CN116368216A - 含血红素的细胞培养基及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的培养基或发酵培养基，用培养基或发酵培养基培养细胞或组织的方法，以及通过培养方法产生的产物，产物包括食物产品、食物成分、植物保护性细菌细胞产物以及如维生素、脂肪酸、氨基酸、类胡萝卜素等其他感兴趣的产物。

Description

含血红素的细胞培养基及其用途
背景技术
发酵和细胞或组织培养涉及在生长培养基中培养细胞或组织，生长培养基包含细胞存活或生长所需的营养物。酵母提取物、蛋白胨以及动物血清通常用作发酵、细胞和组织培养的营养物来源。然而，这些营养物来源可能受成本限制，或者缺乏一些促进细胞最佳生长的营养物。需要用于发酵和细胞或组织培养的其他营养物来源来支持有效的商业化生产过程。
发明内容
本公开提供了细胞或组织培养基或发酵培养基及其成分，包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物，使用培养基或发酵培养基的方法，以及由使用培养基和发酵培养基的方法产生的如食物成分等产物。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。经请求并且支付必要费用后，专利局将提供具有(多个)彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1是根据实施例1的4个自溶产物样品(样品B135、B139、B140和B141)的分子量分布图，自溶产物样品由产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌(荚膜甲基球菌巴斯(Methylococcus capsulatus Bath))的生物质产生。样品B145是未经历自溶的生物质匀浆的样品。
图2是通过分光光度法测量的两种海洋栖居细菌(海摩替亚氏菌(Moritellamarina)以及肺鲐希瓦氏菌(Shewanella pneumatophori))以及裂殖壶菌属物种(Schizochytriumsp.)ATCC 20888的细胞生长图，这些细菌各自在不含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌(荚膜甲基球菌巴斯)的生物质或由生物质产生的自溶产物的培养基中培养，在含生物质的培养基(“生物质培养基”)中培养，或在含由生物质产生的自溶产物的培养基(“自溶产物培养基”)中培养。参见实施例2。
图3是由海摩替亚氏菌(Moritella marina)、肺鲐希瓦氏菌(Shewanellapneumatophori)以及裂殖壶菌属物种ATCC 20888产生的二十碳五烯酸(EPA–C20:5(n-3))和二十二碳六烯酸(DHA–C22:6(n-3))的浓度图，这些细菌各自在不含荚膜甲基球菌巴斯的生物质或由生物质产生的自溶产物的培养基中培养，在含生物质的培养基(“生物质培养基”)中培养，或在含由生物质产生的自溶产物的培养基(“自溶产物培养基”)中培养，以及这样的海洋栖居生物的细胞生长。参见实施例3。
图4A和4B是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(ATCC 53757)的图A)：通过在BioLector中培养，在不含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌(荚膜甲基球菌巴斯)(“基质”)的生物质或由生物质产生的自溶产物(“B199”)或含由添加蛋白酶的生物质产生的自溶产物(“B223”)的培养基中培养来测量的细胞生长，以及B)：A)中培养物的溶解氧痕迹。这些图表示在最高浓度(0.1g/L N)下含和不含自溶产物生长的重复培养物。参见实施例4。
图5是杰丁毕赤酵母(Pichia jadini)(CBS 4511)细胞生长的图，通过在BioLector中培养，在不含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌(荚膜甲基球菌巴斯)(“基质”)的生物质或由生物质产生的自溶产物(“B199”)或含由添加蛋白酶的生物质产生的自溶产物(“B223”)的培养基中培养来测量。该图表示在最高浓度(0.1g/L N)下含和不含自溶产物生长的重复培养物。参见实施例4。
图6是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(DSM 20053)细胞生长的图，通过在BioLector中培养，在不含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌(荚膜甲基球菌巴斯)(“MRS”)的生物质或由生物质产生的自溶产物(“B199”)或含由添加蛋白酶的生物质产生的自溶产物(“B223”)的培养基中培养来测量。该图表示在最高浓度(1.0g/LN)下含和不含自溶产物生长的重复培养物。参见实施例4。
图7是大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 25922)细胞生长的图，通过在BioLector中培养，在不含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌(荚膜甲基球菌巴斯)(“基质”)的生物质或由生物质产生的自溶产物(“B199”)或含由添加蛋白酶的生物质产生的自溶产物(“B223”)的培养基中培养来测量。该图表示在最高浓度(0.22g/L N)下含和不含自溶产物生长的重复培养物。参见实施例4。
具体实施例
本公开提供了细胞或组织培养基或发酵培养基及其成分，包括产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物，使用培养基或发酵培养基的方法，以及由使用培养基和发酵培养基的方法产生的如食物成分等产物。
产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物，包括匀浆、提取物、裂解物、自溶产物和消化物，可以用作成份确定或复合生长或培养基的成分，以培养或发酵多种类型的细胞或组织。可以使用本文所述的成分发酵或培养的细胞或组织类型的示例包括细菌、酵母、真菌、微藻、蘑菇、包括昆虫在内的动物以及包括微藻在内的植物。使用本文所述的成分发酵或培养的细胞或组织类型可以用于如人类食物、动物饲料、化妆品、药品和植物保护性农产品等产物。例如，产物可以包括细胞培养肉(cell-based meat)和肉替代产物(由非动物生物质产生)、氨基酸、肽、蛋白质、脂肪酸、有机酸、酶、色素、调味剂、香料、发酵剂、培养物、益生菌、食物成分、化妆品以及药品的活性成分、核苷、维生素、小分子、代谢物等。
产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物可以用于取代培养基的其他常见氮和/或碳源，特别是在如蛋白胨、酵母提取物、大豆蛋白胨和玉米粉等复合培养基中。在培养基中使用产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌生物质和生物质衍生物(例如，自溶产物、分离物、消化物、提取物、匀浆)作为氮和/或碳源的一个优点是，它给在培养基中培养的细胞赋予了“肉样”颜色、“肉样”风味，或其他如的铁含量升高等所需的特征。细菌生物质(或其衍生物)可用于培养基中，以向细胞培养物提供含血红素的蛋白质(即，血红素蛋白)、氨基酸以及其他营养物(例如，如铜、铁等矿物质)。存在于C1代谢非光合细菌生物质(或其衍生物)中的血红素蛋白在生长培养基中被输送至在生长培养基中培养的细胞。在生长培养基中培养的细胞的生物物质改善了肉样品质(例如，红色、金属味、鲜味、铁含量升高)，这对于产生肉以及鱼替代食物产品是有用的。本文提供的培养基成分的另一个优点可以包括由于培养基提供的必需氨基酸、铁、铜以及其他营养物而提高培养的细胞或组织或感兴趣的最终产物的生长速率、产量、生产率和/或效率。这与使用发酵产生食物、饲料、化妆品和植物保护行业感兴趣的如肉替代物、氨基酸、肽和蛋白质、脂肪酸、有机酸、酶、色素、调味剂和香料、生物质(如发酵剂、培养物、益生菌)、活性成分等成分的产生系统尤其相关。
在更详细地阐述本公开之前，提供本文使用的某些术语的定义可以有助于理解本公开。另外的定义在本公开中阐述。
在本说明书中，除非另外指明，否则术语“约”意指所指示的范围、值或结构的±20％。术语“基本上由……构成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。应当理解，本文所用的术语“一种(a和an)”是指“一种或多种”所列举的组分。替代物的使用(例如，“或”)应理解为意指替代物中的任一个、两个或其任何组合。如本文所用，术语“包括”和“具有”同义使用，这些术语及其变体旨在被解释为非限制性的。术语“包含”是指权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但其不排除一个或多个其他特征、整数，步骤、组分或其群组的存在或添加。本文提供的任何范围包括所述范围内的所有值和较窄范围。
A.细胞或组织培养基或发酵培养基
本文描述了细胞或组织培养基，其包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物。
术语“培养基”、“生长培养基”、“细胞或组织培养基”或“细胞或组织培养基或发酵培养基”是设计用于支持微生物(例如，细菌、酵母、真菌以及微藻)、细胞(微生物或衍生自如动物、昆虫以及植物等多细胞生物)、组织或小植物生长的液体或凝胶。培养基通常包含适当的能量和营养物来源(例如，碳源、氮、矿物质)。除了提供营养物之外，培养基还有助于保持培养物的pH和渗透压。
“产血红素蛋白”是指细菌产生一种或多种血蛋白的能力。血红素蛋白(hemoprotein)(也称为“血红素蛋白(heme protein)”)是与血红素基团相连的蛋白质。血红素是与卟啉分子配位的铁离子的配位络合物。血红素蛋白的示例包括血红蛋白、豆血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、催化酶、血红素过氧化物酶以及内皮一氧化氮合酶。血红素蛋白通常含有至少一种血红素，血红素以化学计算量紧密结合于(例如，结合常数在10-8至10-15M的范围内)且通常可通过其红色来识别。可以通过UV-可见吸收光谱测量410-415nm处的峰和500-550nm处的峰来测量血红素蛋白。
如本文所用，术语“C1底物”在本文中是指任何缺乏碳-碳键的含碳分子。示例包括甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺(诸如像甲胺、二甲胺以及三甲胺)、甲基化硫醇、甲基卤素(例如，溴甲烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷)、氰化物等。
如本文所用，术语“C1代谢细菌”是指能够利用如甲烷、天然气、沼气、合成气或非传统天然气等C1底物，作为其主要或唯一碳源和能源的非光合细菌。此外，C1代谢细菌包括“专性C1代谢细菌”，它们只能利用C1底物(例如，甲烷)作为碳源和能源，而不能利用含碳-碳键的有机化合物(例如，含多碳化合物)作为碳源和能源。还包括“兼性C1代谢细菌”，除了C1底物(例如，甲烷)之外，它们还可以自然使用如乙酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐或乙醇等多碳底物，作为它们的碳源和能源。
“非光合”是指不能进行光合作用。
在某些实施例中，C1代谢非光合细菌是甲基营养细菌。
如本文所用，“甲基营养菌”或“甲基营养细菌”是指能够氧化不含碳-碳键的如甲烷、甲醇或两者等有机化合物的细菌。甲基营养细菌包括革兰氏阴性菌属和革兰氏阳性菌属。本公开的甲基营养细菌可以是需氧甲基营养细菌或厌氧甲基营养细菌。在某些实施例中，本公开的甲基营养细菌是需氧的。
甲基营养细菌包括兼性甲基营养菌，其具有氧化不含碳-碳键的有机化合物(例如，甲醇)的能力，但也可以利用其他如糖和复合碳水化合物等碳底物，以及专性甲基营养菌，其仅限于使用不含碳-碳键的有机化合物。在某些实施例中，甲基营养细菌是专性甲基营养菌。说明性专性甲基营养菌包括嗜甲基菌属物种(Methylophilus sp.)、甲基菌属物种(Methylobacillus sp.)、食甲基菌属物种(Methylovorus sp.)以及噬甲基菌属物种(Methylophaga sp)。
在任何前述实施例中，本公开的C1代谢细菌包含如嗜甲基菌、甲基球形菌属(Methylopila)、甲基菌属或甲基杆菌属(Methylobacterium)等特定属的细菌甲基营养菌。甲基营养细菌的示例包括荚膜甲基球菌、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)、杨树甲基杆菌(Methylobacteriumpopuli)、嗜中温甲基杆菌(Methylobacterium chloromethanicum)、结瘤甲基杆菌(Methylobacterium nodulans)、克莱拉甲基单胞菌(Methylomonas clara)以及鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellates)。
“甲烷营养细菌”是指任何具有氧化甲烷作为其主要碳源和能源的甲基营养细菌。
在某些实施例中，C1代谢细菌是甲烷营养细菌。甲烷营养细菌根据其碳同化途径和内膜结构分为三组：I型(γ变形菌)、II型(α变形菌)以及X型(γ变形菌)。如荚膜甲基球菌等I型甲烷营养菌使用磷酸核酮糖(RuMP)途径用于生物质合成并完全由CH4产生生物质，而II型甲烷营养菌使用丝氨酸途径，其从CH4同化50-70％的细胞碳并从CO2同化30-50％(Hanson和Hanson,1996)。X型甲烷营养菌使用RuMP途径，但也表达低水平的丝氨酸途径的酶。
甲烷营养细菌分为几个属，包括甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)和甲基细胞菌属(Methylocella)。
在特定实施例中，甲烷营养细菌选自由甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属和甲基细胞菌属构成的组。
甲烷营养细菌包括专性甲烷营养菌(仅可以利用C1底物作为碳源和能源)和兼性甲烷营养菌(天然具有利用一些多碳底物作为唯一碳源和能源的能力)。兼性甲烷营养菌包括甲基细胞菌属、甲基孢囊菌属和甲基帽菌属(Methylocapsa)(例如，森林甲基胞菌(Methylocella silvestris)、沼泽甲基胞菌(Methylocella palustris)、冻原甲基胞菌(Methylocella tundrae)、道氏甲基孢囊菌菌株SB2(Methylocystis daltona strainSB2)、布氏甲基孢囊菌(Methylocystis bryophila)、金色甲基荚膜菌KYG(Methylocapsaaurea KYG))的一些物种以及嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum；ATCC27,886)。已知专性甲烷营养细菌能产生如细胞色素c、细胞色素a、细胞色素b、细胞色素P450、细胞色素c氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等血红素蛋白。
