JP3950834B2 - 動物細胞培養用培地およびそれを使用してタンパク質を製造する方法 - Google Patents
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Description
本発明の培地は、魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を含む動物細胞培養用培地である。本発明によれば、従来動物細胞培養用培地として一般的に使用されている培地において哺乳動物由来の成分を添加しなくとも良好に動物細胞を培養することができる。
酵素処理は、使用する酵素の種類によって異なるが、通常、pH2−12、好ましくはpH4−8で、30−90℃、好ましくは40−65℃の温度で、30分−72時間、好ましくは3−24時間行う。その際、酵素は基質としてのタンパク質の0.01−10%、好ましくは0.5−5%、さらに好ましくは1−3%程度使用する。
本発明の培地は特に限定されることなく種々の動物細胞を好適に培養するのに使用できる。例えば、遺伝子工学的操作によって所望の抗体あるいは生理活性物質の遺伝子を組み込んだCOS細胞やCHO細胞、あるいは、抗体を産生するマウス−ヒト、マウス−マウス、マウス−ラット等のハイブリドーマに代表される融合細胞を培養することが可能である。特に、CHO細胞の培養に好適である。勿論、本発明の動物細胞培養用培地は、動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合にも使用でき、上述した細胞の他に、BHK細胞、HeLa細胞などの培養にも使用できる。
魚肉として市販の鰯を使用した。魚肉をミンチ状にカットしたもの500gに水2500gを加え、95℃の温度で90分間抽出した。
実施例2:魚肉(鰹)の酵素分解物の調製
魚肉として市販の鰹を使用した。鰹をミンチ状にカットしたもの1000gに水1500gを加え、植物由来のパパイン4gで、pH6.0、50℃の条件下で1時間インキュベ−トし、酵素分解を行った。次に、カビ由来のエキソペプチダーゼ4gでさらに上記条件下で20時間酵素分解を行った後、95℃に加熱することで酵素を失活させた。その後遠心分離、濾過により不溶物、油分を除去、濃縮して、本発明の魚肉(鰹)の酵素分解物500gを調製した。
基本となる動物細胞培養用培地として、市販のDMEM/F12培地(GIBCO BRL Products and Reference Guide, p.357-358)からチミジン、ヒポキサンチンを除去した培地に以下の成分を添加したもの(以下において培地Aと記載する)を用いた。
(培地A)
市販のDMEM/F12培地からチミジン、ヒポキサンチンを除去した培地に以下の成分を添加したもの:
アスコルビン酸30mg/L、
デオキシアデノシン(1H2O)10mg/L、
デオキシシチジン10mg/L、
デオキシグアノシン10mg/L、
アデノシン5mg/L、
シチジン5mg/L、
グアノシン5mg/L、
ウリジン5mg/L、
エタノールアミン(HCl)4mg/L、
プルロニックF-68 1000mg/L、
塩化第二鉄(6H2O)18.9mg/L
上記培地Aに、実施例2で調製した酵素分解物を最終濃度Brix 1%あるいはBrix 2%で添加し、濾過滅菌した。
国際特許出願公開番号WO92/19759号公報の実施例10に記載されたヒトエロンゲ−ションファクタ−Iαプロモ−タ−を利用し、特開平8−99902号公報の参考例2に記載された方法に準じて作成したヒト型化PM−1抗体(抗ヒトIL−6レセプタ−抗体)を産生するCHO細胞株を用いて試験した。
対照として実施例2の酵素分解物に代えて牛肉加水分解物10g/L(PrimatoneTM:米国、Quest社製)を含む培地を調製し、同様の方法でCHO細胞を培養した。
鰹、鰯、鮭、ソウダカツオ、鱈、鯖を原料とした魚肉の酵素分解物を非哺乳動物由来培地に添加して抗体タンパク質の産生量の検討を行った。
魚肉の酵素分解物の調製
魚肉の酵素分解物を実施例2に記載の方法を用いて調製した。すなわち、魚肉をミンチ状にカットし、植物由来のエンドペプチダーゼであるパパインで酵素分解を行った。次にカビ由来のエキソペプチダーゼでさらに酵素分解を行い加温することで酵素を失活させた。遠心分離、濾過により不溶物、油分を除去、濃縮して魚肉の酵素分解物を調製した。
培地の調製及び試験方法
