DE60106749T2

DE60106749T2 - Verfahren zum screening von mikroorganismen unter nährstofflimitierten bedingungen

Info

Publication number: DE60106749T2
Application number: DE60106749T
Authority: DE
Inventors: Volker Schellenberger
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: AU2001251065A1; US6248541B1; WO2001081616A3; EP1276894A2; EP1276894B2; EP1276894B1; WO2001081616A2; ATE280837T1; CA2406465A1; DE60106749D1; DE60106749T3; CA2406465C

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalten von Populationen von Zellen in Kultur mit ähnlicher Dichte. Sie betrifft auch Verfahren zum Screenen von Populationen von Zellen hinsichtlich eines Phänotyps von Interesse, einschließlich der verbesserten Herstellung von Produkten und der Herstellung verbesserter Produkte.
Hintergrund der Erfindung
Mikroorganismen werden in breitem Umfang als Quellen nützlicher chemischer Produkte verwendet, ob natürlich vorkommend oder durch Gentechnik hergestellt. Das Screening von Organismen, insbesondere Einzelzell-Organismen, ist zur Identifizierung derjenigen notwendig, welche nützliche Produkte oder nützliche Produkte in reichlicheren Mengen herstellen. Derartige identifizierte Organismen können dann isoliert und wegen ihrer nützlichen Eigenschaften verwendet werden.
Herkömmlicherweise ist das Screening einer Population von Organismen auf Agarplatten durchgeführt worden. Die Population wird üblicherweise auf Platten, welche einen Indikator für ein Zielenzym, beispielsweise ein chromogenes Substrat, oder Magermilch zum Nachweis von Proteasen enthalten, ausgestrichen. Kolonien des ausplattierten Organismus, welche erhöhte Spiegel des Zielenzyms herstellen, können basierend auf der Intensität der Farbe, der Klärungszone etc. nachgewiesen werden.
Das Verfahren zum Screenen durch Ausplattieren auf Agarplatten besitzt mehrere Nachteile. Die Bedingungen auf Agarplatten sind sehr verschieden von den Herstellungsbedingungen, welche im allgemeinen eine Hochdichte-Fermentation beinhalten. Deshalb wird ein Stamm eines Organismus, der erhöhte Spiegel eines Produktes auf Agar erzeugt, dies nicht notwendigerweise so während der Produktion vollführen. Darüber hinaus ist die Intensität eines Reportersignals auf einer Agarplatte von der Größe einer gegebenen Kolonie abhängig, was Variati onen in der Produktivität zwischen Stämmen maskiert. Agarplatten-Screens begünstigen üblicherweise rasch wachsende Stämme, welche dazu neigen, stärkere Signale zu ergeben.
Die Analyse von Mikrokolonien ist kürzlich beschrieben worden (Yang et al., Gene 173:19–23 (1996)). Dieses Verfahren gestattet das Screening großer Zahlen von Kolonien auf einer einzelnen Agarplatte. Jedoch leidet dieses Verfahren noch unter den obenstehend erwähnten Problemen.
Noch kürzlicher ist ein Screening von Populationen von Organismen auf Mikrotiterplatten durchgeführt worden. Dieses Verfahren beinhaltet im allgemeinen das Verteilen einzelner Klone in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten, zum Beispiel unter Verwendung eines Kolonie-"Pickers". Die Zellen werden dann in einem Vollmedium herangezogen, das die Produktionsbedingungen nachahmt, wodurch den Zellen erlaubt wird, zu einer hohen Dichte zu wachsen. Die Zellen werden während verschiedener Zeitspannen wachsen gelassen. Proben werden zur Analyse entnommen, wobei häufig eine Verdünnung der Probe erforderlich ist, um die Aktivität des Zielenzyms in den Bereich des Nachweisverfahrens zu bringen. Die Aktivität kann durch verschiedene Mittel gemessen werden, z.B. unter Verwendung von chromogenen oder fluorogenen Substraten, Radioaktivität etc.
Die obenstehend beschriebenen Mikrotiter-Screening-Verfahren besitzen mehrere Nachteile. Sie erfordern mehrere Flüssigkeitsbehandlungs-Schritte, was den Durchsatz beschränkt und/oder Roboter-Einrichtungen erfordert, was sehr kostenaufwendig ist. Flüssigkeitsbehandlungs-Schritte sind auch Fehlerquellen. Es ist auch schwierig, Kulturen in Mikrotiterplatten mit Sauerstoff zu versorgen, was für viele Wirte essentiell ist. Darüber hinaus wachsen die Kulturen zu einer hohen Dichte, was zu einer Änderung der Mediumbedingungen, wie pH, Nährstoffkonzentrationen, Nebenprodukten etc., führt. Die sich ändernden Mediumbedingungen beeinflußen die Produktivität der Zellen, was zur Identifizierung von Stämmen führt, welche unter solchen Bedingungen gut produzieren, aber nicht notwendigerweise unter Produktionsfermentations-Bedingungen.
Deshalb besteht ein Bedarf nach einer raschen und effizienten und kostengünstigen Methode zum Screenen großer Zahlen von Zellen hinsichtlich individueller Stämme mit einer bevorzugten Produktivität eines Produktes unter Bedingungen, welche den Produktionsfermentations-Bedingungen sehr nahekommen. Ein solches Screening wäre nicht nur zur Identifizierung von Zellen einer Population mit natürlich vorkommenden bevorzugten Eigenschaften nützlich, sondern auch zur Identifizierung derartiger bevorzugter Mitglieder einer aus induzierter Mutagenese resultierenden Population.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht neue Verfahren zum Erhalten einer Vielzahl von Populationen von Zellen mit ähnlicher Dichte und Screenen von Zellpopulationen hinsichtlich eines Phänotyps von Interesse, einschließlich der verbesserten Herstellung von Produkten und der Herstellung verbesserter Produkte, vor. In einem Aspekt umfasst das Verfahren das Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus einer Anfangspopulation von Zellen in einem Medium, das mindestens einen Nährstoff in limitierender Konzentration enthält. Das Wachstum von Zellen in jeder Probe wird durch den limitierenden Nährstoffs reguliert, wodurch Subpopulationen mit einer ähnlichen Zelldichte hergestellt werden. Dies vereinfacht den Vergleich der Subpopulationen in großem Maße. In einer Ausführungsform stammen die Zellen aus einer einzelnen Anfangspopulation, welche ein einzelner Organismustyp oder Zelllinie oder ein Pool von bevorzugten Zellen sein kann. Die Proben können bei verschiedenen Zelldichten durch verschiedene Verfahren inokuliert werden. Es können verschiedene limitierende Nährstoffe verwendet werden, und die Proben können in verschiedenen Aufnahmegefäßen kultiviert werden.
Darüber hinaus sieht die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit einem Phänotyp von Interesse vor. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen mit ähnlicher Dichte aus der Zellpopulation von Interesse, durch Kultivieren von Proben der Zellpopulation von Interesse. Die Proben umfassen Zellen aus der Population von Interesse und ein Zellkulturmedium, enthaltend einen limitierenden Nährstoff, welcher das Zellwachstum so reguliert, dass Zellen in jeder Probe zu einer ähnlichen Dichte wachsen. Subpopulationen, umfassend Zellen mit dem Phänotyp von Interesse, werden dann identifiziert.
In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung Verfahren zum Screenen einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit dem Phänotyp einer verbesserten Herstellung von einem oder mehreren Produkten von Interesse vor. Dieses Verfahren umfasst die Schritte des Erhaltens einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen von ähnlicher Dichte aus der Zellpopulation von Interesse durch Kultivieren von Proben der Zellpopulation von Interesse. Die Proben umfassen Zellen aus der Population von Interesse und ein Zellkulturmedium, enthaltend einen limitierenden Nährstoff, welcher das Zellwachstum so reguliert, dass Zellen in jeder Probe zu einer ähnlichen Dichte wachsen. Die Menge des durch die individuellen Subpopulationen hergestellten Produkts wird dann gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die verbesserte Herstellung während der stationären Phase. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die verbesserte Herstellung eine erhöhte Gesamtherstellung oder eine erhöhte Herstellung über die Zeit. Vorzugsweise wird die Menge des Produktes gemessen. In einer Ausführungsform erfolgt die Messung durch Messen der Aktivität des Produktes in jeder der Vielzahl von Zellpopulationen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Proben eine Substanz, oder diese ist ihnen zugesetzt, welche das Vorhandensein von jedem der Produkte nachweist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz ein Substrat des Produktes. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz ein Ligand des Produktes. Vorzugsweise ist die Substanz fluorogen oder chromogen.
Von der Erfindung ebenfalls vorgesehen wird ein Verfahren zum Screenen einer Zellpopulation von Interesse hinsichtlich Zellen mit dem Phänotyp der Herstellung eines verbesserten Produktes von Interesse. In einem Aspekt besitzt das verbesserte Produkt eine erhöhte Aktivität gegenüber einem unverbesserten Produkt. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen aus der Population von Interesse durch Kultivieren von Proben aus der Population von Interesse mit mindestens einem limitierenden Nährstoff, welcher das Zellwachstum reguliert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aktivität des Produktes in den Subpopulationen gemessen, um die relative Aktivität des von Jeder hergestellten Produktes zu bestimmen.
