DE60305476T2

DE60305476T2 - Wachstumsmedium für mikroorganismen umfassend die biomasse von methanotrophen und heterotrophen bakterien

Info

Publication number: DE60305476T2
Application number: DE60305476T
Authority: DE
Inventors: c/o Norferm DA Einar MOEN; c/o Norferm Danmark A/S Jeanette M. JORGENSEN; c/o Norferm Danmark A/S Karen M. JENSEN; c/o Norferm DA Arild JOHANNESSEN
Original assignee: Norferm DA
Current assignee: Equinor ASA
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2023-04-18
Also published as: WO2003089625A2; US20090186397A1; US7799550B2; RU2004133807A; NO20045022L; JP2005523021A; WO2003089625A3; BR0309347A; ATE327319T1; EP1497409A2; CN100532539C; GB0209007D0; IL164517A; DE60305476D1; NO331278B1; CA2481400C; CA2481400A1; RU2343192C2; US8592198B2; AU2003262372B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung als ein Wachstumssubstrat für Mikroorganismen aus einer bakteriellen Biomasse, insbesondere eine Biomasse, die hierin als „Bakterienextrakt" bezeichnet wird, die wenigstens zum Teil aus einer Bakterienkultur stammt, umfassend ein methanotrophes und ein heterotrophes Bakterium.
Mikroorganismen werden häufig in kommerziellem und im Labormaßstab herangezogen, zum Beispiel um gewünschte Substanzen aus Bakterienstämmen herzustellen, die entweder solche Substanzen natürlicherweise produzieren oder die genetisch modifiziert worden sind, um solche Substanzen zu produzieren, oder um die Art einer bakteriellen Kontamination zu beenden, ect. Für diese Zwecke benötigen die Mikroorganismen Nährstoffe und in diesem Bezug ist es üblich Hefe-, Fleisch- oder Pflanzenextrakte zu verwenden, die weitgehend kommerziell erhältlich sind, zum Beispiel MRS (De Mann, Rogosa und Sharpe), PCA (Plate Count Agar), VRBD (Violet Red Bile Dextrose Agar), YM-Agar (Yeast Mould Agar), Baired-Parker Agar Base, VRB-Agar (Violet Red Bile Agar), XLD-Agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar), CASO (Caseinpepton Sojapepton), TBS (Tryptic Soy Broth) und NB (Nutrient Broth). Hefeextrakt-Wachstumssubstrate (enthalten zum Beispiel in MRS, VRBD, VRB-Agar, PCA, Baired-Parker Agar Base und XLD Agar) sind unter anderem kommerziell von Merck und Difco erhältlich. Solche Hefeextrakte werden üblicherweise unter Verwendung von Biomasse aus Hefekulturen hergestellt, welchen eine Autolyse ermöglicht wurde, dass heißt es wirken Enzyme die natürlicherweise in den Hefezellen vorkommen wirken um die Zellwand nach dem Zelltod abzubauen. Die Autolyse von Hefezellen ist im Allgemeinen langsam und es können mehrere Tage benötigt werden bevor ein geeigneter Verdauungsgrad erreicht ist. Dementsprechend werden im Allgemeinen Additive verwendet, die als Autolyseinitiatoren oder -stimulatoren wirken, zum Beispiel Thiolmittel, um den Autolyseprozess zu beschleunigen. Die Verwendung von solchen Additiven trägt natürlich zu den Kosten der kommerziellen Herstellung von Hefeautolysaten bei. Zu den resultierenden Autolysaten können extra Nährstoffe zugesetzt werden, um das Zellwachstum für bestimmte Mikroorganismen zu optimieren und tatsächlich spezifizieren Bibliotheksregister für Mikroorganismen im Allgemeinen welches Wachstumsmedium für den registrierten Stamm am besten geeignet ist. DD 290 917 offenbart die Verwendung von Biomasse von methanotrophen Bakterien als Nährstoffzusammensetzung zur Kultivierung von Bakterien.
Da verschiedene Mikroorganismen verschiedene Nährstoffbedürfnisse haben, gibt es natürlich einen anhaltenden Bedarf für alternative und verbesserte Mikroorganismenwachstumsmedien, insbesondere für Wachstumsmedien, die für das heranziehen jener Mikroorganismen wirksam sind, deren Heranzucht in vitro eine Herausforderung ist (zum Beispiel Lactobacilli), und für „Breitband"-Medien, die für die Verwendung von unbekannten Mikroorganismen geeignet sind.
