KR101573529B1

KR101573529B1 - 세포의 배양 방법 및 그 이용

Info

Publication number: KR101573529B1
Application number: KR1020077015339A
Authority: KR
Inventors: 스스무 고토; 쇼헤이 기시시타; 신야 다쿠마; 지카시 히라시마
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2005-01-05
Filing date: 2005-12-26
Publication date: 2015-12-01
Also published as: JPWO2006073070A1; IL184262A0; MX2007007842A; EP1835022A1; DK1835022T3; KR20130101161A; EP2843040A1; ES2535230T3; AU2005323643A1; TW200636068A; PL1835022T3; EP1835022A4; US20080124761A1; WO2006073070A1; CA2593521A1; SI1835022T1; KR20070090998A; EP1835022B1; HK1207883A1; AU2005323643B2

Abstract

어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 포함한 배지를 이용하고, 세포에 단백질을 고생산시킨다. 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한 배지로 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법. 이 배양 방법을 이용하여, 원하는 단백질을 제조하는 방법.

Description

세포의 배양 방법 및 그 이용{CELL CULTURE METHOD AND UTILIZATION OF THE SAME}

본 발명은, 세포의 배양 방법 및 그 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 세포의 배양 방법과 그것을 이용하여 세포에 단백질을 생산시키는 방법에 관한 것이다.

동물 세포를 배양하고 그 동물 세포가 생성하는 천연형 단백질을 얻고자 하는 경우, 또는 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 동물 세포를 배양하고 원하는 단백질 등을 제조하는 경우에는, 염류, 당류, 아미노산류, 및 비타민류 등의 기초 영양물 외에, 그 동물 세포의 증식을 위해서, 통상, 포유 동물 유래의 추출물, 구체적으로는 우태 혈청 등의 혈청이 5 ∼ 20% 의 범위에서 배지에 첨가되어 있다. 그러나, 이러한 포유 동물 유래의 혈청은, 배지 비용의 75 ∼ 95% 를 차지하는 것, 품질에 로트간 차이가 있기 때문에 안정적인 증식을 얻을 수 없다는 결점이 있다. 또, 포유 동물 유래의 혈청은 오토클레이브 등에 의해 멸균할 수 없으므로, 바이러스 또는 마이코 플라스마 오염될 가능성이 있고, 그 대부분은 무해하지만, 안정 생산이라는 점에서는 부가적인 미지의 요인이 될 수 있다. 또한 혈청에는 500 종 이상의 단백질이 포함되어 있어, 이로 인해 배양 배지로부터의 세포 산물인 원하는 단백질의 단리, 정제를 복잡화한다. 이러한 안정 생산상의 문제를 해소하기 위해서, 혈청의 대신으로서, 페투인, 인슐린, 트랜스페린 등의 혈청 유래의 순화된 단백질을 사용하는 방법이 실시되고 있다. 또, 제조 비용의 관점에서, 포유 동물로부터 추출된 배지 성분을 사용하는 방법도 시도되고 있다.

그러나, 최근, 포유 동물 유래의 성분에 대해서는, 광우병 (mad cow disease), 소해면상뇌증 (Bovine Spongiform Encephalopathy : BSE), 감염성 해면상뇌증 (Transmissible Spongiform Encephalopathy : TSE), 나아가 크로이츠펠트 야콥병 (Creutzfeld-Jakob Disease : CJD) 등과의 관계가 염려되어, 안전성의 관점에서 이들 포유 동물에서 유래하는 성분을 함유하지 않는 동물 세포 배양용 배지의 출현이 요구되고 있다.

동물 세포를 배양할 때, 사용하는 배지 중에 상기와 같은 포유 동물 유래의 성분을 첨가하지 않으면, 배양 초기에 세포의 생존율이 현저하게 저하되어, 배양액 중의 생세포 수가 감소하기 때문에 장기 배양 또는 대량 배양을 실시할 수 없다는 문제가 있었다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 배양용 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가하는 방법이 보고되어 있다 (특허 문헌 1, 2). 당해 방법에 의해, 일반적으로 필수로 되어 있던 소 태아 혈청을 사용하지 않고, 단백질을 고(高)생산하는 것이 가능해졌다.

그러나, 제조 비용의 관점에서, 단백질의 생산량은 가능한 한 많은 것이 바람직하고, 더나은 개량이 요구되고 있었다.