Weiterhin sieht die Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Zellpopulation von Interesse hinsichtlich Zellen mit dem Phänotyp der Herstellung eines Produktes von Interesse mit veränderter Selektivität für Substrate) vor. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen aus der Population von Interesse durch Kultivieren von Proben aus der Population von Interesse mit mindestens einem limitierenden Nährstoff, welcher das Zellwachstum reguliert. Die Proben enthalten, gemeinsam oder aufeinanderfolgend, zwei oder mehrere verschiedene Substrate für das Produkt von Interesse, oder diese sind ihnen zugesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aktivität des Produktes auf jedes Substrat in den Subpopulationen gemessen. Vorzugsweise sind die Substrate fluorogen, voneinander unterscheidbar und sind unabhängig voneinander messbar.
Ebenfalls vorgesehen wird ein Verfahren zum Screenen einer Zellpopulation von Interesse hinsichtlich Zellen mit dem Phänotyp des Herstellens eines Produktes von Interesse mit erhöhter Stabilität. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen aus der Population von Interesse durch Kultivieren von Proben aus der Population von Interesse mit mindestens einem limitierenden Nährstoff, welcher das Zellwachstum reguliert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an vorhandenem Produkt über die Zeit oder die Aktivität des Produktes über die Zeit unter nicht-optimalen Bedingungen für ein Produkt von Interesse, das keine erhöhte Stabilität besitzt, gemessen. Die nicht-optimalen Bedingungen können Temperatur, pH, Konzentration von gelösten Stoffen, Gegenwart von Proteasen, Gegenwart von Detergenzien und Gegenwart von Lösungsmitteln einschließen. Vorzugsweise wird die Messung an mehr als einem Zeitpunkt vorgenommen.
In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Zellpopulation von Interesse hinsichtlich Zellen mit dem Phänotyp einer verbesserten Effizienz der Herstellung eines Produktes von Interesse vor. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen aus der Population von Interesse durch Kultivieren von Proben aus der Population von Interesse mit mindestens zwei limitierenden Nährstoffen. Einer der limitierenden Nährstoffe reguliert das Zellwachstum, während der/die andere(n) für die Herstellung des Produktes von Interesse notwendig ist. Die Menge des in jeder der Subpopulationen hergestellten Produktes wird gemessen, um die Effizienz der Herstellung des Produktes zu bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind der zweite und nachfolgende limitierende Nährstoff(e) Kohlenstoff und/oder Stickstoff.
Die Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Screenen einer Zellpopulation von Interesse hinsichtlich Zellen mit dem Phänotyp einer verbesserten Herstellung eines Produktes von Interesse vor. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen aus der Population von Interesse durch Kultivieren von Proben aus der Population von Interesse mit mindestens zwei limitierenden Nährstoffen. Ein erster limitierender Nährstoff beschränkt das Wachstum der Zellen von jeder Probe, während der mindestens zweite limitierende Nährstoff ein Substrat für das Produkt von Interesse ist, welches bei Umsetzung mit dem Produkt den selben Nährstoff wie den Ersten bereitstellt. Proben mit Zellen, welche mehr von dem Produkt von Interesse herstellen, werden eine größere Zelldichte erreichen. Die Zelldichte der Subpopulationen wird gemessen, wobei eine höhere Zelldichte eine höhere Herstellung des Produktes von Interesse zeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zelldichte durch optische Dichte gemessen. In einer anderen Ausführungsform wird die Zelldichte durch die relative Fluoreszenz hinsichtlich eines fluoreszierenden Produktes gemessen, das von den Zellen der Population von Interesse hergestellt wird.
Ferner wird hierin ein Verfahren gemäß mindestens eines der obenstehend beschriebenen Screening-Verfahren vorgesehen, weiter umfassend das Unterziehens der Zellpopulation von Interesse unter eine Zufalls-Mutagenese oder Rekombination. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellpopulation von Interesse einer mutagenen Substanz unterzogen. In einer anderen Ausführungsform werden die Schritte des Verfahrens anschließend an bevorzugten Zellpopulationen, welche in vorangehenden Screenings identifiziert wurden, wiederholt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Screening einer Population von Zellen. In einem Aspekt sieht das Verfahren das Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen ähnlicher Dichte vor, abgeleitet aus einer Anfangspopulation und repräsentativ für individuelle Mitglieder dieser Anfangspopulation. Die Populationen werden in einem Medium herangezogen, welches einen Nährstoff in einer limitierten Menge enthält, durch den man in die Lage versetzt wird, die Zelldichte der Subpopulationen zu steuern. Eine derartige Kollektion von Zell-Subpopulationen ist nützlich, um nach Mitgliedern der Anfangspopulation mit bevorzugten Merkmalen zu screenen, insbesondere der Fähigkeit, verbesserte Mengen oder eine verbesserte Version eines Produkts von Interesse herzustellen.
Die Erfindung besitzt viele Vorteile gegenüber früher bekannten Zellkultursystemen. Die meisten bekannten Screening-Assays begünstigen schnell wachsende Zellen. Die Erfindung reguliert die Zelldichte durch einen oder mehrere limitierende Nährstoffe. Langsam wachsende Zellen werden länger brauchen, um den limitierenden Nährstoff aufzuzehren, aber sie werden letztendlich ähnliche Zelldichten zu den schnell wachsenden Zellen erreichen. Dies verbessert die Chance zur Identifizierung von Mutationen, welche nachteilige Effekte auf das Zellwachstum besitzen, aber zu einer erhöhten Produktivität oder verbesserten Produkteigenschaften führen. Vorzugsweise vermeidet die Erfindung auch jedwede O₂-Beschränkung, wodurch die Notwendigkeit für ein Schütteln ausgeschlossen und die Verwendung von Hochdichte-Formaten, wie Bündeln von Kapillaren, welche einen limitierten Sauerstofftransfer zulassen, gestattet wird.
Im Allgemeinen sind die Subpopulationen von ähnlicher Dichte, wodurch ein direkter Vergleich von Produkten, beispielsweise hergestellten Enzymen gestattet wird. Aspekte der Herstellung dieser Produkte, einschließlich der hergestellten Menge, der Aktivität des Produkts und der Verwertung unterschiedlicher Substrate durch das Produkt, können unter Bedingungen verglichen werden, welche Fermentierungsbedingungen im großen Maßstab entsprechen. Da die Zelldichte in jeder Probe durch die Konzentration des limitierenden Nährstoffs gesteuert werden kann, kann man Änderungen im Kulturmedium, welche durch die metabolische Aktivität der Zellen verursacht werden, minimieren. Daher ähneln die Bedingungen, unter welchen die Zellen während der gesamten Kultivierung kultiviert werden, sehr den Bedingungen am Beginn der Kultivierung. Die Kultivierungsbedingungen, wie Zelldichte und Kulturmedien-Komponenten, können auch ohne weiteres modifiziert werden, um das gewünschte Merkmal zu optimieren, wobei die Modifikationen leicht auf Herstellungsanwendungen im großen Maßstab übertragen werden können. Die Screening-Verfahren der Erfindung werden auch an Zellen in der stationären Phase durchgeführt, was fernerhin Fermentierungsbedingungen im großen Maßstab ähnlich ist.
Die Verfahren der Erfindung sehen ein Screening einer Population von Zellen mit einer mannigfaltigen genetischen Konstitution vor, um individuelle Zellen in der Population mit Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Diese Verfahren gestatten das Screening von Zellpopulationen mit genetischer Diversität, induziert durch externe Manipulation, wie durch Mutagenese der Population. Die Verfahren sind nützlich zum Screening großer Zahlen von Zellen und eignen sich ohne weiteres für die Anwendung im Hochdurchsatz-Screening.
Im Allgemeinen beinhaltet das Verfahren das Herstellen einer Vielzahl von Proben aus einer Population von Zellen von Interesse und das Heranziehen der Zellen dieser Proben zur Erzeugung einer Vielzahl von Subpopulationen. Das Zellsuspensionsmedium enthält mindestens einen Nährstoff in limitierender Konzentration, sodass die Maximum-Zelldichte, zu welcher jede Subpopulation heranwachsen kann, reguliert ist, wodurch Subpopulationen ähnlicher Dichte erzeugt werden. Die resultierende Zelldichte wird eher von der Konzentration des limitierenden Nährstoffs bestimmt als von der Wachstumsrate der verschiedenen Stämme in der Population.
Der Ausdruck "von Interesse" wird hierin verwendet, um eine Gruppe, Zusammensetzung, Eigenschaft etc. zu bezeichnen, welche unter Betrachtung und identifiziert oder identifizierbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proben aus einer Zellsuspension einer Anfangspopulation von Zellen entnommen. Mit "Anfangspopulation von Zellen", "Anfangszellpopulation" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon wird eine Population von Zellen gemeint, aus der eine oder mehrere Zellen anschließend zu mindestens einer Subpopulation von Zellen herangezogen wird. Mit "Population von Zellen", "Zellpopulation", "Population" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon wird eine Mischung von 5 bis 10⁵ Zellen gemeint, welche genetisch verschieden sind. Mit "Subpopulation" wird eine Population von Zellen gemeint, herangezogen aus einer oder mehreren Zellen, welche aus einer Anfangspopulation entnommen wurden.