示例性的甲烷营养细菌属物种包括：荚膜甲基球菌巴斯菌株、甲基单胞菌16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b；NRRL B-11,196)、生孢甲基弯菌(Methylosinus sporium；NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(Methylocystis parvus；NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica；NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(Methylomonas albus；NRRL B-11,200)、荚膜甲基杆菌(Methylobacter capsulatus；NRRL B-11,201)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属物种AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌(ATCC 700799)、冻原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、布氏甲基孢囊菌、金色甲基荚膜菌KYG、极端嗜酸甲烷营养菌(Methylacidiphilum infernorum)、Methylacidiphilum fumariolicum、Methyloacidakamchatkensis、培氏甲基细菌(Methylibium petroleiphilum)以及嗜碱甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum)。
在某些实施例中，甲烷营养细菌是需氧甲烷营养细菌或厌氧甲烷营养细菌。在特定实施例中，甲烷营养细菌是需氧甲烷营养细菌。需氧甲烷营养菌可以通过特定的酶—甲烷单加氧酶(MMO)代谢甲烷。
在另外的实施例中，甲烷营养细菌是甲基球菌(例如，荚膜甲基球菌，包括菌株荚膜甲基球菌巴斯)或甲基弯菌(例如，发孢甲基弯菌，包括菌株发孢甲基弯菌OB3b)。
在特定实施例中，C1代谢非光合细菌是荚膜甲基球菌。细胞或组织培养基的荚膜甲基球菌可以是遗传修饰的或非遗传修饰的。在特定实施例中，荚膜甲基球菌衍生自荚膜甲基球菌(巴斯)、荚膜甲基球菌(得克萨斯州)、荚膜甲基球菌(阿伯丁)或其组合。在优选实施例中，细胞或组织培养基的荚膜甲基球菌包括荚膜甲基菌(巴斯)。
在特定实施例中，细胞或组织培养基或发酵培养基包含甲烷营养细菌和一种或多种异源非甲烷营养细菌。例如，甲烷营养细菌(例如，荚膜甲基球菌巴斯)可以与贪铜菌属物种(Cupriavidus sp.)、丹麦解硫胺素芽孢杆菌(Anuerinibacillus danicus)或两者一起培养，并任选地与土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)组合。
在特定实施例中，培养基或发酵培养基的C1代谢非光合细菌是非遗传修饰的。
在特定实施例中，C1代谢非光合细菌包含修饰的C1代谢细菌，其中修饰的C1代谢细菌包含至少一种重组或异源多核苷酸，其编码所需蛋白质、修饰内源性蛋白质的表达、或两者。在特定实施例中，编码所需蛋白质的重组或异源多核苷酸可操作地连接到启动子。修饰内源性蛋白质表达的重组或异源多核苷酸可以对应于控制内源性蛋白质表达地内源性、异源或合成调节元件，或者它可以编码其表达使得内源性蛋白质表达减弱的代谢途径酶，等等。
异源或重组核酸分子可以通过转染、转导、转化、电穿孔或结合引入(统称为“转化”)的方式插入C1代谢非光合细菌中，其中核酸分子被结合到细胞的基因组中，是外基因组的，在附加体质粒上，或其任何组合。
如本文所用，术语“转化”是指将核酸分子(例如，外源或异源核酸分子)转移到宿主细胞中的过程，包括将多核苷酸引入细胞的所有方法(如转化、转染、转导、电穿孔、缀合引入等)。转化的宿主细胞可以在染色体外携带外源或异源核酸分子，或者核酸分子可以整合到染色体中。整合到宿主基因组和自我复制载体中通常导致转化核酸分子的遗传稳定遗传。含有转化核酸的宿主细胞被称为“修饰”、“重组”、“非天然存在”、“基因工程”、“转化”或“转基因”细胞(例如，细菌)。
细菌缀合是指涉及供体细胞和受体细胞直接接触的特殊类型的转化，通常用于将核酸转移到甲烷营养细菌中。细菌缀合涉及将“供体”和“受体”细胞紧密接触地混合在一起。缀合是通过供体和受体细菌之间的细胞质连接形成的，新合成的供体核酸分子单向转移到受体细胞中。缀合反应中的受体是任何可以通过水平转移从供体细菌接受核酸的细胞。缀合反应中的供体是含有缀合质粒或动员质粒的细菌。供体质粒的物理转移可以通过自传播质粒或在“辅助”质粒的帮助下进行。涉及甲烷营养细菌的缀合物已经描述于Stolyar等人,Mikrobiologiya[微生物学]64:686,1995；Motoyama等人,Appl.Micro.Biotech.[应用微生物学与生物技术]42:67,1994；Lloyd等人,Arch.Microbiol.[微生物学文献集]171:364,1999；PCT公开号WO 02/18617；以及Ali等人,Microbiol.[微生物学]152:2931,2006，其方法通过引用并入本文。
如前所述，培养基或发酵培养基包含C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物。生物质可以衍生自C1代谢非光合细菌的整个和/或裂解的细胞。此外，生物质可以进一步加工以产生匀浆、提取物、裂解物、自溶产物、分离物、消化物。
“生物质”或“细菌生物质”是指从细菌培养物收集的有机材料。生物质主要(即，大于50％w/w)包含细菌细胞，但可以包括如裂解的细菌细胞、细菌细胞膜、包涵体以及胞外物质(例如，分泌或排泄到培养基中的产物)或其任何组合等其他物质，其与细菌细胞一起从细菌发酵收集。优选地，生物质包含从细菌发酵收集的超过60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞。
为了产生衍生自C1代谢非光合细菌的整个和/或裂解的细胞的生物质，可以在各种培养条件下用C1底物培养细菌。
如本文所用，术语“培养(culturing或cultivation)”是指在适当条件下在液体或固体培养基中生长细胞群。根据其上下文，该术语可以指(a)生长C1代谢非光合细菌以产生生物质或其衍生物，生物质或其衍生物被包括作为培养基或发酵培养基的成分，或(b)在包含C1代谢无光合细菌的生物质或其衍生物的培养基或发酵培养基中生长细胞或组织。
在一些实施例中，培养是指通过C1代谢非光合细菌将C1底物发酵生物转化为如用于在细胞或组织培养基或发酵培养基中使用的成分等中间体或最终产物。该培养步骤也可以称为“培养以产生培养基生物质”等。
在另外的实施例中，C1底物或碳原料选自甲烷、甲醇、合成气、天然气、生物气或其组合。更典型地，碳原料选自甲烷或天然气。在某些实施例中，培养基可以包含单一C1底物作为甲烷营养细菌的唯一碳源，或者可以包含两种或更多种C1底物的混合物(混合的C1底物组合物)作为甲烷营养细菌的多种碳源。
如下文更详细地描述，当在液体培养基中培养C1代谢非光合细菌以产生生长培养基生物质时，可以使用多种已知的气-液相系统中的任何一种将气态C1底物引入并分散到液体培养基。当在固体培养基上培养C1代谢非光合细菌以产生生长培养基生物质时，将气态C1底物引入固体培养基的表面。
多种培养方法可用于培养本文所述的C1代谢非光合细菌。例如，C1代谢非光合细菌可以通过分批培养或连续培养方法生长。在某些实施例中，产生生长培养基生物质的培养物在如发酵罐、生物反应器、中空纤维膜生物反应器等受控培养单元中生长。其他合适的方法包括经典的分批或补料分批培养或连续或半连续培养方法。在某些实施例中，产生生长培养基生物质的培养物在如发酵罐、生物反应器、中空纤维膜生物反应器等受控培养单元中生长。
经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定，并且在培养过程期间不受外部改变。因此，在培养过程开始时，用所需甲烷营养细菌接种培养基，并允许生长或代谢活性发生，而无需向系统中进一步添加任何物质。然而，通常情况下，“分批”培养物在添加甲烷营养底物方面是分批的，并且经常试图控制如pH和氧气浓度等因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成不断变化，直到培养终止。在分批培养中，细胞通过静态滞后期调节到高生长对数期，最后调节到生长速率降低或停止的稳定期。如果不处理，处于静止期的细胞最终会死亡。在某些系统中，对数生长期的细胞通常负责最终产物或中间体的批量产生。在其他系统中可以获得平稳或指数后相位的产生。
补料分批系统是标准分批系统的变体。补料分批培养工艺包括典型的分批系统，分批系统具有随着培养的进行而增量添加甲烷营养底物的修改。当分解代谢抑制倾向于抑制细胞的代谢时，以及当需要在培养基中具有有限量的C1底物时，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中测量实际底物浓度是困难的，因此是根据如pH、溶解氧和如CO2等废气的分压等可测量因素的变化来估计的。分批和补料分批培养方法是本领域中常见和已知的(参见，例如，Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology[生物技术：工业微生物学教科书],第2版(1989)Sinauer Associates公司,桑德兰,马萨诸塞州；Deshpande,Appl.Biochem.Biotechnol.[生物技术与应用生物化学]36:227,1992，其方法通过引用以其整体并入本文)。
连续培养是“开放”系统，将成份确定培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基进行处理。连续培养通常将细胞维持在恒定的高液相密度其中细胞主要处于对数期生长。可替代地，可以用固定化细胞进行连续培养，其中连续加入C1底物和营养物，并且从细胞团中不断去除有价值的产物、副产物和废物。细胞固定化可以使用由天然和/或合成材料组成的广泛的固体支持物来进行。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一种或任何数量的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持如C1底物或氮含量等有限的营养物，并允许所有其他参数进行调节。在其他系统中，当通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定时，可以连续改变影响生长的许多因素。连续系统努力维持稳定状态的生长条件，因此由于培养基被抽出而导致的细胞损失必须与培养物中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续培养过程的营养物和生长因子的方法，以及使产物形成速率最大化的技术，在本领域是众所周知的。
液相生物反应器(例如，搅拌槽、填充床、一液相、两液相、中空纤维膜)在本领域是众所周知的，并且可以用于微生物的生长和生物催化。
通过使用气相生物反应器，用于生物产生的底物被微生物从气体中吸收，而不是从液体中吸收。具有微生物的气相生物反应器的使用是本领域已知的(参见，例如，美国专利2,793,096；4,999,302；5,585,266；5,079,168；以及6,143,556；美国法定发明登记H1430；美国专利申请公开号US 2003/0032170；Emerging Technologies in HazardousWaste Management III[危险废物管理的新兴技术III],1993,Tedder和Pohland编辑,第411–428页，其全部内容通过引用并入本文)。示例性的气相生物反应器包括单程系统、闭环泵送系统以及流化床反应器。通过利用气相生物反应器，甲烷或其他气体底物很容易被具有例如单加氧酶活性的多肽生物转化。
用于培养C1代谢非光合细菌(例如，甲烷营养细菌)的合适的发酵器可以是环型或气升式反应器。示例性发酵罐包括U环发酵罐(参见美国专利号7,579,163、WO 2017/218978)、蛇形发酵罐(参见WO 2018/132379)和Kylindros发酵罐(参见WO 2019/0366372)。
在其中C1代谢非光合细菌是甲烷营养细菌的实施例中，甲烷营养细菌可以作为分离的纯培养物生长，具有可以帮助生长的异源非甲烷营养细菌，或者一种或多种不同的甲烷营养细菌菌株或属物种可以组合以产生混合培养物。
在C1代谢非光合细菌包含荚膜甲基球菌的实施例中，培养基可以包括衍生自荚膜甲基球菌的生物质，荚膜分枝菌与如贪铜菌属物种、丹麦解硫胺素芽孢杆菌或两者等一种或多种异源生物培养，并任选地与土壤短芽孢杆菌组合。在这样的实施例中，除了来自荚膜甲基球菌的生物质之外，细菌生物质还可以包含来自一种或多种异源生物的生物质。
在细菌培养期间，通常将发酵混合物的pH调节为如约6和约7之间、约7和约8之间、或约6.5和7.5之间等约6和约8之间。
在细菌培养期间，温度保持在最适合培养细菌的范围内。例如，对于荚膜甲基球菌巴斯，温度可以在40℃和45℃之间(如42℃)。
在特定实施例中，生物质主要包含(即按重量计大于50％，如大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％或大于90％)来自荚膜甲基球菌的生物质。
优选地，荚膜甲基球菌可以用甲烷作为其碳源、用空气或纯氧进行氧合、并用氨作为氮源来培养。在某些实施例中，用于培养荚膜甲基球菌的包含甲烷的碳原料是天然气或非传统天然气。除了这些底物之外，细菌培养物通常需要水、磷酸盐以及如镁、钙、钾、铁、铜、锌、锰、镍、钴以及钼等几种矿物质。示例性培养基包括Higgins最小硝酸盐培养基(NSM)或MM-W1培养基、如实施例1所述的主混合进料(MMF)、MMF1.1、培养基MMS1.0或AMS培养基。荚膜甲基球菌的示例性培养条件在实施例中提供。
每升培养基MMS 1.0的组成如下：0.8mM MgSO4.7H2O、30mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4.2H2O、6μM CuSO4.5H2O、10μMFeIII-Na-EDTA以及1mL痕量金属溶液(每升含有：500mg FeSO4.7H2O、400mg ZnSO4.7H2O、20mg MnCl2.7H2O、50mg CoCl2.6H2O、10mg NiCl2.6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。培养基的最终pH为7.0±0.1。
AMS培养基每升含有以下：10mg NH3、75mg H3PO4.2H2O、380mg MgSO4.7H2O、100mgCaCl2.2H2O、200mg K2SO4、75mg FeSO4.7H2O、1.0mg CuSO4.5H2O、0.96mg ZnSO4.7H2O、120μgCoCl2.6H2O、48μg MnCl2.4H2O、36μg H3BO3、24μg NiCl2.6H2O以及1.20μg NaMoO4.2H2O。
每升培养基MMF1.1的组成如下：0.8mM MgSO4·7H2O、40mM NaNO3、0.14mM CaCl2、6mM NaHCO3、4.7mM KH2PO4、6.8mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4·2H2O、6μM CuSO4·5H2O、10μMFeIII-Na-EDTA以及1mL痕量金属溶液(每升含有500mg FeSO4·7H2O、400mg ZnSO4·7H2O、20mg MnCl2·7H2O、50mg CoCl2·6H2O、10mg NiCl2·6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。
