JP4388824B2

JP4388824B2 - 生産物

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Publication number: JP4388824B2
Application number: JP2003586338A
Authority: JP
Inventors: アイナモーエン; ジャネットモラーヨアンセン; カレンモラージェンセン; アーリルドヨハネッセン
Original assignee: ノルフェルムディーエー
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2009-12-24
Anticipated expiration: 2023-04-17
Also published as: DE60305476T2; ATE327319T1; DE60305476D1; BR0309347A; JP2005523021A; KR20050016354A; WO2003089625A2; IL164517A0; CA2481400C; DK1497409T3; KR100902396B1; WO2003089625A3; AU2003262372A1; US20090186397A1; AU2003262372B2; NO20045022L; GB0209007D0; CA2481400A1; US7799550B2; CN1659272A

Description

本発明は、微生物増殖基質として細菌性バイオマスの使用方法、具体的には、メタン栄養細菌を含む細菌培養物に少なくとも部分的に由来し、本明細書で「細菌抽出物（bacterial extract）」と呼称するバイオマスを使用する方法に関する。

微生物は、たとえば所望の物質を、そのような物質を天然に生産する菌株から、あるいはそのような物質を生産するように、または細菌汚染などの特質を決定するために遺伝子組替えされた菌株から生産するために、工業的および実験室規模でしばしば培養される。これらの目的のために、微生物には栄養素が必要である。この点に関して、たとえば、ＭＲＳ (De Mann, Rogosa および Sharpe)、PCA (Plate Count Agar)、VRBD (Violet Red Bile Dextrose Agar)、YM Agar (Yeast Mould Agar)、Baird-Parker Agar Base、VRB Agar
(Violet Red Bile Agar)、XLD Agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar)、CASO (Casein-peptone Soybean-peptone)、TSB (Tryptic Soy Broth)およびNB (Nutrient Broth)などの広く市販されている酵母、肉エキスまたは植物抽出物を使うのが一般的である。中でも酵母抽出物増殖基質（たとえばMRS、VRBD、VRB Agar、PCA、Baird-Parker Agar BaseおよびXLD Agarに含まれる）は、Merck社およびDifco社から市販されている。

そのような酵母抽出物は、自己融解させた酵母培養物から得たバイオマスを使用して一般に生産される。ここで自己融解とは、酵母細胞内に本来存在する酵素が、細胞の死後に作用してその細胞を分解することである。酵母の自己融解は通常遅く、適切な程度の分解がなされるまでに数日かかることもある。したがって、自己融解の開始剤または促進剤として作用する添加物、たとえばチオール剤が自己融解過程を促進するために通常使われる。そのような添加物の使用は当然、酵母自己融解物の工業生産における費用を増大させる。生成する自己融解物に対しては、特定微生物の細胞増殖を最適化するための追加栄養素を添加してもよい。実際、微生物の寄託ライブラリーは、いずれの増殖培地が寄託された微生物について最も好適であるか特定している。

異なる微生物は必要な栄養が異なる。したがって、当然に代替性の改良された微生物増殖培地、特に、インビトロで増殖させようとする微生物（たとえば乳酸菌）が増殖するために有効な増殖培地、および未知微生物についても好適に使用することができる「広幅の範囲」増殖培地が、継続して必要とされている。
［発明の開示］
今回我々が見出したのは、特別に有効な微生物増殖培地が、メタン栄養細菌を含む培養物から得られるバイオマス（たとえばWO 01/60974に記載されたように生産されるバイオ
マス）を用いて生産することができるという驚くべきことである。

一つの側面から見るとそれゆえ、本発明は、メタン栄養細菌を含む細菌の培養物のバイオマスから得られ、必要に応じて追加の栄養素を含む無菌的栄養組成物を、微生物増殖培地として使用する方法を提供するものである。

バイオマスを生産するために使用する細菌の培養物は、細菌の全重量に対して、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上、特に７０重量％以上、具体的には７５重量％以上、たとえば７５〜９５重量％、さらに具体的には７５〜８０重量％がメタン栄養細菌である。

さらなる側面から見ると、本発明は、微生物と該微生物用の増殖培地とを接触させるこ
とからなる微生物を培養する方法であって、該増殖培地が、必要に応じて追加の栄養素を添加した、メタン栄養細菌を含む細菌の培養物のバイオマスから得られる無菌的栄養組成物であるか、または該組成物から調製されることを特徴とする方法を提供するものである。