Bei der Erfindung können die Zellen jedwede Art sein, welche zum Wachstum unter Zellkulturbedingungen in der Lage sind. Nützliche Zelltypen in dem Verfahren schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Hefe, Bakterien, Archaebakterien, Pilze, einschließlich filamentöser Pilze, Pflanzenzellen und Tierzellen ein, einschließlich Insekten- und Säugerzellen. Bevorzugte Zelltypen schließen Bacillus und E. Coli ein.
Die Anfangspopulation von Zellen kann aus jedweder Quelle stammen, vorausgesetzt, dass sie in Zellkultur herangezogen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anfangspopulation, aus welcher die Zellsuspensionsproben genommen werden, von einem einzigen Zelltyp.
In den Verfahren hierin werden Zellen in Kultur herangezogen. Mit "Heranziehen von Zellen in Zellkultur", "Kultivieren von Zellen" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon wird das Vorsehen von Zellen in einem Zellkulturmedium gemeint, aufweisend mindestens die Minimum-Nährstoffe zur Unterstützung des Wachstums und der Lebensfähigkeit der Zellen in/auf einem Aufnahmegefäß unter Bedingungen, welche das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit fördern, einschließlich jeglicher Kombination von Nährstoffen, Salzen, Puffern und anderen Komponenten, welche als nützlich für die zu kultivierenden, spezifischen Zellen anerkannt sind. Wie vom Fachmann auf dem Gebiet richtig eingeschätzt werden wird, können die Zusammensetzung des Zellkulturmediums sowie die Bedingungen, unter welchen die Zellen kultiviert werden, variieren und werden in großem Maße von dem Typ der zu kultivierenden Zelle abhängen. Verfahren zum Kultivieren von Zellen sind im Fachgebiet gut bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Temperatur und Feuchtigkeit der Kulturen reguliert, um Verdampfung und Kondensation einzuschränken. Die Modifikation von Zellkulturmediums-Zusammensetzung und Kulturbedingungen zur Optimierung von Zellwachstum und -lebensfähigkeit für eine gegebene Anwendung ist eine übliche Praxis und liegt durchaus innerhalb des Kenntnisstands des Durchschnittsfachmanns. Weitere Anweisungen in Hinsicht auf die Kultivierung von Zellen werden in den nachstehenden Beispielen angegeben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen in Aufnahmegefäßen kultiviert, welche die Kultivierung einer großen Anzahl individueller Zellkulturproben gestatten. Bevorzugte Aufnahmevorrichtungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Platten, welche mehrere Vertiefungen enthalten, welche Kulturmedium fassen können (Mehrfachvertiefungs-Platten), Ultrahochdichte-Platten, Platten mit Durchbohrungs-Löchern, CD-artige Scheiben, kohärente Kapillar-Arrays, Bündel von Kapillaren oder Vesikeln, mikrofabrizierte Kanäle und gesprühte Tröpfchen von Flüssigkeit und Kombinationen hiervon ein. Am stärksten bevorzugt werden Mehrfachvertiefungsplatten mit so viel wie 96, 384, 1536 oder mehr Vertiefungen verwendet. Mehrere Aufnahmevorrichtungen können gleichzeitig verwendet werden.
In den Verfahren der Erfindung wird eine Vielzahl von Proben aus einer Anfangspopulation von Zellen entnommen. Mit "Probe einer Anfangspopulation von Zellen", "Probe einer Population von Interesse", "Probe" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon wird ein Volumen an Zellkulturmedium gemeint, welches eine Untergruppe einer Anfangspopulation von Zellen enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben der Anfangspopulation von Zellen in die Aufnahmevorrichtung eingebracht, und die Zellen darin werden herangezogen zur Erzeugung von Subpopulationen von Zellen, abgeleitet aus der anfänglichen Zellpopulation. Die Inokulation der Proben kann vor, gleichzeitig zu oder nach der Einführung von Medium in die Aufnahmevorrichtung erfolgen. Mit "Inokulation" ist die Verteilung von Zellen aus der Anfangspopulation in die Proben hinein gemeint. Die Inokulation kann durch mehrere im Fachgebiet bekannte Verfahren ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Inokulation durch statistische Verdünnung einer Suspension der Population von Zellen, gefolgt von Einbringung von Volumina der Suspension in die Aufnahmeeinrichtung durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform wird die Inokulation durch Kolonie-Picken erreicht. In noch einer anderen Ausführungsform werden individuelle Zellen aus der Anfangspopulation isoliert, zum Beispiel durch einen Zell-Sorter, und in die Proben eingeführt. Vorzugsweise sind die Proben distinkt und innerhalb der Aufnahmeeinrichtung identifizierbar, beispielsweise eine Probe pro Vertiefung einer Mehrfachvertiefungsplatte.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Proben ein ähnliches Volumen auf. Mit "ähnliches Volumen" wird hierin gemeint, dass, wenn eine Messung der Aktivität eines Produkts, hergestellt durch eine Population von Zellen, in einer Probe vorgenommen wird, wie die Messung eines fluoreszenten Produktes aus einem fluorogenen Substrat durch ein Enzym, welches durch die Zellen hergestellt wird, die Messung zwischen Proben mit identischen Zellen, welche in selbigen unter identischen Bedingungen herangezogen wurden, nicht signifikant unterschiedlich sein wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die Proben der anfänglichen Zellpopulation eine geringe Inokulationsdichte. Mit "geringe Inokulationsdichte" wird hierin eine solche Dichte gemeint, dass die Mehrzahl von Proben, welche statistisch aus der Suspension entnommen wird, drei Zellen oder weniger, vorzugsweise zwei, und weiter bevorzugt lediglich eine Zelle aufweisen wird. Vorzugsweise liegt bei den Proben ein Durchschnitt von weniger als je 1,4 Zellen vor. Weiter bevorzugt liegt bei den Proben ein Durchschnitt von jeweils 0,5 Zellen vor. Wie vom Fachmann richtig eingeschätzt werden wird, kann die gewünschte Zell dichte der Proben durch Einstellung der Verdünnung einer Suspension der anfänglichen Zellpopulation erhalten werden.
In einer anderen Ausführungsform beträgt die Inokulationsdichte der Proben 5 bis 5000 Zellen je Probe.
Nachdem die Proben hergestellt worden sind, wachsen die Zellen in jeder Probe zu einer Zelldichte heran, welche hauptsächlich von der Konzentration eines limitierenden Nährstoffs abhängig ist. Wenn eine Probe mit einer oder einigen wenigen Zellen inokuliert wird, dann wird die resultierende Subpopulation in hohem Maße klonal sein, d. h. mit der Ausnahme von einigen wenigen spontanen Mutanten werden alle Zellen in der Subpopulation genetisch zu den Zellen identisch sein, welche anfänglich in dieser Probe eingebracht wurden. Diese Situation ist nützlich, wenn die Unterschiede im Phänotyp zwischen den Zellen in der Anfangspopulation nahe zur Nachweisgrenze des angewandten Assays liegen. Man hat die beste Chance zur Identifizierung einer Zelle mit einem Phänotyp von Interesse, wenn die gesamte Subpopulation in der Probe genetisch zu dieser Zelle identisch ist. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn Zellen mit dem Phänotyp von Interesse langsamer wachsen als die Durchschnittszelle der Anfangspopulation.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Zell-Sorter (oder eine andere Vorrichtung) eingesetzt, um individuelle Zellen in die Aufnahmegefäße zu verteilen. Dies ermöglicht, dass man die Inokulationsdichte der Proben steuert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jede Probe mit einer Zelle inokuliert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Zellen, welche auf festem Medium wachsen, in individuelle Proben überführt. Dies gewährleistet, dass die meisten Proben Zellen aus lediglich einem Klon enthalten, was die Identifizierung von Zellen erleichtert, welche sich nur geringfügig vom Durchschnitt der Population unterscheiden. Die Überführung von Zellen in die Aufnahmegefäße kann manuell oder unter Anwendung einer Roboter-Arbeitsstation durchgeführt werden. Die meisten der Verfahren, welche angewandt werden, um Zellen von einem festen Medium in Aufnahmegefäße zu überführen, gestatten eine eingeschränkte Kontrolle der Anzahl von Zellen, welche überführt werden. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass die letztendliche Zelldichte in den Subpopulationen durch die Konzentration eines limitierenden Nährstoffs und nicht durch die Inokulationsdichte bestimmt wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Inokulationsdichte höher als eine Zelle pro Probe, z.B. 3–1000 Zellen je Probe. In diesem Fall wird jede Subpopulation eine Mi schung von unterschiedlichen Klonen repräsentieren. Dieses Vorgehen wird bevorzugt, wenn man nach Zellen screent, welche sich in ihrem Phänotyp signifikant vom Durchschnitt der Population unterscheiden. Als Ergebnis ist man in der Lage, eine Subpopulation zu identifizieren, welche einen erwünschten Klon enthält, selbst wenn dieser Klon nur einen Bruchteil der Zellen in der Subpopulation repräsentiert. Durch Arbeiten mit einer höheren Inokulationsdichte wird es ermöglicht, eine große Anfangspopulation mit einer begrenzten Anzahl von Aufnahmegefäßen zu screenen.