특허 문헌 1 : 국제공개공보 제99/63058호 팜플렛

특허 문헌 2 : 일본 공개특허공보 2003-334068호

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은, 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 함유한 배지를 이용하여 유가(流加) 배양을 실시함으로써, 세포에 단백질을 고생산시키는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 노력한 결과, 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한 배지를 이용하고 유가 배양을 실시함으로써, 세포에 원하는 단백질을 보다 높은 수량(收量)으로 생산시킬 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

본 발명의 요지는 이하와 같다.

(1) 초기 배지에서 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 유가 배지를 첨가하는 배양 방법에 있어서, 초기 배지 또는 유가 배지의 적어도 일방에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물이 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.

(2) 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한 배지에서 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.

(3) 세포를 유가 배양법으로 배양하는 (2) 의 배양 방법.

(4) 세포가 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 것인 청구항 (1) ∼ (3) 중 어느 하나의 배양 방법.

(5) 원하는 단백질이 항체인 (4) 의 배양 방법.

(6) 세포가 동물 세포인 청구항 (1) ∼ (5) 중 어느 하나의 배양 방법.

(7) 세포가 포유 동물 세포인 (6) 의 배양 방법.

(8) 포유 동물 세포가 CHO 세포인 (7) 의 배양 방법.

(9) 초기 배지에서 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 유가 배지를 첨가하여 세포를 배양함으로써, 단백질을 제조하는 방법으로서, 초기 배지 또는 유가 배지의 적어도 일방에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물이 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

(10) 단백질을 제조하는 방법으로서, 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한 배지에서 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

(11) 세포를 유가 배양법으로 배양하는 (10) 의 제조 방법.

(12) 세포가 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 것인 (9) ∼ (11) 중 어느 하나의 제조 방법.

(13) 원하는 단백질이 항체인 (12) 의 제조 방법.

(14) 세포가 동물 세포인 (9) ∼ (13) 중 어느 하나의 제조 방법.

(15) 세포가 포유 동물 세포인 (14) 의 제조 방법.

(16) 포유 동물 세포가 CHO 세포인 (15) 의 제조 방법.

발명의 효과

본 발명에 있어서, 세포의 배양 개시시의 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가할 뿐만 아니라, 세포 배양 중의 배지에도 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가함으로써, 보다 높은 수량으로 원하는 단백질을 세포에 생산시킬 수 있다.

본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원, 일본 특허 출원 2005-000747호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1 은, 가다랑어 가수 분해물 5g/L 를 첨가한 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 (초기 배지) 및 가다랑어 가수 분해물 30g/L 를 첨가한 포유 동물 유래 성분비함유 배지 (유가 배지) 에서 배양한 CHO 세포가 배지 중에 생산한 항체 단백질 농도 (g/L) 를 나타내는 그래프이다.

도 2 는, 가다랑어 가수 분해물 15g/L 를 첨가한 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 (초기 배지) 및 가다랑어 가수 분해물 75g/L 를 첨가한 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 (유가 배지) 에서 배양한 CHO 세포가 배지 중에 생산한 항체 단백질 농도(g/L) 를 나타내는 그래프이다.

도 3 은, 가다랑어 가수 분해물 5g/L 를 첨가한 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 (초기 배지) 및 가다랑어 가수 분해물 30g/L 를 첨가한 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 (유가 배지) 에서 배양한 CHO 세포가 배지 중에 생산한 항체 단백질 농도 (g/L) 를 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서는, 초기 배지로 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 유가 배지를 첨가한다. 여기에서, 초기 배지 또는 유가 배지의 적어도 일방에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물이 첨가되어 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 양태로서, 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한 배지에서 세포의 배양을 개시하고, 또한 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한다.

본 발명에 의하면, 종래 동물 세포 배양용 배지로서 일반적으로 사용되고 있는 배지에 있어서 포유 동물 세포 유래의 성분을 첨가하지 않아도, 양호하게 세포를 배양할 수 있다.

일반적으로, 세포 배양 방법은, 회분법 (batch culture), 연속법 (continuous culture), 유가 배양법 (fed-batch culture) 으로 분류된다. 본 발명 방법에 있어서는, 어떠한 배양 방법을 이용해도 되는데, 바람직하게는, 유가 배양법 또는 연속법이 이용되고, 특히 바람직하게는, 유가 배양법이 사용된다.