Wir haben nun überraschenderweise herausgefunden, dass besonders wirkungsvolle Mikroorganismenwachstumsmedien unter Verwendung der Biomasse hergestellt werden, die aus einem Kulturmedium geerntet wird, das methanotrophe und heterotrophe Bakterien umfasst, wie die zum Beispiel in WO 01/60974 beschriebene hergestellte Biomasse.
Von einer Seite betrachtet stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer sterilen Nährstoffzusammensetzung als ein Mikroorganismenwachstumsmedium bereit, die aus der Biomasse einer Bakterienkultur erlangt wird, die methanotrophe und heterotrophe Bakterien einschließt, und optional weitere Nährstoffe enthält.
Die Bakterienkultur, die verwendet wird, um die Biomasse herzustellen, beträgt wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 75%, zum Beispiel 75 bis 95%, besonders vorzugsweise 75 bis 80%, bezogen auf das Gewicht methanotropher Bakterien (relativ zu dem Gesamtbakteriengewicht).
Von einer anderen Seite betrachtet stellt die Erfindung ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen bereit, welches dafür das Zusammenbringen eines Mikroorganismus und eines Wachstumsmediums umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Wachstumsmedium eine sterile Nährstoffzusammensetzung ist oder daraus hergestellt ist, die aus der Biomasse einer Bakterienkultur stammt, die methanotrophe und heterotrophe Bakterien einschließt, optional mit der Zugabe weiterer Nährstoffe.
Von einer noch anderen Seite betrachtet stellt die Erfindung ein Mikroorganismenwachstumssubstrat bereit, umfassend eine sterile Nährstoffzusammensetzung, die aus der Biomasse einer Bakterienkultur erlangt wird, die methanotrophe und heterotrophe Bakterien einschließt, die ferner wenigstens einen sterilen Nährstoff und optional ein Verdünnungsmittel enthält.
Die Biomasse, aus welcher der Wachstumsmedium oder das Substrat hergestellt werden, ist eine Biomasse, die aus wenigstens einer Spezies methanotropher Bakterien und wenigstens einer Spezies heterotropher Bakterien erzeugt wird, vorzugsweise in demselben Kulturmedium herangewachsen, zum Beispiel unter Verwendung eines Schleifenreaktors, bereitgestellt mit Methan, Sauerstoff, Ammoniak und Mineralnährstoffen. Geeignete Kombinationen von Bakterien zu Bildung der Biomasse sind zum Beispiel in WO 01/60974 beschrieben, dessen Inhalte mittels der Referenz umfasst sind. Eine besonders geeignete Kombination ist Methylococcus capsulatus (Bath) (Stamm NCIMB 11132), Ralstonia sp. DB3 (Stamm NCIMB 13287), Aneurinibacillus sp. DB4 (Stamm NCIMB 13288) und Brevibacillus agri DBS (Stamm NCIMB 13289) (jeder dieser Mikroorganismen ist von Norferm DA, Norwegen, für die Laufzeit dieses Patentes erhältlich).
Die Biomasse aus der Bakterienkultur kann direkt verwendet werden (obwohl im Allgemeinen nach der Entwässerung und der Sterilisation) oder sie kann erst prozessiert werden, um die Bakterienzellen abzubauen, zum Beispiel durch Homogenisierung, Hydrolyse oder Autolyse. Solche Behandlungen sind in WO 01/60974 und den internationalen Patentanmeldungen Nummern PCT/GB03/000610 und PCT/GB03/000640 beschrieben, angemeldet am 12. Februar 2003, deren Inhalte hierin auch mittels der Referenz umfasst sind. Während das Homogenisat, Hydrolysat und Autolysat, vorzugsweise getrocknetes Homogenisat und besonders vorzugsweise getrocknetes Autolysat der Bakterienbiomasse die bevorzugten Materialien zu Herstellung der Mikroorganismenwachstumsmedien sind, können auch gemäß der Erfindung Vorläufermaterialien verwendet werden, die durch Filtration (zum Beispiel Ultrafiltration) der homogenisierten, autolysierten oder hydrolysierten Biomasse erhalten werden, da s heißt das flüssige Filtrat selbst und das Retentat.