In den Verfahren der Erfindung enthalten die Proben der anfänglichen Population von Zellen mindestens einen limitierenden Nährstoff. Mit "limitierender Nährstoff', "Nährstoff in limitierender Konzentration" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon ist ein Nährstoff in dem Medium gemeint, welcher als Ergebnis des Wachstums der Zellen vor jedwedem anderen Nährstoff in dem Medium aufgezehrt wird. Ein bevorzugter limitierender Nährstoff ist Phosphat. Andere bevorzugte limitierende Nährstoffe schließen Kalium, Magnesium, Stickstoff, Kohlenstoff, Schwefel und Spurenelemente ein. Noch andere bevorzugte limitierende Nährstoffe schließen Aminosäuren, Wachstumsfaktoren, Vitamine und andere spezifische Erfordernisse für das Wachstum der jeweiligen Population von Zellen von Interessen ein. Allerdings wird der Fachmann davon ausgehen, dass viele Komponenten des Zellmediums und Kombinationen davon als ein limitierender Nährstoff wirken können. Der limitierende Nährstoff kann in Elementform vorliegen oder kann in jedweder molekularen Form vorliegen, durch welche er von einer Zelle als ein Nährstoff verwendet werden kann. Zum Beispiel schließen geeignete Quellen von Kohlenstoff Zucker, Polysaccharide, Alkohole und andere organische Moleküle ein, welche von einer Zelle metabolisiert werden können. Die Selektion eines passenden limitierenden Nährstoffs liegt innerhalb der Durchschnittsfähigkeiten eines Fachmanns auf dem Gebiet.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der limitierende Nährstoff in dem Medium vor, welches zur Herstellung der Proben der Anfangspopulation von Zellen verwendet wird. Wie vom Fachmann richtig eingeschätzt werden wird, kann der limitierende Nährstoff jederzeit zu den Zellen eingeführt werden, so lange der limitierende Nährstoff in dem Zellkulturmedium während der Kultivierung der Zelle(n) in den Proben vorhanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform hören die Zellen zu wachsen auf, sobald der limitierende Nährstoff aus der Probe aufgezehrt worden ist, was zu Subpopulationen von Zellen führt, deren Dichte vorwiegend von der Menge eines limitierenden Nährstoffs und nicht von der Wachstumsrate der Zelle(n) oder der Inokulationsdichte der ursprünglichen Probe abhän gig ist. Vorzugsweise treten die Zellen in die stationäre Phase ein, nachdem der limitierende Nährstoff aufgezehrt ist, und die Zellen hören auf zu wachsen und bleiben produktiv.
Folglich sieht die Erfindung Verfahren zum Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen vor. Mit "Vielzahl" wird mehr als 1 gemeint. Allerdings versteht es sich für den Fachmann, dass so viele wie 10⁹ oder mehr Subpopulationen durch die hierin erörterten Verfahren erhalten werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform unter Anwendung des obenstehenden Verfahrens besitzt die Vielzahl von Subpopulationen von Zellen eine ähnliche Dichte und Größe (d. h. Anzahl an Zellen) aufgrund der Gegenwart eines limitierenden Nährstoffs im Kulturmedium bzw. des ähnlichen Volumens jeder Probe. Mit "ähnliche Dichte" ist hierin eine Anzahl an Zellen pro Volumen gemeint, so dass bei Vornehmen einer Messung der Aktivität eines Produkts, welches von einer Population von Zellen in einer Probe hergestellt wird, wie der Messung eines fluoreszierenden Produktes aus einem fluorogenen Substrat durch ein von den Zellen hergestelltes Enzym, die Messung zwischen Proben mit identischen Volumina an identischen Zellen nicht signifikant unterschiedlich sein wird.
Das Verfahren zum Erhalten einer Vielzahl von Populationen von Zellen, welches obenstehend beschrieben wurde, findet Anwendung in einer Reihe von Applikationen, insbesondere für das Screening einer Anfangspopulation von Zellen hinsichtlich Zellen mit einem Phänotyp von Interesse. Mit "Phänotyp" wird jedwedes nachweisbare Merkmal einer Zelle gemeint. Bevorzugte Phänotypen schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die verbesserte Herstellung eines oder mehrerer Produkte von Interesse, verbesserte Effizienz bei der Herstellung eines Produkts von Interesse und Herstellung eines verbesserten Produkts von Interesse ein. Verbesserte Produkte von Interesse schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Produkte mit verbesserter Aktivität, veränderter Selektivität für Substrate und erhöhter Stabilität ein.
Andere bevorzugte Phänotypen schließen die Fähigkeit zum Wachsen und/oder Herstellen eines Produkts von Interesse unter Bedingungen, bei welchen die durchschnittliche Zelle der anfänglichen Population dies nicht vermag, ein. Derartige Bedingungen schließen diejenigen, worin ein Nährstoff in einer solchen Form vorliegt, dass er lediglich von Zellen verwendet werden kann, welche einen vom Durchschnitt veränderten Phänotyp aufweisen, und diejenigen, worin pH, Temperatur und/oder Gegenwart von Toxinen, gelösten Stoffen und/oder Lösungsmitteln das Wachstum und/oder die Lebensfähigkeit von durchschnittlichen Zellen der Anfangspopulation behindern, ein.
In Verfahren zum Screening einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich eines Phänotyps von Interesse wird eine Vielzahl von Subpopulationen von Zellen aus der Population von Interesse, wie obenstehend beschrieben, erhalten. Subpopulationen mit einem Phänotyp von Interesse werden dann identifiziert. Dem Fachmann auf dem Gebiet wird es offensichtlich sein, dass die spezifischen Mittel zum Identifizieren eines Phänotyps von Interesse von dem zu identifizierenden jeweiligen Phänotyp bestimmt werden. Assays für eine Vielfalt von Zellphänotypen sind im Fachgebiet bekannt und die Bestimmung eines besonderen Assays liegt durchaus innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Screening einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit einer verbesserten Herstellung eines oder mehrerer Produkte von Interesse vorgesehen. Mit "verbesserte Herstellung" wird hierin eine Gesamtherstellungsmenge oder eine Herstellungsrate gemeint, welche gegenüber der Herstellung des Produkts durch Zellen ohne die verbesserte Herstellung verändert und bevorzugt ist. In einer Ausführungsform ist die Herstellung größer als der Durchschnitt der Population. In einer anderen Ausführungsform ist die Herstellung geringer als der Durchschnitt der Population. In einer bevorzugten Ausführungsform stellen individuelle Zellen größere Mengen an einem oder mehreren Produkten und geringe Mengen an einem oder mehreren anderen her.
Mit "Produkt von Interesse" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon wird jedwedes Produkt der physiologischen/biochemischen Aktivität der Zellen der Population von Interesse gemeint, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Polypeptide, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate und Metabolite davon. Vorzugsweise ist das Produkt von Interesse ein Polypeptid, weiter bevorzugt ein Enzym.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Produkt von Interesse gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipase, Cellulase, Endo-Glukosidase H, Protease, Carbohydrase, Reductase, Oxidase, Isomerase, Transferase, Kinase, Phosphatase, Alpha-Amylase, Glucoamylase, Lignocellulose-Hemicellulase, Pectinase und Ligninase. In einer anderen Ausführungsform ist das Produkt von Interesse ein Therapeutikum, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Impfstoffen, Zytokinen, Rezeptoren, Antikörpern, Hormonen und Faktoren einschließlich Wachstumsfaktoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt eine Protease. In einem Aspekt ist die Protease FN4. Andere bevorzugte Produkte schließen zu Subtilisin homologe Proteasen, Phytasen, Zellulasen und Esterasen ein. Diese Sequenzen von Genbank-Zugangsnummern sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen. Genbank ist dem Fachgebiet bekannt, siehe z.B. Benson, DA, et al., Nucleic Acids Research 26:1–7 (1998) und http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Wie der Fachmann richtig einschätzen wird, können die Produkte endogen oder heterolog sein. Ein endogenes Produkt ist ein solches, hergestellt durch die angeborene genetische Konstitution der Zelle, einschließlich natürlich vorkommenden Mutationen und allelischen Variationen von nativen Produkten. "Heterolog", wie hierin verwendet, bedeutet, dass das Produkt durch rekombinante Methoden hergestellt wird oder ansonsten ein Produkt von induzierter Mutagenese ist. Deshalb kann das Produkt für die Zellen nativ sein, wird jedoch beispielsweise durch Transformation mit einem selbst-replizierenden Vektor, enthaltend die Nukleinsäure, welche das Produkt von Interesse kodiert, hergestellt. Alternativ dazu könnte eine Rekombinante vorliegen, in welcher eine oder mehrere Extrakopien einer nativen Nukleinsäuresequenz durch rekombinante Techniken in das Genom integriert sind. Darüber hinaus könnte das rekombinante Produkt als Ergebnis einer Mutation des Genoms der Zelle hergestellt werden, induziert durch ein mutagenes Mittel, wie nachstehend ferner beschrieben.