회분법은, 배지에 소량의 종 배양액을 첨가하고, 배양 중에 새롭게 배지를 첨가하거나 또는 배양액을 배출하거나 하지 않고, 세포를 증식시키는 배양 방법이다.

연속법은, 배양 중에 연속적으로 배지를 첨가하고, 또한, 연속적으로 배출시키는 배양 방법이다. 또한, 연속법에는, 관류 배양도 포함된다.

유가 배양법은 회분법과 연속법의 중간에 해당하기 때문에, 반회분법 (semi-batch culture) 이라고도 불리고, 배양 중에 연속적으로 또는 축차적으로 배지가 첨가되는데, 연속법과 같은 연속적인 배양액의 배출을 실시하지 않은 배양 방법이다. 유가 배양시에 첨가되는 배지 (이하, 유가 배지라고 한다) 는, 이미 배양에 사용되어 있는 배지 (이하, 초기 배지라고 한다) 와 동일한 배지일 필요는 없고, 상이한 배지를 첨가해도 되거나, 특정 성분만을 첨가해도 된다.

본 발명에 있어서 초기 배지란, 통상, 세포 배양의 최초의 단계에서 사용되고 있는 배지를 말한다. 단, 유가 배지를 여러 차례로 나누어 첨가하는 경우에는, 유가 배지를 각각 첨가하기 전의 배지를 초기 배지로 해도 된다.

본 발명의 방법에 있어서, 유가 배양법을 채용하는 경우, 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물은 유가 배지 또는 초기 배지 중 어느 하나에 함유되어 있으면 되는데, 유가 배지 및 초기 배지의 양방에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물이 함유되어 있는 것이 바람직하다. 또, 초기 배지 중의 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물의 농도와 비교하여, 유가 배지 중의 어육의 효소 분해물 또는 어육의 추출물의 농도인 편이 높아지고 있는 것이 바람직하다. 초기 배지 중의 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물의 농도는, 통상, 1 ∼ 30g/L 가 적당하고, 3 ∼ 20g/L 가 바람직하며, 5 ∼ 15g 이 보다 바람직하다. 유가 배지 중의 어육의 효소 분해물 또는 어육의 추출물의 농도는, 통상, 5 ∼ 150g/L 가 적당하고, 10 ∼ 120g/L 가 바람직하고, 20 ∼ 90g/L 가 더욱 바람직하며, 30 ∼ 75g/L 가 보다 바람직하다. 배양 초기의 배지와 유가 배지의 양의 비는 특별히 한정되지 않는데, 통상, 배양 초기의 배지의 용량을 1 로 한 경우에 유가 배지는 0.01 ∼ 10 이며, 바람직하게는 0.1 ∼ 1 이며, 더욱 바람직하게는 0.2 ∼ 0.3 이다. 유가 배지는 연속적으로 첨가되어도 되고, 축차 첨가되어도 된다. 축차 첨가되는 경우, 첨가의 횟수는 특별히 한정되지 않아, 1 회이어도 되고, 여러 차례로 나누어 첨가되어도 된다.

본 발명에서 사용하는 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물에 대해, 어육으로서는, 가다랑어, 몽치다래, 참치, 고등어, 꽁치, 정어리, 전갱이, 연어 등의 붉은 살 생선이나, 대구, 농어, 넙치, 가자미, 도미 등의 흰 살 생선 등의 어육을 들 수 있고, 바람직하게는 가다랑어, 몽치다래, 대구, 고등어, 연어, 정어리이다.

본 발명에서 사용하는 어육 추출물은, 예를 들어, 상기 어육을 적당한 단편으로 절단하거나 또는 잘게 썰어 페이스트상으로 하고, 그 가용성 성분을 뜨거운 물, 예를 들어 90-95℃ 의 뜨거운 물에서 수십 분에서 수십 시간 추출함으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, 가다랑어포 제조시의 가다랑어 끓인 국물이나 통조림 제조시의 쿡 드레인 등을 들 수 있다.

또, 어육의 효소 분해물은, 예를 들어, 어육을 끓인 것을 그대로, 또는, 잘게 썰어 페이스트상으로 한 것, 또는 상기와 같이 하여 얻어진 어육 추출물에 적당 량의 물을 첨가하여, 필요에 따라 가열하고 단백 변성시킨 후, 단백질 분해 효소로 처리하고, 적절하게 원심 분리나 여과 등에 의해 유분이나 불용화물을 제거함으로써 얻을 수 있다. 이러한 어육 추출물 또는 어육의 효소 분해물은 pH 를 7-7.4 정도로 조정하여 사용하는 것이 좋다.