Das Mikroorganismenwachstumsmedium kann das Produkt der bakteriellen Biomasse selbst sein oder eine Zusammensetzung, die das Produkt der Biomasse und weitere Bestandteile, wie zum Beispiel einen flüssigen oder nicht flüssigen Träger oder Verdünnungsmittel (wie Wasser, Gel (zum Beispiel Agargel) oder eine gelbildende Flüssigkeit) und Materialien wie Mineralien, Kohlenstoffquellen (wie Saccharide (zum Beispiel Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, vorzugsweise Mono- und Disaccharide)), Stickstoffquellen (zum Beispiel Nitrate, Proteine oder Proteinfragmente, Ammoniumverbindungen, Oligopeptide, Aminosäuren (vorzugsweise essentielle Aminosäuren, zum Beispiel Tryptophan)), Nukleinsäuren und Nukleinsäurefragmente, Lipide, ect. Besonders vorzugsweise enthält das Medium Glukose und zugegebene Nitrat- und Mineralsalze (zum Beispiel Verbindungen aus Kalium, Kalzium, Magnesium, Natrium, Molybdän, Eisen, Zink, Bor, Kobalt, Mangan und Nickel), vorzugsweise Glukose. Die Zusammensetzung, so wie sie bereitgestellt ist, kann ein steriler Feststoff sein (zum Beispiel partikulär), ein halbfester Stoff oder eine Flüssigkeit in einer gebrauchsfertigen oder konzentrierten Form. Besonders vorzugsweise ist die Zusammensetzung, so wie sie bereitgestellt ist, ein steriles trockenes partikuläres Konzentrat, das durch die Zugabe von Wasser oder einem wässerigen gelbildenden Mittelzusammensetzung in ein Wachstumsmedium umgewandelt werden kann.
Wo die Zusammensetzung zugegebene Glukose enthält, ist dies vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis auf Basis der Trockenmasse von 5:1 bis 1:5 (vorzugsweise 2:1 bis 1:2) relativ zu dem aus Biomasse erhaltenen Bestandteil. Wo die Zusammensetzung zugegebene Nitrat- und Mineralsalze enthält ist dies vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis von 0,01:1 bis 0,2:1 (vorzugsweise 0,05:1 bis 0,1:1) relativ zu dem aus Biomasse erhaltenen Bestandteil. Wo die Zusammensetzung, wie sie bereitgestellt ist, keine zugegebene Glukose und/oder Nitrat- und Mineralsalze enthält, wird es bevorzugt, dass die Herstellung des Wachstumsmediums die Zugabe von einer oder beiden solchen Bestandteilen in den oben ausgeführten Gewichtsverhältnissen involviert.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind insbesondere für die Verwendung als Wachstumssubstrate für heterotrophe Mikroorganismen geeignet, vorzugsweise Algen, Hefe oder Bakterien, vorzugsweise anaerobe Bakterien wie Lactobacilli (zum Beispiel L. plantarum, L. acidophilus), aerobe Bakterien wie E. coli und Algen wie Crypthecodinium cohnii.
Die Erfindung wird nun ferner in Bezug auf die folgenden nicht einschränkenden Beispiele und die begleitenden Figuren dargelegt werden, in welchen:
1 die Ergebnisse der Fermentationsuntersuchungen in einem Fermenter mit A) L. acidophilus und B) L. plantarum auf MRS (-) und auf BP-Autolysat (...) dargelegt.
2 illustriert die Daten aus E. coli-Fermentationsuntersuchungen auf Hefeextrakt, BP-Extrakt und BP-Autolysat.
3 illustriert die Lysinherstellung in verschiedenen Fermentationen als eine Funktion der Zeit und des Typs und der Menge einer zugegebenen komplexen N-Quelle.
Beispiel 1
Biomasseextrakte
Methanotrophe und heterotrophe Bakterien (Methylococcus capsulatus (Bath) (Stamm NCIMB 11132), Ralstonia sp. DB3 (Stamm NCIMB 13287), Aneurinibacillus sp. DB4 (Stamm NCIMB 13288) und Brevibacillus agri DBS (Stamm NCIMB 13289), jeweils erhältlich von Norferm DA, Norwegen) wurden wie in WO 01/60974 beschrieben kultiviert und die resultierende Biomasse geerntet und wie in WO 01/60974 beschrieben behandelt, um ein sprühgetrocknetes Homogenisat herzustellen (nachstehend als „BP-Homogenisat) bezeichnet), wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB03/000610 beschrieben, um ein sprühgetrocknetes Hydrolysat (nachstehend als „BP-Hydrolysat" bezeichnet) herzustellen, und wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB03/000640 (siehe zum Beispiel Beispiel 1) beschrieben ein Autolysat (nachstehend als „BP-Extrakt" bezeichnet) herzustellen. Dort wo die Ultrafiltrations- und Evaporationsschritte nach der Autolyse bei der Herstellung des „BP-Extrakts" weggelassen werden, wird das Produkt hierin als „BP-Autolysat" bezeichnet. Die Herstellung eines solchen Produkts ist zum Beispiel in den Beispielen 3 und 4 der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB03/000640 beschrieben. Das Produkt, das als „BP-Retentat" bezeichnet wird, ist eine mit Ultrahochtemperatur behandelte Biomasse, die homogenisiert wurde. Das Produkt, das als „BP-Permeat" bezeichnet wird, entspricht im Wesentlichen dem Produkt des Ultrafiltrationsschritts bei der Herstellung des „BP-Extrakts".
