JP2003334068A

JP2003334068A - 動物細胞培養用培地の添加剤およびそれを用いたタンパク質の製造方法

Info

Publication number: JP2003334068A
Application number: JP2002144444A
Authority: JP
Inventors: Noriyuki Muramatsu; 憲行村松; Masaaki Yokoyama; 正秋横山; Masaharu Hirano; 正治平野; Yoshinori Hokari; 義則保苅; Kazufumi Shibuya; 和史渋谷; Ko Atami; 甲熱海; Yoshiyuki Tsunakawa; 恵之綱川; Kanero Nogaki; 兼朗野垣
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Maruhachi Muramatsu KK
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Maruhachi Muramatsu KK
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2003-11-25
Anticipated expiration: 2022-05-20
Also published as: JP3822137B2

Abstract

(57)【要約】【課題】魚肉抽出物又は魚肉酵素分解物を含む動物細
胞培養用培地の中でも、特に細胞生存率及びタンパク質
産生量の高い培地を提供することを目的とする。【解決手段】魚肉の内臓と正肉からなる混合物の酵素
分解物又は前記混合物の抽出物を含むことを特徴とする
動物細胞培養用培地への添加剤、該添加剤を含む動物細
胞培養用培地およびそれを用いたタンパク質製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞培養用培
地の添加剤、該添加剤の製造方法、該添加剤を含む動物
細胞培養用培地およびそれを用いたタンパク質製造方法
に関する。詳しくは、本発明は、魚肉の内臓と正肉から
なる混合物の酵素分解物又は前記混合物の抽出物を含む
ことを特徴とする動物細胞培養用培地への添加剤、該添
加剤を含む動物細胞培養用培地およびそれを用いたタン
パク質製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞を培養して該動物細胞の産生す
る天然型タンパク質を得ようとする場合、あるいは所望
のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を
培養して所望のタンパク質等を製造する場合には、塩
類、糖類、アミノ酸類、およびビタミン類などの基礎栄
養物のほかに、該動物細胞の増殖のために、通常哺乳動
物由来の抽出物、具体的には牛胎児血清などの血清が５
〜２０％の範囲で培地に添加されている。しかしなが
ら、かかる哺乳動物由来の血清は、培地のコストの７５
〜９５％を占めること、品質にロット間差があるために
安定した増殖が得られないという欠点がある。また、哺
乳動物由来の血清はオートクレーブ等で滅菌できないの
で、ウイルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があ
り、その多くは無害であるものの、安定生産という点か
らは付加的な未知の要因となりうる。更に血清には５０
０種以上のタンパク質が含まれており、このため培養培
地からの細胞産物である所望のタンパク質の単離、精製
を複雑化する。このような安定生産上の問題を解決する
為に，血清の代わりとして、フェツイン、インスリン、
トランスフェリンなどの血清由来の純化されたタンパク
質を使用する方法が行われている。また、製造コストの
観点から、哺乳動物より抽出された培地成分を使用する
方法も試みられている。

【０００３】しかし、近年、哺乳動物由来の成分につい
ては、狂牛病(mad cow disease)、ウシ海綿状脳症(Bovi
ne Spongiform Encephalopathy：BSE)、感染性海綿状脳
症(Transmissible Spongiform Encephalopathy：TSE)、
更にはクロイツフェルト・ヤコブ病(Creutzfeld-Jakob
Disease：CJD)などとの相関が懸念され、安全性の点か
らこれらの哺乳動物由来成分を含有しない動物細胞培養
用培地の出現が望まれていた。

【０００４】しかしながら、動物細胞を培養する際、使
用する培地中に上記のような哺乳動物由来の成分を添加
しないと、培養の早い時期に細胞の生存率の著しい低下
が生じ、培養液中の生細胞数が減少するため長期培養あ
るいは大量培養を行うことができないという問題があっ
た。

【０００５】国際公開公報WO99/63058では、哺乳動物由
来成分のかわりに、魚の正肉や内臓などを含む魚肉を添
加することにより、動物細胞の長期培養や所望のタンパ
ク質の大量培養が可能であることを見出している。しか
しながら、WO99/63058では魚肉中の内臓と正肉の比率を
変化させた場合に、タンパク質の産生量にどのような影
響があるかについては言及していない。