단백질 분해 효소로서는, 프로테이나아제 및/또는 펩티다아제를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 프로테이나아제는, 단백질을 기질로 하여 단백질을 가수 분해하는 효소를 말하고, 펩티다아제는, 펩티드를 기질로 하는 펩티드 결합 가수 분해 효소를 말한다. 즉, 프로테아제의 단백질 기질에 대한 활성을 프로테이나아제 활성, 펩티드 기질에 대한 활성을 펩티다아제 활성으로 하여 구별할 수 있다. 단백질 기질에 대한 프로테아제의 활성에 의해, 펩티드 결합사슬의 중간 정도로부터의 절단을 촉매할 때에는 프로테이나아제라는 용어를 사용하고, 따라서 엔도펩티다아제는 본 명세서에서는 프로테이나아제의 1 종으로서 사용하고 있다.

구체적으로는, 파파인, 키모파파인, 브로멜라인, 피신 등의 식물 기원의 효소 및 곰팡이, 세균, 효모 등의 미생물 기원의 효소로, 엔도펩티다아제, 엑소펩티다아제, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 디펩티다아제 등의 효소 등을 들 수 있다. 이들의 효소는 단독 또는 병용하여 사용할 수 있다. 병용하는 경우에는, 그들을 동시에 첨가해도 되거나, 단계적으로 첨가해도 된다.

본 발명에 있어서의 어육의 효소 분해물로서는, 상기의 프로테이나제로 처리하고, 이어서 펩티다아제로 처리하여 얻어지는 어육의 효소 분해물이 바람직하다.

효소 처리는, 사용하는 효소의 종류에 따라 상이한데, 통상, pH2-12, 바람직 하게는 pH4-8 로, 30-90℃, 바람직하게는 40-65℃ 의 온도에서, 30 분-72 시간, 바람직하게는 3-24 시간 실시한다. 그 때, 효소는 기질로서의 단백질의 0.001-10 W/W%, 바람직하게는 0.1-1W/W%, 더욱 바람직하게는 0.2-0.6W/W% 정도 사용한다. 이와 같이 하여 얻어진 어육의 효소 분해물 중의 효소를 가온 등에 의해 실활시킨 후, 원심 분리나 여과 등을 적절하게 실시하여 유분이나 불용화물을 제거함으로써 효소 분해물을 조제할 수 있다.

어육에는 생선의 내장과 살코기가 포함되는데, 내장과 살코기의 비율은 특별히 한정되지 않고 어떠한 비율을 이용해도 되는데, 예를 들어, 일본 공개특허공보2003-334068호에 기재된 비율을 이용하는 것이 가능하다.

본 발명에서 이용하는 배지의 다른 성분으로서는, 통상, 세포 (바람직하게는, 동물 세포) 배양 배지에서 사용되고 있는 각 성분을 적절하게 사용할 수 있는데, 이들에는 아미노산, 비타민류, 지질 인자, 에너지원, 침투압 조절제, 철원, pH 완충제를 포함한다. 상기 성분 외에, 예를 들어, 미량 금속 원소, 계면 활성제, 증식 보조 인자, 뉴클레오시드 등을 첨가해도 된다.

구체적으로는, 예를 들어, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루타민, L-글루타민산, 글리신, L-히스티딘, L-이소로이신, L-로이신, L-리신, L-메티오닌, L-오르니틴, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 등, 바람직하게는 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스틴, L-글루타민, L-글루타민산, 글리신, L-히스티딘, L-이소로이신, L-로이신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 등의 아미노산류 ; i-이노시톨, 비오틴, 폴산, 리포산, 니코틴아미드, 니코틴산, p-아미노벤조산, 판토텐산 칼슘, 염산 피리독살, 염산 피리독신, 리보플라빈, 염산 티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등, 바람직하게는 비오틴, 폴산, 리포산, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 염산 피리독살, 리보플라빈, 염산 티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등의 비타민류 ; 염화 콜린, 타르타르산 콜린, 리놀산, 올레산, 콜레스테롤 등, 바람직하게는 염화 콜린 등의 지질 인자 ; 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스 등, 바람직하게는 글루코오스 등의 에너지원 ; 염화 나트륨, 염화 칼륨, 질산 칼륨 등, 바람직하게는 염화 나트륨 등의 침투압 조절제 ; EDTA 철, 시트르산 철, 염화 제 1 철, 염화 제 2 철, 황산 제 1 철, 황산 제 2 철, 질산 제 2 철 등, 바람직하게는 염화 제 2 철, EDTA 철, 시트르산 철 등의 철원류 ; 탄산 수소 나트륨, 염화 칼슘, 인산 2 수소 나트륨, HEPES, MOPS 등, 바람직하게는 탄산 수소 나트륨 등의 pH 완충제를 함유한 배지를 예시할 수 있다.