Alle oben beschriebenen Materialien sind von Norferm DA, Norwegen, erhältlich.
Die Mikroorganismenwachstumsmedien wurden durch die Zugabe des BP-Homogenisats, BP-Autolysats, BP-Extrakts, BP-Retentat und des BP-Permeats zu demineralisiertem Wasser mit einer Konzentration von 1 g/l hergestellt. Diese Medien wurden dann entweder direkt verwendet oder mit der Zugabe von 0,1 g/l Glukose und/oder 32,4 ml/l Nitratmineralsalzmedium (NMS).
NMS umfasst:
1,0 g KNO₃
0,2 g CaCl₂·2H₂O
1,0 g MgSO₄·7H₂O
0,1 ml Spurenelementlösung*
0,1 ml Natrium-Molybdat-Lösung (5 g/l NaMoO₄·2H₂O in demineralisiertem Wasser)
0,1 ml EDTA-Lösung (45 g/l FeNaEDTA·2H₂O in Wasser) Wasser – auf 1 Liter
10 ml/l sterilen Phosphatpuffer (35,6 g Na₂HPO₄·2H₂O, 26,0 g KH₂PO₄ und Wasser auf 1 Liter) wurden zugegeben.
*6,4 g ZnSO₄·7H₂O
150 mg H₃BO₃
600 mg CoSO₄·7H₂O
130 mg MnCl₂
100 mg NiCl₂·6H₂O
demineralisiertes Wasser – auf 1 Liter
Alle Medien wurden vor der Verwendung autoklaviert.
Es wurde auch ein Mikroorganismenwachstumsmedium auf Agarbasis hergestellt, umfassend:
32,2 g/l BP-Extrakt
20,0 g/l Glukose
34 ml/l NMS-Medium
14,0 g/l Agar
demineralisiertes Wasser auf 1 Liter
Dies wurde vor der Verwendung autoklaviert.
Beispiel 2
Test für das Wachstum von Mikroorganismen
Es wurden anaerobe und aerobe, Gram-positive und Gram-negative Bakterien in einem Schüttelkolben unter Verwendung der flüssigen Wachstumsmedien aus Beispiel 1 herangezogen und als Kontrollen wurden Wachstumsmedien, die für die Bakterienstämme empfohlen werden, verwendet. Die optische Dichte der Kulturen wurde als ein Indikator für das erhaltene bakterielle Wachstum überwacht (dass heißt das „Plateau" oder die stationäre Phase mit der höchsten Anzahl Zellen). Die Resultate sind in Tabelle 1 unten dargelegt.
Tabelle 1

---: Keine der Kombinationen aus dem BP-Derivat war besser als das Kontrollsubstrat.
+: Einige der Kombinationen aus dem BP-Derivat waren genauso gut wie das Kontrollsubstrat.
+++: Einige der Kombinationen aus dem BP-Derivat waren deutlich besser als das Kontrollsubstrat.

Für E. coli stellte der BP-Extrakt mit zugegebener Glukose eindeutig das beste Wachstum bereit. Für L. plantarum ergaben alle Kombinationen des BP-Extrakts eindeutig das beste Wachstum. Für P. aeruginosa ergaben alle Kombinationen des BP-Extrakts das beste Wachstum, insbesondere der BP-Extrakt mit der zugegebenen Glukose. Für B. subtilis ergaben der BP-Extrakt mit der zugegebenen Glukose und sowohl zugegebener Glukose als auch NMS eindeutig das beste Wachstum.
Beispiel 3
Überlebensfähigkeit unbekannter Bakterien
Auf Agargelen (PCA, MRS-Agar und BP-Extrakt mit Agar (Beispiel 1) pH 6,0 und 7,1) wurden unbekannte Mikroorganismen ausplattiert, die einer Probe Hackfleisch entnommen wurden. Die Kulturen wurden für 72 Stunden bei 25°C inkubiert und die Zähler der gesamten Platte erfasst. Für den BP-Extrakt war der log (CFU/g) zwischen 5 und etwa 6,6, während er für das MRS weniger als 1 war. Für den PCA war der log (CFU/g) etwa 6,7, dass heißt kaum höher.
