Oxidation von Aminosäuren sowie Protein- und Lipidkatabolismus hin (Hauser and Wagner, 1997; Alberts, 2002).
Wie in Beispiel 1 beschrieben, kann die Sauerstofftransferrate OTR (oxygen transfer rate) über den k_La-Wert berechnet werden. Dieser wurde in beiden Reaktoren zellfrei bei Normaldruck mit der Aufsättigungsmethode im Kulturmedium bei Standardfermentationsbedingungen bestimmt. Für den hier unter Atmosphärendruck betriebenen 1 L Reaktor war der
= 3.55 h^–1. Über die Diffusitäten der Gase Sauerstoff und Kohlendioxid ergibt sich ein über den Proportionalitätsfaktor von 0.89 (Frahm, Blank et al., 2002) für diesen Reaktor ein
= 3.16 h^–1.
Die OUR wurde über den Volumenstrom des Sauerstoffs in der Zuluft berechnet. Der Partialdruck des Sauerstoffs im Reaktor wurde online mit einer Sauerstoffsonde gemessen. Aus dem pO₂ wurde die Konzentration an Sauerstoff in Lösung über die Henrykonstante für Sauerstoff bei 37°C berechnet. Aus der Sauerstoffkonzentration in der Zuluft wurde die theoretische Sättigungskonzentration c* berechnet. Die OTR konnte dann berechnet werden. Im stationären geregelten Zustand kann die OTR der OUR bzw. die CTR der CER gleichgesetzt werden.
Analog zur OUR kann die CER aus der Abgasmessung berechnet werden. OUR, CER und RQ sind für die pCO₂-geregelten Prozesse in den 49 und 50 dargestellt. Der RQ bei 5% pCO₂ fällt nach Erreichung des Maximums wesentlich schneller ab als im Prozess, der auf 15% pCO₂ geregelt wurde. Nach 300 h Prozesszeit beträgt der RQ beim Prozess mit 5% pCO₂ nur noch etwa ein Drittel des RQ bei 15% pCO₂. Der Stoffwechsel dieses vergleichsweise produktiveren Prozess mit geregelten 15% pCO₂ verläuft oxidativer über die gesamte Prozessdauer als bei dem Prozess mit geregelten 5% pCO₂.
Die geringen Zellverbrauchs- und Produktionsraten ermöglichen aufgrund der im Vergleich dazu hohen Gasvolumenströmen keine Bilanzierung über Konzentrationsunterschiede in Zu- und Abluft. Diesbezüglich weisen die hier dargestellten Berechnungen des RQ im Vergleich zu Berechnungen in mikrobiellen Kultivierungen einige Nachteile auf. Trotzdem zeigen die RQ-Berechnungen das Potential der pCO₂-Regelung auf, auch in tierischen Zellkulturprozessen den Parameter RQ in Echtzeit während der Fermentationen zu erfassen. In industriellen Hochzelldichteprozessen wäre somit eine Prozessführung am Parameter RQ über den pCO₂ und damit unter gezielter Beeinflussung des pH_i mit o. g. Optimierungspotentialen realisierbar.
Die Produktbildung findet vornehmlich in der G0G1-Phase der untersuchten Zelllinie statt. Es verbleiben umso mehr Zellen in dieser Phase, desto höher der geregelte pCO₂ ist. Die höhere Viabilität der Zellen bei höherem geregelten pCO₂ deutet also darauf hin, dass Zellen bei erhöhtem pCO₂ länger in der G0G1-Phase bleiben.
(H) Apoptose
Es wurde untersucht, ob ein erhöhter geregelter pCO₂-Level eine anti-apoptotische Wirkung auf die Zellkultur hat. Allen o. g. Kultivierungen gemeinsam ist der 5-phasige Verlauf des pH_i, ersichtlich aus den 45 bis 47. Der letzte Wendepunkt des pH_i-Verlaufs markiert sehr wahrscheinlich die beginnende Apoptose in allen Kultivierungen. Hierbei alkalisiert die Zelle intrazellulär, bevor die Viabilitäten unter 80% sinken, welches das Abbruchkriterium in allen Kultivierungen war. In den begleitenden durchflusszytometrischen Messungen zum Zellzyklus wurden nach diesem späten pH_i-Wendepunkt auch vermehrt DNA-Bruchstücke als sub-G1-Spitze detektiert (Daten nicht gezeigt), welche generell in späten Apoptosephasen (budding) zu beobachten sind.