상기 성분 외에, 예를 들어, 황산 구리, 황산 망간, 황산 아연, 황산 마그네슘, 염화 니켈, 염화 주석, 염화 마그네슘, 아규산 나트륨 등, 바람직하게는 황산 구리, 황산 아연, 황산 마그네슘 등의 미량 금속 원소 ; Tween 80, 플루로닉 F68 등의 계면 활성제 ; 및 재조합형 인슐린, 재조합형 IGF, 재조합형 EGF, 재조합형 FGF, 재조합형 PDGF, 재조합형 TGF-α, 염산 에탄올아민, 아셀렌산 나트륨, 레티노인산, 염산 퓨트레신 등, 바람직하게는 아셀렌산 나트륨, 염산 에탄올아민, 재조합형 IGF, 염산 퓨트레신 등의 증식 보조 인자 ; 디옥시아데노신, 디옥시시티딘, 디 옥시구아노신, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘 등의 뉴클레오시드 등을 첨가해도 된다. 또한 상기 본 발명의 적합예에 있어서는, 스트렙토마이신, 페니실린 G 칼륨 및 겐타마이신 등의 항생 물질이나, 페놀 레드 등의 pH 지시약을 포함하고 있어도 된다.

배지는, 시판된 동물 세포 배양용 배지, 예를 들어, D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), D-MEM/F-12 1:1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12), RPMI1640, CHO-S-SFMII (Invitrogen 사), CHO-SF (Sigma-Aldrich 사), EX-CELL 301 (JRH biosciences 사), CD-CHO (Invitrogen 사), IS CHO-V (Irvine Scientific 사), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich 사) 등의 배지에, 어육 추출물 또는 어육의 효소 분해물을 첨가함으로써 조제하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 어육 추출물 또는 어육 효소 분해물을 첨가하는 배지는, 특별히 한정되지 않아, 어떠한 배지를 이용해도 되는데, 포유 동물 유래의 혈청을 함유하지 않는 무혈청 배지가 바람직하고, 특히 포유류 동물로부터 단리된 포유 동물 유래 성분을 함유하지 않은 포유 동물 유래 성분 비함유 배지가 바람직하다.

어육 추출물 또는 어육의 효소 분해물을 첨가하는 배지가, 무혈청 배지 또는 동물 유래 성분 비함유 배지인 경우에는, 통상, 배양되는 세포는 무혈청 배지 또는 동물 유래 성분 비함유 배지 중에서도 생육할 수 있도록 그들의 배지에 적응되어져 있다. 세포의 순화 방법은 이미 당업자에게 잘 알려져 있다.

또, 배지 중의 그 밖의 성분의 함량은, 아미노산은 0.05-1500㎎/L, 비타민류 는 0.001-10㎎/L, 지질 인자는 0-200㎎/L, 에너지원은 1-20g/L, 침투압 조절제는 0.1-10000㎎/L, 철원은 0.1-500㎎/L, pH 완충제는 1-10000㎎/L, 미량 금속 원소는 0.00001-200㎎/L, 계면 활성제는 0-5000㎎/L, 증식 보조 인자는 0.05-10000㎍/L 및 뉴클레오시드는 0.001-50㎎/L 의 범위가 적당하고, 배양하는 세포의 종류, 원하는 단백질의 종류 등에 의해 적절하게 결정할 수 있다.

배지의 pH 는 배양하는 세포에 의해 상이한데, 일반적으로는 pH6.8 ∼ 7.6, 대부분의 경우 pH7.0 ∼ 7.4 가 적당하다.