【０００６】

【発明が解決すべき課題】本発明は魚肉抽出物又は魚肉
酵素分解物を含む動物細胞培養用培地の中でも、特に効
果の高い培地を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな課題を達成すべく鋭意工夫を重ねた結果、魚肉の内
臓のみ又は正肉のみを添加した動物細胞培養用培地に比
べて、魚肉の内臓と正肉からなる混合物の酵素分解物又
は前記混合物の抽出物を添加した動物細胞培養用培地は
特に効果が高いことを見出し、本発明を完成するに至っ
た。又、本発明者らは内臓と正肉の重量比が７５：２５
〜４０：６０、好ましくは６５：３５〜５５：４５、さ
らに好ましくは６０：４０の場合に、細胞生存率及びタ
ンパク質の生産量が向上することを見出した。

【０００８】すなわち、本発明は、魚肉の内臓と正肉か
らなる混合物の酵素分解物又は前記混合物の抽出物を含
むことを特徴とする動物細胞培養用培地への添加剤を提
供する。

【０００９】本発明はさらに、以下の工程を含む動物細
胞培養用培地への添加剤の製造方法を提供する：（ａ）魚肉の内臓と正肉を混合する工程、及び（ｂ）上
記混合物を酵素分解して酵素分解物を得るか、又は前記
混合物から抽出物を得る工程。

【００１０】本発明はさらに、以下の工程を含む動物細
胞培養用培地への添加剤の製造方法を提供する：ａ）魚
肉の内臓を酵素分解して酵素分解物を得るか、又は内臓
から抽出物を得る工程、（ｂ）魚肉の正肉を酵素分解し
て酵素分解物を得るか、又は正肉から抽出物を得る工
程、及び（ｃ）上記（ａ）工程で作製した物質と、上記
（ｂ）工程で作製した物質を混合する工程。

【００１１】本発明はさらに、前記添加物を含む動物細
胞培養用培地を提供する。本発明はさらに、動物細胞を
培養して所望のタンパク質を製造する方法において、該
培養を魚肉の内臓と正肉からなる混合物の酵素分解物又
は前記混合物の抽出物を含むことを特徴とする動物細胞
培養用培地を使用して行うタンパク質の製造方法を提供
する。

【００１２】本発明はさらに、上記方法で製造されたタ
ンパク質を提供する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の動物細胞培養用培地への
添加剤では、内臓と正肉との重量比が７５：２５〜４
０：６０、好ましくは６５：３５〜５５：４５、さらに
好ましくは６０：４０である。

【００１４】本発明の添加剤を含む培地を用いると、哺
乳動物由来の成分を添加しなくとも特に良好に動物細胞
を培養することが可能である。また、良好なタンパク質
の産生量が得られる。

【００１５】本発明で使用する魚肉の内臓及び正肉を採
取する魚としては、鰹、ソウダガツオ、鮪、鯖、秋刀
魚、鰯、鯵、鮭などの赤身魚や、鯛、鱈、平目、鰈、鱸
などの白身魚が挙げられ、好ましくは鰹、ソウダガツ
オ、鯖、鱈、鮭、鰯であり、特に好ましくは鰹、鯖であ
る。

【００１６】混合する正肉と内臓は同じ魚種のものを用
いてもよいが、正肉と内臓で異なる魚種のものを用いて
もよい。本発明で使用する添加剤には、魚肉の内臓と正
肉からなる混合物の酵素分解物又は前記混合物の抽出物
を用いることができる。前記混合物の酵素分解物は、前
記混合物又は混合物抽出物をタンパク質分解酵素で処理
して得ることができる。

【００１７】あるいは、魚肉の内臓を酵素分解して酵素
分解物を得るか、又は内臓から抽出物を得て、別途魚肉
の正肉を酵素分解して酵素分解物を得るか、又は正肉か
ら抽出物を得た後、これらを混合することによって添加
剤を製造してもよい。

【００１８】本発明で使用する魚肉混合物の抽出物は、
例えば、上記魚肉の内臓と正肉を一緒にあるいは別々に
適当な断片に切断したり、あるいはミンチにしてペース
ト状にして、その可溶性成分を熱水、例えば90-95℃の
熱水で数十分から数十時間抽出することによって得るこ
とができる。具体的には、鰹節の製造時の鰹煮汁や缶詰
製造時のクックドレンなどが挙げられる。