可通过多种技术如沉降、离心、微滤、超滤和喷雾干燥从细菌培养物中收获生物质。优选地，通过离心(例如，在10℃以4,000x g进行10分钟)从细菌培养物收获生物质。例如，可以收集发酵肉汤(细胞和液体)并离心。离心后，可以弃去液体，保存沉淀的细胞并任选地冻干。
在一些实施例中，培养基包括生物质的衍生物。生物质可以通过一个或多个另外的步骤进行处理以获得生物质衍生物。如本文所用，当与生物质有关时，术语“衍生物”包括可以使用如通过离心和/或过滤方法从发酵培养基或液体中分离生物质材料等下游加工技术或本领域已知的技术从这种材料衍生的任何产物；通过使用高压均化器或珠磨机或超声处理进行均化或细胞破坏；通过激活内源性酶或添加物或外部酶来消化或裂解细胞及其组分；多种热处理；以及通过蒸发、喷雾干燥、滚筒干燥或冷冻干燥进行干燥。生物质衍生物包括生物质自溶产物、生物质裂解物、生物质提取物、生物质分离物、生物质悬浮液、生物质匀浆以及生物质消化物(也称为“消化物”)。最终培养基成分可以是可流动的水性糊状物、浆料或干燥粉末的形式。
“生物质裂解物”是指已经裂解的细胞(即，细胞的细胞壁和/或膜已经被破坏)的生物质。细胞裂解可以例如通过电化学裂解(例如，使用通过钯电极在装置内电化学产生的氢氧根离子，蒸发细胞膜引起细胞裂解)、化学裂解(例如，通过化学溶解细胞膜内的蛋白质和脂质)、声学裂解(例如，使用超声波产生引起空化的高压和低压，进而引起细胞裂解)、机械裂解(例如，使用物理穿透来破坏细胞膜)。
“生物质消化物”是指经过酶处理的生物质的一种或多种组分。生物质消化物的示例包括分别通过自溶或水解形成的自溶产物和水解物。如通过自溶或水解等生物质的消化，允许产生游离氨基酸和短链肽。
“生物质水解物”是指经过外源供给生物质的酶消化的生物质。
“生物质自溶产物”是指经过生物质中天然存在的酶消化的生物质衍生物，称为自溶。在某些情况下，可以向生物质中添加另外的外源酶(例如蛋白酶、脂肪酶、催化酶)以增强或加速自溶过程。它通常将通过在精心控制的条件下孵育细菌培养物来进行。生物质的自溶可以通过浓缩C1代谢细菌的培养物并将浓缩的培养物加热到约50℃-60℃的温度，持续足以产生自溶产物的时间来进行。自溶后，可以在约70℃-80℃的温度下对自溶产物进行热灭活，然后可以分离出包括游离氨基酸在内的自溶产物的可溶性部分。在一些实施例中，通过1)C1代谢细菌的发酵，(2)通过离心、过滤或蒸发浓缩发酵产物，(3)均化，(4)添加或不添加酶的自溶，(5)巴氏灭菌，以及(6)喷雾干燥来产生自溶产物。
“生物质提取物”是指从生物质的其他组分中分离出来的生物质组分。例如，一些提取物可以富含血红素或含血红素的蛋白质。其他提取物可以富含在C1生物质中表达的特定重组蛋白(例如动物生长因子)。可以用于培养基的生物质提取物的示例包括富含血红素的提取物和重组蛋白提取物。
“生物质分离物”是指经过分离和纯化的生物质组分。例如，对于一些生长培养基应用，将可溶性部分与残留的颗粒细胞壁和细胞碎片分离可能是重要的，从而产生更可溶的分离物和颗粒产物。可以用于培养基的生物质分离物的示例包括过滤和纯化的提取物、可溶性部分或不溶性部分。
“生物质悬浮液”是指包括悬浮在液体培养基中的生物质细胞的混合物。
“生物质匀浆”是指经过匀浆以释放细胞内容物的生物质。生物质的均化可以通过超声处理、珠粒均化、冷冻/解冻循环、使用Dounce均化器或研钵和研杵进行。生物质匀浆可以是或包括含有可溶性和颗粒细胞组分的粘性蛋白质浆料。
在特定实施例中，细胞或组织培养基包含浓度为至少0.1g/l的C1代谢细菌的生物质。在一些实施例中，培养基中生物质或其衍生物的量为至少0.1g/l、至少0.5g/l、至少1.0g/l、至少2.0g/l、至少3.0g/l、至少4.0g/l或至少5.0g/l。
在特定实施例中，培养基中生物质或其衍生物的量在0.1至50g/l的范围内。在一些实施例中，培养基中生物质或其衍生物的量在0.1至50g/l、0.1至40g/l、0.1至30g/l、0.1至20g/l、0.1至10.0g/l、0.1至5g/l、0.5至20g/l、0.5至10g/l、0.5至5g/l、1至50g/l、1至40g/l、1至30g/l、1至20g/l、1至10g/l、1至5g/l、5至50g/l、5至40g/l、5至30g/l、5至20g/l、5至10g/l、10至50g/l、10至40g/l、10至30g/l或10至20g/l的范围内。
在一些实施例中，生物质是自溶产物，并且包括一种或多种以干重的百分比计的以下组分：灰分约为9％-11％，氮约为10％-11％，粗脂质约为7％-9％，总葡萄糖约为2％-8％，RNA约为3％-6％，DNA约为1％-3％，总氨基酸约为50％-60％，游离氨基酸约为10％-25％，以及α-氨基酸约为3％-4％。
在一些实施例中，生物质是自溶产物，并且包括一种或多种以下组分：磷、硫、氯化物、钙、钾、镁、钠、铁、铜和锌，如约19.5g/kg磷、约5.4g/kg硫、约7.6g/kg氯化物、约4.7g/kg钙、约8.4g/kg钾、约3.0g/kg镁、约20g/kg钠、约0.33g/kg铁、约0.9g/kg铜以及约0.02g/kg锌。
在一些实施例中，生物质是自溶产物，并且包括一种或多种以下氨基酸：天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸以及色氨酸，如以下量(以g/kg计)：天冬氨酸-约46、丝氨酸-约15、谷氨酸-约72、甘氨酸-约34、组氨酸-约12、精氨酸-约32、苏氨酸-约23、丙氨酸-约59、脯氨酸-约26、酪氨酸-约20、缬氨酸-约40、甲硫氨酸-约15、赖氨酸-约34、异亮氨酸-约32、亮氨酸-约52、苯丙氨酸-约28、半胱氨酸-约7以及色氨酸-约11。
在一些实施方案中，生物质是自溶产物，并且包括一种或多种：核黄素和吡哆醇，如约47mg/kg的核黄素和约55mg/kg的吡哆醇。
在一些实施例中，生物质是自溶产物，并且包括一种或多种以下参数：干物质的约50％至约70％之间的粗蛋白、9％至11％之间的总氮；干物质的1％至4％之间的氨基氮；由30％至60％体外蛋白质消化率产生的约80％-90％游离氨基酸；约30-85％的蛋白质溶解度；约6.5-7.5的2％溶液pH；约4％-12％的水分含量。
C1代谢非光合细菌(例如荚膜甲基球菌)的生物质或其衍生物可以表现出独特的同位素特征，其允许鉴定含有C1代谢无光合细菌的细胞或组织培养基。C1代谢非光合细菌生物质或其衍生物的不同同位素特征可以允许将包括生物质或其衍生物的培养基与包括如酵母提取物、蛋白胨或大豆蛋白胨等不同碳源和氮源的培养基区分开来。不同同位素特征可以包括以下中的至少一个、至少两个或全部：不同同位素δ13C值、不同同位素δ15N值和不同同位素δ34S值。
同位素δ13C值是指碳的稳定同位素组成的值，该值通过以下公式计算：(以‰计)＝(R样品/R标准-1)1000，其中“R”为13C:12C。计算同位素δ13C值的R标准基于国际标准Vienna PeeDee Belymine(VPDB)。
同位素δ15N值是指氮的稳定同位素组成的值，该值通过以下公式计算：(以‰计)＝(R样品/R标准-1)1000，其中“R”为15N:14N。计算同位素δ15N值的R标准基于大气15N:14N比率。
同位素δ34S值是指硫的稳定同位素组成的值，该值通过以下公式计算：(以‰计)＝(R样品/R标准-1)1000，其中“R”为34S:32S。计算同位素δ34S值的R标准基于Vienna-Canyon DiabloTroilite(VCDT)。
同位素特征可以通过同位素比率质谱法来测量。例如，Templeton等人Geochim.Cosmochim.Acta 70:1739,2006中提供了测量同位素的方法，其方法通过引用以其整体特此并入。在某些实施例中，同位素特征是从大量样品(例如，C1代谢非光合细菌的完整生物质)和一个或多个大量参考样品(例如，参考样品的肌肉)中确定的。在某些其他实施例中，通过化合物特异性同位素分析来确定同位素特征。化合物特异性同位素分析可以用于分析例如特定氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸)、氨基酸子集(例如，谷氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸)、总氨基酸、总脂质或总脂肪酸、饱和或不饱和脂肪酸、特定链长的氨基酸(例如，C16或C18)、特定脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸)、正构烷烃或靶向碳氢化合物(例如，类异戊二烯、维生素)的同位素特征。
在某些实施例中，C1代谢非光合细菌(例如，荚膜甲基球菌)生物质或其衍生物表现出以下至少一种、至少两种或全部：低于培养基(例如，酵母提取物、蛋白胨和大豆蛋白胨)中使用的其他碳源或氮源的δ13C值的δ13C值，低于培养基(例如，酵母提取液、蛋白胨和大豆蛋白胨)中使用的其他碳源或氮源的δ15值的δ15N值，低于培养基(例如，酵母提取物、蛋白胨和大豆蛋白胨)中使用的其他碳源或氮源的δ34S值的δ34S值。
在某些实施例中，细胞或组织培养基的C1代谢非光合细菌(例如，荚膜甲基球菌)和相关生物质表现出小于-30‰、小于-31‰、小于-32‰、小于-33‰、小于-34‰、小于-35‰、小于-36‰、小于-37‰、小于-38‰、小于-39‰、小于-40‰、小于-41‰、小于-42‰、小于-43‰、小于-44‰、小于-45‰、小于-46‰、小于-47‰、小于-48‰、小于-49‰、小于-50‰、小于-51‰、小于-52‰、小于-53‰、小于-54‰、小于-55‰、小于-56‰、小于-57‰、小于-58‰、小于-59‰、小于-60‰、小于-61‰、小于-62‰、小于-63‰、小于-64‰、小于-65‰、小于-66‰、小于-67‰、小于-68‰、小于-69‰或小于-70‰的δ13C。
在某些实施例中，细胞或组织培养基的C1代谢细菌(例如，荚膜甲基球菌)和相关生物质表现出约-35‰至约-50‰、-45‰至约-35‰、或约-50‰至约-40‰、或约-45‰至约-65‰、或约-60‰至约-70‰、或约-30‰至约-70‰的δ13C。
在另外的实施例中，C1代谢非光合细菌是专性甲烷营养菌，并且相关的生物质或其衍生物表现出小于约-30‰，或在约-40‰至约-60‰、或约-40‰至约-50‰的范围内的δ13C值。
培养基的C1代谢细菌的生物质或其衍生物可以包括赋予培养基优势的多种营养物。特别是，生物质的营养成分可以提供培养基中培养的细胞或组织的更有效生长，和/或可以赋予培养基中培养的细胞或组织或衍生自组织或培养基中培养的细胞或组织的细胞培养产物其他所需性质。
在一些实施例中，生物质或其衍生物包括血红素。“血红素”是指与铁配位的卟啉分子。“血红素铁”是指由血红素分子配位的铁。作为铁的饮食来源的血红素铁比非血红素铁更容易被吸收，并且其吸收途径与非血红素铁不同。与无机非血红素铁相比，血红素铁在小肠上部的高pH环境中保持可溶。如前所述，血红素铁(或血红素)可以与蛋白质连接，形成血红素蛋白。
本文公开的血红素的浓度通过基于在酸性条件下通过去除血红素铁将血红素转化为荧光卟啉衍生物的方法来测量(Sassa S(1976)Sequential induction of hemepathway enzymes during erythroid differentiation of mouse Friend leukemiavirus-infected cells[小鼠Friend白血病病毒感染细胞红系分化过程中血红素途径酶的顺序诱导].The Journal of experimental medicine[实验医学杂志]143(2):305-315)。然后可基于血红素与血红素铁之间的1:1摩尔比计算血红素铁的量。
在一些实施例中，生物质或其衍生物在生物质或其衍生物中每克蛋白质具有至少0.01mg、至少0.05mg或至少0.1mg血红素。在某些实施例中，生物质或其衍生物含有如0.01至5、0.01至2、0.01至1、0.001至0.5、0.05至10、0.05至5、0.05至2、0.05至1、0.005至0.5、0.1至10、0.1至5、0.1至2、0.1至1、0.1至0.5、0.2至10、0.2至5、0.2至2、0.2至1、0.2至0.5mg血红素/g蛋白质等0.01至10mg血红素/g蛋白质。
在一些实施例中，生物质或其衍生物(例如，自溶产物)包括在生物质或其衍生物中浓度为至少0.001mg/g蛋白质的血红素铁。在一些实施例中，生物质包括浓度为至少0.002mg/g、至少0.005mg/g或至少0.01mg/g的血红素铁。在一些实施例中，生物质中血红素铁的量在0.001至1mg/g、0.005至1mg/g、0.01至1mg/g、0.001至0.5mg/g、0.005至0.5mg/g、0.01至0.5mg/g、0.001至0.1mg/g、0.005至0.1mg/g、0.01至0.1mg/g、0.001至0.05mg/g、0.005至0.05mg/g或0.01至0.05mg/g的范围内。
在一些实施例中，生物质或其衍生物包括所需量的必需氨基酸。必需氨基酸是指人体不能产生的氨基酸，包括：组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸以及缬氨酸。必需氨基酸的量可以指所有九种必需氨基酸的总量。样品的氨基酸含量可以通过LC-质谱法或高效液相色谱法进行测量。总必需氨基酸可以通过测量样品中存在的组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸以及缬氨酸中的每一个的总重量来计算。在一些实施例中，生物质包含量为至少1mg/g的必需氨基酸。在一些实施例中，生物质包含量为至少1mg/g、至少2mg/g、至少5mg/g或至少10mg/g的必需氨基酸。在一些实施例中，生物质包含量为至少1mg/g的必需氨基酸。在一些实施例中，生物质包含量为在1至100mg/g、2至100mg/g、5至100mg/g、或10至60mg/g范围内的必需氨基酸。
在一些实施例中，生物质或其衍生物包括所需量的至少一种必需氨基酸。本文所用的必需氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸、组氨酸以及色氨酸。在一些实施例中，生物质或其衍生物包含量各自为在1-100mg/g范围内(如各自为10-80mg/g、各自为20-60mg/g)的必需氨基酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少1mg/g、至少2mg/g、或至少5mg/g或至少10mg/g的至少一种必需氨基酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的赖氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少1mg/g、至少2mg/g、至少5mg/g、至少10mg/g或至少15mg/g的甲硫氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的缬氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的亮氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的异亮氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的苯丙氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的苏氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的色氨酸。在一些实施例中，生物质包括如10-80mg/g和20-60mg/g等1-100mg/g、或至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g或至少20mg/g的组氨酸。