(I) Konsequenz für die Verfahrensentwicklung

Bei ungeregeltem bzw. auf niedrigem Niveau (5%) geregelten pCO₂ können sich gepulste Zufütterungen ungünstig auf den intrazellulären pH-Wert auswirken (45–47). Neben dieser Zufütterungstechnik wird in der pharmazeutischen Industrie in analogen Prozessen die kontinuierliche Zufütterung über den gesamten Fed Batch Prozess angewandt. Bei fehlender pCO₂-Regelung auf ein relativ konstantes bzw. hohes Niveau (s. o.) ist dies zunächst aufgrund der hier gezeigten Ergebnisse eine Möglichkeit, um nicht unkontrollierte pH_i-Schwankungen zu provozieren. Allerdings ließe sich über eine zu optimierende Kombination von gepulster und kontinuierlicher Zufütterung, vorzugsweise zusammen mit einer pCO₂-geregelten Kultivierung, gezielt auf den pH_i der Zellen und damit auf Physiologie und Metabolismus derselben Einfluss nehmen. Eine an die Prozessphasen Wachstum und Produktion angepasste Strategie kann auf Basis der Ergebnisse dieser Erfindung rational optimiert werden. Ein hoher (geregelter) pCO₂-Gehalt im Medium bedingt dabei durch eine hohe intrazelluläre Pufferkapazität durch HCO₃ ^– geringere Schwankungen des pH_i durch Umgebungsänderungen. Abkürzungen

Abkürzung	Erklärung
ATCC	American Type Culture Collection
BA	Buttersäure
BGA	Blutgasanalysator
BHK	Baby hamster kidney
BSA	Bovines Serum Albumin
CA	Carboanhydrase
CD	Chemisch definiert
CER	CO₂-Bildungsrate
CHO	Chinese hamster ovary
CIP	Clean-in-place
CMV	Cytomegalovirus
CTR	CO₂-Transferrate
DMSO	Dimethylsulfoxid
DNA	Desoxyribonukleinsäure
DPN	Druckregulierte Probenahmevorrichtung
E. coli	Escherichia coli
ELISA	Enzyme linked immuno sorbent assay
FACS	Fluorescence assisted cell sorting, Duschflusszytometrie
FBS	Fetal bovine serum
FL	Fluorescent light, Fluoreszenzstrahlung
FSC	Forward scatter,
G418	Geneticin
GFP	Green fluorescent Protein
GLC	Glukose
GLN	Glutamin
GLT	Glutamat
HDFBS	dialysiertes FBS in HEPES-Puffer
HEPES	N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethansulfonsäure]
hGM-CSF	humaner Granulozyten-Makrophagen-KolonieStimulierenden Faktor
HPLC	High Performance liquid chromatography
HPTS	Hydroxypyren-3-sulfonsäure
HRP	horseradish peroxidase
HTS	High throughput screening = Hochdurchsatzsuche
IgG	Immunglubolin
LAC	Laktat
LDH	Laktatdehydrogenase
MCB	Masterzellbank
MFC	Massendurchflussmesser
MUC1	Mucin-Glykoproteins
NAD	Nicotimamiddinucleotid
NHE	Natrium-Protonen-Tauscher
OPA	ortho-Phthaldialdehyd
OPD	1,2-Phenylendiamin-dihydrochlorid
OSM	Osmolalität
OTR	Oxygen transfer rate = Sauerstofftransferrate
OUR	Oxygen uptake rate = Sauerstoffaufnahmerate
PBS	Phosphate buffered saline
pH_i	Intrazellulärer pH
pNPP	p-Nitrophenolphosphat
PRO	Produkt
PYC	Pyruvat-Carboxylase
RNA	Ribonukleinsäure
RP	Reverse Phase
Rpm	Umdrehungen pro Minute
RQ	Respirationsquotient
RZA	Raum-Zeit-Ausbeute
SNARF-1	5'(und 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'on
SSC	Sideward scatter, seitwärts gestreutes Anregungslicht
TCA	Tricarbonsäurezyklus
TMA	Trimethylamin
tPA	Tissue plasminogene activator
VIA	Viabilität
WCB	Arbeitszellbank
WTR	Wachstumsrate
ZDG	Gesamtzelldichte
ZDL	Lebendzelldichte

Literatur

Alberts, B. J., A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. (2002). Molecular Biology of the cell, Garland Science.