Beispiel 4
Lactobacillus-Überlebensfähigkeit
Die Lactobacillusstämme L. casei ssp. rhamnosus (Stamm ATCC 7469), L delbruekii ssp. lactis (Stamm ATCC 7830), L. fermentum (Stamm CCUG 30138), L. gasseri (Stamm ATCC 19992) und L. plantarum (Stamm ATCC 8014) wurden unter aeroben Bedingungen auf MRS-Agar und BP-Extrakt-Agar (Beispiel 1) herangezogen. In allen Fällen war die Lebensfähigkeit, gemessen als log (CFU/ml), für den BP-Extrakt dieselbe oder größer. Dies war am eindeutigsten für L. delbruekii. Dieselben Stämme wurden auch auf diesen Medien unter anaeroben Bedingungen herangezogen und wiederum war die Überlebensfähigkeit in allen Fällen für den BP-Extrakt dieselbe oder besser.
Beispiel 5
Herstellung von poly-ungesättigten Fettsäuren
Es wurde Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky (Stamm ATCC 30772) auf Kulturmedium herangezogen, umfassend 9 g/l Glukose, 25 g/l Mehrsalz und 2 g/l entweder Hefeextrakt (YE für Englisch: yeast extrakt) oder BP-Extrakt in demineralisiertem Wasser. Nach zwei Tagen Inkubation wurden die Zellen geerntet und der Gesamtfettsäuregehalt, das Zelltrockengewicht (CDW für Englisch: cell dry weight) und der 22:6 (Docosahexaensäure)-Gehalt bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 2 unten dargelegt.
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt, dass das CDW und der Prozentsatz der poly-ungesättigten Fettsäure 22:6 höher war, wenn der BP-Extrakt verwendet wurde.
Beispiel 6
Wachstum von Lactobacillus in Medien, die BP-Autolysat enthielten
Das Wachstum der Lactobacillus-Stämme L. plantarum und L. acidophilus auf Medien mit komplexen Bestandteilen, ersetzt durch BP- Autolysat (Beispiel 1), wurde verglichen mit dem Wachstum unter Verwendung von Standard-MRS-Medien in Kolben und in Fermentationen.
Experimente in Kolben
Es wurde Lactobacillus in anaeroben Kolben herangezogen, um die Eigenschaften des BP-Autolysats mit denen der existierenden Produkte auf dem Markt verglichen. Die komplexen Bestandteile in den MRS-Medien (siehe Tabelle 3) wurden durch das BP-Autolysat entsprechend Tabelle 4 ersetzt, sodass der Gesamtstickstoffgehalt konstant gehalten wurde.
Tabelle 3: Gesamtstickstoff (%) in den Komplexmedien-Bestandteilen
Tabelle 4: Komplexmedien-Bestandteile
Experimente im Fermenter:
Es wurden zwei Fermentationen an jedem Stamm durchgeführt; eine mit Standardmedien, MRS, und eine, in welcher die komplexen Bestandteile in dem MRS durch das BP-Autolysat ersetzt worden sind (Medien CA-4 in dem Kolben-Experiment).
Verfahren für die Experimente, die in anaeroben Kolben durchgeführt wurden:
Inokulum: Es wurden 1 ml Animpfvolumen von L. plantarum und L. acidophilus verwendet, um 80 ml MRS-broth (Oxoid) zu inokulieren und bei 37°C für 20 h inkubiert. Für den Stamm L. acidophilus wurde das MRS-broth auf einen pH 5,5 eingestellt.
Kultivierungsbedingungen: Die Komplexmediensubstrate wurden entsprechend Tabelle 4 verwendet, während die andern Medienbestandteile konstant gehalten wurden (Tabelle 5). Alle Bestandteile, mit Ausnahme der Glukose, wurden vermischt, der pH-Wert auf 6,0 beziehungsweise 5,5 eingestellt und bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Die Glukose wurde getrennt autoklaviert. Die Kolben wurden vor der Inokulation mit Stickstoff gespült.
Zwei Kolben wurden inokuliert und einer wurde als Kontrolle verwendet. Es wurden 0,5 ml Inokulum pro Kolben verwendet. Die Kolben wurden bei 37°C, 100 rpm nach 20h beziehungsweise 24h seitlich inokuliert. Die Proben wurden hinsichtlich pH und CFU/ml analysiert.