在一些实施例中，生物质或其衍生物包括浓度为按重量计至少20％、按重量计至少30％或按重量计至少40％的总氨基酸。在一些实施例中，生物质包括浓度为按重量计至少1％、按重量计至少5％、按重量计至少10％或按重量计至少15％的游离氨基酸。总氨基酸可以通过LC-质谱法或高效液相色谱法进行测量。
在一些实施例中，生物质或其衍生物包括铜，优选生物可利用铜。铜是一种天然存在于某些物质中的必需矿物，是参与能量产生、铁代谢、神经肽激活、结缔组织合成和神经递质合成的几种酶(称为“铜酶”)的辅因子。“生物可利用铜”是指容易被身体吸收的铜的形式。铜的生物利用度受到多种因素的影响。例如，由于存在植酸酶和纤维，植物来源的铜比其他饮食铜来源的生物可利用性更低。在一些实施例中，生物质或其衍生物包含量为在50-500mg/kg范围内的铜。在一些实施例中，生物质中铜的量为至少50mg/kg、至少75mg/kg或至少100mg/kg。在一些实施例中，生物质中的生物可利用铜的量为50至350mg/kg的范围内、75mg/kg或100mg/kg。例如，可以通过使用热电离和磁扇区质谱法对65Cu进行稳定同位素测量来测量铜(参见例如，Turnlund,J.,Science of The Total Environment[整体环境科学](28),1–3,1983,385-392)。
在特定实施例中，除了C1代谢细菌之外，培养基还包含一种或多种其他成分。可以基于将在培养基中培养的细胞或组织的类型来选择其他成分。培养基的其他成分可以包括以下中的一种或多种：液体或非液体载体或稀释剂(例如，水、如琼脂凝胶等凝胶、可凝胶化的液体)；矿物盐；如糖类等碳水化合物、有机醇(例如，甘油)以及其他包括有机酸(例如，乳酸或乳酸盐)的碳源；如硝酸盐等氮源、蛋白质片段、铵化合物、氨基酸以及如色氨酸等特别必需氨基酸；核酸或核酸片段；以及脂质。在某些实施例中，其他成分包括如葡萄糖或右旋糖等糖类。在某些实施例中，其他成分包括如钾、钙、镁、钠、钼、铁、锌、硼、钴、锰或镍等矿物盐。在某些实施例中，其他成分包括如粗农产品，如玉米浆、酵母提取物或蛋白胨等复合组分。
培养基可以是液体培养基或固体培养基，这取决于要培养的细胞类型。在特定实施例中，培养基是液体培养基。在特定实施例中，培养基是固体培养基。固体培养基可以通过例如将液体培养基与如琼脂糖等凝胶剂混合，并使培养基冷却和固化来产生。
在一些实施例中，将产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物用作培养基中的主要氮源。生物质或其衍生物可以用于取代培养基中使用的主要氮源和任选的一种或多种其他氮源。
培养基中使用的主要氮源包括无动物提取物和基于动物的提取物。培养基中使用的无动物提取物包括酵母提取物、大豆提取物、麦芽提取物、植物蛋白胨以及微生物蛋白胨。无动物提取物可以具有大约10％的氮含量。培养基中使用的基于动物的提取物包括，肉提取物包括牛肉提取物(例如，牛肉提取物粉末、BBLTM和BactoTM色氨酸)、猪提取物(例如，3号蛋白胨)、酪蛋白和小麦提取物(例如，BBLTM胰蛋白酶、TC乳白蛋白、Acidicase PeptoneBBL、Biosate Peptone BBL、酪蛋氨基酸、Bacto、酪蛋白消化物Difco、Casitone、Bacto)。细胞培养中使用的基于动物的提取物可以具有比无动物提取物更高的氮含量(例如，约13％)。
在一些实施例中，生物质或其衍生物取代蛋白胨作为培养基中的主要氮源。蛋白胨是有机化合物，为微生物、细胞提供碳源、有机氮源、生长因子和其他营养物。蛋白胨是从肉、酪蛋白、明胶、大豆、豌豆、小麦、马铃薯以及其他蛋白质中获得的。蛋白胨的主要类型包括动物蛋白胨、植物蛋白胨以及微生物蛋白胨。蛋白胨是水溶性复合物，衍生自蛋白质消化过程中的水解。它是有机化合物，并且是微生物和细胞生长中无机氮、肽和蛋白质的来源。蛋白胨是通过酸水解或酶将蛋白质部分分解为短肽和氨基酸而获得的。蛋白胨组成取决于蛋白质的来源和消化过程，这些因素决定了氨基酸和肽的相对流行率。
蛋白胨的示例包括基于大豆的蛋白胨(例如PhytoneTM蛋白胨，Select Soytone)、猪蛋白胨(例如，3号蛋白胨)、乳基蛋白胨(例如，TC乳白蛋白)、肉基蛋白胨(例如，BactoTM色氨酸、BBL牛肉提取物粉末、胆汁酸蛋白胨、新蛋白胨、Bacto蛋白胨、Polyeptone蛋白胨、Proeose蛋白胨、Thiotone)和酵母蛋白胨(例如，TC Yeastolate、BactoTM酵母提取物)。
在一些实施例中，生物质或其衍生物取代酵母提取物作为培养基中的主要氮源。有两种不同类型的酵母提取物：水解酵母提取物，也称为酵母蛋白胨和自溶酵母。水解酵母提取物是通过消化外源酶或酸来水解蛋白质而产生的。酵母自溶产物或酵母自溶提取物是通过酵母发酵到酵母死亡和细胞壁破裂的浓度水平而制成的。酵母自身的蛋白酶开始消化蛋白质，并将其分解为肽和氨基酸。去除不溶部分。
在一些实施例中，培养基适合于细菌细胞培养。通常用于细菌细胞培养的细胞培养基包括胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)；溶菌肉汤(LB，也称为Luria-Bertani肉汤)；对革兰氏阴性细菌有选择性的如Hektoen肠琼脂、MacConkey琼脂和木糖赖氨酸脱氧胆酸盐等培养基；以及对革兰氏阳性细菌有选择性的如甘露醇盐琼脂等培养基。本文公开的适合于细菌培养的培养基可以包含这种已知培养基的一种或多种成分。
在特定实施例中，培养基适合于海洋栖居细菌。适合于海洋栖居细菌的培养基可以包括过滤的海水。适合于海洋栖居细菌的培养基的示例是DifcoTM海洋肉汤2216。本文公开的适合于海洋栖居细菌培养的培养基可以包含已知海洋细菌培养基的一种或多种成分。
在一些实施例中，培养基适合于如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌属物种。在一些实施例中，适合于芽孢杆菌属物种(例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)的培养基包括KCl、MgCl2、NaCl和CaCl2中的至少一种，其浓度分别为例如约0.75、约2.5、约0.5和约5.0g/L。在一些实施例中，适合于芽孢杆菌属物种的培养基包括葡萄糖(例如，约20g/L)、牛肉提取物(例如，约9g/L)、KCl(例如，约0.75g/L)以及NaCl(例如，0.5g/L)。在一些实施例中，适合于芽孢杆菌属物种的培养基包括马铃薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycinemax)和/或鹰嘴豆(Cicer arietinum)的过滤水溶液。
在一些实施例中，培养基适合于大肠杆菌。适合于大肠杆菌的已知培养基的示例包括LB肉汤和LB琼脂，以及M9微量肉汤。本文公开的适合于大肠杆菌培养的培养基可以包含这种已知培养基的一种或多种成分。
在一些实施例中，培养基适合于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。适合于谷氨酸棒杆菌的已知培养基的示例是CGXII，其可以任选地补充脑心输注(BHI)和/或氨基酸(AA)混合物。本文公开的适合于谷氨酸棒杆菌培养的培养基可以包含这种已知培养基的一种或多种成分。
在一些实施例中，培养基适合于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。适合于恶臭假单胞菌的已知培养基的示例包括LB肉汤、LB琼脂和EWING的培养基。本文公开的适合于恶臭假单胞菌培养的培养基可以包含这种已知培养基的一种或多种成分。
在一些实施例中，培养基适合于黄单胞菌属(Xanthomonas)物种。适合于黄原单胞菌属物种的已知培养基的示例是蛋白胨蔗糖琼脂(PSA)、营养肉汤酵母提取物培养基(NBY)、生长因子(GF)琼脂以及改良的Wakimoto琼脂。本文公开的适合于黄单胞菌属物种培养的培养基可以包含这种已知培养基的一种或多种成分。
在一些实施例中，培养基适合于非细菌细胞培养。适合非细菌细胞培养的培养基可以包括抗菌剂。抗菌剂是抑制细菌有机体的生长和/或杀死细菌有机体的如小分子等试剂。抗菌剂的示例包括卡那霉素、链霉素以及青霉素。
在一些实施例中，培养基适合于藻类细胞培养。藻类细胞培养基可以包括海水基质和/或土壤提取物。海水基质是指天然海水(例如，无菌过滤海水)或包括纯净水和模仿海水含量的一定量的盐的合成海水。土壤提取物可以通过产生无菌过滤水中土壤悬浮液来产生。藻类细胞培养基的示例包括土壤水培养基、waris培养基和Guillard F/2培养基。本文公开的适合于藻类培养的培养基可以包含已知藻类培养基的一种或多种成分。
在一些实施例中，培养基适合于真菌细胞或组织培养。真菌细胞或组织培养基可以包括抗菌剂。通常用于真菌细胞或组织培养的培养基的示例包括YPD肉汤、CSM培养基、酵母氮基以及马铃薯右旋糖肉汤。本文公开的适合于真菌细胞或组织培养的培养基可以包含这样的常用肉汤的一种或多种如葡萄糖、右旋糖、酵母提取物、马铃薯提取物以及蛋白胨等成分。
在一些实施例中，培养基适合于酵母细胞培养。通常用于酵母细胞培养的培养基的示例包括YPD肉汤、CSM培养基以及酵母氮基。本文公开的适合于酵母细胞培养的培养基可以包含这样的常用肉汤的一种或多种如葡萄糖、右旋糖、酵母提取物以及蛋白胨等成分。
在一些实施例中，培养基适合于蘑菇细胞或组织培养。适合于蘑菇细胞或组织培养的培养基可以包括马铃薯提取物、谷物和/或结果基质。马铃薯提取物可以通过将清洗过但未去皮的马铃薯在蒸馏水中煮沸，然后倾析或用粗棉布过滤肉汤来制作。结果基质是指菌丝体生长的基质，可以包括以下一种或多种：稻草、枯木、锯末、木屑、如麦麸等谷物、以及咖啡渣。可用于菌丝体生长的培养基的示例包括马铃薯右旋糖肉汤或马铃薯右旋糖琼脂、酵母提取物肉汤或琼脂、麦芽提取物或琼脂、lamberts琼脂和堆肥提取物肉汤或琼脂糖、玉米粉提取物以及燕麦提取物。此外，以下是用于产生一升培养基的培养基和配方的示例：
·PDA-马铃薯右旋糖琼脂培养基：马铃薯右旋糖琼脂-39g，水-1000ml；MEA-麦芽提取物琼脂培养基：
·麦芽提取物-30g，琼脂-15g，水-1000ml；
·GPA-葡萄糖蛋白胨琼脂培养基：蛋白胨-20g，右旋糖-10g，Nacl-5g，琼脂-15g，水-1000ml；
·YMA-酵母麦芽琼脂培养基：麦芽-20g，酵母-2g，琼脂-15g，水-1000ml；以及
·SDA-Saboraud的葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖40g，琼脂-15g，蛋白胨-10g，水-1000ml。
适合于蘑菇细胞或组织培养的培养基的示例是马铃薯右旋糖肉汤。马铃薯右旋糖肉汤可以通过将200克洗净但未去皮的马铃薯在1升蒸馏水中煮沸30分钟，然后用粗棉布倾析或过滤肉汤来制作。添加蒸馏水，使得悬浮液的总体积为1升。然后加入20克右旋糖，并通过高压灭菌对培养基进行灭菌。
本文公开的适合于蘑菇细胞或组织培养的培养基可以包含已知蘑菇培养基的一种或多种成分。
在一些实施例中，培养基适合于动物细胞或组织培养。培养基可以包括已知动物细胞或组织培养基的一种或多种成分。动物细胞的典型培养基由氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖的补充物和作为生长因子、激素和附着因子的来源的血清组成。适合动物细胞或组织培养的培养基可以包括血清、生长激素、生长因子、抗菌剂和/或抗真菌剂。用于动物细胞或组织的培养基可以包括如改良的基本培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、RPMI-1640(“RPMI”)、Eagle最低基本培养基(EMEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)或Ham F12等培养基基质。用于动物细胞的培养基可以另外包括如磷酸盐缓冲盐水、Dulbecco磷酸盐缓冲液(Dulbecco's phosphate-buffered saline)和Hanks平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt Solution)等平衡盐溶液。
在一些实施例中，适合动物细胞或组织的培养基包括L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺是必需氨基酸。“必需氨基酸”是指细胞类型自身不能产生的氨基酸。L-谷氨酰胺为NAD、NADPH和核苷酸提供氮，并作为代谢的二级能源。L-谷氨酰胺是不稳定的氨基酸，随着时间的推移，它会转化为细胞无法使用的形式，因此应该在使用前添加到培养基中。
在一些实施例中，培养基包括血清。血清可以作为生长因子、激素和附着因子的来源添加到培养基中。此外，血清为不稳定或不溶于水的营养物、蛋白酶抑制剂提供载体或螯合剂，还结合和中和毒性部分。血清通常以2％-10％的浓度添加到动物细胞培养基中。可以使用的血清的示例包括如胎牛血清等牛血清、鸡血清、马血清、人血清和鱼血清。胎牛血清是最常添加到培养基中的血清。
在一些实施例中，培养基不包括血清。排除血清可能有益的原因包括：批次不一致、可能污染培养物、动物福利问题和供应问题。在一些实施例中，从用于产生食物成分的培养基中排除血清是特别有用的。在一些实施例中，在培养基中使用C1代谢微生物生物质或其衍生物允许排除血清，而不牺牲培养基中培养的细胞的生长效率。在一些实施例中，培养基包括如Ultroser G(特别适用于真核生物的生长)或蘑菇提取物等血清替代物。在一些实施例中，C1代谢微生物生物质或其衍生物用作血清替代物。
在一些实施例中，培养基包括生长因子。生长因子是天然存在的物质，能够刺激细胞增殖、伤口愈合，偶尔还会刺激细胞分化。生长因子可以通过血清提供给培养基，或者可以独立于血清添加到培养基中。生长因子的示例包括成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素、肾上腺素、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子。生长激素是指刺激生长的如人类生长激素(hGH)等肽类激素。
在某些实施例中，本文公开的适合动物细胞或组织的培养基包含一种或多种抗真菌剂。抗真菌剂是抑制真菌细胞的生长和/或杀死真菌细胞的如小分子等试剂。抗真菌剂的示例包括两性霉素B、伏立康唑和卡泊芬净。
用于动物细胞和组织的培养基的示例包括MEM+2mM谷氨酰胺+10％ FBS+1％非必需氨基酸(NEAA)；RPMI 1640+2mM谷氨酰胺+10％-20％ FBS；DMEM+2mM谷氨酰胺+5％新生小牛血清(NBCS)+5％ FBS；DMEM+2mM谷氨酰胺+10％ FBS；Ham′s F12+2mM谷氨酰胺+10％FBS；EMEM(EBSS)+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸(NEAA)+10％ FBS；F-12K+10％ FBS+100μg/ml肝素；以及RPMI-1640+10％FBS。
在一些实施例中，培养基适合于鱼或贝类细胞或组织培养。Eagle MEM是可用于鱼类细胞或组织培养的细胞培养基的示例(Fernandez等人Gyobyo Kenkyu,28(1),27-34,1993)。Grace的培养基、Leibovitz的-15(L-15)培养基和M199培养基是可以用于如贝类细胞等无脊椎动物细胞的培养基的示例。鱼组织培养中常用的成分的示例包括血清、如EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)等长链ω-3脂肪酸和其他脂肪酸、维生素E以及生长因子(如成纤维细胞生长因子)。可以用于贝类培养的成分的示例包括如衍生自对虾属物种(Penaeus species)(即，对虾)等血清和血淋巴提取物。血淋巴是指类似脊椎动物血液的液体，在节肢动物体内循环，同时与动物组织保持接触。本文公开的适合于鱼细胞或组织培养的培养基可以包含用于鱼或贝类细胞或组织培养的已知培养基的一种或多种如鱼血清等成分。鱼血清是细胞培养级血清，其可以衍生自鲑鱼中无菌提取的全血和血浆产物。