본 발명의 배양 방법은 특별히 한정되지 않고 여러 가지의 세포 (예를 들어, 세균 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포 등) 의 배양에 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전자 공학적 조작에 의해 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 삽입한 COS 세포나 CHO 세포, 또는, 항체를 생성하는 마우스-인간, 마우스-마우스, 마우스-래트 등의 하이브리도마로 대표되는 융합 세포를 배양하는 것이 가능하다. 본 발명의 방법은, 동물 세포를 배양하여 그 동물 세포가 생성하는 천연형 단백질을 얻으려고 하는 경우에도 사용할 수 있고, 상기 서술한 세포 외에, BHK 세포, HeLa 세포 등의 배양에도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 특히 바람직한 동물 세포는 원하는 단백질을 코드하는 유전자가 도입된 CHO 세포이다. 원하는 단백질은 특별히 한정되지 않아, 항체 (천연 항체, 저분자화 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등) 나 생리 활성 단백질 (과립구 코로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 매크로파지 코로니 증식 인자 (GM-CSF), 에리스로포에틴, 인터페론, IL-1 이나 IL-6 등의 인터루킨, t-PA, 우로키나 아제, 혈청 알부민, 혈액 응고 인자 등) 등 어떠한 단백질이어도 되는데, 특히 항체가 바람직하다.

본 발명의 제조 방법으로 생산되는 항체로서는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 원숭이 등의 동물 유래의 모노클로날 항체뿐만 아니라, 키메라 항체, 인간 인화 항체, bispecific 항체 등 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체도 포함된다. 또, 항체의 면역 글로블린 클래스는 특별히 한정되는 것이 아니고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 등 어느 클래스이어도 되는데, 의약으로서 이용하는 경우에는 IgG 및 IgM 이 바람직하다. 또한 본 발명의 항체로서는 whole 의 항체뿐만 아니라, Fv, Fab, F(ab)₂ 등의 항체 단편이나, 항체의 가변 영역을 펩티드 링커 등의 링커로 결합시킨 1 가 또는 2 가 이상의 1 개 사슬 Fv(scFv, sc(Fv)₂ 등) 의 저분자화 항체 등도 포함된다.

배양 조건은 사용하는 세포의 종류에 따라 상이하므로, 적절하게 바람직한 조건을 결정하면 된다. 예를 들어 CHO 세포이면 통상적으로, 기상의 CO₂ 농도가 0-40%, 바람직하게는, 2-10% 의 분위기 하, 30-39℃, 바람직하게는, 37℃ 정도에서, 1-14 일간 배양하면 된다.

또, 동물 세포 배양용의 각종의 배양 장치로서는, 예를 들어 발효조형 탱크 배양 장치, 에어 리프트형 배양 장치, 컬쳐 플라스크형 배양 장치, 스피너 플라스크형 배양 장치, 마이크로 캐리어형 배양 장치, 유동층형 배양 장치, 홀로우파이버형 배양 장치, 롤러 보틀형 배양 장치, 충전조형 배양 장치 등을 이용하여 배양할 수 있다.

본 발명 방법에 의해 세포 (바람직하게는, 동물 세포) 를 배양함으로써, 단백질을 고생산시키는 것이 가능해진다.

동물 세포의 단백질의 생산은, 간단하게 그것을 배양하는 것만으로 되나, 특수한 조작을 필요로 하는 것도 존재하는데, 그들의 조작 또는 조건 등은 배양하는 동물 세포에 의해 적절하게 결정하면 된다. 예를 들어 유전자 공학적 조작에 의해 마우스-인간 키메라 항체를 코드하는 유전자를 포함한 벡터로 트랜스 폼된 CHO 세포에서는, 상기와 같은 조건 하에서 배양을 실시함으로써, 1-14일간, 바람직하게는 7-10일간 정도로 원하는 단백질을 배지 중에 얻을 수 있다. 이것을 통상적인 방법 (예를 들어, 항체 공학 입문, 지인서관, p.102-104 ; Affinity Chromatography Principles & Methods, 아마샴 파마시아 바이테크 (주), p.56-60 등 참조) 에 따라 단리, 정제함으로써 원하는 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명에 의해, 재조합 항체 (천연 항체, 항체 단편, 저분자화 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, bispecific 항체 등, 유전자 재조합 단백질 (과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리스로포에틴, 인터페론, IL-1 이나 IL-6 등의 인터루킨, t-PA, 우로키나아제, 혈청 알부민, 혈액 응고 인자 등) 등을 높은 생산량으로 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 참고예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

〔실시예 1〕 가다랑어 가수 분해물을 이용한 유가 배양

배지 조성 및 조제법은 이하와 같다.