【００１９】また、魚肉混合物の酵素分解物は、例え
ば、魚肉の内臓と正肉を一緒にあるいは別々に煮たもの
をそのまま、あるいは、ミンチにしてペースト状にした
もの、あるいは上記のようにして得られた抽出物に適量
の水を加え、必要に応じて加熱してタンパク変性させた
後、タンパク質分解酵素で処理し、適宜遠心分離や濾過
等により油分や不溶化物を除去することによって得るこ
とができる。かかる魚肉混合物の抽出物あるいは酵素分
解物はpHを7-7.4程度に調製して使用するのが好まし
い。

【００２０】本発明で使用するタンパク質分解酵素とし
ては、プロテイナーゼ及び／又はペプチダーゼが挙げら
れる。本発明では、プロテイナーゼの語は、タンパク質
を基質としてタンパク質を加水分解する酵素をいい、ペ
プチダーゼの語は、ペプチドを基質とするペプチド結合
加水分解酵素をいう。すなわち、プロテアーゼのタンパ
ク質基質に対する活性をプロテイナーゼ活性、ペプチド
基質に対する活性をペプチダーゼ活性として区別するこ
とができる。タンパク質基質に対するプロテアーゼの活
性によって、ペプチド結合鎖の中程からの切断を触媒す
るときにはプロテイナーゼという用語を用い、従ってエ
ンドペプチダーゼは本明細書ではプロテイナーゼの１種
として使用している。本発明で使用するプロテイナーゼ
又はペプチダーゼは哺乳動物由来でないことが好まし
い。

【００２１】具体的には、パパイン、キモパパイン、プ
ロメライン、フィシンなどの植物起源の酵素およびカ
ビ、細菌、酵母などの微生物起源の酵素で、エンドペプ
チダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、
カルボキシペプチダーゼ、ジペプチダーゼなどの酵素等
が挙げられる。これらの酵素は単独あるいは併用して使
用することができる。併用する場合は、それらを同時に
添加してもよいし、段階的に添加してもよい。

【００２２】本発明における魚肉混合物の酵素分解物と
しては、上記のプロテイナーゼで処理し、次いでペプチ
ダーゼで処理して得られる魚肉混合物の酵素分解物が好
ましい。

【００２３】酵素処理は、使用する酵素の種類によって
異なるが、通常、pH2−12、好ましくはpH4−8で、30−9
0℃、好ましくは40−65℃の温度で、30分−72時間、好
ましくは3−24時間行う。その際、酵素は基質としての
タンパク質の0.01−10％、好ましくは0.5−5％、さらに
好ましくは1−3％程度使用する。

【００２４】このようにして得られた魚肉混合物の酵素
分解物中の酵素を加温などによって失活させた後、遠心
分離や濾過等を適宜行って油分や不溶化物を除去するこ
とによって酵素分解物を調製することができる。

【００２５】得られた酵素分解物は必要に応じて濃縮し
たり、スプレードライやフリーズドライなどの乾燥、粉
化技術を擁して粉末にし、動物培養培養用培地への添加
剤にすることも可能である。

【００２６】本発明における魚肉の内臓としては、胃、
幽門垂、腸、肝臓、胆のう、精巣、卵巣、心臓などを挙
げることができる。本発明における魚肉の正肉とは、魚
から上記の内臓及び骨、頭などを除いた正肉部分をい
う。

【００２７】本発明の動物細胞培養用培地への添加物は
魚肉の内臓と正肉が含まれていればよく、その比率は特
に限定されないが、細胞の生存率及びタンパク質の産生
量の点からは、好ましくは内臓と正肉との重量比が７
５：２５〜４０：６０、好ましくは６５：３５〜５５：
４５、さらに好ましくは６０：４０である。

【００２８】なお、本発明では、魚肉の内臓と正肉から
なる混合物を製造するときに、魚の骨、頭などの部分が
混入してもよい。本発明の動物細胞培養用培地には、本
発明の魚肉の内臓と正肉からなる混合物の酵素分解物又
は前記混合物の抽出物を含むことを特徴とする動物細胞
培養用培地への添加物を含み、さらに他の成分として通
常動物細胞培養培地で使用されている各成分を適宜使用
できる。これらにはアミノ酸、ビタミン類、脂質因子、
エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、pH緩衝剤を含む。
上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、
増殖補助因子、ヌクレオシドなどを添加しても良い。