その上さらなる別の面から、本発明は、メタン栄養細菌を含む細菌の培養物のバイオマスから得られる無菌的栄養組成物を含有し、しかも少なくとも一種以上の無菌的栄養素を含み、必要に応じて希釈剤をも含む、微生物増殖基質を提供するものである。

増殖培地または増殖基質を調製する原料であるバイオマスは、少なくとも一種類以上のメタン栄養細菌と一種類以上の従属栄養細菌とから生産されたバイオマスであることが好ましい。それらの細菌は、たとえばメタン、酸素、アンモニア、および無機養分が供給されるループ型反応器を使用して、同じ培地内で培養するのが好ましい。バイオマスを生産するための細菌の適切な組み合わせは、たとえばWO 01/60974に記載されており、その内
容は本明細書中に引用して取り込まれる。特に適切な組み合わせの具体例は、メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）(Bath) (NCIMB 11132株)、ラルストニア（Ralstonia）sp. DB3 (NCIMB 13287株)、アニュリニバチラス（Aneurinibacillus）sp. DB4 (NCIMB 13288株)およびブレビバチラウス・アグリ（Brevibacillus agri）DB5 (NCIMB 13289株)である（これらの微生物のそれぞれは、特許の存続期間中はノルウェーのNorferm DA社から入手できる）。

細菌培養物から得られるバイオマスは、直接に（もっとも通常は脱水および滅菌をした後に）使用してもよく、あるいはたとえばホモジナイズ化、加水分解または自己融解によって細菌細胞を破壊する処理を最初に行ってもよい。そのような処理は、W001/60974ならびに２００３年２月１２日に出願された国際特許出願PCT/GB03/000610およびPCT/GB03/000640に記載されており、それらの記載内容もまた本明細書中に引用して取り込まれる（これら２つの国際特許出願の写しも、本明細書とともに提出されている。）。細菌バイオマスのホモジナイゼート(homogenizate)、加水分解物(hydrolysate)および自己融解物(autolysate)、とりわけ乾燥ホモジナイゼート、より一層特に乾燥自己融解物は、本発明に係
る微生物増殖培地の調製のための好ましい原料である。ホモジナイズ化、自己融解または加水分解されたバイオマスをろ過（たとえば限外ろ過）して得られる前駆体原料、すなわち、濾液自体およびそのろ過残留物もまた使用してもよい。しかし、最も好ましいのは乾燥した自己融解物である。

微生物増殖培地は、細菌バイオマス生産物自体でもよく、あるいは、バイオマス生産物と追加の成分とを含む組成物でもよい。そのような成分として、たとえば、液状もしくは非液状の担体または希釈剤（たとえば水、ゲル（寒天ゲルなど）、またはゲル化可能な液体など）、および無機塩類、炭素源（たとえば糖類（たとえば単糖、二糖、オリゴ糖および多糖、とりわけ単糖および二糖））、窒素源（たとえば硝酸塩、タンパク質、タンパク質断片、アンモニウム化合物、オリゴペプチド、アミノ酸類（特に必須アミノ酸、たとえばトリプトファン））、核酸および核酸断片、脂質などの物質が挙げられる。特に好ましい微生物増殖培地は、ブドウ糖ならびに添加された硝酸塩および無機塩類（たとえば、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、モリブデン、鉄、亜鉛、ホウ素、コバルト、マンガンおよびニッケルの化合物）を含み、特にブドウ糖を含むものである。供給される組成物は、直ちに使用できる形態または濃縮形態の無菌の固体（たとえば微粒子）、半固体または液体でよい。供給時の組成物が、水または含水ゲル化剤組成物の添加によって増殖培地に変換できる無菌の乾燥微粒子濃縮物であることは特に好ましい。

上記組成物すなわち上記増殖培地が添加ブドウ糖を含む場合、当該添加ブドウ糖は、好ましくはバイオマス由来成分に対して５：１〜１：５（特に２：１〜１：２）の乾燥質量
に基づく重量比で存在する。上記組成物が添加硝酸塩および無機塩類を含む場合、それらは好ましくはバイオマス由来成分に対して０．０１：１〜０．２：１（特に０．０５：１〜０．１：１）の重量比で存在する。供給時の組成物がブドウ糖および／または硝酸無機塩類を含まない場合には、増殖培地の調製の際に、上記に特定した重量比で、そのような成分の一方または両方を添加することが好ましい。