在一些实施例中，培养基适合于禽类细胞或组织培养。可以用于培养禽类细胞或组织的培养基的示例包括最低必需培养基(MEM)和Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。在一些实施例中，培养基包括如胎牛血清等血清或血清替代物。本文公开的适合于禽细胞或组织培养的培养基可以包含用于禽类细胞或组织培养的已知培养基的一种或多种如葡萄糖和鸡血清等成分。
在一些实施例中，培养基适合于昆虫细胞或组织培养。可以用于昆虫细胞或组织培养的培养基的示例包括ExpiSf CD培养基、Sf-900 III SFM和Sf-900 II SFM，以及包括IPL-41基础培养基、大豆蛋白水解物、酵母酯、脂质甾醇乳液和Pluronic F-68的培养基(Donaldson,M.S.,以及Shuler,M.L.(1998).Biotechnol.Prog.[生物技术进展]14,573–579)。本文公开的适合于昆虫细胞或组织培养的培养基可以包含用于昆虫细胞或组织培养的已知培养基的一种或多种如大豆提取物、酵母提取物、葡萄糖以及乳清蛋白等成分。
在一些实施例中，在细胞培养基中提供C1代谢细菌的生物质或其衍生物，作为如酵母提取物或酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白或乳清蛋白胨、或肉蛋白胨等常见主要营养物来源(例如，氮源或碳源)的替代物。“主要”营养物来源是指提供50％以上特定营养物来源的营养物来源。例如，主要氮源是指在培养基中提供50％以上氮的氮源。在一些实施例中，生物质或其衍生物是如氮或碳等营养物的唯一或主要来源。例如，对于包括细菌用胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的培养基(例如，Luria-Bertani肉汤)，细菌用胰蛋白胨和酵母提取物中的一种或两种可以用C1代谢细菌的生物质或其衍生物取代。
在特定实施例中，通常包括常见营养源的细胞培养基可以被修饰以用C1代谢细菌的生物质取代常见营养源，取代比率范围为约1:10至约10:1、约1:5至约5:1、或约1:2至约2:1(常见源：C1代谢细菌的生物质，按重量计)。在特定实施方式中，通常包括常见营养源的细胞培养基可以被修饰以用C1代谢细菌的生物质取代常见营养源，取代比率为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1(常见源：C1代谢细菌的生物质，按重量计)。
本公开还提供了本文所述的细胞或组织培养基的浓缩物。可以将这样的浓缩物稀释到适合培养各种类型的细胞或组织(例如，适合培养细菌细胞或适合培养非细菌细胞或组织)的细胞或组织培养基中。浓缩物可以是液态、半固态(例如，凝胶)或固态。
B.培养细胞或组织的方法
如前所述，本文提供了细胞或组织培养或发酵的方法。
在一些实施例中，方法包括在培养基或发酵培养基中培养细胞或组织，培养基或发酵培养基包含本文提供的产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物。在某些实施例中，生物质或其衍生物中血红素的量在0.01至10.0mg/g蛋白质的范围内，和/或培养基中生物质或其衍生物的量在0.1至20g/l的范围内。
在一些实施例中，方法包括培养细菌细胞。在一些实施例中，细菌细胞选自如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌属物种、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌、如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)等黄单胞菌属物种、海洋栖居细菌和植物保护性细菌。在一些实施例中，细菌细胞是用于食品或饮料发酵的细菌，和/或用作益生菌。益生菌中使用的微生物的示例包括几种乳杆菌(例如，发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bf.bifidum)、长双歧杆菌(Bf.longum)、婴儿双歧杆菌(Bf.infantis)、动物双歧杆菌(Bf.animalis)、短双歧杆菌(Bf.breve)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)以及凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。“益生菌”可以指以活的形式施用并具有健康优势的活微生物培养物。口服益生菌能够以活的形式通过胃肠道。
在一些实施例中，细菌是海洋栖居细菌。可以培养的海洋栖居细菌的示例包括如肺鲐希瓦氏菌等希瓦氏菌属物种、深海嗜压菌(Photobacterium profundum)、海摩替亚氏菌以及弧菌属物种(Vibrio species)。希瓦氏菌属物种和海摩替亚氏菌是能够产生如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等ω-3脂肪酸的海洋栖居细菌。
在特定实施例中，细菌是植物保护性细菌。“植物保护性细菌”是如细菌病原体、病原线虫和/或病原真菌等能够保护植物免受病原体侵害的细菌。植物保护性细菌的示例包括甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotropicus)和枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
在一些实施例中，细菌用于食品或饮料发酵。用于食品或饮料发酵的细菌的示例包括乳球菌属物种、乳杆菌属物种、链球菌属物种、双歧杆菌属物种、球菌属物种、微球菌属物种、明串珠菌属物种、葡萄球菌属物种和纳地青霉。
在一些实施例中，方法包括培养非细菌细胞或组织。非细菌细胞或组织可以包括藻类细胞、真菌细胞和/或动物细胞。
在一些实施例中，方法包括培养藻类细胞。藻类主要是水生光合生物，包括微藻(指单细胞藻)和大型藻(指多细胞藻)。在特定实施例中，藻类细胞是裂殖壶菌，其是能够产生如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等ω-3脂肪酸的海洋微藻。
在一些实施例中，方法包括培养真菌细胞或组织。真菌细胞或组织包括酵母细胞和蘑菇细胞或组织。用于生产感兴趣的成分的真菌或酵母的示例是黑曲霉(Aspergillusniger)、木霉(Trichoderma)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、棉病囊霉(Ashbyagossypii)、Morteriella isabellina以及卷枝毛霉(Mucor circinelloides)。
在一些实施例中，方法包括培养酵母细胞。在特定实施例中，酵母细胞是布鲁塞尔酒香酵母(B.bruxellensis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)或铁红梅氏酒香酵母(B.claussenii)等酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或酒香酵母(Brettanomyces)。
在一些实施例中，方法包括培养蘑菇细胞或组织。为了培养蘑菇，可以从孢子或蘑菇组织中开始产生蘑菇卵。卵可以在如包括产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质的琼脂培养基等培养基中培养。接下来，可以将卵播种在如原木等基质上，以产生子实体。可以使用的蘑菇的示例包括香菇(Lentinula edodes)、平菇(蘑菇属多个物种)和白蘑菇(变褐蘑菇(Agaricus brunnescens))。
在一些实施例中，方法包括培养动物细胞或组织。根据细胞类型，动物细胞可以在如在烧瓶中或在培养皿或培养板中的一层或多层中等液体培养悬浮液中培养。可以使用的动物细胞的示例包括鱼或贝类细胞或组织、昆虫细胞或组织、禽类细胞或组织、或哺乳动物细胞或组织。
培养动物细胞可以用于产生细胞培养肉产物。“细胞培养肉产物”是指通过体外培养动物细胞或组织而不是屠宰动物产生的肉。可用于产生细胞培养肉产物的细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、肌卫星细胞、成肌细胞、肌细胞和/或肌肉细胞。在一些实施例中，动物细胞包含胚胎干细胞、成体干细胞、肌卫星细胞、成肌细胞、肌细胞和/或肌肉细胞。与通过在不存在产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的情况下培养动物细胞或组织而产生的细胞培养肉产物相比，通过本文公开的方法产生的细胞培养肉产物可以具有改进的风味(例如，更具金属味或更鲜味)和/或视觉吸引力(例如，颜色更红)。
在一些实施例中，方法包括培养鱼或贝类细胞或组织。可以培养鱼或贝类细胞或组织来产生细胞培养海鲜。“细胞培养海鲜产物”是指通过体外培养鱼或贝类细胞或组织而不是从整个动物中产生的可食用鱼或贝产物。在一些实施例中，鱼或贝类细胞或组织包含鱼肌肉组织。贝类细胞或组织的示例包括甲壳动物和软体动物细胞和组织。与在不存在产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的情况下培养鱼或贝类细胞相比，通过本文公开的方法产生的细胞培养海鲜产物可以具有改善的“鱼腥味”或鲜味。
在一些实施例中，方法包括培养禽类细胞或组织。禽类细胞或组织可以用于产生细胞培养禽肉产物。“细胞培养禽肉产物”是指通过体外培养禽类细胞或组织而不是从整个动物中产生的禽肉产物。禽类细胞可以包括鸡细胞、火鸡细胞、鹌鹑细胞、鸭细胞、鹅细胞。例如，鸡肌肉细胞或组织可以生长以产生细胞培养鸡肉产物。
在一些实施例中，方法包括培养昆虫细胞或组织。如昆虫肌肉细胞或脂肪体细胞等昆虫细胞，可以作为食物来源进行培养。通常在细胞培养物中生长的昆虫细胞包括家蚕(Bombyx mori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)以及黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。
在一些实施例中，方法包括培养哺乳动物细胞或组织。哺乳动物细胞或组织可以用于产生细胞培养肉产物。哺乳动物细胞的示例包括猪(例如，母猪或公猪)细胞、牛(例如，母牛或野牛)细胞、绵羊细胞、山羊细胞、袋鼠细胞以及豚鼠细胞。例如，猪肌肉细胞或组织可以用于产生细胞培养猪肉产物。
在一些实施例中，方法包括从生长培养基中分离培养的细胞以产生分离的培养细胞和/或分离的上清液。在一些实施例中，通过离心和/或过滤将细胞与上清液分离。
在一些实施例中，方法包括从培养的细胞或组织中隔离所需产物。所需产物可以选自维生素、脂肪酸、氨基酸、核苷、肽、蛋白质、酶、色素、调味剂、香料、有机酸、防腐剂、小分子代谢物、发酵剂、培养物、益生菌以及细胞培养肉。小分子代谢物是低分子量(例如，高达1500道尔顿)的有机化合物，通常作为底物或产物参与生物过程。小分子代谢物的示例包括乙酸、柠檬酸、乳酸、异抗坏血酸以及甘油。在一些实施例中，所需产物是在培养基中培养的细胞或组织的生物质或其衍生物。
在包括本文所述的C1代谢细菌的生物质或其衍生物的培养基中培养细胞或组织可以导致细胞或组织更快或更有效的生长。“更快或更有效的生长”是指细胞以更快的速率生长或分裂的能力。在一些实施例中，与在不存在生物质或其衍生物的情况下培养的等效细胞或组织相比，在包括C1代谢细菌的生物质或其衍生物的培养基中培养的细胞或组织以至少快5％、至少快6％、至少快7％、至少快8％、至少快9％、至少快10％、至少快15％、至少快20％、至少快25％、至少快30％、至少快35％、至少快40％、至少快45％或至少快50％的速率生长。生长效率可以通过如通过显微镜或分光光度法等计数细胞来测量，并绘制一段时间内的细胞数以获得生长速率。更快或更有效的生长可以基于生物质的高营养状况。在一些实施例中，与在参考细胞或组织培养基中培养细胞或组织相比，通过本文所述的方法培养细胞或细胞组织使得细胞或组织的生长速率提高。
在一些实施例中，与在不存在生物质或其衍生物的情况下培养的等效细胞或组织产生的所需产物相比，在包括C1代谢细菌的生物质或其衍生物的培养基中培养的细胞或组织提供由培养的细胞或者组织产生的所需产物的增强产量(即，增强生产率)，其中增强产量至少高2％、高5％、至少高6％、至少高7％、至少高8％、至少高9％、至少高10％、至少高15％、至少高20％、至少高25％、至少高30％、至少高35％、至少高40％、至少高45％或至少高50％(按重量测量)。
在一些实施例中，与在不存在生物质或其衍生物的情况下培养的等效细胞或组织的产量相比，在包括C1代谢细菌的生物质或其衍生物的培养基中培养的细胞或组织在培养期间提供细胞或组织的增强产量，其中增强产量至少高2％、高5％、至少高6％、至少高7％、至少高8％、至少高9％、至少高10％、至少高15％、至少高20％、至少高25％、至少高30％、至少高35％、至少高40％、至少高45％或至少高50％(按重量测量)。
在一些实施例中，与在不存在生物质或其衍生物的情况下培养的等效细胞或组织产生感兴趣的产物的效率相比，在包括C1代谢细菌的生物质或其衍生物的培养基中培养的细胞或组织通过培养细胞或组织提供产生感兴趣的产物的增强效率(即，增强速率)，其中增强效率至少高2％、高5％、至少高6％、至少高7％、至少高8％、至少高9％、至少高10％、至少高15％、至少高20％、至少高25％、至少高30％、至少高35％、至少高40％、至少高45％或至少高50％(按重量测量)。
本文所用的“参考培养基”是指与培养基相同的培养基，培养基包括产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物，除了参考培养基包括不是衍生自产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的主要氮源(例如，酵母提取物、蛋白胨、本文所述或在已知细胞或组织培养基中使用的另一种主要氮源)。参考培养基不包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的任何生物质或其衍生物。
C.细胞或组织培养产物或发酵产物
如前所述，本文提供了细胞或组织培养产物或发酵产物。细胞或组织产物可以通过如前所述的培养细胞或组织的方法来产生。培养细胞或组织的方法可以包括除了培养细胞或细胞组织之外的如从生长培养基中分离培养的细胞以产生分离的培养细胞和/或分离的上清液，和/或从培养的细胞或组织中分离所需产物等另外的步骤。在一些实施例中，处理细胞或组织培养产物包括从发酵或培养的细胞或组织中隔离、浓缩、分离和/或纯化所需产物。
在一些实施例中，细胞或组织培养产物或发酵产物包括分离的培养细胞。在一些实施例中，分离的培养细胞是活的分离培养细胞。包括活的分离培养细胞的细胞培养产物的示例可以包括益生菌、乳制品培养物、肉腌制培养物、植物保护性细菌细胞产物以及用于烘焙或酒精饮料产生的酵母起子培养物。“乳制品培养物”是指活微生物培养物，通常是细菌培养物，将其添加到乳制品中，以产生如奶酪、酸奶、酪乳、酸奶油或开菲尔等发酵乳制品。乳制品培养物的示例包括乳杆菌和双歧杆菌。“肉腌制培养物”是指将活微生物培养物添加到肉中，以生产发酵或腌制的如香肠等肉产物。