Tabelle 5: Medienzusammensetzung für Experimente in anaeroben Kolben
Verfahren für Fermentationen:
Inokulum: Es wurden dieselben Bedingungen wie für die Kolbenexperimente verwendet: Es wurden 1 ml Animpfvolumen von L. plantarum und L. acidophilus verwendet um 80 ml MRS-broth (Oxoid) zu inokulieren und bei 37°C für 20 h inkubiert. Für den Stamm L. acidophilus wurde das MRS-broth auf einen pH 5,5 eingestellt.
Kultivierungsbedingungen: Alle Fermentationsexperimente wurden in einem 7,5-L Chemap-Fermenter durchgeführt. Es wurden 7I-Ladungen pro Lauf mit 70 ml Inokulum inokuliert. Die Komplexmediensubstrate wurden entsprechend MRS und CA-4 verwendet und der Rest der Bestandteile wurde wie in dem Kolbenexperiment gehalten, mit Ausnahme, dass das (Na)₃-Citrat (2,40 g/l) zu (NH₄)₃-Citrat (2,00 g/l) geändert wurde (Tabelle 6). Alle Bestandteile, mit Ausnahme der Glukose, wurden vermischt, der pH-Wert auf 6,0 beziehungsweise 5,5 eingestellt und bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Die Glukose wurde getrennt autoklaviert.
Die Fermentationen wurden bei 37°C durchgeführt und der pH-Wert wurde konstant bei einem pH 5,8 für L. plantarum und pH 5,5 für L. acidophilus durch die Zugabe von 25% NaOH gehalten. Die Fermentation wurde gestoppt, wenn die Zugabe von NaOH aufhörte. Es wurden Vorkehrungen getroffen, um das Einmischen von Luft in die Medien zu minimalisieren. Das Endprodukt wurde hinsichtlich der CFU auf MRS-Agar (Oxoid) und Kontamination auf Blutagar und TSA (Difco) analysiert.
Tabelle 6: Medienzusammensetzung für Fermentationen
Ergebnisse der Experimente in Kolben:
Tabelle 7: Kolbenexperiment zur Herstellung von L. plantarum.
Zusammensetzung der Medien in Bezug auf die Wachstumssubstrate (g/l), die Lebensfähigkeit von L. plantarum (CFU/ml) und den pH nach 20 h bei 37°C. Die anderen Bestandteile der MRS-Medien wurden nicht verändert. Der pH in den Medien wurde auf 6,0 eingestellt. Es wurden zwei Parallelexperimente für jedes Experiment durchgeführt.
Tabelle 8: Kolbenexperiment zur Herstellung von L. acidophilus.
Zusammensetzung der Medien in Bezug auf die Wachstumssubstrate (g/l), die Lebensfähigkeit von L. acidophilus (CFU/ml) und den pH nach 24 h bei 37°C. Die anderen Bestandteile der MRS-Medien wurden nicht verändert. Der pH in den Medien wurde auf 5,5 eingestellt. Es wurden zwei Parallelexperimente für jedes Experiment durchgeführt.
Ergebnisse für die Experimente in Fermentern:
Beide Stämme zeigen sowohl die CFU als auch die Verwendung von Natriumhydroxid ein gleiches oder besseres Wachstum auf Medien an, die das BP-Autolysat enthielten, verglichen mit den Standardkomplexbestandteilen in dem MRS. Die Fermentationszeit war für beide Stämme kürzer auf dem BP-Autolysat als auf dem MRS. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 und in 1 zusammengefasst. Es wurde zu keinem Zeitpunkt eine Kontamination beobachtet.
Tabelle 9: Zusammenfassung der Fermentationen auf MRS (mit Komplexmedienbestandteilen (Pepton bakteriologisch 10 (g/l), Rinderextrakt 10 (g/l), Hefeextrakt 5 (g/l)) und mit Komplexmedienbestandteilen, die gegen das BP-Autolysat 32 (g/l) ausgetauscht sind).
Schlussfolgerungen:
Sowohl die Kolben- als auch die Fermentationsexperimente zeigten wenigstens ein gleichwertiges oder verbessertes Wachstum auf Medien, die das BP-Autolysat anstelle des Standard-MRS enthielten.