本発明の組成物は、従属栄養微生物、特に従属栄養藻類、酵母または細菌、より具体的には、乳酸桿菌（たとえばL.プランタラム（plantarum）、L.アシドフィルス（acidophilus））のような嫌気性細菌、大腸菌のような好気性細菌、およびクリプテコディニウム・コーニイ（Crypthecodinium cohnii）のような藻類のための増殖基質としての使用方法に特に適している。

本発明は以降、次に示す実施例および添付図面（それらに限定はされない）を参照してさらに説明される。

＜バイオマス抽出物＞
メタン栄養細菌および従属栄養細菌（メチロコッカス・カプスラタスMethylococcus capsulatus (Bath) (NCIMB 11132株)、ラルストニアRalstonia sp. DB3 (NCIMB 13287株)、アニュリニバチラスAneurinibacillus sp. DB4 (NCIMB 13288株)およびブレビバチラウス・アグリBrevibacillus agri DB5 (NCIMB 13289株)、それぞれノルウェーのNorferm DA社から入手可能）を、W001/60974に記載のとおりに培養し、その結果生成したバイオマスはWO01/60974に記載のとおりに回収・処理し、スプレードライ・ホモジナイゼート（以後「ＢＰホモジナイゼート」という）を生成し、国際特許出願PCT/GB03/000610に記載のとお
りにスプレードライ加水分解物（以後「ＢＰ加水分解物」という）を生成し、国際特許出願PCT/GB03/000640（たとえば実施例１参照）に記載のとおりに自己融解物（以後「ＢＰ
抽出物」という）を生成した。

「ＢＰ抽出物」の生産において、自己融解後の限外ろ過および留去の処理を行わない場合の生産物は、本明細書では「ＢＰ自己融解物」という。そのような生産物の調製は、たとえば国際特許出願PCT/GB03/000640の実施例３および４に記載されている。「ＢＰ残留
物(Retentate)」という生産物は、ホモジナイズされ、超高温処理されるバイオマスをい
う。「ＢＰ透過物（Permeate）」という生産物は、基本的には「ＢＰ抽出物」の生産において限外ろ過処理された生産物のことである。

上記のすべての原料はノルウェーのNorferm DA社から入手できる。
微生物増殖培地は、ＢＰホモジナイゼート、ＢＰ自己融解物、ＢＰ抽出物、ＢＰ残留物およびＢＰ透過物を、１ｇ／Ｌの濃度で脱塩水に加えることで生産した。これらの培地は、その後直接に、または０．１ｇ／Ｌのブドウ糖および／または３２．４ｍＬ／Ｌの硝酸無機塩培地（Nitrate Mineral Salt medium：ＮＭＳ）を添加して使用した。

ＮＭＳの組成：
１．０ｇＫＮＯ₃
０．２ｇＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ
１．０ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．１ｍＬ微量元素溶液*
０．１ｍＬモリブデン酸ナトリウム溶液（５ｇ／ＬＮａＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、脱塩水）
０．１ｍＬＥＤＴＡ溶液（４５ｇ／ＬＦｅＮａＥＤＴＡ・２Ｈ₂Ｏ、水）
水で〜１Ｌにして、
１０ｍＬ／Ｌ無菌リン酸緩衝液（３５．６ｇＮａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、２６．０ｇＫ
Ｈ₂ＰＯ₄および水で１Ｌ）を加えた。
*６．４ｇＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
１５０ｍｇＨ₃ＢＯ₃
６００ｍｇＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
１３０ｍｇＭｎＣｌ₂
１００ｍｇＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ
脱塩水で１Ｌにした。
すべての培地は使用前にオートクレーブ滅菌した。

以下のものを含む微生物増殖用寒天培地も調製した。
３２．２ｇ／ＬＢＰ抽出物
２０．０ｇ／Ｌブドウ糖
３４ｍＬ／ＬＮＭＳ培地
１４．０ｇ／Ｌ寒天
脱塩水で１Ｌにした。
使用前にはオートクレーブ滅菌した。

＜微生物増殖試験＞
好気性および嫌気性、グラム陽性およびグラム陰性の細菌を、実施例１の液体培養培地ならびに対照用として細菌菌株用に勧められている増殖培地を用いて、振とうフラスコ内で培養した。培養物の光学濃度を、細菌の得られた増殖の指標（すなわち、細胞数が最大であって、「頭打ち」もしくは定常状態の指標）としてモニターした。結果を表１に示す。