초기 배지 : 포유 동물 유래 성분 비함유 배지에 참고예 1 에서 조제한 가다랑어 가수 분해물 5g/L 를 첨가하고, 용해 후 여과 멸균하였다.

유가 배지 : 초기 배지에 이용하는 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 성분을 초기 배지에 대해 약 2 배 농도로 하고, 가다랑어 가수 분해물 30g/L 를 첨가하여 용해 후 여과 멸균하였다.

세포 : 국제공개 제2005/005636호 팜플렛에 기재된 재조합형 항암 글리오시드 GM3 인간 항체 (L612) 를 생성하는 CHO 세포주. 본 항체의 클래스는 IgM 이다.

항아리(jar)형 세포 배양 장치에 초기 배지를 첨가하고, 이것에 상기 CHO 세포주를, 2 x10⁵ cells/mL 가 되도록 첨가하여 37℃, 10% CO₂ 의 조건으로 배양을 개시하였다. 유가 배양에서는, 배양 3 일째부터 유가 배지를 일정 유속으로 유가하고, 14 일째까지 배양을 실시하였다. 배양 개시시 및 3, 7, 10, 14 일째에 샘플링을 실시하였다. 각 샘플의 배양 상청에 대해, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 생산된 항체 단백질 농도를 측정하였다. 도 1 에 나타내는 바와 같이, 유가를 실시하지 않은 경우의 항체 단백질 농도는 10 일간의 배양에서 0.6g/L 정도였다. 이것에 대해, 가다랑어 가수 분해물을 포함한 용액을 유가하면, 10 일간의 배양으로 1.2g/L 이상, 14 일간에서는 1.7g/L 를 초과하는 높은 항체 단백질 농도를 얻을 수 있다.

〔실시예 2〕가다랑어 가수 분해물을 이용한 유가 배양

배지 조성 및 조제법은 이하와 같다.

초기 배지 : 포유 동물 유래 성분 비함유 배지에 참고예 1 에서 조제한 가다랑어 가수 분해물 15g/L 를 첨가하고, 용해 후 여과 멸균하였다.

유가 배지 : 초기 배지에 이용하는 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 성분을 초기 배지에 대해 약 4 배 농도로 하고, 가다랑어 가수 분해물 75g/L 를 첨가하여 용해 후 여과 멸균하였다.

세포 : 국제공개 제92/19759호 팜플렛의 실시예 10 에 기재된 인간 신장 인자 Iα 프로모터를 이용하고, 일본 공개특허공보 평8-99902호의 참고예 2에 기재된 방법에 준하여 제작한 인간형화 PM-1 항체 (항인간 IL-6 리셉터 항체) 를 생성하는 CHO 세포주. 본 항체의 클래스는 IgG1 이다.

항아리형 세포 배양 장치에 초기 배지를 첨가하여, 이것에 상기 CHO 세포주를, 유가를 실시하는 경우에는 1×10⁶cells/mL, 실시하지 않은 경우에는 0.5×10⁶cells/mL 가 되도록 각각 첨가하여 37℃, 10% CO₂ 의 조건으로 배양을 개시하였다. 유가 배양에서는, 배양 2 일째부터 유가 배지를 일정 유속으로 유가하고, 10 일째까지 배양을 실시하였다. 배양 개시시 및 3, 5, 7, 10 일째에 샘플링을 실시하였다. 각 샘플의 배양 상청에 대해, 프로테인 A 칼럼을 이용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 생산된 항체 단백질 농도를 측정하였다. 도 2 에 나타내는 바와 같이, 유가를 실시하지 않은 경우의 항체 단백질 농도는 7 일간의 배양에서 0.5g/L 정도였다. 이에 대해, 가다랑어 가수 분해물을 포함한 용액을 유가하면, 7 일간의 배양으로 1.1g/L 이상, 10 일간에서는 1.4g/L 를 초과하는 높은 항체 단백질 농도를 얻을 수 있다.

〔실시예 3〕가다랑어 가수 분해물을 이용한 유가 배양

배지 조성 및 조제법은 이하와 같다.