Bailey, J. and D. Ollis (1986). Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill.
BD_Biosciences (2000). "Introduction to Flow Cytometry – A Learning Guide, Manual Part Number 11-11032-01."
Bell SL, Bebbington CR, Scott MF, Vardell JN, Spier RE, Bushell ME, Sanders PG. (1995) "Genetic engineering of hybridoma glutamine metabolism." Enzyme Microb Technol 17: 98
Bloemkolk, J. W. G., M. R.; Merchant, F.; Mosmann, T. R. (1992). "Effetc of teperature on hybridoma cell cycle and MAb production." Biotechnol Bioeng 40 427-431.
Bollati Fogolin, M., Oggero Eberhardt, M., Kratje, R. B., Etcheverrigaray, M. (2002). "Choice of the adequate quantification method for recombinant human GM-CSF produced in different host systems." Electron. J. Biotechnol.
Bollati Fogolin, M., Schulz, C., Wagner, R., Etcheverrigaray, M., Kratje, R. B. (2001). Expression of yeast pyruvate carboxylase in hGM-CSF-producing CHO cells. Proceeding of the 17th ESACT Meeting, Tylösand, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
Bollati Fogolin, M., Wagner, R., Etcheverrigaray, M., Kratje, R. B. (2003). "Impact of temperature reduction and expression of yeast pyruvate carboxylase on hGM-CSF-producing CHO cells." J. Biotechnol. 109 (2004): 179-191.
Bond, J. and J. Varley (2005). "Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells." Cytometry Part A (64A): 43-50.
Bresnahan, W. A., I. Boldogh, et al. (1996). "Human cytomegalovirus inhibits cellular DNA synthesis and arrests productively infected cells in late G1." Virology 224: 150-160.
Büntemeyer, H. (1988). Entwicklung eines Perfusionsprozesses zur kontinuierlichen Kultivierung tierischer Zellen in Suspension. Hannover, Universität Hannover.
Büntemeyer, H., Lütkemeyer, D, Lehmann, J. (1991). "Optimization of serum-free fermentation processes for antibody production." Cytotechnol. 5: 57-67.
Chef, K., Liu, Q., Xie, L., Sharp, P. A., Wang, D. I. C. (2001). Engineering of a mammalian cell line for reduction of lactate formation and high monoclonal antibody production, Biotechnol. Bioeng. 72: 55
Cherlet, M., P. Franck, et al. (1999). "Development and validation of a methodology for intracellular pH measurements of hybridoma cells under bioreactor culture conditions." Biotechnol Prog 15 (4): 630-9.
Chow, S. and D. Hedley (1997). Flow Cytometric Measurement of Intracellular pH. Current Protocols in Flow Cytometry, 9.3.1–9.3.10, John Wiley & Sons, Inc.
Chow, S., D. Hedley, et al. (1996). "Flow cytometric calibration of intracellular pH measurements in viable cells using mixtures of weak acids and bases." Cytometry 24 (4): 360-7.
deZengotita, V. M., Schmelzer, A. E., Miller, W. M. (2002). "Characterization of hybridoma cell responses to elevated pCO2 and osmolality: Intracellular pH, cell size, apoptosis and metabolism." Biotechnol. Bioeng. 77(4): 369-380.
Dittmer, D. and E. S. Mocarski (1997). "Human cytomegalovirus infection inhibits G1/S transition." J. Virol. 71: 1629-1634.
Engasser, J. M., A. Marc, et al. (1996). Measurement of intracellular pH of hybridoma cells in batch and continiuos cultures. Flow cytometry applications in cell culture. M. Al-Rubeai and A. N. Emery. New York, Marcel Dekker.
Etcheverrigaray, M., Oggero Eberhardt, M. R., Bollati Fogolin, M. R., Kratje R. B., (1998). Study of human recombinant GM-CSF produced in different host systems using monoclonal antibodies. Animal Cell Technology: Nwe Developments, New Applications. J. B. Griffiths, Merten, O. W. (Ed.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
Frahm, B., H. C. Blank, et al. (2002). "Determination of dissolved CO(2) concentration and CO(2) production rate of mammalian cell suspension culture based on off-gas measurement." J Biotechnol 99(2): 133-48.