Beispiel 7
E. coli-Fermentation für die β-Galaktosidaseherstellung
Das Ziel der Untersuchung war es alternativ BP-Autolysate als eine Stickstoffquelle bei der E. coli-Fermentation zu testen. Das BP-Extrakt und das BP-Autolysat (Beispiel 1) wurden gestestet und mit einem Standardhefeextrakt verglichen.
Verfahren:
Die Sauerstoffsättigung wurde über 20% gehalten. Die Temperatur war 37°C und der pH 6,8. Zu Anfang wurde die Fermentation in einem Batch-Modus mit 50% C-Quelle und 50% N-Quelle mit zugegebenen Mineralien durchgeführt. Bei einer OD₆₂₀ 10 wurde die verbliebene N-Quelle über eine Stunde hinweg zugegeben. Bei Glukosespiegeln unter 0,7 gl^–1 wurde Glukose zugeführt. Die Glukose wurde auch über den pH überwacht: 1) pH > 6,8, die Glukosezufuhr wurde erhöht, und 2) pH < 6,75, die Glukosezufuhr wurde vermindert und NaOH zugegeben.
Zugaben:

1. C-Quelle als Glukose, und
2. N-Quelle a. Hefeextrakt b. BP-Extrakt c. BP-Autolysat (mit einer 1,5-fachen Konzentration der Konzentration des Hefeextrakts oder des BP-Extrakts).

Nach 4,5 Stunden wurde ITPG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) als ein Induktor für die β-Galaktosidase zugegeben.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt und bestätigen, dass die Enzymproduktion ähnlich für die drei N-Quellen war.
Beispiel 8
Analyse des BP-Autolysats als eine komplexe N-Quelle für einen L-Lysinüberproduzierenden Stamm Corynebacterium glutamicum NRRL B-11470
Das Ziel dieser Untersuchung war es das BP-Autolysat (Beispiel 1) mit Sojahydrolysat (Bactosoytone) als eine komplexe N-Quelle für die Herstellung von Lysin mittels Fermentation mit einer Lysinüberproduzierenden Mutante von C. glutamicum zu vergleichen.
Die Lysinproduktion wurde in Fermentationen vergleichen, durchgeführt in 3 Liter Glasfermentern mit 1 Liter Medium mit C. glutamicum NRRL B-11470. Die Mediumzusammensetzung war in allen Fermentationen dieselbe, mit Ausnahme der komplexen N-Quelle, welche entweder ein BP-Autolysat oder Soytone war (14, 21 oder 28 g pro Liter).
Ergebnisse:
Die Hauptergebisse der Fermentationen sind in Tabelle 10 zusammengefasst. Die Lysinproduktion als eine Funktion der Zeit ist auch in 3 gezeigt.
Im Allgemeinen erhöht sich die Lysinproduktionsrate mit zunehmenden Konzentrationen der komplexen N-Quelle, vermutlich weil die Zellkonzentration mit vermehrter Zugabe der komplexen N-Quelle zunimmt. Die Produktionsrate ist jedoch in den Kulturen, zu welches das BP-Autolysat zugegeben ist, signifikant höher als in den Kulturen mit derselben Menge Soytone. Auf Grund der hohen Partikelkonzentration in dem BP-Autolysat war es nicht möglich die optische Dichte in den Fermentationen mit dem BP-Autolysat zu bestimmen. Deshalb muss die Zellmasse in diesen Fermentationen abgeschätzt werden. Die höhere Produktionsrate besteht jedoch vermutlich auf Grund einer höheren Zellkonzentration in den Fermentationen mit dem BP-Autolysat, verglichen mit den entsprechenden Fermentationen mit Soytone.
Die Lysinendausbeute pro Einheit Glukose war in dem meisten Fermentation etwa dieselbe, 0,17–0,19 g Lysin HCl/g Glukose, unabhängig vom Typ und der Menge der zugegebenen komplexen N-Quelle. Möglicherweise ist die Ausbeute in den Fermentationen mit 21 g pro Liter zugegebenem BP-Autolysat etwas höher, 0,21–0,22 g Lysin HCl/g Glukose.
Schlussfolgerungen:
Die Fermentationsuntersuchungen zeigen deutlich, dass das BP-Autolysat eine gute Alternative für Soytone ist, und es scheint in Bezug auf die Produktionsrate in Fermentern überragend im Vergleich zu Soytone zu sein. Die erhöhte Produktionsrate besteht vermutlich auf Grund einer höheren Zellkonzentration in den Fermentationen mit dem BP-Autolysat als in den Fermentationen mit derselben Menge an Soytone. Der Grund dafür ist unbekannt, aber es kann sein, dass das BP-Autolysat auf Grund seines bakteriellen Ursprungs die Zellbedürfnisse für das Wachstum in Bezug auf solche Bestandteile wie Ribonukleinsäuren, zellwandbildende Bestandteile, Lipide, ect. besser erfüllt als Soytone.