【００２９】具体的には、例えば、L-アラニン、L-アル
ギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システ
イン、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グ
リシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、
L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルア
ラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリ
プトファン、L-チロシン、L-バリン等、好ましくはL-ア
ラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギ
ン酸、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グ
リシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、
L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロ
リン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-
チロシン、L-バリン等のアミノ酸類；ｉ−イノシトー
ル、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチ
ン酸、p-アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩
酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、
塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等、好ま
しくはビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パ
ントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラ
ビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等
のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール
酸、オレイン酸、コレステロール等、好ましくは塩化コ
リン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノ
ース、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネ
ルギー源；塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウ
ム等、好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤；ED
TA鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一
鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好ましくは塩化第二
鉄、EDTA鉄、クエン酸鉄等の鉄源類；炭酸水素ナトリウ
ム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、HEPE
S、MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等のpH緩衝
剤を含む培地を例示できる。

【００３０】上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マ
ンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、
塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケイ酸ナトリウム等、
好ましくは硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微
量金属元素；Tween80、プルロニックF68等の界面活性
剤；および組換え型インシュリン、組換え型IGF、組換
え型EGF、組換え型FGF、組換え型PDGF、組換え型TGF-
α、塩酸エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、レ
チノイン酸、塩酸プトレッシン等、好ましくは亜セレン
酸ナトリウム、塩酸エタノールアミン、組換え型IGF、
塩酸プトレッシン等の増殖補助因子；デオキシアデノシ
ン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、アデノシ
ン、シチジン、グアノシン、ウリジン等のヌクレオシド
などを添加してもよい。なお上記本発明の好適例におい
ては、ストレプトマイシン、ペニシリンGカリウム及び
ゲンタマイシン等の抗生物質や、フェノールレッド等の
pH指示薬を含んでいても良い。

【００３１】本発明の動物細胞培養用培地を具体的に調
製するには、市販の動物細胞培養用培地、例えば、ＢＭ
Ｅ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１０培地、Ｆ１
２培地などの培地に、哺乳動物由来の成分に代えて、本
発明の添加物を添加して調製してもよい。

【００３２】本発明においては、培地中Brix 5%以下、
好ましくは、Brix 0.5-3%、特に好ましくはBrix 1-2%程
度の濃度となるように培地に魚肉混合物抽出物又は魚肉
混合物の酵素分解物を添加する。なお、上記濃度は屈折
糖度計により測定した可溶性固形分を指標にした濃度で
ある。

【００３３】また、培地中のその他の成分の含量は、ア
ミノ酸は0.05−1500mg/L、ビタミン類は0.001−10mg/
L、脂質因子は0−200mg/L、エネルギー源は1−20g/L、
浸透圧調節剤は0.1−10000mg/L、鉄源は0.1−500mg/L、
pH緩衝剤は1−10000mg/L、微量金属元素は0.00001−200
mg/L、界面活性剤は0−5000mg/L、増殖補助因子は0.05
−10000μg/Lおよびヌクレオシドは0.001−50mg/Lの範
囲であり、培養する動物細胞の種類、所望のタンパク質
の種類などにより適宜決定できる。

【００３４】培地のｐＨは培養する細胞により異なる
が、一般的にはｐＨ６．８〜７．６、多くの場合ｐＨ
７．２〜７．４である。本発明の培地は特に限定される
ことなく種々の動物細胞を好適に培養するのに使用でき
る。例えば、遺伝子工学的操作によって所望の抗体ある
いは生理活性物質の遺伝子を組み込んだCOS細胞やCHO細
胞、あるいは、抗体を産生するマウス−ヒト、マウス−
マウス、マウス−ラット等のハイブリドーマに代表され
る融合細胞を培養することが可能である。特に、CHO細
胞の培養に好適である。勿論、本発明の動物細胞培養用
培地は、動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然
型タンパク質を得ようとする場合にも使用でき、上述し
た細胞の他に、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞などの培養に
も使用できる。

【００３５】培養条件は使用する細胞の種類によって異
なるので、適宜好適な条件を決定すればよい。例えばCH
O細胞であれば通常、気相のCO₂濃度が0−40%、好ましく
は、2−10%の雰囲気下、30−39℃、好ましくは、37℃程
度で、1−14日間培養すればよい。