在一些实施例中，细胞或组织培养产物或发酵产物包括分离的上清液。作为分离的上清液的产物的示例包括：特定氨基酸(例如，赖氨酸和苏氨酸)、肽和蛋白质、脂肪酸(例如EPA和DHA)、有机酸(例如柠檬酸)、酶(例如，凝乳酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和碳水化合物)、色素(例如，类胡萝卜素)、调味剂和香料(例如，香草醛和薄荷醇)、发酵剂、培养物、益生菌(例如，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、嗜热链球菌和苏云金芽孢杆菌)、维生素(例如，维生素B12和维生素B2)；活性药物成分(例如，青霉素、头孢菌素、红霉素、土霉素、四环素、去甲四环素、林可霉素、庆大霉素钾以及克拉维酸)。
在一些实施例中，细胞或组织培养产物或发酵产物包括一种或多种如前所述的所需产物。与参考细胞或组织培养产物相比，细胞或组织培养产物可以包括含量升高的一种或多种所需产物。“参考细胞或组织培养产物”是在与产生本公开的细胞或组织产物相同的条件下产生的产物，不同之处在于使用本文定义的参考培养基代替包含C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的生长培养基。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的所需产物。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括5％至200％、5％至100％、5％至50％、10％至200％、10％至100％、5％至25％、25％至50％、50％至100％或100％至200％的所需产物。
在一些实施例中，所需产物是小分子代谢物。小分子代谢物是低分子量(例如，高达1500道尔顿)的有机化合物，通常作为底物或产物参与生物过程。小分子代谢物的示例包括乙酸、柠檬酸、乳酸、异抗坏血酸以及甘油。在特定实施例中，小分子代谢物是柠檬酸或乳酸。
在一些实施例中，所需产物是维生素。在特定实施例中，维生素是如维生素B6或维生素B12等B族维生素。
在一些实施例中，所需产物是酶(例如，重组产生的酶)。在特定实施例中，酶选自凝乳酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶以及碳水化合物。在特定实施例中，所需产物是酶，并且培养的细胞或组织包含如枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属物种、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或恶臭假单胞菌。
凝乳酶，也称为肾素，是蛋白水解酶，能够凝固或凝结牛奶，通常用于奶酪制作。牛凝乳酶是常用的凝乳酶形式，可以重组产生。在某些实施例中，所需产物是重组产生的凝乳酶。
可以作为所需产物产生的蛋白酶的示例包括碱性蛋白酶、savinase、esperase、木瓜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶。
可以作为所需产物产生的脂肪酶的示例包括植物来源的脂肪酶和动物来源的脂肪酶。
在一些实施例中，所需产物是ω-3脂肪酸。在特定实施例中，ω-3脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)和/或二十碳六烯酸(DHA)。在某些实施例中，ω-3脂肪酸由海洋栖居细菌或藻类细胞的培养物产生。
在一些实施例中，所需产物是类胡萝卜素。类胡萝卜素是衍生自四萜的色素，四萜是由8个包含40个碳的多烯结构的异戊二烯(C5)单元构成的化合物。根据本公开可以产生的类胡萝卜素包括虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、花药黄质、岩藻黄素、硅藻黄质、硅甲藻黄素、玉米黄质、角黄素。在某些实施例中，类胡萝卜素由微藻(例如，雨生血球菌(Haematococcus pluvialis))、细菌(例如，Paracoccus carotinifaciens)和酵母(例如，红酵母属物种(Rhodotorula sp.)、红冬孢酵母属物种(Rhodosporidium sp.)、掷孢酵母属物种(Sporobolomyces sp.)、Xanthophylomyces sp.、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma))的培养物产生。在一些实施例中，所需产物是黄原胶。黄原胶是可食用的多糖，具有广泛的工业用途，包括食物、石油产品以及化妆品。在特定实施例中，所需产物是黄原胶，并且培养的细胞或组织包含如野油菜黄原单孢菌(Xanthomonas campestris)等黄原单胞菌属物种(Xanthamonas species)。
在一些实施例中，所需产物是生物基聚合物。生物基聚合物被定义为至少一部分聚合物由如植物或微生物等可再生原材料产生的材料构成的材料。生物基聚合物的示例包括聚乳酸生物聚合物(PLA)、聚L-丙交酯、聚羟基丁脲酸酯、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚羟基丁酸酯(PHB)聚酰胺、聚丙烯(PP)。在特定实施例中，所需产物是生物基聚合物，并且培养的细胞或组织包含恶臭假单胞菌。在特定实施例中，生物基聚合物是聚羟基链烷酮(PHA)，并且培养的细胞或组织包含恶臭假单胞菌。
在某些实施例中，所需产物是以下中的一种或多种：芳族化合物(例如，vailin、邻甲酚、4-羟基喹哪啶、对香豆素、对羟基苯乙烯、苯酚、肉桂酸盐以及邻氨基苯甲酸盐)、二羧酸(例如，黏酸盐、己二酸以及呋喃二羧酸)、酸和醇(例如，乳酸盐、丙酮酸盐、乙醇酸盐、乙醛酸盐、草酸盐、乙酸盐、乙醇、乙烯以及正辛醇)、内酯(例如，4-戊内酯)、糖脂(例如，鼠李糖脂)、萜类化合物(例如，β-胡萝卜素、玉米黄质以及番茄红素)、天然产物(例如，myxochromide S、黏硫菌素A、灵菌素、2,4-二乙酰基氯葡萄糖酚、蚕豆素、微管溶素、吩嗪羧酸盐以及喹诺酮类)、脂肪酸(例如，二十二碳六烯酸)、蛋白质(例如，抗体片段)、生物聚合物(例如，PHA)、藻酸盐、聚酮以及非核糖体肽。在特定实施例中，培养的细胞或组织包含恶臭假单胞菌。
在一些实施例中，与参考细胞或组织培养产物相比，细胞或组织培养产物或发酵产物包括升高浓度的ω-3脂肪酸。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的ω-3脂肪酸。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括5％至100％、5％至50％、10％至200％、10％至100％、5％至25％、25％至50％、50％至100％或100％至200％的ω-3脂肪酸。
在一些实施例中，所需产物是在培养基中培养的细胞或组织的生物质或其衍生物。
在一些实施例中，所需产物是血红素铁。在一些实施例中，与参考细胞或组织培养产物相比，细胞或组织培养产物包括含量升高的血红素铁或血红素蛋白。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培育产物多包括至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的血红素铁或血红素蛋白。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括5％至100％、5％至50％、10％至200％、10％至100％、5％至25％、25％至50％、50％至100％或100％至200％的血红素铁或血红素蛋白。
在一些实施例中，与参考细胞或组织培养产物相比，细胞或组织培养产物包括总含量升高的铁。细胞或组织培养产物中的铁可以是血红素铁的形式和/或不与血红素中的卟啉分子配位的另一种形式(非血红素铁)。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括至少2％、5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的总铁。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括5％至100％、5％至50％、10％至200％、10％至100％、5％至25％、25％至50％、50％至100％或100％至200％的总铁。在不希望受任何理论约束的情况下，铁的总含量升高被认为至少部分是由培养基或发酵培养基中C1代谢非光合细菌生物质或其衍生物提供的血红素铁的含量升高引起的。
在一些实施例中，与参考细胞或组织培养产物相比，细胞或组织培养产物包括含量升高的非血红素铁。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括至少2％、5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的非血红素铁。在一些实施例中，细胞或组织培养产物比参考细胞或组织培养产物多包括5％至100％、5％至50％、10％至200％、10％至100％、5％至25％、25％至50％、50％至100％或100％至200％的非血红素铁。在不希望受任何理论约束的情况下，非血红素铁的含量升高被认为至少部分是由培养基或发酵培养基中C1代谢非光合细菌生物质或其衍生物提供的血红素铁的含量升高引起的。
在一些实施例中，产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物包含自溶产物，并且其中与在不包含自溶产物的参考培养基中培养的细胞或组织的生物质相比，培养的细胞或者组织的生物质包含含量升高的血红素或血红素蛋白。在一些实施例中，细胞或组织的生物质包含细胞培养肉产物或肉替代产物。
在一些实施例中，细胞或组织培养产物包括含量升高的铁、血红素和/或血红素蛋白，并且选自：蘑菇细胞或组织的培养产物、益生菌、乳制品培养物、肉腌制培养物、素肉替代产物或其组合。具有含量升高的血红素的细胞或组织培养产物可以具有如增强风味和/或增强视觉吸引力等所需性质。具有含量升高的血红素的细胞或组织培养产物的增强风味可以包括更多鲜味和/或更多金属味。具有含量升高的血红素的细胞或组织培养产物的增强视觉吸引力可以包括更红的颜色。增强风味和增强视觉吸引力可以由品尝师小组进行评估。
在一些实施例中，细胞或组织培养产物的同位素δ13C值低于参考细胞或组织培养产物的同位素δ13C值。较低的同位素δ13C值基于在培养产物的细胞或组织的培养期间培养基中存在C1代谢非光合细菌或其衍生物的生物质，以及在参考细胞或组织产物的细胞或组织的培养期间培养基中不存在C1代谢非光合细菌或其衍生物的生物质。在一些实施例中，同位素δ13C值比参考培养产物的值低至少1％、低至少2％、低至少3％、低至少4％、低至少5％、低6％、低至少7％、低至少8％、低至少9％、低至少10％。在一些实施例中，同位素δ13C值比参考培养产物的值低1％至50％、低5％至50％、低1％至5％或低5％至10％。
在另外的实施例中，细胞或组织培养产物的同位素δ15N值低于参考细胞或组织培养产物的同位素δ15N值。较低的同位素δ15N值基于在培养产物的细胞或组织的培养期间存在C1代谢非光合细菌或其衍生物的生物质，以及在参考细胞或组织产物的细胞或组织的培养期间培养基中不存在C1代谢非光合细菌或其衍生物的生物质。在一些实施例中，同位素δ15N值比参考培养产物的值低至少1％、低至少2％、低至少3％、低至少4％、低至少5％、低6％、低至少7％、低至少8％、低至少9％、低至少10％。在一些实施例中，同位素δ15N值比参考培养产物的值低1％至50％、低5％至50％、低1％至5％或低5％至10％。
在另外的实施例中，细胞或组织培养产物的同位素δ34S值低于参考细胞或组织培养产物的同位素δ34S值。较低的同位素δ34S值基于在培养产物的细胞或组织的培养期间培养基中存在C1代谢非光合细菌或其衍生物的生物质，以及在参考细胞或组织产物的细胞或组织的培养期间培养基中不存在C1代谢非光合细菌或其衍生物的生物质。在一些实施例中，同位素δ34S值比参考培养产物的值低至少1％、低至少2％、低至少3％、低至少4％、低至少5％、低6％、低至少7％、低至少8％、低至少9％、低至少10％。在一些实施例中，同位素δ34S值比参考培养产物的值低1％至50％、低5％至50％、低1％至5％或低5％至10％。
在一些实施例中，细胞或组织培养产物是细菌细胞产物。细菌细胞产物的示例包括植物保护性细菌细胞产物、益生菌、乳制品制作培养物、肉腌制培养物以及用于酒精饮料发酵的细菌培养物。
在一些实施例中，细胞或组织培养产物包含植物保护性细菌细胞产物。植物保护性细菌细胞产物可以是直接应用于植物的细菌细胞的液体培养物的形式。
在一些实施例中，细胞或组织产物是非细菌细胞或组织产物。非细菌细胞或组织产物可以是藻类细胞产物、真菌细胞或组织产物、或动物细胞或组织产物。
藻类细胞产物可以包括，例如，含有一种或多种如二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)等ω-3脂肪酸的藻类油或如虾青素、玉米黄质、叶黄素、花药黄质、岩藻黄素、硅藻黄质和硅甲藻黄素等藻类类胡萝卜素。
真菌细胞或组织产物包括酵母细胞产物和蘑菇细胞或组织产物。例如，真菌细胞或组织产物可以用作素肉替代食物产品。“素肉替代产物”或“肉替代产物”是指衍生自非动物生物，但具有如肉样风味和/或肉样外观(如红色或红棕色)等肉样品质的食物产品。例如，素肉替代产物可以由酵母细胞或蘑菇细胞或组织产生，并且可以具有肉样品质，这是通过培养含C1代谢非光合细菌的生物质的酵母细胞或菇细胞或组织而获得的。例如，细胞或组织培养产物中升高的血红素铁可以为在生长培养基中培养的真菌细胞或组织提供肉样风味和/或肉样外观，生长培养基包括C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物。肉样风味和肉样外观可以由品尝师小组进行评估。
在某些实施例中，细胞或组织产物是非微生物细胞或组织产物。非微生物细胞或组织产物可以是非微生物藻类、真菌、或动物细胞或组织产物。微生物是微观生物，可以以单细胞形式或细胞集落形式存在。非微生物细胞或组织产物是由微生物以外的生物体的细胞或组织培养产生的产物。
动物细胞或组织产物可以包括鱼、禽类、昆虫和哺乳动物细胞或组织培养产物。动物细胞或组织产物可以包括细胞培养肉产物。细胞培养肉产物是从动物细胞或组织培养中产生的肉产物，而不是从活体动物中收获的肉产物。
在一些实施例中，对细胞或组织产物进行加工以产生食物产品和食物成分。本文提供了制作食物产品和食物成分的方法。在一些实施例中，方法包括通过本文所述的培养方法产生细胞培养产物，以及加工细胞培养产物以产生食物产品或食物成分。处理细胞培养产物可以包括细胞培养产物的分离、过滤、澄清、沉淀、絮凝、蒸发和/或干燥。
在一些实施例中，食物产品或食物成分是酵母产物。在一些实施例中，酵母产物是如用于开菲尔或康普茶或用于酒精饮料(例如，啤酒和葡萄酒)等用于发酵饮料产生的起子培养物。在一些实施例中，起子培养物是啤酒起子培养物或葡萄酒起子培养物。在一些实施例中，酵母产物是面包酵母或营养酵母。