Ein Phänotyp von Interesse könnte von zahlreichen endogenen und heterologen Genen beeinflusst sein. Diese schließen Zellen mit erhöhter metabolischer Effizienz und Zellen, welche weniger Nebenprodukte herstellen, wie nachstehend weiter beschrieben, ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist/sind die limitierenden Nährstoffe) nicht direkt für die Herstellung des Produkts von Interesse erforderlich. Beispielsweise kann das Zellwachstum durch Begrenzen der Konzentration der Kohlenstoffquelle limitiert werden; jedoch kann eine Kohlenstoffquelle für die Herstellung des Produkts durch die Zellen erforderlich sein, weshalb die Herstellung nach Aufzehrung des limitierenden Nährstoffs beschränkt wird. Bevorzugte limitierende Nährstoffe sind obenstehend aufgelistet.
Das Verfahren umfasst ferner das Messen der Menge des Produkts von Interesse in jeder der Vielzahl von Subpopulationen, woraus die relative Herstellung des Produkts von Interesse in individuellen Zellen der Population von Interesse abgeleitet wird. Wie vom Fachmann richtig eingeschätzt werden wird, kann eine Reihe von Methoden zur Messung eines Produkts einer Zellpopulation angewandt werden, was in großem Maße abhängig von dem zu messenden Produkt ist. Zum Beispiel können Moleküle mit spezifischer Affinität für das Produkt von Interesse, wie Antikörper, verwendet werden, um das Produkt von Interesse zu markieren oder zu fällen.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Proben eine Substanz, welche das Produkt von Interesse nachweisen kann, oder weisen diese zugesetzt zu ihnen auf. Wenn das Produkt von Interesse ein Enzym ist, enthält die Suspension vorzugsweise ein Substrat des Enzyms, weiter bevorzugt ein Substrat, welches fluorogen oder chromogen ist. Mit "fluorogenes Substrat" und grammatikalischen Äquivalenten davon ist eine Substanz oder ein Molekül gemeint, mit welchem das Produkt von Interesse spezifisch wechselwirkt, wodurch die fluoreszenten Merkmale des Substrats sich in einer nachweisbaren Art ändern. In einer bevorzugten Ausführungsform ändert sich die Fluoreszenz des Substrats im Anschluss an die Wechselwirkung mit dem Produkt von Interesse, und weiter bevorzugt ist die Änderung quantifizierbar, zum Beispiel durch Messen der Lumineszenz. In gleicher Weise bedeutet ein "chromogenes Substrat" eine Substanz oder ein Molekül, dessen optische Eigenschaften sich in einer nachweisbaren Art im Anschluss an die Wechselwirkung mit dem Produkt von Interesse ändern. Vorzugsweise ist die Änderung im chromogenen Substrat quantifizierbar, beispielsweise durch Messen der Dichte. Auf diese Weise wird die Aktivität des Enzym-Produkts von Interesse gemessen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz, welche ein Produkt von Interesse nachweisen kann, ein Ligand des Produkts von Interesse. Weiter bevorzugt ist die Substanz ein niedermolekulargewichtiger Ligand. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Ligand einen fluoreszierenden Marker auf. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge des Produkts von Interesse unter Anwendung des Verfahrens der Fluoreszenzpolarisation; Fernades P.B., Curr. Opin. Chem. Biol. 2(5):597–603 (1998); und/oder durch Densitometrie gemessen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthalten die Proben mehr als eine Substanz, welche ein Produkt von Interesse nachweisen kann, oder dieses ist ihnen zugesetzt. Die zusätzlichen Substanzen) können dasselbe Produkt oder ein verschiedenes Produkt nachweisen. Zum Beispiel kann die Suspension ein zweites fluorogenes Substrat enthalten, welches mit dem Produkt von Interesse unter Erzeugung eines fluoreszenten Signals reagiert. Vorzugsweise ist jede Substanzen) von den anderen so unterscheidbar, dass jede unabhängig gemessen werden kann. Zum Beispiel kann das Signal eines zusätzlichen fluorogenen Substrates) unterschiedliche Fluoreszenzstimulations- und/oder Emissionswellenlängen zu dem ersten besitzen, was gestattet, dass die enzymatische Aktivität auf die verschiedenen Substrate differenziert werden kann. Alternativ dazu können Zellpopulationen, welche hinsichtlich einer gewünschten Produktaktivität selektiert werden, hinsichtlich Aktivität mit den zusätzlichen Substraten) in einem anschließenden Assay getestet werden. Dies gestattet die Identifizierung von Zellen mit veränderten Spezifitäten oder von Zellen, welche verschiedene Produkte in veränderten Verhältnissen herstellen.
Wie der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, gestattet die regulierte Dichte der Vielzahl von Zell-Subpopulationen, diktiert von der Konzentration des limitierenden Nährstoffs, einen direkten Vergleich zwischen den verschiedenen Subpopulationen. Beispielsweise lässt sich ein Unterschied in der gemessenen Enzymaktivität zwischen Subpopulationen direkt übertragen auf entweder einen Unterschied in der Menge des Produkts, das von den Zellen jeder Subpopulation hergestellt wird, oder einen Unterschied in der enzymatischen Aktivität der Produkte, welche in jeder Subpopulation hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jede Subpopulation aus ungefähr einer Zelle herangezogen; deshalb wird gewöhnlicherweise jede Zelle in einer gegebenen Population ein Klon sein, aufweisend dieselbe(n) genetische Konstitution und Produktherstellungs-Eigenschaften. Darüber hinaus wird, zumal der limitierende Nährstoff die Zellsubpopulationen davon abhält, zu hoher Dichte heranzuwachsen, auch die Produktdichte reguliert, was die Messung der Produktaktivität gestattet, die ohne Verdünnung von Populationen, welche unter nicht-limitierten Wachstumsbedingungen herangezogen wurden, nicht messbar wäre.
In einer bevorzugten Ausführungsform zeigt die Messung der Aktivität des Enzymprodukts von Interesse die relative Menge des Produkts in jeder Subpopulation an. Wie obenstehend erörtert, besitzt die Vielzahl von Subpopulationen von Zellen der vorliegenden Erfindung eine ähnliche Zelldichte. Deshalb kann, in dieser Ausführungsform, ein Vergleich der Aktivität des Enzymprodukts von Interesse zwischen jeder der Vielzahl von Subpopulationen von Zellen vorgenommen werden, aus welchem die relative Menge an Enzym, welche in Jeder hergestellt wird, bestimmt werden kann. Darüber hinaus kann die Änderung in der Menge an nachweisbarem Substrat über die Zeit herangezogen werden, um die über die Zeit hergestellte, relative Menge des Enzyms zu bestimmen. Wie vom Fachmann richtig eingeschätzt werden wird, kann die relative Menge eines Produkts von Interesse zwischen Proben durch anschließende Analyse, wie einem für das Produkt spezifischen ELISA, HPLC, Massenspektrometrie oder Elektrophorese bestätigt werden.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung werden Verfahren zum Screening einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen, welche ein verbessertes Produkt von Interesse in einer individuellen Zelle der Population herstellen, vorgesehen. Mit "verbessertes Produkt", "verbessertes Produkt von Interesse" und grammatikalischen Äquivalenten davon wird hierin ein Produkt von einer oder mehreren Zellen der Population von Interesse gemeint, aufweisend ein gewünschtes Merkmal, welches in der Mehrheit der Zellen der Population nicht gefunden wird, wobei es sich um jedwede Änderung, Erhöhung oder Verringerung handeln kann. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das verbesserte Produkt von Interesse eine erhöhte Aktivität, weiter bevorzugt eine erhöhte enzymatische Aktivität. In einem anderen Aspekt besitzt das verbesserte Produkt, alternativ dazu oder zusätzlich dazu, eine unterschiedliche spezifische Aktivität, vorzugsweise eine veränderte Substratspezifität, zu der Mehrheit der Zellen der Population von Interesse. Andere Merkmale, welche als eine Verbesserung angesehen werden können, sind eine erhöhte Stabilität, Änderungen von Optimum-pH-Wert oder -Temperatur, erhöhte Beständigkeit gegenüber Proteolyse und eine verbesserte Sezernierbarkeit.