【００３６】また、動物細胞培養用の各種の培養装置と
しては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト
型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナ
ーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装
置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ロ
ーラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて
培養することができる。

【００３７】本発明の動物細胞培養用培地中で培養を行
うことにより、動物細胞により生産されたタンパク質を
培地中に得ることができる。動物細胞のタンパク質の生
産は、単にそれを培養するのみで良いものや、特殊な操
作を必要とするものも存在するがそれらの操作又は条件
等は培養する動物細胞により適宜決定すれば良い。例え
ば遺伝子工学的操作によりマウス−ヒトキメラ抗体をコ
ードする遺伝子を含むベクターでトランスフォームされ
たCHO細胞では、前記のような条件下で培養を実施する
ことにより、1−14日間、好ましくは7−10日間程度で所
望のタンパク質を培地中に得ることができる。これを常
法（例えば、抗体工学入門、地人書館、p.102-104；Aff
inity Chromatography Principles & Methods、アマシ
ャムファルマシアバイテク（株）、p.56-60など参
照）に従い単離、精製することによって、所望のタンパ
ク質を得ることができる。

【００３８】上記の製造方法によって、抗ヒトIL-6レセ
プター抗体などの組換え抗体（キメラ抗体、ヒト化抗
体、ヒト型化抗体を含む）、顆粒球コロニー刺激因子
（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（G
M-CSF）、エリスロポエチン、インターフェロン、IL-1
やIL-6等のインターロイキン、t-PA、ウロキナーゼ、血
清アルブミン、血液凝固第VIII因子等の遺伝子組換えタ
ンパク質を製造することができる。

【００３９】

【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するための実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。当業者にとっては種々の変更、改変が可能で
あり、これらも本発明の範囲に含まれる。実施例１： (1) 正肉の酵素分解物の調製魚肉として市販の鰹を使用した。魚肉から内臓、骨、頭
などを除去し、ミンチ状にカットしたもの1000ｇに水15
00ｇを加え、植物由来のパパイン4ｇで、pH6.0、５0℃
の条件下で1時間インキュベートし、酵素分解を行っ
た。次にカビ由来のエキソペプチダーゼ4ｇでさらに上
記条件下で15時間酵素分解を行った後、95℃に加熱する
ことで酵素を失活させた。その後遠心分離、濾過により
不溶物、油分を除去、濃縮して、本発明の正肉（鰹）の
酵素分解物500ｇを調製した。 (2)内臓の酵素分解物の調製魚肉として市販の鰹を使用した。魚肉から内臓のみを取
り出し、取り出した内臓を(1)の正肉の酵素分解物の調
整と同様の方法で処理し、内臓（鰹）の酵素分解物500
ｇを調製した。 (3)内臓と正肉の酵素分解物の混合物の調製 (1)および(2)と同様の方法で、内臓：正肉が7：3、6：
4、5：5、4：6、3：7の割合で混合された酵素分解物を
調製した。実施例２：培地の調製基本となる動物細胞培養用培地（基本培地）として、市
販のDMEM/F12/培地(GIBCO BRL Product and Reference
Guide, p357-358)からチミジン、ヒポキサチンを除去し
た培地に以下の成分を添加したものを用いた。

【００４０】市販のDMEM/F12培地からチミジン、ヒポキ
サチンを除去した培地に以下の成分を添加したもの：アスコルビン酸30mg/L、デオキシアデノシン（1H₂O）10mg/L、デオキシシチジン10mg/L、デオキシグアノシン10mg/L、アデノシン5mg/L、シチジン5mg/L、グアノシン5mg/L、ウリジン5mg/L、エタノールアミン（HCl）4mg/L、プルロニックF-68 1000mg/L、塩化第二鉄（6H₂O）18.9mg/L 上記培地（基本培地）に、実施例1で調製した酵素分解
物をそれぞれ固形分換算で10ｇ/L又は17.5ｇ/L添加し、
濾過滅菌した。実施例３：内臓と正肉の比率が細胞生存率に及ぼす効果国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９号公報の実
施例１０に記載されたヒトエロンゲ−ションファクタ−
Ｉαプロモ−タ−を利用し、特開平８−９９９０２号公
報の参考例２に記載された方法に準じて作成したヒト型
化ＰＭ−１抗体（抗ヒトＩＬ−６レセプタ−抗体）を産
生するCHO細胞株を用いて試験した。