−−−：ＢＰ誘導体の組み合わせのうち、対照用の基質より優れたものがない。
＋：ＢＰ誘導体の組み合わせのうち、対照用の基質と同等のものがある。
＋＋＋：ＢＰ誘導体の組み合わせのうち、対照用の基質よりも明らかに優れたものがある
。

大腸菌について、ブドウ糖を添加したＢＰ抽出物は、明らかに最高の増殖をもたらした。L. plantarumに対しては、ＢＰ抽出物のすべての組み合わせが、明らかに最高の増殖を与えた。緑膿菌については、ＢＰ抽出物のすべての組み合わせ、特にブドウ糖を添加したＢＰ抽出物が最高の増殖をもたらした。枯草菌に対して、ブドウ糖を添加したＢＰ抽出物、ならびにブドウ糖およびＮＭＳの両方を添加したＢＰ抽出物は、明らかに最高の増殖をもたらした。

＜未知の細菌の増殖性＞
寒天ゲル（ＰＣＡ、ＭＲＳ寒天、および寒天を含むＢＰ抽出物（実施例１）ｐＨ６．０および７．１）に、刻んだ肉のサンプルから採取した未知の微生物を塗布した。培養物は２５℃で７２時間培養し、総平板計数結果を記録した。ＢＰ抽出物では、ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｇ）は、５〜約６．６であり、ＭＲＳでは１未満であった。ＰＣＡではｌｏｇ（ＣＦＵ／ｇ）は、約６．７であり、わずかに高かった。

＜乳酸菌の増殖能＞
乳酸菌株L. casei ssp. rhamnosus (ATCC 7469株)、L. delbruekii ssp. lactis (ATCC
7830株)、L. fermentum (CCUG 30138株)、L. gasseri (ATCC 19992株)およびL. plantarum (ATCC 8014株)を、ＭＲＳ寒天上およびＢＰ抽出物寒天（実施例１）上で、好気性条件下で培養した。すべての場合において、ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）として測定された増殖性は、ＢＰ抽出物については、同一かより高かった。このことは、L. delbruekiiについて
最も顕著だった。同じ菌株をそれらの培地上で、嫌気性条件下でも培養した。この場合も、増殖能は、ＢＰ抽出物についてのすべての場合において同じかより高かった。

＜多価不飽和脂肪酸の生産＞
Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky (ATCC 30772株)を、脱塩水中に９ｇ／
Ｌのブドウ糖、２５ｇ／Ｌの海塩、および２ｇ／Ｌの酵母抽出物（yeast extract：YE）
またはＢＰ抽出物を含む培地上で培養した。培養２日後、細菌細胞を回収し、全脂肪酸、細胞乾燥重量（cell dry weight：CDW）および２２：６（ドコサヘキサエン酸）含有量を決定した。その結果を表２に示す。

表２は、ＢＰ抽出物を使用した場合に、ＣＤＷおよび多価不飽和脂肪酸２２：６（％）がより高いことを示している。

＜ＢＰ自己融解物を含む培地における乳酸菌の増殖＞
フラスコ内および発酵槽において、複合成分をＢＰ自己融解物（実施例１）で置き換えた培地上での、乳酸菌株、L. plantarumおよびL. acidophilusの増殖と、標準ＭＲＳ培地を使用した場合の増殖とを比較した。

フラスコ内の実験：乳酸菌を嫌気性フラスコ内で培養し、ＢＰ自己融解物の性質と市場に出ている製品の性質とを比較した。全窒素量が一定に保たれるように、表４に従ってＭＲＳ培地における複合成分（表３参照）をＢＰ自己融解物で置換した。

発酵槽おける実験：
それぞれの菌株について二つの発酵を行った；一つは標準培地ＭＲＳを用いたもので、もう一つはＭＲＳ中の複合成分をＢＰ自己融解物と置換したものである（フラスコ実験における培地ＣＡ−４）。
嫌気性フラスコ内で行われた実験の方法：
接種材料： L. plantarumおよびL. acidophilusの種割り当て(seed lot)、１ｍｌを８０
ｍｌのＭＲＳ培養液（Oxoid）に接種し、３７℃で２０時間培養した。L. acidophilus株
に対しては、ＭＲＳ培養液をｐＨ５．５に調整した。
培養条件：表４に従って複合培地基質を使用し、その際他の培地成分は一定に保った（表５）。ブドウ糖以外のすべての成分を混合し、ｐＨを６．０および５．５にそれぞれ調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。ブドウ糖は別途にオートクレーブ滅菌した。培養前にフラスコに窒素を流した。二つのフラスコを接種し、一方を対照用とした。フラスコごとに０．５ｍｌの接種材料を使用した。フラスコにそれぞれ２０時間および２４時間、３７℃、１００ｒｐｍで横側から接種した。サンプルのｐＨおよびＣＦＵ／ｍ
ｌを分析した。