In diesem Aspekt der Erfindung wird eine Vielzahl von Subpopulationen von Zellen aus einer Suspension der Population von Zellen von Interesse, wie obenstehend beschrieben, erhalten. Wie obenstehend beschrieben, wird in einer Ausführungsform die Zelldichte der Suspension so eingestellt, dass die Proben eine niedrige Inokulationsdichte aufweisen. Die Proben sind ebenfalls von ähnlichem Volumen. Darüber hinaus wird in einer bevorzugten Ausführungsform die relative Aktivität eines Enzymprodukts von Interesse zwischen der Vielzahl von Subpopulationen von Zellen, wie obenstehend beschrieben, bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform zeigt die Messung der Aktivität des Enzymprodukts von Interesse in jeder der Vielzahl von Subpopulationen die relative Aktivität des individuellen Produkts in jeder der Vielzahl von Proben an, wodurch individuelle Zellen der Population von Zellen von Interesse, welche ein verbessertes Enzymprodukt herstellen, identifiziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sehen die Verfahren das Screening einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit einer verbesserten Effizienz der Herstellung eines Produkts von Interesse vor. Mit "Effizienz der Herstellung" wird gemeint, dass das Verhältnis von hergestelltem Produkt je Menge an aus dem Kulturmedium verwendeten Rohmaterial erhöht ist. In dieser Ausführungsform enthalten die Proben mindestens zwei limitierende Nährstoffe, einen ersten limitierenden Nährstoff, der das Wachstum der Subpopulation reguliert, und andere limitierende Nährstoffe, welche die Fähigkeit der Zelle, das Produkt von Interesse herzustellen, limitieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der limitierende Nährstoff, welcher die Herstellung des Produkts von Interesse beschränkt, Kohlenstoff oder Stickstoff. In dieser Ausführungsform zeigt eine erhöhte Herstellung des Produkts von Interesse eine erhöhte Effizienz der Herstellung an.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung für jedes der obenstehend beschriebenen Screening-Verfahren wird die Population von Zellen von Interesse einer Zufalls-Mutagenese oder Rekombination unterzogen, bevor man die Vielzahl von Proben erhält. Verfahren zur Zufalls-Mutagenese und Rekombination sind im Fachgebiet gut bekannt. Beispielhafte Verfahren lassen sich in Miller, J.H., A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1992), finden. Weitere Anweisungen hinsichtlich Mutagenese-Techniken lassen sich in den nachstehenden Beispielen finden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mutagenese-Vorgehensweisen vor der Suspension der Anfangspopulation durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Population von Zellen mit einem mutagenen Mittel behandelt. Viele derartige Mittel sind kommerziell erhältlich und sind dem Fachmann gut bekannt. Ein bevorzugtes mutagenes Mittel ist Ethylmethansulfonat (EMS). Im Anschluss an das Mutations/Rekombinations-Vorgehen werden die Zellen im Kulturmedium suspendiert, und die obenstehend beschriebenen Verfahren werden befolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen aufeinanderfolgenden Runden von Mutation und Wachstum unterzogen, wie hierin beschrieben. In dieser Ausführungsform werden eine oder mehrere Subpopulationen mit gewünschten Merkmalen selektiert und isoliert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie, wenn mehr als eine Subpopulation selektiert wird, vereinigt. Die selektierte Population wird dann einer Mutagenese/Rekombination unterzogen, suspendiert und kultiviert, wie in den obenstehenden Verfahren beschrieben wurde. Wie es vom Fachmann auf dem Gebiet richtig eingeschätzt werden wird, können Mutation und Screening so viele Male wiederholt werden, wie es gewünscht wird. Durch dieses Verfahren können Zellen mit noch erwünschteren Merkmalen erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Schablonenvorrichtung angewandt, um das Identifizieren und Auffinden von Subpopulationen aus der Vielzahl von Zellsubpopulationen, welche gewünschte Merkmale aufweisen, zu erleichtern. Vorzugsweise wird die Erzeugung der Schablone automatisiert, wenn Daten aus individuellen Subpopulationen gemessen und diejenigen mit wünschenswerten Merkmalen identifiziert werden. Vorzugsweise wird die Schablone physikalisch in eine Ausrichtung bzw. Parallelanordnung mit dem Aufnahmegefäß gebracht, welches die Subpopulationen enthält, wobei diejenigen Subpopulationen mit gewünschten Merkmalen wahrnehmbar gekennzeichnet werden. Bei Messung von Fluoreszenzdaten aus individuellen Subpopulationen in einer Mehrfachvertiefungsplatte wird beispielsweise eine Tabelle bzw. ein Arbeitsblatt mit den Daten erzeugt, und die Vertiefungen, welche den bevorzugten Fluoreszenz-Ausstoß aufweisen (üblicherweise den höchsten) werden identi fiziert. Eine "Picking"-Schablone, wie ein Abbild der Mehrfachvertiefungsplatte im Maßstab 1:1, welches die Lokalisierung jeder Vertiefung zeigt, wird dann so erzeugt, dass die Vertiefungen, enthaltend die Subpopulationen mit den gewünschten Merkmalen, gekennzeichnet werden. Das Überlagern der Mehrfachvertiefungsplatte auf die Schablone gestattet die einfache Identifizierung der gewünschten Populationen.
Es wird dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung ohne weiteres auf ein Hochdurchsatz-Screening-Paradigma angewandt werden können. Mit "Hochdurchsatz-Screening-Paradigma", "Hochdurchsatz-Screening" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon ist jedwede Systemauslegung zum Nachweis von Individuen bzw. Einzelfällen mit einem identifizierenden Signal oder Merkmal aus einer großen Gruppe gemeint. Hochdurchsatz-Screening ist eine übliche und sich ausbreitende Praxis auf dem Fachgebiet (de Silva et al., PNAS, USA 96(15): 8336–8337 (1999), Sandman et al., Chem. Biochem. 6(8): 541 – 551 (1999); Zlokarnik et al., Science 279(5347): 84 – 88 (1998)). Im allgemeinen wird eine Mehrzahl von Assays gleichzeitig in Hochdurchsatz-Screens durchgeführt.
Vorzugsweise werden Zellen von Subpopulationen, welche als einen Phänotyp von Interesse aufweisend identifiziert wurden, isoliert. Jegliche Anzahl von Zellen der identifizierten Subpopulation kann isoliert werden, beispielsweise durch Entnehmen eines Volumens der Probe, in welcher die Subpopulation herangezogen wurde. Die isolierten Zellen können dann unter jeglichen Bedingungen herangezogen werden, welche die Lebensfähigkeit der Zellen fördern. In einer Ausführungsform werden die Zellen als eine Anfangspopulation oder eine Komponente hiervon erneut in den Assay eingeführt, wie obenstehend beschrieben. In einer anderen Ausführungsform werden die isolierten Zellen im Zellkulturmedium herangezogen, aufweisend eine Zusammensetzung, welche von der Probe abgewandelt ist, wodurch Optimalbedingungen für die Herstellung des Produkts von Interesse identifiziert werden. In noch einer anderen Ausführungsform werden die isolierten Zellen unter Fermentierungsbedingungen von großem Maßstab in Medium mit gleicher Zusammensetzung und limitierendem Nährstoff wie die Probe, oder einer Zusammensetzung, welche eine optimierte Umgebung für die Herstellung des Produkts von Interesse vorsieht, wie eben beschrieben, herangezogen.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Anwendungsweise der obenstehend beschriebenen Erfindung vollständiger zu beschreiben, sowie die in Betracht gezogen besten Wege zur Ausführung verschiedener Aspekte der Erfindung darzulegen. Es versteht sich, dass diese Beispiele keineswegs dazu dienen, den wahrhaftigen Umfang dieser Erfindung einzuschränken, sondern eher aus Zwecken der Veranschaulichung angeboten werden.
Beispiele
Beispiel 1. Isolierung von Bacillus-Stämmen, welche eine erhöhte Menge der Protease FN4 herstellen.
Screening-Protokoll
Es sei denn, es ist anderweitig angegeben, wurden die Reagenzien von Sigma (Saint Louis, Missouri) bezogen. Das Kulturmedium bestand aus einem Minimal-MOPS-Medium mit 40 mM Glukose, 10 ppm Soytone, 5 μg/ml Chloramphenicol und 5 M Phosphat.
Die EMS-Mutagenese beinhaltete die Behandlung von 1 ml der frühen Log-Phase von OS 6.31-Zellen (OD 0,2) mit 1 % EMS während 20 Minuten bei 37 °C und 280 U/min, gefolgt von zwei 1-ml-Medium-Waschungen und 5 Stunden Wachstum in 4 ml Medium bei 37 °C und 280 U/min. 15%ige Glycerol-Stammlösungen wurden hergestellt und ihre CFU wurde durch Ausplattierung von Verdünnungsreihen auf L-Agar-Platten bestimmt.
Die folgenden Schritte wurden angewandt, um die 1536-Vertiefungs-Platten mit mutagenisierten Zellen zu befüllen. Eine 1536-Vertiefungs-Platte (# 782101, Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland) wurde umgekehrt in eine Schale eingebracht, welche eine Mischung von Medium, 43 EMS-behandelten Zellen/ml und 7,5 M Suc-Ala-Phe-AMC (Suc-Ala-Phe-7-Amino-4-methylcumarin; AMC-084, Enzyme System Products, Livermore Kalifornien) enthielt (Suspension). Die Schalen waren ausgelegt, um vier Platten zu enthalten, und sind stapelbar, weswegen mehrere Schalen auf einmal angesetzt wurden. Die Schalen wurden in eine Vakuumkammer gebracht, und die Kammer wurde auf 69 mm Hg evakuiert, an welchem Punkt das Vakuum abgelassen wurde, die Platten aus den Schalen entnommen wurden, und einzelne Platten-Deckel (# 656161, Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland) aufgesetzt wurden. Ungefähr gleiche Volumina von Suspension werden in jeder Vertiefung aufgrund des gleichmäßigen Volumens der Vertiefungen erhalten. Es wurden zwanzig 1536-Vertiefungs-Platten angesetzt und in eine befeuchtete Inkubator-Kiste bei 37 °C ohne Schütteln eingebracht.
Die resultierenden 1536-Vertiefungsplatten bestanden aus Vertiefungen mit oder ohne Zellen bei einem Verhältnis, welches von der Zell-Plattierungsdichte abhing. Die Ziel-Plattierungsdichte belief sich auf 60 % leere Vertiefungen (0,5 Zellen/Vertiefung). Die Platten wurden inkubiert, bis 10 bis 20 % des Substrats von dem Großteil der Vertiefungen mit Zellen hydrolysiert waren, typischerweise 48 Stunden. Die Hydrolyse wurde unter Verwendung einer An regung von 360 nm und einer Emission von 465 nm in einem 1536-Vertiefungs-kompatiblen Fluoreszenz-Plattenlesegerät (HTS 7000 Plus, Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut) gemessen.