【００４１】実施例２で調製した内臓：正肉の比率を変
化させた培地（基本培地に実施例１(4)で調製した酵素
分解物をそれぞれ17.5g/L添加した培地）に上記CHO細胞
(1.5×10⁵cell/ml)を添加し、シェーカーフラスコ型細
胞培養装置を用いて37℃、5％CO₂のインキュベーション
条件下で１２日間培養した。

【００４２】次いで、培養開始から７日後、１０日後、
１２日後の細胞生存率を測定した。結果を図１〜３に示
す。培養７日後では内臓：正肉の比率が7：3、6：4、5：5、
4：6の場合に生存率が高く、3：7では生存率が低いこと
が明らかとなった。

【００４３】培養１０日後では内臓：正肉の比率が7：
3、6：4の場合に生存率が高く、4：6、3：7では細胞は
生存していないことが明らかとなった。培養１２日後では、内臓：正肉の比率が６：４の場合に
細胞が生存しており、その他の比率では細胞は生存して
いないことが明らかとなった。実施例４：抗体産生量に及ぼす効果本明細書の実施例２で調製した培地（基本培地＋正肉酵
素分解物4ｇ/L＋内臓酵素分解物6ｇ/L（内臓：正肉の比
率6：4）、基本培地＋正肉酵素分解物10g/L、基本培地
＋内臓酵素分解物10g/L）に上記CHO細胞（1.5x10⁵ cell
/ml）を添加し、シェーカーフラスコ型細胞培養装置を
用いて37℃、5%CO2のインキュベーター条件下で10日間
培養した。

【００４４】次いで培地から得られた抗体タンパク質の
産生量を測定した。産生量は逆相系高速液体クロマトグ
ラフィーを使用して測定した。結果を図４に示す。内臓
と正肉の酵素分解物の混合物を添加した培地で培養した
場合、内臓酵素分解物又は正肉酵素分解物のみを添加し
た培地で培養した場合よりも、抗体タンパク質の産生量
において高い効果を示した。従って、正肉のみ又は内臓
のみよりも内臓と正肉の混合物の方が効果が高いことが
明らかとなった。

【００４５】以上の結果から、魚肉の内臓のみ又は正肉
のみに比べて、魚肉と正肉の混合物の方が抗体産生量が
多いことが明らかとなった。又、細胞生存率の点から、
内臓と正肉の比率が7：3〜4：6の場合効果が高く、7：3
〜6：4ではさらに高くあり、6：4の場合に最も高いこと
が判明した。

【００４６】

【発明の効果】本発明の動物細胞培養用培地は、魚肉の
内臓と正肉からなる混合物の酵素分解物又は前記混合物
の抽出物を含有することにより、牛胎児血清等の高価で
品質のばらつきが大きいタンパク質を使用すること無
く、安定的に動物細胞を培養することが可能である。ま
た、本発明の培地は、魚肉の内臓のみ又は正肉のみを含
む培地に比べて細胞生存率、タンパク質産生量のいずれ
においても優れている。更に本発明の細胞培養用培地で
動物細胞を培養することにより、近年問題となっている
異常プリオンあるいはウイルス等による汚染の危険性は
除去され、安全なバイオ医薬品を製造し提供することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】魚肉の内臓酵素分解物と正肉酵素分解物を様々
な比率で含む培地でＣＨＯ細胞を培養したときの７日後
の細胞生存率を示すグラフである。

