JP2800338B2 - 細胞培養用無血清培地の調製方法 - Google Patents
細胞培養用無血清培地の調製方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、動物細胞の組織培養用培地、更に詳細に
は、細胞の長期間培養が可能な、培地成分としてトラン
スフェリンを含まない無血清培地で全成分が加熱殺菌可
能な動物細胞培養用培地の調製方法に関する。
は、細胞の長期間培養が可能な、培地成分としてトラン
スフェリンを含まない無血清培地で全成分が加熱殺菌可
能な動物細胞培養用培地の調製方法に関する。
近年の細胞工学の進歩に伴い、細胞工学の基礎技術と
しての細胞培養技術の重要性が増してきている。例え
ば、遺伝子組替え技術を応用して構築された組替え動物
細胞による有用物質の産生、細胞融合技術を応用して作
製されたモノクローナル抗体の産生を目的とするハイブ
リドーマの培養等が行なわれている。また、従来ウイル
スの培養等においては動物の生体内が利用されていたが
これに代わり、継代培養細胞を利用したインビトロでの
細胞培養技術が利用されつつある。このように動物細胞
を主とする細胞の培養に関する研究が進められている。
しての細胞培養技術の重要性が増してきている。例え
ば、遺伝子組替え技術を応用して構築された組替え動物
細胞による有用物質の産生、細胞融合技術を応用して作
製されたモノクローナル抗体の産生を目的とするハイブ
リドーマの培養等が行なわれている。また、従来ウイル
スの培養等においては動物の生体内が利用されていたが
これに代わり、継代培養細胞を利用したインビトロでの
細胞培養技術が利用されつつある。このように動物細胞
を主とする細胞の培養に関する研究が進められている。
一般にこのような細胞をインビトロで培養する場合に
は、培地に動物の血清、例えば牛胎児血清を添加する必
要がある。しかしながら、これらの血清は、高価である
こと、原因不明のロット差があって再現性のよい培養が
得られないこと、また、血清は極めて多種類の成分から
成っているために、培養物から有用物質を分離する際に
これらの血清由来物質を除去することが非常に面倒でま
た困難であること等の問題点がある。
は、培地に動物の血清、例えば牛胎児血清を添加する必
要がある。しかしながら、これらの血清は、高価である
こと、原因不明のロット差があって再現性のよい培養が
得られないこと、また、血清は極めて多種類の成分から
成っているために、培養物から有用物質を分離する際に
これらの血清由来物質を除去することが非常に面倒でま
た困難であること等の問題点がある。
このような問題を解決すべく、近年これまで必須とさ
れていた血清成分を含まない、いわゆる無血清培地が開
発されている。これらの無血清培地は、これまで添加し
ていた血清の代わりに、トランスフェリン、インシュリ
ン等のタンパク質成分を添加することによって細胞の培
養を可能とするものである（Barnes,D.and Sato,G.,Cel
l,22,649−655,1980）。
れていた血清成分を含まない、いわゆる無血清培地が開
発されている。これらの無血清培地は、これまで添加し
ていた血清の代わりに、トランスフェリン、インシュリ
ン等のタンパク質成分を添加することによって細胞の培
養を可能とするものである（Barnes,D.and Sato,G.,Cel
l,22,649−655,1980）。
ところで、細胞を培養する際にはまず培地を無菌化し
なければならない。この無菌化には加熱殺菌する方法と
濾過滅菌する方法がある。濾過滅菌法では通常0.2ない
し0.5μｍのポアサイズをもつフィルターを使うが、こ
の濾過法ではバクテリアより小さい微生物、例えば動物
細胞の培養において障害をもたらすことが知られている
マイコプラズマ、ウイルスなどは除去することが困難で
ある。また、濾過滅菌は、フィルターを加圧または減圧
下で行わなければならず、フィルターの材料によって
は、培地の微量有効成分が吸着して失われたり、膜にか
かる圧力や材質の不均一性のために、微量の細菌が漏出
することも希にみられるので、濾過滅菌して調製した培
地は各種の検定をしなければならない。特に大量細胞培
養では上記の問題点は深刻で、さらに膜や装置のランニ