発酵方法：
接種材料：フラスコ実験の場合と同様の条件を使用した。L. plantarumおよびL. acidophilus、種割り当て（seed lot）の１ｍｌを使用して８０ｍｌのＭＲＳ培養液（Oxoid）
を接種し、３７℃で２０時間培養した。L. acidophilus株に対しては、ＭＲＳ培養液をｐＨ５．５に調整した。

培養条件：すべての発酵実験は７．５Ｌ−Chemap発酵槽で行った。７Ｌのバッチ培養には７０ｍｌの接種材料を接種した。複合培地基質はＭＲＳおよびＣＡ−４に従って使用し、残りの成分については、（Ｎａ）₃−クエン酸塩（２．４０ｇ／ｌ）を（ＮＨ₄）₃−ク
エン酸塩（２．００ｇ／ｌ）に変更したこと以外は、フラスコ実験の条件を維持した（表６）。ブドウ糖以外のすべての成分を混合し、ｐＨを６．０およびｐＨ５．５にそれぞれ調整し、１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。ブドウ糖は別途にオートクレーブ滅菌した。

発酵は３７℃で行い、ｐＨは、２５％ＮａＯＨを添加することで、L. plantarumに対してはｐＨ５．８に、L. acidophilusに対してはｐＨ５．５に一定に保った。ＮａＯＨの添加を終えたとき、発酵は停止した。培地への空気の混入を最小限にするように注意を払った。最終生産物を、ＭＲＳ寒天（Oxoid）上のＣＦＵ、ならびに血液寒天培地およびＴＳ
Ａ（Difco）上の細菌汚染について分析した。

フラスコ内における実験の結果：
＜表７＞L. plantarumの生産についてのフラスコ実験。
増殖基質に関する培地の組成（ｇ／Ｌ）、L. plantarumの増殖能（ＣＦＵ／ｍＬ）および３７℃、２０時間後のｐＨ。

ＭＲＳ培地の他の成分は変更しなかった。培地のｐＨは６．０に調整した。それぞれの実験について、並行実験を行った。

＜表８＞L. acidophilusの生産についてのフラスコ実験。
増殖基質に関する培地の組成（ｇ／Ｌ）、L. acidophilusの増殖能（ＣＦＵ／ｍＬ）お
よび３７℃、２４時間後のｐＨ。

ＭＲＳ培地の他の成分は変更しなかった。培地のｐＨは５．５に調整した。それぞれの実験について、並行実験を行った。

発酵実験の結果：
ＣＦＵおよび水酸化ナトリウムの使用から、両菌株に関してＢＰ自己融解物を含む培地における増殖は、ＭＲＳ中に標準複合成分を含む場合と比べて同等またはより優れていることが示された。発酵時間は、両菌株について、ＭＲＳの場合よりもＢＰ自己融解物の場合の方がより短かった。結果を表９および図１にまとめた。細菌汚染は常に観測されなかった。

＜表９＞ＭＲＳ（複合培地成分Peptone bacteriological １０（ｇ／ｌ）、牛肉抽出物１０（ｇ／ｌ）、酵母抽出物５（ｇ／ｌ）を含む）の場合、および複合培地組成物をＢＰ自己融解物３２（ｇ／ｌ）と交換した場合における発酵のまとめ

結論：
フラスコ実験および発酵実験の両方から、ＢＰ自己融解物を含む培地における増殖は、標準ＭＲＳの場合と比べて同等以上またはさらに改善されていることが明らかになった。

＜β−ガラクトシダーゼ生産のための大腸菌発酵＞
本研究の目的は、大腸菌発酵における窒素源として代替性ＢＰ自己融解物を試験することである。ＢＰ抽出物およびＢＰ自己融解物（実施例１）を試験し、標準の酵母抽出物と
比較した。