【図２】魚肉の内臓酵素分解物と正肉酵素分解物を様々
な比率で含む培地でＣＨＯ細胞を培養したときの１０日
後の細胞生存率を示すグラフである。

【図３】魚肉の内臓酵素分解物と正肉酵素分解物を様々
な比率で含む培地でＣＨＯ細胞を培養したときの１２日
後の細胞生存率を示すグラフである。

【図４】魚肉の内臓酵素分解物、正肉酵素分解物又はこ
れらの混合物を含む培地でＣＨＯ細胞を培養したときの
抗体産生量に及ぼす効果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者横山正秋静岡県焼津市惣右衛門1281の８株式会社マルハチ村松内 (72)発明者平野正治静岡県焼津市惣右衛門1281の８株式会社マルハチ村松内 (72)発明者保苅義則静岡県焼津市惣右衛門1281の８株式会社マルハチ村松内 (72)発明者渋谷和史東京都北区浮間５丁目５番１号中外製薬株式会社内 (72)発明者熱海甲東京都北区浮間５丁目５番１号中外製薬株式会社内 (72)発明者綱川恵之東京都北区浮間５丁目５番１号中外製薬株式会社内 (72)発明者野垣兼朗東京都北区浮間５丁目５番１号中外製薬株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA58 DA02 FA02 HA01 4B064 AG01 AG26 CA10 CA19 CC03 CC24 CD25 DA01 4B065 AA90 AB01 BB02 BB20 BB23 CA24 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】魚肉の内臓と正肉からなる混合物の酵素
分解物又は前記混合物の抽出物を含むことを特徴とする
動物細胞培養用培地への添加剤。
【請求項２】混合物の酵素分解物がプロテイナーゼ及
び／又はペプチダーゼを用いて得られる請求項１記載の
添加剤。
【請求項３】プロテイナーゼ又はペプチダーゼが哺乳
動物由来でないことを特徴とする請求項２記載の添加
剤。
【請求項４】混合物の酵素分解物が、混合物又は混合物
抽出物をプロテイナーゼ処理し、次いで、ペプチダーゼ
処理して得られるものである請求項２又は３記載の添加
剤。
【請求項５】内臓と正肉との重量比が７５：２５〜４
０：６０である請求項１記載の添加剤。
【請求項６】内臓と正肉との重量比が６５：３５〜５
５：４５である請求項５記載の添加剤。
【請求項７】内臓と正肉との重量比が６０：４０であ
る請求項６記載の添加剤。
【請求項８】魚肉が、鰹、ソウダガツオ、鱈、鯖、鮭
および鰯からなる群より選ばれる１種以上である請求項
１−７のいずれかに記載の添加剤。
【請求項９】以下の工程を含む動物細胞培養用培地へ
の添加剤の製造方法：（ａ）魚肉の内臓と正肉を混合する工程、及び（ｂ）上
記混合物を酵素分解して酵素分解物を得るか、又は前記
混合物から抽出物を得る工程。
【請求項１０】以下の工程を含む動物細胞培養用培地
への添加剤の製造方法：（ａ）魚肉の内臓を酵素分解し
て酵素分解物を得るか、又は内臓から抽出物を得る工
程、（ｂ）魚肉の正肉を酵素分解して酵素分解物を得る
か、又は正肉から抽出物を得る工程、及び（ｃ）上記
（ａ）工程で作製した物質と、上記（ｂ）工程で作製し
た物質を混合する工程。
【請求項１１】内臓と正肉との重量比が７５：２５〜
４０：６０である請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】内臓と正肉との重量比が６５：３５〜
５５：４５である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】内臓と正肉との重量比が６０：４０で
ある請求項１２記載の方法。
【請求項１４】請求項１〜８のいずれかに記載の添加
物を含む動物細胞培養用培地。
【請求項１５】動物細胞を培養して所望のタンパク質
を製造するための培地である請求項１４記載の動物細胞
培養用培地。
【請求項１６】動物細胞培養用培地が、哺乳動物由来
の成分を含まない培地である請求項１４又は１５記載の
動物細胞培養用培地。
【請求項１７】動物細胞培養用培地が、アミノ酸、ビ
タミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄
源およびｐＨ緩衝剤を含む請求項１４−１６のいずれか
に記載の動物細胞培養用培地。
【請求項１８】動物細胞が、所望のタンパク質をコー
ドする遺伝子を導入されたものである請求項１４−１７
のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
【請求項１９】所望のタンパク質が、抗体又は生理活
性物質である請求項１８記載の動物細胞培養用培地。
【請求項２０】動物細胞が、CHO細胞である請求項１
４−１９のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
【請求項２１】動物細胞を培養して所望のタンパク質
を製造する方法において、該培養を魚肉の内臓と正肉か
らなる混合物の酵素分解物又は前記混合物の抽出物を含
むことを特徴とする動物細胞培養用培地を使用して行う
タンパク質の製造方法。
【請求項２２】請求項２１記載の方法により製造され
たタンパク質。