Givan, A. L. (1992). Flow Cytometry: First Principles New York, Wiley-Liss.
Grinstein, S., Rotin, D., Mason, M. J. (1989). "Na+/H+ exchange and growth factor – induced cytosolic pH changes: Role in cellular function." Biochim. Biophys. Acta 988: 73-97.
Hauser, H. and R. Wagner (1997). "Physiology of cultured animal cells." J Biotechnol 59 (1-2): 103-115.
Hu, W. S., G. Seth, et al. (2007). An advanced course in cellular bioprocess technology – Fundamentals and frontiers. Garmisch-Partenkirchen.
Irani, N., Wirth, M., van den Heuvel, J., Wagner, R. (1999). "Improvement of the primary metabolism of cell cultures by introducing a new cytoplasmic pyruvate carboxylase reaction." Biotechnol. Bioeng. 66: 238-246.
Jockwer, A., J. Gätgens, et al. (2005). Pressurisable sampling device for representative measurement of dissolved gases in large-scale fermentation processes. Vortrag Bioperspectives 2005, Wiesbaden.
Jockwer, A., J. Gätgens, et al. (2005). "Verfahren zur Probeentnahme und Probeentnahmevorrichtung." ( DE 10 2005 020 985.8-41 ).
Kaufmann, H. M., X.; Fussenegger, M.; Bailey, J. E. (1999). "Influence of low temperature an productivity, proteome and Protein phosphorylation of CHO cells." Biotechnol Bioeng 3: 573-582.
Kim, M. S., N. S. Kim, et al. (2002). "Biphasic culture strategy based an hyperosmotic Pressure for improved humanized antibody production in chinese hamster ovary cell culture" In Vitro Cell. Dev. Biol. Animal 38: 314-319.
Kimura, R. M. and W. Miller (1996). "Effects of elevated pCO2 and/or osmolality at the growth and recombinant tPA production of CHO cells." Biotechnol Bioeng 52(1): 152-160.
Klinger, C. (2006). Bioverfahrenstechnische Untersuchungen zur optimierten pCO2-Prozessführung – Beiträge zur Prozessentwicklung. Fachbereich Biotechnologie und Bioinformatik – Studienrichtung Biotechnologie. Weihenstephan, University of Applied Sciences Weihenstephan. Diplomarbeit.
Langheinrich, C. and A. Nienow (1999). "Control of pH in Large-Scale, Free Suspension Animal Cell Bioreactors: Alkali Addition and pH Excursions." Biotechnol. Bioeng. 66(3).
Lim, C. K. (1987). HPLC of small molecules – a practical approach. Oxford, IRL Press, Oxford.
Link, T. (2003). Glukoselimitierung als Strategie zur Steigerung der Produktion von MUC1 und anderen rekombinanten Glykoproteinen mit CHO-Zellen Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Bonn, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Link, T. et al. (2004). "Bioprocess development for the production of a recombinant MUC1 fusion Protein expressed by CHO-K1 cells in Protein-free medium". Journal of Biotechnology 110: 51-62
Madshus, I. H. (1988). "Regulation of intracellular pH in eukaryotic cells (review article)." Biochem. J. 250: 1-8.
Melamed, M. R. (1990). Flow Cytometry and Sorting New York, Wiley-Liss.
Moore, A. M., J.; Dutina, G.; Donahue, C. J.; Bauer, K.; Mather, J. P.; Etcheverry, T.; Ryll, T. (1997). "Effects of temperature shift an cewll cycle and nucleotide Pools in CHO cell batch cultures." Cytotechnology 23: 47-54.
Osman, J. J., J. Birch, et al. (2001). "The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations." Biotechnol Bioeng 75(1): 63-73.
Osman, J. J., J. Birch, et al. (2002). "The response of GS-NS0 myeloma cells to single and multiple pH perturbations." Biotechnol Bioeng 79(4): 398-407.
Owen, C. S. (1991). "Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein." Anal. Biochem. 204: 65-71.
Owen, C. S., P. Carango, et al. (1992). "pH-Dependent intracellular quenching of the indicator carboxy-SNARF-1 " J. Fluorescence 2(2): 75-80.
Parker, C. (1990). "Immunoassays." Methods Enzymol. 182: 700-718.