Claims

Verwendung einer sterilen Nährstoffzusammensetzung als ein Wachstumsmedium für Mikroorganismen, die aus der Biomasse einer Bakterienkultur erlangt wird und die optional weitere Nährstoffe enthält, worin die besagte Bakterienkultur wenigstens eine Spezies methanotrophe Bakterien und wenigstens eine Spezies heterotrophe Bakterien umfasst.
Verfahren zu Kultivierung von Mikroorganismen, umfassend dafür das Zusammenbringen eines Mikroorganismus und eines Wachstumsmediums, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Wachstumsmedium eine sterile Nährstoffzusammensetzung ist oder daraus hergestellt ist, die aus der Biomasse einer Bakterienkultur erlangt wird, optional mit der Zugabe weiterer Nährstoffe, worin die besagte Bakterienkultur wenigstens eine Spezies methanotrophe Bakterien und wenigstens eine Spezies heterotrophe Bakterien umfasst.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die besagte Nährstoffzusammensetzung ein Hydrolysat, Homogenisat oder Autolysat der besagten Biomasse umfasst, vorzugsweise ein Autolysat.
Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die besagte Nährstoffzusammensetzung ferner Glukose und/oder Nitrat- und Mineralsalze (zum Beispiel Verbindungen aus Kalium, Kalzium, Magnesium, Natrium, Molybdän, Eisen, Zink, Bor, Kobalt, Mangan und Nickel) umfasst.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 4, worin die Glukose in der besagten Nährstoffzusammensetzung in einem Gewichtsverhältnis auf Basis der Trockenmasse von 5:1 bis 1:5 (vorzugsweise 2:1 bis 1:2) relativ zu dem aus Biomasse erhaltenen Bestandteil vorhanden ist.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin die Nitrat- und Mineralsalze in der besagten Nährstoffzusammensetzung in einem Gewichtsverhältnis von 0,01:1 bis 0,2:1 (vorzugsweise 0,05:1 bis 0,1:1) relativ zu dem aus Biomasse erhaltenen Bestandteil vorhanden sind.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergegangenen Ansprüche, worin die Bakterienkultur, die verwendet wird, um die Biomasse herzustellen, wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 75%, zum Beispiel 75 bis 95%, besonders vorzugsweise 75 bis 80%, bezogen auf das Gewicht methanotropher Bakterien (relativ zu dem Gesamtbakteriengewicht), beträgt.
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergegangenen Ansprüche, worin die besagte Kultur Methylococcus capsulatus (Bath) (Stanzen NCIMB 11132), Ralstonia sp. DB3 (Stamm NCIMB 13287) und Brevibacillus agri DBS (Stamm NCIMB 13289) umfasst, optional in Kombination mit Aneurinibacillus sp. DB4 (Stamm NCIMB 13288).
Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergegangenen Ansprüche, worin die besagte Bakterienkultur durch Fermentation auf Kohlenwasserstofffraktionen oder Erdgas hergestellt wird, vorzugsweise durch die Fermentation auf Erdgas.
Wachstumssubstrat für Mikroorganismen, umfassend eine sterile Nährstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, ferner enthaltend wenigstens einen sterilen Nährstoff und optional ein Verdünnungsmittel.
Substrat nach Anspruch 10, worin der besagte sterile Nährstoff ausgewählt ist aus Glukose, Nitrat- und Mineralsalzen (zum Beispiel Verbindungen aus Kalium, Kalzium, Magnesium, Natrium, Molybdän, Eisen, Zink, Bor, Kobalt, Mangan und Nickel) und Kombinationen davon.
Substrat nach Anspruch 11, worin die Glukose in einem Gewichtsverhältnis auf Basis der Trockenmasse von 5:1 bis 1:5 (vorzugsweise 2:1 bis 1:2) relativ zu dem aus Biomasse erhaltenen Bestandteil vorhanden ist.
Substrat nach Anspruch 11 oder 12, worin die Nitrat- und Mineralsalze in einem Gewichtsverhältnis von 0,01:1 bis 0,2:1 (vorzugsweise 0,05:1 bis 0,1:1) relativ zu dem aus Biomasse erhaltenen Bestandteil vorhanden sind.