実施例4で記載したヒト型化PM−1抗体(抗ヒトIL−6レセプタ−抗体)蛋白をコードする遺伝子及びdhfr選択マーカー遺伝子で形質転換されたdhfr(−)のCHO細胞を、鰹、鰯、鮭、ソウダカツオ、鱈、鯖の酵素分解物を最終濃度10g/L(Brix 1%)あるいは15g/L(Brix 1.5%)含有する培地Bに添加し、シェーカーフラスコ型細胞培養装置を用いて37℃、5%CO2のインキュベーター条件下で10日間培養した。そして生細胞数、細胞生存率、抗体タンパク質の産生量を測定した。培地Bの成分を以下に示す。
(培地B)
市販のDMEM/F12培地からチミジン、ヒポキサンチンを除去した培地に以下の成分を添加したもの:
アスコルビン酸12.5mg/L、
デオキシアデノシン(1H2O)2.5mg/L、
デオキシシチジン2.5mg/L、
デオキシグアノシン2.5mg/L、
アデノシン2.5mg/L、
シチジン2.5mg/L、
グアノシン2.5mg/L、
ウリジン5.0mg/L、
プトレッシン(2HCl)0.2mg/L、
エタノールアミン(HCl)0.975mg/L、
プルロニックF-68 500mg/L、
クエン酸鉄10mg/L
結果
得られた結果を図4に示す。魚肉の加水分解物による抗体タンパク質の産生量には違いが見られた。すなわち、魚肉の酵素分解物の最終濃度がBrix 1%(10g/L)添加の場合、産生量が高い順に鰹 > ソウダガツオ > 鱈 > 鮭 > 鯖 >鰯 である。また魚肉の酵素分解物の最終濃度がBrix 1.5%(15g/L)添加の場合は鰹 > ソウダガツオ > 鱈 > 鯖 > 鮭 >鰯 である。
Claims (16)
- 動物細胞を培養して所望のタンパク質を製造するための培地であって、該培地が魚肉の酵素分解物を含む動物細胞培養用培地。
- 魚肉の酵素分解物が、魚肉又は魚肉抽出物をタンパク質分解酵素で処理して得られたものである請求項1記載の動物細胞培養用培地。
- タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼ及び/又はペプチダーゼである請求項2記載の動物細胞培養用培地。
- 魚肉の酵素分解物が、魚肉又は魚肉抽出物をプロテイナーゼ処理し、次いで、ペプチダーゼ処理して得られるものである請求項2記載の動物細胞培養用培地。
- 動物細胞培養用培地が、哺乳動物由来の血清を含まない培地である請求項1−4のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
- 動物細胞培養用培地が、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源およびpH緩衝剤を含む請求項1−5のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
- 動物細胞培養用培地が、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子およびヌクレオシドから選ばれる1つ以上をさらに含む請求項6記載の動物細胞培養用培地。
- 動物細胞が、所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入されたものである請求項1−7のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
- 所望のタンパク質が、抗体又は生理活性物質である請求項8記載の動物細胞培養用培地。
- 動物細胞が、CHO細胞である請求項1−9のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
- 魚肉が、鰹、ソウダガツオ、鱈、鯖、鮭および鰯からなる群より選ばれる1種以上である請求項1−10のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
- 動物細胞を培養して所望のタンパク質を製造する方法において、該培養を魚肉の酵素分解物を含むことを特徴とする動物細胞培養用培地を使用して行うタンパク質の製造方法。
- 魚肉の酵素分解物を含むことを特徴とする動物細胞培養用培地の添加剤。
- 動物細胞を培養して所望のタンパク質を製造するための培地であって、該培地が鰹および/またはソウダガツオの魚肉の酵素分解物を含む動物細胞培養用培地。
- 動物細胞を培養して所望のタンパク質を製造する方法において、該培養を鰹および/またはソウダガツオの魚肉の酵素分解物を含むことを特徴とする動物細胞培養用培地を使用して行うタンパク質の製造方法。
- 鰹および/またはソウダガツオの魚肉の酵素分解物を含むことを特徴とする動物細胞培養用培地の添加剤。
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