Paredes C, Prats E, Cairo JJ, Azorin F, Cornudella LI, Godia F. (1999) "Modification of glucose and glutamine metabolism in hybridoma cells through metabolic engineering". Cytotechnology 30: 85
Pattison, R. N., J. Swamy, et al. (2000). "Measurement and control of dissolved carbon dioxide in mammalian cell culture processes using an in situ fiber optic chemical sensor" Biotechnol Prog 16: 769-774.
Rake, H. (1993). Umdruck zur Vorlesung Regelungstechnik A und Ergänzungen (Regelungstechnik B). Aachen, RWTH Aachen.
Reusch, H. P., Lowe, J., Ives, H. E. (1995). "Osmotic activation of a Na+-dependent Cr–/HCO3– exchanger." Am. J. Physiol. 268: C147-C153.
Schmelzer, A. E., V. M. deZengotita, et al. (2000). "Considerations for osmolality measurement under elevated pCO2: comparison of vapor pressure and freezing point osmometry." Biotechnol Bioeng 67(2): 189-96.
Shapiro, H. (1994). Practical Flow Cytometry. 3rd ed. New York, Alan R. Liss.
Stucka, R., Dequin, S., Salmon, J. M., Gancedo, C. (1991). "DNA sequences in chromosomes II and VII code for pyruvate carboxylase isoenzymes in Saccharomyces cerevisiae; analysis of pyruvate carboxylase-deficient strains." Mol. Gen. Genet. 229: 307-315.
Thomas, J. A., R. N. Buchsbaum, et al. (1979). "Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ." Biochemistry 18: 2210-2218.
Thomas, R. (1995). "Acid-base physiology. Bicarbonate briefly CO2-free." Nature 374(6523): 597-598.
Wagner, R., Irani, N., Wirth, M., van den Heuvel, J (1998). Process for the improvement of the primary energy metabolism of mammalian cell lines
Welsh, J. P. and M. Al-Rubeai (1996). The relationship between intracellular pH and cell cycle in cultured animal cells using SNARF-1 indicator. Flow Cytometry: Application in cell culture. M. E. Al-Rubeai, A. N. New York, Marcel Dekker Inc.: 163-175.
Wu, P., Ray, N. G., Shuler, M. L. (1993). "A computer model for intracellular pH regulation in Chinese hamster ovary cells." Biotechnol Prog 9(4): 374-84.
Wurm, F. M. (2004). "Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells." Nature Biotechnology 22: 553-558.
Zhangi, J. A., A. E. Schmelzer, et al. (1999). "Bicarbonate concentration and osmolality are key determinants in the inhibition of CHO cell polysialylation under elevated pCO2 or pH." Biotechnol Bioeng 65: 1^82-191.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 6706524 [0067, 0068]
- WO 00/46378 [0067]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Wurm, 2004 [0002]
- Irani, 1999 [0047]
- Irani et al. (1999) [0063]
- Chen et al. (2001) [0063]
- Paredes et al. (1999) [0063]
- Bell et al. (1995) [0063]
- Stucka et al. (1991) [0067]
- Wagner, 1998 [0067]
- Irani, 1999 [0067]
- Bollati Fogolin, 2003 [0067]
- Link et al., 2004 [0076]
- Link 2003 [0076]
- Bollati Fogolin, 2001 [0077]
- Wagner 1998 [0077]
- Irani 1999 [0077]
- Bollati Fogolin, 2003 [0077]
- Bollati Fogolin, 2003 [0078]
- Büntemeyer, 1988 [0088]
- Lim, 1987 [0088]
- Büntemeyer, 1991 [0088]
- Büntemeyer, 1991 [0090]
- Parker, 1990 [0092]
- Link, 2003 [0092]
- Bollati Fogolin, 2002 [0097]
- Etcheverrigaray, 1998 [0097]
- Melamed, 1990 [0100]
- Givan, 1992 [0100]
- Shapiro, 1994 [0100]
- BD_Biosciences 2000 [0100]
- Madshus, 1988 [0101]
- Grinstein, 1989 [0101]
- Madshus, 1988 [0101]
- Reusch, 1995 [0101]
- Welsh and Al-Rubeai, 1996 [0101]
- Owen 1991 [0103]
- Owen, Carango et al. 1992 [0103]
- Cherlet, Franck et al., 1999 [0103]
- Bond and Varley, 2005 [0103]
- Jockwer, Gätgens et al., 2005 [0103]
- Jockwer, Gätgens et al. 2005 [0105]
- Jockwer, Gätgens et al., 2005 [0106]
- Chow, Hedley et al., 1996 [0107]
- Chow and Hedley, 1997 [0108]