Die Fluoreszenz-Rohdaten wurden in eine Tabelle übertragen (Excel, Microsoft, Redmond, Washington), worin die Daten für jede Platte zusammengefasst werden konnten, und eine Picking-Schablone wurde ausgedruckt (HP LaserJet 5 Msi, HP, Palo Alto, Kalifornien). Die Picking-Schablone half bei der raschen Isolierung von Zellen aus den am stärksten fluoreszierenden Vertiefungen. Je mehr Protease sezerniert wurde, desto größer war die Fluoreszenz. Die Schablone bestand aus einem Abbild einer 1536-Vertiefungs-Platte im Maßstab 1:1, auf welchem ausgewählte individuelle Vertiefungs-Abbilder dunkel gefärbt waren. Die dunkelgefärbten Vertiefungen entsprachen den Vertiefungen mit der höchsten Fluoreszenz auf der 1536-Vertiefungs-Platte. Nach Ausrichtung einer Platte auf der Oberseite dieses Abbilds erschienen die Vertiefungen mit einer Spitzenfluoreszenz dunkel, wenn sie von oben betrachtet wurden. Die dunkelgefärbten Vertiefungen steuerten die Einführung einer Pipettenspitze, welche 5 μl Kultur entnahm.
Die Kultur wurde dann in eine Vertiefung einer 96-Vertiefungs-Platte überführt, enthaltend 100 μl an 100 mM Tris 8,6 und 0,005 % TWEEN-80. Nachdem die fünf Vertiefungen mit der höchsten Fluoreszenz jeder 1536-Verfiefungs-Platte in individuelle Vertiefungen aliquotiert worden waren, wurden 100 μl 2 mg/ml Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Paranitroanalid; PNA-85, Enzyme System Products, Livermore, California), 100 mM Tris 8,6 und 0,005 % TWEEN-80 in jede Vertiefung der 96-Vertiefungs-Platte zugegeben. Die Rate für die Paranitroanalid-Bildung wurde im Anschluss an die Erhöhung der 410-nm-Extinktion in einer 96-Vertiefungs-Plattenlesevorrichtung (Spectra Max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, California) gemessen. Die Ratenmessung erleichterte die Isolierung von Spitzenhersteller-Vertiefungen durch Vermindern des Hintergrundrauschens des ersten Screens und Bestätigung der Enzymspezifität.
Die Kulturen mit der höchsten Rate aus dem Screen werden vereinigt und kreislaufartig einer weiteren Runde von EMS und Screening unterzogen.
Tabelle 1. Rate der AMC-Hydrolyse im Anschluss an aufeinanderfolgende Runden der gerichteten Evolution.
Beispiel 2 Isolierung einer Mutante mit erhöhter spezifischer Aktivität.
Das Gen, codierend die Protease FN4 und ihr Signal- und Propeptid, wurde mutagenisiert. Das gleiche Screening, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde angewandt. Es wurde eine Variante isoliert, welche 50 % spezifische Aktivität auf das Substrat Suc-AAPF-pNA aufwies, welche für das zweite Screening verwendet wurde.
Beispiel 3 Isolierung einer Mutante, welche erhöhte Mengen einer Verbindung von Interesse erzeugt.
Ein Produktions-Zellstamm wird einer Zufalls-Mutagenese zur Erzeugung einer Anfangspopulation von Mutanten unterzogen. Die Zellen werden in einem Medium suspendiert, welches limitierende Konzentrationen an Phosphat enthält. Darüber hinaus enthält das Medium einen niedermolekulargewichtigen Liganden, welcher fluoreszierend ist und an eine von den Zellen hergestellte Verbindung von Interesse bindet. Die Suspension wird in 1536-Vertiefungs-Platten verteilt und inkubiert. An einem oder mehreren Zeitpunkten, nachdem die Kulturen die stationäre Phase erreichen, wird die Fluoreszenz-Polarisation gemessen. Der Ligand in dem Medium bindet an die hergestellte Verbindung von Interesse, was zu einer veränderten Fluoreszenz-Polarisation fuhrt. Mutanten, welche erhöhte Mengen der Verbindung von Interesse herstellten, können basierend auf dem gemessenen Polarisationssignal identifiziert werden.
Beispiel 4 Isolierung einer Mutante, welche eine erhöhte Menge an Phytase herstellt.
Ein Phytase-herstellender Zellstamm wird einer Zufalls-Mutagenese unterzogen, um eine Anfangspopulation von Mutanten zu erzeugen. Die Zellen werden in Medium suspendiert, welches limitierende Konzentrationen an Phosphat und Phytat enthält. Die Suspension wird in 1536-Vertiefungs-Platten verteilt und inkubiert. Zellen, welche erhöhte Mengen an Phytase herstellen, sind in der Lage, das Phytat im Kulturmedium als eine Quelle für Phosphat zu verwerten, und liegen bei einer erhöhten Rate vor. Solche Subpopulationen können basierend auf ihrer erhöhten optischen Dichte identifiziert werden. Um die Detektion zu verstärken, wird ein Gen, codierend ein fluoreszierendes Produkt (wie grünes fluoreszierendes Protein aus Aequoria victoria), in die Zellen kloniert, und die Dichte einer Subpopulation wird basierend auf der Fluoreszenz gemessen.

Claims

Verfahren zur Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen mit einer ähnlichen Dichte, umfassend das Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus einer Anfangspopulation von Zellen, wobei die Proben mindestens einen limitierenden Nährstoff enthalten, wodurch die Maximumzelldichte, zu der die Zellen wachsen können, so reguliert wird, dass eine Vielzahl von Populationen von Zellen mit einer ähnlichen Dichte erhalten wird.
Verfahren von Anspruch 1, worin die Zellen der Anfangspopulation aus einer einzelnen Population von Zellen stammen.
Verfahren von Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin: (a) die Anfangspopulation von Zellen eine Population eines einzigen Organismentyps ist; oder (b) die Anfangspopulation von Zellen aus einer Zelllinie stammt; oder (c) die Anfangspopulation eine Population von vereinigten Zellen ist.
Verfahren von mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Proben statistisch aus der Zellsuspension entnommen werden.
Verfahren von mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Inokulationsdichte der Proben geringer als 1,4 Zellen je Probe ist, oder die Inokulationsdichte geringer als 0,5 Zellen je Probe ist.
Verfahren von mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, worin jede der Proben anfänglich drei Zellen oder weniger umfasst, oder jede der Proben anfänglich 5–5000 Zellen umfasst.
Verfahren von mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Inokulation der Proben durch statistische Verdünnung erfolgt und/oder die Inokulation der Proben durch Kolonie-Picken erfolgt und/oder die Inokulation der Proben durch Einbringen individuell isolierter Zellen in jede der Proben erfolgt.
Verfahren von mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, worin jeder des mindestens einen limitierenden Nährstoffs aus der Gruppe gewählt ist/sind, bestehend aus Phosphat, Magnesium, Stickstoff, Kohlenstoff und Schwefel.
Verfahren von mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Kultivierung in einem Aufnahmegefäß oder einer Form erfolgt, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer oder mehreren Mehrfachvertiefungsplatten, Ultrahochdichte-Platten, Kapillar-Arrays, Kapillarenbündeln, mikrogefertigten Kanälen, Platten mit Durchbohrungen, Vesikeln, CD-artigen Scheiben und gesprühten Tröpfchen.
Verfahren zum Screening einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit einem Phänotyp von Interesse, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen mit einer ähnlichen Dichte aus der Population von Zellen von Interesse durch Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus der Population von Zellen von Interesse, wobei die Proben mindestens einen limitierenden Nährstoff enthalten, wodurch die Maximum-Zelldichte, zu welcher die Zellen heranwachsen können, reguliert wird; und (b) Identifizieren von Subpopulationen der Vielzahl von Subpopulationen, welche einen Phänotyp von Interesse aufweisen.
Verfahren zum Screening einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich des Aufweisens eines Phänotyps von Interesse, wobei es sich bei dem Phänotyp um die verbesserte Herstellung von einem oder mehreren Produkten von Interesse handelt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen mit einer ähnlichen Dichte aus der Population von Zellen von Interesse durch Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus der Population von Zellen von Interesse, wobei die Proben mindestens einen limitierenden Nährstoff enthalten, wodurch die Maximum-Zelldichte, zu der die Zellen heranwachsen können, reguliert wird; und (b) Messen der Menge von jedem der Produkte von Interesse, hergestellt in jeder der Vielzahl von Subpopulationen von Zellen, wodurch Zellen der Population von Zellen von Interesse mit einer verbesserten Herstellung der Produktes) identifiziert werden.
Verfahren von Anspruch 11, wobei: (a) die verbesserte Herstellung während der stationären Phase erfolgt; oder (b) die verbesserte Herstellung eine erhöhte Gesamtherstellung oder eine erhöhte Herstellung über die Zeit ist; oder (c) die verbesserte Herstellung eine verminderte Gesamtherstellung oder eine verminderte Herstellung über die Zeit ist; oder (d) die verbesserte Herstellung eine erhöhte Herstellung eines ersten Produktes von Interesse und/oder eine verminderte Herstellung anderer Produkte von Interesse ist.