초기 배지 : 포유 동물 유래 성분 비함유 배지에 참고예 1 에서 조제한 가다랑어 가수 분해물 5g/L 를 첨가하고, 용해 후 여과 멸균하였다. 비교 대조용으로서 가다랑어 가수 분해물을 함유하지 않는 것을 이용하였다.

유가 배지 : 포유 동물 유래 성분 비함유 배지 성분을 초기 배지에 대해 2 배 농도로 하고, 가다랑어 가수 분해물 30g/L 를 첨가하여 용해 후 여과 멸균하였다. 비교 대조용으로서 가다랑어 가수 분해물을 함유하지 않는 것을 이용하였다.

세포 : 국제 공개 제2005/056604호 팜플렛에 기재된 방법으로 제작한, MPL 결합성 single chain (Fv)₂(sc(Fv)₂) 을 생성하는, 재조합 CHO 세포.

배양 결과 : 항아리형 세포 배양 장치에 초기 배지를 첨가하고, 이것에 상기 CHO 세포주를, 3×10⁵cells/mL 가 되도록 첨가하여 37℃, 10% CO₂ 의 조건으로 배양을 개시하였다. 배양 3 일째부터 유가 배지를 일정 유속으로 유가하고, 14 일 째까지 배양을 실시하였다. 배양 기간 중 적절하게 샘플링을 실시하였다. 각 샘플의 배양 상청에 대해, MPL 의 아미노산 배열 중 sc(Fv)₂ 가 결합하는 부분을 이용하고, BIACORE법에 의해 생산된 단백질 농도를 측정하였다. 도 3 에 나타내는 바와 같이, 가다랑어 가수 분해물을 함유하지 않은 유가 배양에서는 단백질 농도는 14 일간의 배양으로 450㎎/L 정도였다. 이에 대해, 가다랑어 가수 분해물을 함유한 용액을 유가하면, 14 일간의 배양으로 760㎎/L 를 초과하는 높은 단백질 농도를 얻을 수 있었다.

〔참고예 1〕가다랑어의 효소 분해물의 조제

어육으로서 시판되는 가다랑어를 사용하였다. 가다랑어를 잘게 썬 것 840㎏ 에 물 1200㎏ 을 첨가하여, 식물 유래의 파파인 3.2㎏ 으로, pH6.0, 65℃ 의 조건 하에서 1 시간 인큐베이트하고, 효소 분해를 실시하였다. 다음으로, 곰팡이 유래의 엑소펩티다아제 3.2㎏ 으로 추가로 상기 조건 하에서 15 시간 효소 분해를 실시한 후, 95℃ 로 가열함으로써 효소를 실활시켰다. 그 후 원심 분리, 여과에 의해 불용물, 유분을 제거, 농축하고, 어육 (가다랑어) 의 효소 분해물 약 150㎏ 을 조제하였다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

본 발명에 의해, 우태아 혈청 등의 고가이며 품질의 편차가 큰 단백질을 사 용하지 않고, 안정적으로 세포를 배양하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법에서 세포를 배양함으로써, 최근 문제가 되고 있는 이상 프리온 또는 바이러스 등에 의한 오염의 위험성이 제거되어 안전한 바이오 의약품을 고생산하여 제공할 수 있다.

Claims

삭제
어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한 배지에서 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가하고, 배양 기간을 7 일 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.
제 2 항에 있어서,

세포를 유가 배양법으로 배양하는 배양 방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

세포가 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 것인 배양 방법.
제 4 항에 있어서,

원하는 단백질이 항체인 배양 방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

세포가 동물 세포인 배양 방법.
제 6 항에 있어서,

세포가 포유 동물 세포인 배양 방법.
제 7 항에 있어서,

포유 동물 세포가 CHO 세포인 배양 방법.
삭제
단백질을 제조하는 방법으로서, 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가한 배지로 세포의 배양을 개시하고, 또한, 적어도 1 회, 세포 배양 중의 배지에 어육의 효소 분해물 또는 어육 추출물을 첨가하고, 배양 기간을 7일 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10 항에 있어서,

세포를 유가 배양법으로 배양하는 제조 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,

세포가 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 것인 제조 방법.
제 12 항에 있어서,

원하는 단백질이 항체인 제조 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,

세포가 동물 세포인 제조 방법.
제 14 항에 있어서,

세포가 포유 동물 세포인 제조 방법.
제 15 항에 있어서,

포유 동물 세포가 CHO 세포인 제조 방법.