- Zhangi, Schmelzer et al., 1999 [0118]
- Pattison, Swamy et al., 2000 [0118]
- Schmelzer, deZengotita et al., 2000 [0118]
- Frahm, Blank et al., 2002 [0143]
- Frahm, Blank et al. 2002 [0145]
- Rake, 1993 [0153]
- B. Braun, Kap. 3.5.2 [0158]
- Rake, 1993 [0162]
- Langheinrich and Nienow, 1999 [0166]
- (Osman, Birch et al., 2001 [0166]
- Osman, Birch et al., 2002 [0166]
- Osman et al. [0171]
- Osman, Birch et al., 2002 [0171]
- Langheinrich and Nienow 1999 [0171]
- Osman, Birch et al., 2002 [0171]
- Osman et al. [0171]
- Kim, Kim et al., 2002 [0176]
- Bailey and Ollis, 1986 [0177]
- Thomas, 1995 [0177]
- Klinger, 2006 [0186]
- Klinger, 2006 [0189]
- Welsh and Al-Rubeai, 1996 [0198]
- Thomas, 1995 [0201]
- Hu, Seth et al., 2007 [0201]
- Madshus, 1988 [0201]
- Reusch, 1995 [0201]
- Engasser, Marc et al., 1996 [0210]
- Welsh and Al-Rubeai, 1996 [0210]
- Wu et al. [0211]
- Wu, 1993 [0211]
- Kimura and Miller, 1996 [0212]
- Pattison, Swamy et al., 2000 [0212]
- deZengotita, 2002 [0212]
- Bresnahan, Boldogh et al., 1996 [0222]
- Dittmer and Mocarski, 1997 [0222]
- Wagner, 1998 [0234]
- Irani, 1999 [0234]
- Bollati Fogolin, 2001 [0234]
- Bollati Fogolin, 2003 [0234]
- Paul, 2006 [0236]
- Bollati et al. [0252]
- Bollati Fogolin, 2003 [0252]
- Bloemkolk, 1992 [0252]
- Moore, 1997 [0252]
- Kaufmann, 1999 [0252]
- Hauser and Wagner, 1997 [0253]
- Alberts, 2002 [0253]
- Frahm, Blank et al., 2002 [0254]

Claims

Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids in einer im Zitratzyklus modifizierten eukaryontischen Wirtszelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Züchten der eukaryontischen Wirtszelle in einem geeigneten Medium unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben, wobei der Gehalt an gelöstem CO₂ (pCO₂) im Medium auf einem konstanten Wert im Bereich von 5% bis 25% gehalten wird; und (b) Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle oder aus dem Medium.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine tierische Zelle oder Insektenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die tierische Zelle eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Säugerzelle eine CHO, BHK, Hybridom- oder Myelomzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die im Zitratzyklus modifizierte Wirtszelle eine Zelle ist, die eine cytosolische Pyruvatcarboxylase exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle CHO-hGM-CSF-PYC2 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid ein Fusionsprotein, ein Antikörper oder ein Fragment davon, ein Interferon, Cytokin oder Wachstumsfaktor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Gehalt an gelöstem CO₂ (pCO₂) im Medium auf einem konstanten Wert im Bereich von 10% bis 20% gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Gehalt an gelöstem CO₂ (pCO₂) im Medium auf einem konstanten Wert im Bereich von 12,5% bis 17,5% gehalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Fed-Batch Verfahren durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Gehalt an gelöstem CO₂ (pCO₂) im Medium über einen Regelkreis mit einem kaskadierten pCO₂-Regler über Massendurchflussventile (MFC) konstant gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei über die MFC bei einer Sollwertunterschreitung des pCO₂ im Medium der CO₂-Anteil in der Zuluft erhöht wird, bei einer Sollwertüberschreitung des pCO₂ im Medium der CO₂-Anteil in der Zuluft verringert wird, und bei einer Sollwertüberschreitung, die durch Verringerung des CO₂-Anteils in der Zuluft nicht ausreichend kompensierbar ist, der kaskadierte Regler ein zusätzliches MFC zur Einleitung von N₂ öffnet.