Verfahren von Anspruch 12(d), worin die anderen Produkte von Interesse gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Parallelprodukten von metabolischen Vorläufern des ersten Produktes von Interesse, Proteanen und Proteinen, welche von dem ersten Produkt von Interesse verschieden sind.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das eine oder die mehreren Produkte von Interesse jeweils gewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzym, einem Nicht-Enzym-Protein, Enzym-Produkt, einer Nukleinsäure und einem Kohlenhydrat.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 11 bis 14, worin das Messen durch Messen der Menge der Aktivität des Produktes in jeder der Vielzahl von Populationen von Zellen erfolgt.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die Proben eine oder mehrere Substanzen enthalten oder zu ihnen zugesetzt aufweisen, welche das Vorhandensein des einen oder der mehreren Produkte von Interesse nachweisen.
Verfahren von Anspruch 16, worin: (a) mindestens eine der einen oder mehreren Substanzen ein Substrat für jedes des einen oder der mehreren Produkte von Interesse ist/sind; oder (b) mindestens eines des einen oder der mehreren Substrate ein Ligand für jedes des einen oder der mehreren Produkte von Interesse ist/sind.
Verfahren von Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei die eine oder mehreren Substanzen fluorogen und/oder chromogen ist/sind.
Verfahren von Anspruch 18, wobei das Messen durch Messen der Lumineszenz und/oder durch das Verfahren der Fluoreszenzpolarisation und/oder durch Densitometrie erfolgt.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 11 bis 19, worin mindestens ein limitierender Nährstoff für die Herstellung des Produktes nicht erforderlich ist.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 11 bis 20, worin das Messen an mehr als einem Zeitpunkt vorgenommen wird.
Verfahren zum Screenen einer Population von Interesse hinsichtlich Zellen mit einem Phänotyp von Interesse, wobei es sich bei dem Phänotyp um die Herstellung eines Produktes von Interesse mit verbesserter Aktivität handelt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen aus der Population von Zellen von Interesse, welche eine ähnliche Dichte aufweisen, durch Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus der Population von Zellen von Interesse, wobei die Proben mindestens einen limitierenden Nährstoff enthalten, wodurch die Maximum-Zelldichte, zu der die Zellen heranwachsen können, reguliert wird; und (b) Messen der Aktivität des Produktes, hergestellt in jeder der Subpopulationen von Zellen, wodurch die relative Aktivität des von Zellen der Population von Zellen von Interesse hergestellten Produktes bestimmt wird.
Verfahren von Anspruch 22, wobei: (a) das verbesserte Produkt von Interesse erhöhte Aktivität gegenüber einem verbesserten Produkt von Interesse aufweist; und/oder (b) die Proben eine oder mehrere Substanzen enthalten oder dazu zugegeben aufweisen, welche das Vorhandensein des Produktes nachweisen.
Verfahren von Anspruch 23, wobei die eine oder mehreren Substanzen ein Substrat für das Produkt ist/sind.
Verfahren von Anspruch 24, wobei die Proben mehr als ein Substrat des Produktes enthalten oder zu sich zugesetzt aufweisen.
Verfahren zum Screenen einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit einem Phänotyp von Interesse, wobei es sich bei dem Phänotyp um die Herstellung eines Produktes von Interesse in individuellen Zellen der Population mit veränderter Selektivität für Substrate des Produktes handelt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen aus der Population von Zellen von Interesse, welche eine ähnliche Dichte aufweisen, durch Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus der Population von Zellen von Interesse, wobei die Proben mindestens einen limitierenden Nährstoff enthalten, wodurch die Maximum-Zelldichte, zu der die Zellen heranwachsen können, reguliert wird, und wobei die Proben, gemeinsam oder aufeinanderfolgend, zwei oder mehrere verschiedene Substrate für das Produkt von Interesse enthalten oder zu ihnen zugesetzt aufweisen; und (b) Messen der Aktivität des Produktes auf jedes der Substrate in jeder der Subpopulationen von Zellen, wodurch eine veränderte Selektivität für Substrate des Produktes von Interesse, hergestellt in individuellen Zellen der Population von Zellen von Interesse, bestimmt wird.
Verfahren von Anspruch 26, worin die zwei oder mehreren verschiedenen Substrate fluorogen sind.
Verfahren von Anspruch 26 oder Anspruch 27, wobei die fluorogenen Substrate voneinander unterscheidbar und unabhängig messbar sind.
Verfahren zum Screenen einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich des Aufweisens eines Phänotyps von Interesse, wobei es sich bei dem Phänotyp um die Herstellung eines Produktes von Interesse mit erhöhter Stabilität handelt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen mit einer ähnlichen Dichte aus der Population von Zellen von Interesse durch Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus der Population von Zellen von Interesse, wobei die Proben mindestens einen limitierenden Nährstoff enthalten, wodurch die Maximum-Zelldichte, zu der die Zellen heranwachsen können, reguliert wird; und (b) Messen der Menge oder Aktivität des Produktes, hergestellt in jeder der Subpopulationen von Zellen unter einer oder mehreren nicht-optimalen Bedingungen, in jeder der Subpopulationen von Zellen unter einer oder mehreren nicht-optimalen Bedingungen für die Stabilität eines nicht-verbesserten Produktes von Interesse, wodurch die Stabilität des Produktes, hergestellt von individuellen Zellen der Population von Zellen von Interesse, bestimmt wird.
Verfahren von Anspruch 29, wobei: (a) die Bedingungen gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Temperatur, pH, Konzentration eines oder mehrerer gelöster Stoffe, Gegenwart einer oder mehrerer Proteasen, Gegenwart eines oder mehrerer Detergentien und Gegenwart eines oder mehrerer Lösungsmittel; und/oder (b) das Messen an mehr als einem Zeitpunkt vorgenommen wird.
Verfahren zum Screenen einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit einem Phänotyp von Interesse, wobei es sich bei dem Phänotyp um die verbesserte Effizienz der Herstellung eines Produktes von Interesse handelt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen mit einer ähnlichen Dichte aus der Population von Zellen von Interesse durch Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus der Population von Zellen von Interesse, wobei die Proben mindestens zwei limitierende Nährstoffe enthalten, wobei die Maximum-Zelldichte, zu der die Zellen heranwachsen können, durch einen ersten limitierenden Nährstoff reguliert wird, und alle anderen limitierenden Nährstoffe die Fähigkeit der Subpopulationen, das Produkt herzustellen, beschränken; und (b) Messen der Menge des Produktes, hergestellt in jeder der Vielzahl von Populationen von Zellen, wodurch die relative Herstellung des Produktes durch Zellen der Population von Zellen von Interesse bestimmt wird.
Verfahren von Anspruch 31, wobei: (a) der andere limitierende Nährstoffe) gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff und Stickstoff; und/oder (b) das Messen durch Messung der Aktivität des Produktes von Interesse erfolgt.
Verfahren zum Screenen einer Population von Zellen von Interesse hinsichtlich Zellen mit einem Phänotyp von Interesse, wobei es sich bei dem Phänotyp um die verbesserte Herstellung eines Produktes von Interesse handelt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Vielzahl von Subpopulationen von Zellen aus der Population von Zellen von Interesse durch Kultivieren einer Vielzahl von Proben aus der Population von Zellen von Interesse, wobei die Proben einen ersten limitierenden Nährstoff, der das Zell-Wachstum reguliert, und mindestens einen zweiten limitierenden Nährstoff enthalten, welcher derselbe ist wie der erste limitierende Nährstoff, jedoch in einer solchen Form, dass er ein Substrat für das Produkt von Interesse ist und nicht als ein Nährstoff verfügbar ist, außer er wird mit dem Produkt von Interesse umgesetzt; und (b) Messen der Zelldichte von jeder der Subpopulationen, wobei eine höhere Zelldichte eine größere Herstellung des Produktes von Interesse zeigt.
Verfahren von Anspruch 33, wobei das Messen durch Messen der optischen Dichte oder Fluoreszenz eines fluoreszierenden Produktes, hergestellt von den Subpopulationen, erfolgt.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 11 bis 34, ferner umfassend, vor dem Schritt (a), den Schritt des: Unterziehens der Population von Zellen von Interesse unter eine statistische Mutagenese oder Rekombination.
Verfahren von Anspruch 35, wobei das Unterziehen durch Aussetzen an ein mutagenes Mittel erfolgt.
Verfahren von Anspruch 36, wobei das mutagene Mittel EMS ist.
Verfahren von Anspruch 35, wobei die Schritte anschließend unter Verwendung einer oder mehrerer Subpopulationen, identifiziert in der vorangehend erhaltenen Vielzahl von Subpopulationen, als der Zellpopulation von Interesse wiederholt werden.
Verfahren von Anspruch 38, wobei, wenn mehr als eine Subpopulation aus der vorangehend erhaltenen Vielzahl von Subpopulationen verwendet wird, diese Subpopulationen vereinigt werden, um die Population von Interesse für das anschließende Screening herzustellen.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 11 bis 39, wobei das Screenen in einem Hochdurchsatz-Screening-Paradigma durchgeführt wird.