方法：酸素飽和を２０％よりも上で維持した。温度は３７℃、ｐＨは６．８とした。最初は、発酵を、無機塩類を添加した５０％炭素源および５０％窒素源を用いたバッチ方式で行った。ＯＤ₆₂₀１０のときに、残りの窒素源を１時間かけて加えた。０．７ｇＬ^-1未
満のブドウ糖レベルでは、ブドウ糖を補給した。ブドウ糖は、さらにｐＨでモニターした：１）ｐＨ＞６．８ではブドウ糖供給を増やし、２）ｐＨ＜６．７５ではブドウ糖供給を減らしてＮａＯＨを加えた。
供給物：
１．ブドウ糖のような炭素源
２．窒素源
ａ．酵母抽出物
ｂ．ＢＰ抽出物
ｃ．ＢＰ自己融解物（酵母抽出物およびＢＰ抽出物の１．５倍の濃度）
４．５時間後、β−ガラクトシダーゼの誘導物質として、ＩＴＰＧ（iso-propyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を加えた。

結果を図２に示し、酵素生産は三つの窒素源については同様であることを確認した。

＜コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum） NRRL B-11470
のＬ−リジン過剰生産菌株のための複合窒素源としてのＢＰ自己融解物の分析＞
本研究の目的は、C. glutamicumのリジン過剰生産突然変異株の発酵によるリジンの生
産のための複合窒素源として、ＢＰ自己融解物（実施例１）を、大豆加水融解物（Bacto soytone）と比較することである。C. glutamicum NRRL B-11470を含んだ１リットルの培
地を有する３リットルのガラス製発酵槽で行われた発酵において、リジン生産を比較した。培地の組成は、すべての発酵において同じである。ただし、ＢＰ自己融解物またはソイトン（soytone）（１４、２１または２８ｇ／リットル）のいずれかである複合窒素源は
除く。
結果：
発酵の主な結果を表１０にまとめた。さらに、発酵時間の関数としてのリジン生産を図３に示した。全般的に、リジン生産速度は、複合窒素源の濃度増加とともに増加している。これは恐らく、細胞濃度が、複合窒素源の添加量の増加とともに増加しているからである。しかしながら、生産速度は、ＢＰ自己融解物を添加した培地中では、同量のソイトンを添加した培地と比べて、有意に高い。ＢＰ自己融解物における粒体濃度が高いため、ＢＰ自己融解物を用いた発酵における光学濃度を決定することは不可能だった。したがって、これらの発酵における細胞量を推定することはできない。しかしながら、生産速度が高いのは恐らく、ＢＰ自己融解物を用いた発酵においては、ソイトンを用いた同様の発酵よりも細胞濃度が高いからである。

^A 消費ブドウ糖。合計１３２ｇ加えたが、発酵が終了したとき、７ｇ／リットルは依然として残存していた。
^B この計算においては、発酵中の容積増加（５〜１５％）を考慮した。
^C 発酵の終了時における培地の顕微鏡検査では、培地に汚染生物は見られなかったが、分析結果は汚染生物が存在することを明確に示していた。しかしながら、当該生物はリジン生産にそれほど影響しなかったようである。
^E この発酵では、最後のサンプルにおいて測定されたリジン濃度は、最後から２番目のサンプルにおける場合よりも低かった。キナード(Chinard)法がかなり大きな標準偏差を有
していることがその理由である。最終容積収率は、主として最後から２番目のサンプルに基づいて推定した。

単位重量のブドウ糖あたりの最終リジン収率は、大部分の発酵においてほぼ同じで、０．１７〜０．１９ｇリジンＨＣｌ／ｇブドウ糖であり、添加した複合窒素源の種類および量とは無関係だった。２１ｇ／リットルのＢＰ自己融解物を添加した発酵における収率は、０．２１〜０．２２ｇリジンＨＣｌ／ｇブドウ糖であり、わずかに高いといえる。
結論：
発酵研究からＢＰ自己融解物は、ソイトンの良好な代替物であることが明確に示され、発酵における生産速度の点でソイトンよりも優れているようである。ＢＰ自己融解物を用いた発酵において、生産速度の増加は、同量のソイトンを用いた発酵における場合と比べて、恐らく細胞濃度が高いことが原因である。このことの理由は不明である。しかしながら、ＢＰ自己融解物は細菌起源のものであるから、ソイトンと比較すると、増殖のための成分（リボ核酸、細胞壁構成成分、脂質など）についての細胞の必要条件に、より適合していることがその理由であろう。