在一些实施例中，食物产品或食物成分是细菌细胞产物。在一些实施例中，细菌细胞产物是如酸奶制作培养物、奶酪制作培养物或如酸啤酒等酒精饮料培养物等乳制品制作培养物。用于制作奶酪的细菌培养物包括乳球菌(Lactococcus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)以及链球菌(Streptococcus)。用于制作酸奶的细菌培养物包括嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)。用于酒精饮料发酵的细菌培养物包括乳酸杆菌(Lactobacillus)和球菌(Pediococcus)。在一些实施例中，细菌细胞产物是肉腌制培养物。涉及肉腌制的细菌的示例包括酿酒葡萄球菌(Pediococcus cerevisiae)、微球菌(Micrococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、某些葡萄球菌属物种(Staphylococcus species)、乳酸杆菌(Lactobacillus)以及纳地青霉(Penicillium nalgiovense)。
在一些实施例中，食物产品或食物成分是益生菌。在一些实施例中，益生菌由细菌细胞培养产物产生。在一些实施例中，益生菌中的细菌细胞包括以下中的一种或多种：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)、干酪副乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
在一些实施例中，所需产物是小分子、醇、酶或生物基聚合物，并且培养细胞包括恶臭假单胞菌。
在一些实施例中，食物产品或食物成分是食用香料和/或香料和/或如香草醛、薄荷醇、圆柚酮、朱栾倍半萜、广藿香和香根草等防腐剂。在一些实施例中，食物产品或食物成分是如乳酸、迷迭香酸或鼠尾草酸等防腐剂。
实施例
实施例1
荚膜甲基球菌巴斯(NCIMB 11132)生物质自溶产物的产生
通过在45℃、pH 6.5的铵盐/矿物盐培养基(AMS)中对天然气进行连续需氧发酵，在5L搅拌槽中培养荚膜甲基球菌巴斯和异养细菌贪铜菌属物种DB3(菌株NCIMB 41527)、解硫胺素芽孢杆菌属物种DB4(Aneurinibacillus sp.DB4；菌株NCIMB 41528)和土壤短芽孢杆菌DB5(菌株NCIMB 41525)。AMS培养基每升含有以下：10mg NH3、75mg H3PO4.2H2O、380mgMgSO4.7H2O、100mg CaCl2.2H2O、200mg K2SO4、75mg FeSO4.7H2O、1.0mg CuSO4.5H2O、0.96mgZnSO4.7H20、120μg CoCl2.6H2O、48μgMnCl2.4H2O、36μg H3BO3、24μg NiCl2.6H2O以及1.20μgNaMoO4.2H2O。在发酵罐中加入经过125℃加热灭菌10秒的水。不同营养素的添加根据其消耗量进行调节。使用1％-3％的生物质(基于干重)进行连续发酵。将生物质在圆盘堆叠离心机中以3,000rpm进行离心，任选地随后使用排阻尺寸为100,000道尔顿的膜进行超滤。然后将所得产物在工业均化器中进行均化(压降：1000巴(100MPa)；入口温度：15℃以产生均质生物质(样品B145))。将10％至18％的生物质悬浮液加热至50℃至55℃的最佳反应温度，并通过添加NaOH将pH调节至7.0-7.5。孵育时间为45分钟至3小时，在此期间，材料的温度保持在50℃至55℃的范围内，pH保持在7.0至7.5的最佳范围内3小时(样品B135)。对于更可溶的自溶产物样品(分别通过孵育1、2和3小时产生的样品B139、B140和B141)，将蛋白酶(主要由枯草杆菌蛋白酶A构成的丝氨酸内肽酶混合物)添加到均质生物质中，以在孵育步骤开始时增加水解度。在不存在蛋白酶的情况下产生了可溶性较低的样品。孵育后，将生物质在70摄氏度至80摄氏度下进行1至5分钟的热灭活步骤。然后将样品冷冻干燥(在某些情况下，可以对样品进行喷雾干燥)。
4个自溶产物样品(通过向自溶步骤中添加蛋白酶获得的可溶性更强的自溶产物样品B139、B140和B141，以及不添加蛋白酶的可溶性更低的自溶体样品B135)和匀浆样本(B145，其被等效地处理至产生均质生物质的步骤，但没有自溶步骤)的分子量分布通过使用Tosoh Bioscience的
Figure BDA0004186563840000351
G2000SWXL尺寸排阻柱的高效液相色谱(HPLC)和凝胶渗透色谱(GPC)进行分析。结果如图1所示。分子量分布表明，所有自溶产物样品具有比匀浆样品(只有约12％的肽低于1kDa)相对更多的小尺寸肽(超过20％的肽<1kDa)。这种自溶水平升高在用蛋白酶处理的样品中更为明显(>40％的肽<1kDa)—孵育时间越长，小肽就越多。
分析了其他批次(B143、B149、B146和B152)自溶产物的特性，并且总结如表1所示。
表1.
Figure BDA0004186563840000361
七个自溶产物样品(B137、B143、B149、B156、B146、B152和B153)的血红素浓度通过基于在酸性条件下通过去除血红素铁将血红素转化为荧光卟啉衍生物的方法来测量(Sassa S(1976)Sequential induction of heme pathway enzymes during erythroiddifferentiation of mouse Friend leukemia virus-infected cells[小鼠Friend白血病病毒感染细胞红系分化过程中血红素途径酶的顺序诱导].The Journal ofexperimental medicine[实验医学杂志]143(2):305-315)。使用1摩尔血红素铁/摩尔血红素的关系计算血红素铁。自溶产物样品的血红素和血红素铁浓度如表2所示。表2中标记为“自溶产物”的产物类型是指在不添加任何蛋白酶的情况下产生的可溶性较低的自溶产物。表2中标记为“自溶产物HS”的产物类型是指使用添加的蛋白酶碱性蛋白酶产生的更可溶的裂解物。
表2.
Figure BDA0004186563840000362
HS＝高溶解度
实施例2
用C1代谢非光合细菌的生物质进行培养的海洋栖居生物的生长
在以下实施例中，在(a)(1)包括荚膜甲基球菌巴斯的生物质的培养基或(2)包括由生物质产生的自溶产物的培养基，(b)含碳源但不含任何荚膜甲基球菌巴斯生物质或自溶产物，或(c)不含碳源的培养基(作为阴性对照)中培养海摩替亚氏菌、肺鲐希瓦氏菌以及裂殖壶菌属物种ATCC 20888。这些生物首先在高压灭菌和过滤的DifcoTM海洋肉汤2216中，在带挡板的烧瓶中，140RPM，19℃，生长48小时。然后在MMS1.0+2％ NaCl中洗涤细胞三次，以去除预先存在的培养基。如实施例1中那样获得荚膜甲基球菌巴斯的生物质，悬浮、高压灭菌、离心以及过滤，并添加到包括1X MMS1.0和2％ NaCl的培养肉汤中，通过A280nm分光光度法测量，最终生物质浓度为6.31mg/ml。将洗涤的细胞用于接种包括具有生物质的培养基的三个2.5ml培养瓶，以及包括1X MMS1.0和2％ NaCl的阴性对照肉汤，不含碳源的三个2.5ml培养瓶。每隔24小时记录一次时间点，持续48小时以监测生长情况。如图2所示，所有三种生物在包括生物质的培养基中生长良好，但在阴性对照肉汤中未能生长。
实施例3
由用C1代谢非光合细菌的生物质进行培养的细胞产生ω-3脂肪酸
在以下实施例中，在如下所述的各种培养基中培养细胞后，分析了海摩替亚氏菌、肺鲐希瓦氏菌和裂殖壶菌属物种的ω-3脂肪酸的产生。
为了产生自溶产物，将2.5克野生型荚膜甲基球菌巴斯的湿细胞沉淀在20mlMMS1.0中通过重超声裂解。接下来，将未澄清的裂解物在54℃-58℃、pH＝7.0下孵育3小时，以产生自溶产物。然后用无菌5M NaCl将NaCl浓度从0.2％增加至2％，然后进行严格的澄清和无菌过滤。
使用100ul肺鲐希瓦氏菌或海摩替亚氏菌培养物和200ul裂殖壶菌属物种培养物孵育以下每一种：(i)三个2.5ml培养基烧瓶，包括自溶产物、MMS1.0和2％ NaCl(“自溶产物培养基”)，(ii)三个2.5ml培养基烧瓶(包括生物质、MMS1.0和2％ NaCl)(“生物质培养基”)，(iii)三个2.5ml海洋肉汤烧瓶(作为阳性对照)以及(iv)三个不含碳源的2.5mlMMS1.0和2％ NaCl烧瓶(作为阴性对照)。将剩余的种子培养物重复物合并，并在时间点0时提交FA分析，并考虑孵育的二次培养物的稀释因子。
在取样前，允许这些培养物在19℃和160RPM下生长72小时。正如预期的那样，阴性对照显示没有生长，因此没有提交脂肪酸分析。所有其他培养物都显示出生长，但生物质相对较低，因此，将每种条件下的所有重复物合并为单独的样品，用于提交GC-质谱分析。测量了DHA(C22:6(n-3))和EPA(C20:5(n-3))的产生，结果如图3所示。如图3所示，所有培养物中都产生了EPA，裂殖壶菌属物种培养物中产生了DHA。因此，结果表明，ω-3脂肪酸可以由在C1代谢非光合细菌的生物质或其自溶产物存在下培养的海洋栖居微生物产生。
实施例4
用C1代谢非光合细菌的生物质进行培养的工业相关微生物的生长
在以下实施例中，地衣芽孢杆菌(ATCC 53757)、大肠杆菌(ATCC 25922)、罗伊氏乳杆菌(DSM 20053)以及杰丁毕赤酵母(CBS 4511)各自在(1)包括由荚膜甲基球菌巴斯生物质产生的自溶产物的培养基，(2)包括用来自生物质的其他蛋白酶产生的自溶产物的培养基，或(3)含碳源但不含任何荚膜甲基球菌巴斯自溶产物的培养基中培养。自溶产物浓度基于自溶产物的氮(N)含量(表3)，范围为0.03-1g/L N。对于罗伊氏乳杆菌的生长，自溶产物是氮的唯一来源。制备自溶产物的储备溶液(5g/L N)并进行高压灭菌。将无菌自溶产物以表4中列出的浓度添加到无菌基础培养基中。
表3：自溶产物的产生过程和分析数据。
Figure BDA0004186563840000381
表4.添加到无菌基础培养基中的无菌自溶产物浓度
微生物 培养基中无菌自溶产物的浓度(g/l N)
地衣芽孢杆菌 0.03、0.06、0.1
杰丁毕赤酵母 0.03、0.06、0.1
罗伊氏乳杆菌* 0.2、0.6、1.0
大肠杆菌 0.11、0.22
*为了与不含自溶产物的培养基进行比较，使用MRS(Oxoid)。
培养物在微反应器系统(Bio-Leckor，贝克曼公司(Beckman))中生长，系统允许在受控条件(pH、溶解氧)下筛选多个平行的微发酵。培养条件见表5。BioLector通过基于光密度(OD)以外的原理的传感器测量细胞密度。将培养物孵育20小时-30小时，并定期记录细胞密度、溶解氧和pH测量值。
表5.BioLector培养条件
Figure BDA0004186563840000391
自溶产物不是完全可溶的，然而，尽管在使用的较高浓度下背景读数较高，但生物质的增加很容易检测到。如图4-7所示，自溶产物支持生长，是每个菌株的营养物来源。
虽然已经图示和描述了本发明的具体实施例，但是将容易理解的是，上述各种实施例可以被组合以提供另外的实施例，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行各种改变。
在本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开(包括2020年10月20日提交的美国申请号63/094,250)通过引用以其整体并入本文。如果有必要，则可以对实施例的各方面进行修改以采用各个专利、申请和出版物的概念来提供再另外的实施例。
鉴于以上详细描述，可以对实施例作出这些和其他改变。通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求中公开的具体实施例，而是应当被解释为包括所有可能的实施例以及这种权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求不受本公开限制。

Claims (100)

1.一种细胞或组织培养或发酵的方法，所述方法包括在培养基或发酵培养基中培养细胞或组织，所述培养基或发酵培养基包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物，
其中血红素在所述生物质或其衍生物中的量在所述生物质或其衍生物的0.01至10mg/g蛋白质的范围内，和/或
其中所述培养基或发酵培养基中所述生物质或其衍生物的量在0.1至50g/l的范围内。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞或组织包含细菌细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌细胞包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、罗伊氏乳杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌或黄单胞菌属物种。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌细胞包含乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、布拉酵母、嗜热链球菌或凝结芽孢杆菌。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌细胞包含海洋栖居细菌细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞或组织包含非细菌细胞或组织。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞或组织包含藻类细胞，并且任选地所述培养基或发酵培养基进一步包含海水基质。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述藻类细胞包含微藻。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述藻类细胞包含大型藻。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞或组织包含真菌细胞或组织。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述真菌细胞或组织包含酵母细胞。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述真菌细胞或组织包含蘑菇细胞或组织，并且任选地所述培养基或发酵培养基进一步包含马铃薯提取物、谷物和/或结果基质。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞或组织包含动物细胞或组织，并且任选地所述培养基或发酵培养基进一步包含血清、生长激素、生长因子、抗菌剂和/或抗真菌剂。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述动物细胞或组织包含鱼或贝类细胞或组织，并且任选地所述培养基或发酵培养基进一步包含鱼血清。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述动物细胞或组织包含禽类细胞或组织。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述动物细胞包含昆虫细胞或组织。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述动物细胞或组织包含哺乳动物细胞或组织。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述动物细胞包含胚胎干细胞、成体干细胞、肌卫星细胞、成肌细胞、肌细胞和/或肌肉细胞。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述C1代谢非光合细菌包含甲基营养细菌。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述C1代谢非光合细菌包含甲烷营养细菌。