図１は、Ａ）L. アシドフィリウス（acidophilus）およびＢ）L.プランタラム（plantarum）の、ＭＲＳ上（―）およびＢＰ自己融解物上（...）における培養実験研究の結果を示す。時間（ｈ）対２５％ＮａＯＨの添加量（ｇ）およびＯＤ６２０ｎｍ（ＭＲＳ上での発酵について）。図２は、酵母抽出物、ＢＰ抽出物およびＢＰ自己融解物上における大腸菌の発酵研究から得られたデータを示す。図３は、時間ならびに添加した複合窒素源の種類および量を関数として、種々の発酵におけるリジン生産を示す。

Claims

少なくとも一種類以上のメタン栄養細菌と少なくとも一種類以上の従属栄養細菌とを含む細菌の培養物のバイオマスから得られる無菌的栄養組成物の、微生物増殖培地としての使用方法。
前記培養物が追加の栄養素も含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
微生物と該微生物用の増殖培地とを接触させることからなる微生物培養方法であって、前記増殖培地が、少なくとも一種類以上のメタン栄養細菌と少なくとも一種類以上の従属栄養細菌とを含む細菌の培養物のバイオマスから得られる無菌的栄養組成物であるか、または該組成物から調製されることを特徴とする微生物培養方法。
前記培養物が追加の栄養素も添加されたものであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
前記栄養組成物が、前記バイオマスの加水分解物、ホモジナイゼートまたは自己融解物を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
前記栄養組成物が自己融解物を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
前記増殖培地が、ブドウ糖および／または硝酸塩および無機塩類をさらに含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
硝酸塩および無機塩類が、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、モリブデン、鉄、亜鉛、ホウ素、コバルト、マンガンおよびニッケルの化合物から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の方法。
ブドウ糖が、バイオマス由来成分に対して５：１〜１：５の乾燥質量に基づいた重量比で前記増殖培地に存在することを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
ブドウ糖が、バイオマス由来成分に対して２：１〜１：２の乾燥質量に基づいた重量比で前記増殖培地に存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
硝酸塩および無機塩類が、バイオマス由来成分に対して０．０１：１〜０．２：１の重量比で前記増殖培地に存在することを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
硝酸塩および無機塩類が、バイオマス由来成分に対して０．０５：１〜０．１：１の重量比で前記増殖培地に存在することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
バイオマスを生産するために使用する細菌の培養物は、細菌の全重量に対して５０重量％以上がメタン栄養細菌であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
バイオマスを生産するために使用する細菌の培養物は、細菌の全重量に対して７５〜９５重量％がメタン栄養細菌であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
前記培養物が、メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus） (Bath) (NCIMB 11132株)、ラルストニア（Ralstonia）sp. DB3 (NCIMB 13287株)およびブレビバチラス・アグリ（Brevibacillus agri）DB5 (NCIMB 13289株)を含むことを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
前記培養物が、アニュリニバチラス（Aneurinibacillus）sp. DB4 (NCIMB 13288株)も含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
前記細菌の培養物が炭化水素留分または天然ガスの発酵によって生産されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
さらに少なくとも１種以上の無菌的栄養素を含む、請求項１〜６および１３〜１７のいずれかに記載の無菌的栄養組成物を含む微生物増殖基質。
前記無菌的栄養素が、ブドウ糖、硝酸塩、無機塩類およびそれらを組み合わせたものから選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の基質。
硝酸塩および無機塩類が、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、モリブデン、鉄、亜鉛、ホウ素、コバルト、マンガンおよびニッケルの化合物から選ばれることを特徴とする請求項１９に記載の基質。
ブドウ糖が、バイオマス由来成分に対して５：１〜１：５の乾燥質量に基づいた重量比で存在することを特徴とする請求項１９または２０に記載の基質。
ブドウ糖が、バイオマス由来成分に対して２：１〜１：２の乾燥質量に基づいた重量比で存在することを特徴とする請求項２１に記載の基質。
硝酸塩および無機塩類が、バイオマス由来成分に対して０．０１：１〜０．２：１の重量比で存在することを特徴とする請求項１９〜２２のいずれかに記載の基質。
硝酸塩および無機塩類が、バイオマス由来成分に対して０．０５：１〜０．１：１の重量比で存在することを特徴とする請求項２３に記載の基質。