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述甲烷营养细菌选自由甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属和甲基细胞菌属构成的组。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述甲烷营养细菌包含荚膜甲基球菌。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述甲烷营养细菌包含荚膜甲基球菌(巴斯)。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物包含所述生物质的悬浮液、分离物、自溶产物、匀浆、消化物、水解物、分离物、提取物或其组合。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述生物质或其衍生物包含量各自为在1-100mg/g范围内的必需氨基酸。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述生物质或其衍生物包含量为在50-500mg/kg范围内的铜。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述生物质或其衍生物包含量为在0.05至0.6mg/g范围内的铁。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，所述方法进一步包括从所述生长培养基中分离所述培养的细胞以产生分离的培养细胞和/或分离的上清液。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，所述方法进一步包括从所述发酵或培养的细胞或组织中隔离、浓缩、分离或纯化所需产物。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述所需产物选自维生素、脂肪酸、氨基酸、核苷、肽、蛋白质、酶、色素、调味剂、香料、有机酸、防腐剂、小分子代谢物、发酵剂、培养物、益生菌、类胡萝卜素以及肉替代物。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述所需产物是选自柠檬酸和乳酸的小分子代谢物。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述所需产物是选自凝乳酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、淀粉酶以及碳水化合物的酶。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述所需产物是选自二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的ω-3脂肪酸。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述所需产物包含培养的细胞或组织的生物质。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述培养的细胞或组织的生物质包含益生菌、乳制品培养物或肉腌制培养物。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中与在不包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的参考培养基中培养的细胞和组织的生物质相比，所述培养的细胞或组织的生物质包含含量升高的铁、血红素或血红素蛋白。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物包含所述产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的自溶产物。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述培养的细胞或组织、其生物质或所述生物质的衍生物适合于制备细胞培养肉产物或肉替代产物。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中与在不包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的参考培养基中培养所述细胞或组织相比，所述培养使得所述细胞或组织或所述培养物的最终目标成分的生长速率、产量或生产率提高。
40.一种细胞或组织培养基或发酵培养基，所述细胞或组织培养基或发酵培养基包含产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物，
其中血红素在所述生物质或其衍生物中的量在0.01至10.0mg/g蛋白质的范围内，和/或
其中所述培养基中生物质或其衍生物的量在0.1至50g/l的范围内。
41.如权利要求40所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述生物质或其衍生物中必需氨基酸的量各自在1至100mg/g的范围内。
42.如权利要求40或41所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述生物质或其衍生物中的生物可利用铜的量在50至500mg/kg的范围内。
43.如权利要求40至42中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中血红素在所述生物质或其衍生物中的量在所述生物质或其衍生物的0.1至1mg/g蛋白质的范围内。
44.如权利要求40至43中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基包含所述生物质的衍生物。
45.如权利要求44所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述衍生物是所述产血红素蛋白的C1代谢非光合细菌的生物质的自溶产物、裂解物、提取物、分离物、悬浮液、匀浆或消化物。
46.如权利要求40至45中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于细菌细胞培养。
47.如权利要求46所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于海洋栖居细菌的培养。
48.如权利要求40至45中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于非细菌细胞培养。
49.如权利要求40至45中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于藻类细胞培养，并且所述培养基或发酵培养基任选地进一步包含海水基质。
50.如权利要求40至45中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于真菌细胞或组织培养。
51.如权利要求50所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于酵母细胞培养。
52.如权利要求50所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于蘑菇细胞或组织培养，并且所述培养基或发酵培养基任选地进一步包含马铃薯提取物、谷物和/或结果基质。
53.如权利要求40至45中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于动物细胞或组织培养，并且所述培养基或发酵培养基任选地进一步包含血清、生长激素、生长因子、抗菌剂和/或抗真菌剂。
54.如权利要求53所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于鱼细胞或组织培养，并且所述培养基或发酵培养基任选地包含鱼血清。
55.如权利要求53所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于禽类细胞或组织培养。
56.如权利要求53所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于昆虫细胞或组织培养。
57.如权利要求53所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述培养基或发酵培养基适合于哺乳动物细胞或组织培养。
58.如权利要求40至57中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述C1代谢非光合细菌是甲基营养细菌。
59.如权利要求40至58中任一项所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述C1代谢非光合细菌是甲烷营养细菌。
60.如权利要求59所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述甲烷营养细菌选自由甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属和甲基细胞菌属构成的组。
61.如权利要求59所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述甲烷营养细菌是荚膜甲基球菌。
62.如权利要求59所述的细胞或组织培养基或发酵培养基，其中所述甲烷营养细菌是荚膜甲基球菌巴斯。
63.一种通过如权利要求1至39中任一项所述的方法产生的细胞或组织培养或发酵的产物。
64.如权利要求63所述的产物，所述产物通过如权利要求28所述的方法产生，其中所述产物包含所述分离的培养细胞。
65.如权利要求63所述的产物，所述产物通过如权利要求28所述的方法产生，其中所述产物包含衍生自所述上清液或所述细胞本身的分离的、纯化的或浓缩的感兴趣的产物。
66.如权利要求63至65中任一项所述的产物，所述产物包含与使用不包含所述C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的生长培养基产生的参考产物相比，含量升高的一种或多种所需产物。
67.如权利要求66所述的产物，其中所述一种或多种所需产物选自维生素、脂肪酸、氨基酸、核苷、肽、蛋白质、酶、色素、调味剂、香料、有机酸、防腐剂、小分子代谢物、发酵剂、培养物、益生菌以及肉替代物。
68.如权利要求67所述的产物，其中所述一种或多种所需产物包含选自柠檬酸和乳酸的小分子代谢物。
69.如权利要求67所述的产物，其中所述一种或多种所需产物包含酶。
70.如权利要求69所述的产物，其中所述酶包含凝乳酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶以及碳水化合物。
71.如权利要求63至70中任一项所述的产物，其中与使用不包含所述C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的生长培养基产生的参考产物相比，所述所需产物包括升高浓度的ω-3脂肪酸。
72.如权利要求71所述的产物，其中所述ω-3脂肪酸包含二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)。
73.如权利要求63至72中任一项所述的产物，其中与使用不包含所述C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的生长培养基产生的参考产物相比，所述产物包含升高浓度的一种或多种类胡萝卜素。
74.如权利要求73所述的产物，其中所述一种或多种类胡萝卜素选自β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、玉米黄质以及虾青素。
75.如权利要求63至74中任一项所述的产物，所述产物包含与使用不包含所述C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的生长培养基产生的参考产物相比，含量升高的铁、血红素铁或血红素蛋白。
76.如权利要求75所述的产物，所述产物包含细胞培养肉产物。
77.如权利要求63至76中任一项所述的产物，所述产物包含益生菌、乳制品培养物或肉腌制培养物。
78.如权利要求63至76中任一项所述的产物，所述产物包含素肉替代产物。
79.如权利要求63至76中任一项所述的产物，所述产物包含植物保护性细菌细胞产物。
80.一种非细菌细胞或组织培养或发酵的产物，所述产物的血红素铁含量高于使用不包含C1代谢非光合细菌的生物质或其衍生物的培养基或发酵培养基生产的参考产物的血红素铁含量。
81.如权利要求80所述的产物，所述产物进一步包含低于所述参考产物的同位素δ13C值的同位素δ13C值。
82.如权利要求80所述的产物，所述产物进一步具有低于所述参考产物的同位素δ15N值的同位素δ15N值。
83.如权利要求81或82所述的产物，所述产物进一步具有低于所述参考产物的同位素δ34S值的同位素δ34S值。
84.如权利要求80至83中任一项所述的产物，其中所述产物选自非微生物细胞或组织的培养产物或发酵产物。
85.如权利要求80至83中任一项所述的产物，其中所述产物选自藻类、酵母、蘑菇、鱼、禽类、昆虫以及哺乳动物细胞或组织培养或发酵的产物。
86.如权利要求85所述的产物，其中所述细胞或组织包含酵母或蘑菇细胞或组织，并且所述产物包含素肉替代产物。
87.如权利要求80至84中任一项所述的产物，其中所述细胞或组织包含动物细胞或组织，并且所述产物包含细胞培养肉产物。
88.一种制作食物产品或成分的方法，所述方法包括：通过如权利要求1至39中任一项所述的方法产生细胞或组织培养或发酵的产物，以及加工所述产物以产生所述食物产品或食物成分。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述加工所述产物包括分离、过滤、澄清、沉淀、絮凝、蒸发以及干燥中的一种或多种。
90.一种通过如权利要求88或89所述的方法产生的食物产品或食物成分。
91.如权利要求90所述的食物产品或食物成分，其中所述培养的细胞包含酵母，并且其中所述食物产品或食物成分包含用于发酵饮料产生的起子培养物。
92.如权利要求91所述的食物产品或食物成分，其中所述食物产品或食物成分包含用于酒精饮料产生的起子培养物。
93.如权利要求91所述的食物产品或食物成分，其中所述食物产品或食物成分包含啤酒、葡萄酒、开菲尔或康普茶生产的起子培养物。
94.如权利要求91所述的食物产品或食物成分，其中所述食物产品或食物成分包含素肉替代产物。
95.如权利要求94所述的食物产品或食物成分，其中所述培养的细胞或组织包含真菌细胞。
96.如权利要求90所述的食物产品或食物成分，其中所述培养的细胞包含细菌细胞，并且其中所述食物产品或食物成分包含乳制品制作培养物或肉腌制培养物。
97.如权利要求96所述的食物产品或食物成分，其中所述食物产品或食物成分包含酸奶制作培养物或奶酪制作培养物。
98.如权利要求90所述的食物产品或食物成分，其中所述培养的细胞包含细菌细胞，并且其中所述食物产品或食物成分包含益生菌。
99.如权利要求90所述的食物产品或食物成分，所述食物产品或食物成分包含细胞培养肉产物。
100.如权利要求90至99中任一项所述的食物产品或食物成分，所述食物产品或食物成分包含细胞培养肉、肉替代产物、氨基酸、肽、蛋白质、脂肪酸、有机酸、酶、色素、调味剂、香料、发酵剂、培养物、益生菌、食物成分、核苷、维生素、小分子、代谢物、食用香料或防腐剂。
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