ングコストも大きくなる。一方、加熱殺菌法はマイコプ
ラズマ、ウイルス等も殺菌することができるが加熱によ
って特にグルタミン等の一部アミノ酸とアルブミン、ト
ランスフェリン等のタンパク質が変性してしまう。
なければならない。この無菌化には加熱殺菌する方法と
濾過滅菌する方法がある。濾過滅菌法では通常0.2ない
し0.5μｍのポアサイズをもつフィルターを使うが、こ
の濾過法ではバクテリアより小さい微生物、例えば動物
細胞の培養において障害をもたらすことが知られている
マイコプラズマ、ウイルスなどは除去することが困難で
ある。また、濾過滅菌は、フィルターを加圧または減圧
下で行わなければならず、フィルターの材料によって
は、培地の微量有効成分が吸着して失われたり、膜にか
かる圧力や材質の不均一性のために、微量の細菌が漏出
することも希にみられるので、濾過滅菌して調製した培
地は各種の検定をしなければならない。特に大量細胞培
養では上記の問題点は深刻で、さらに膜や装置のランニ
ングコストも大きくなる。一方、加熱殺菌法はマイコプ
ラズマ、ウイルス等も殺菌することができるが加熱によ
って特にグルタミン等の一部アミノ酸とアルブミン、ト
ランスフェリン等のタンパク質が変性してしまう。
熱に不安定でかつ必須成分であるグルタミンを熱安定
物質であるグルタミンペプチド（Ｘ−Gln）で代替し
た、アルブミン、トランスフェリン以外の培地成分が加
熱殺菌可能な無血清培地は知られている（特開昭61−27
1985号公報）。一方、無タンパク培地にするために、ト
ランスフェリンを鉄錯体で代替した無血清培地も知られ
ている（特開昭63−141584号公報、特開昭63−279786号
公報、矢部則次、組織培養、13、13−16、1987）。鉄錯
体を形成させるキレート化剤としてはエチレンジアミン
四酢酸、ニトリロ酢酸等が用いられている。
物質であるグルタミンペプチド（Ｘ−Gln）で代替し
た、アルブミン、トランスフェリン以外の培地成分が加
熱殺菌可能な無血清培地は知られている（特開昭61−27
1985号公報）。一方、無タンパク培地にするために、ト
ランスフェリンを鉄錯体で代替した無血清培地も知られ
ている（特開昭63−141584号公報、特開昭63−279786号
公報、矢部則次、組織培養、13、13−16、1987）。鉄錯
体を形成させるキレート化剤としてはエチレンジアミン
四酢酸、ニトリロ酢酸等が用いられている。
しかしながら、上記のグルタミンペプチドを用いた無
血清培地の場合、培地の必須な構成成分であるアルブミ
ン、トランスフェリン等のタンパク質成分は熱に不安定
であって加熱殺菌ができず、またこれ等の物質の存在が
依然として有用物質の分離精製の操作を煩雑にする原因
となっていた。一方、トランスフェリンを鉄錯体で代替
した無血清培地は有用物質の分離精製を容易にする点で
は改善されたが、加熱殺菌の導入を意図してはいない。
さらに、本発明者らが検討したところ、鉄錯体を加熱殺
菌して培地を添加すると細胞の増殖性が低下するという
問題点が見出された。
血清培地の場合、培地の必須な構成成分であるアルブミ
ン、トランスフェリン等のタンパク質成分は熱に不安定
であって加熱殺菌ができず、またこれ等の物質の存在が
依然として有用物質の分離精製の操作を煩雑にする原因
となっていた。一方、トランスフェリンを鉄錯体で代替
した無血清培地は有用物質の分離精製を容易にする点で
は改善されたが、加熱殺菌の導入を意図してはいない。
さらに、本発明者らが検討したところ、鉄錯体を加熱殺
菌して培地を添加すると細胞の増殖性が低下するという
問題点が見出された。
本発明者らは、このような細胞培養技術における無血
清培養において、培地中の有効成分の無タンパク化、全
成分加熱殺菌可能培地を目標として研究を行った結果、
鉄散体を糖溶液に溶かして加熱殺菌する手段を案出し、
これによって上記目的を達成することができた。すなわ
ち、熱不安定でかつ必須成分であるグルタミンの耐熱安
定代替物であるグルタミンペプチド含有培地を用いれば
トランスフェリン以外は加熱殺菌可能であるので、熱不
安定であるトランスフェリンの代替として鉄錯体を培地
の成分に添加する時、鉄錯体を糖溶液に溶解し、加熱殺
菌して添加することで、従来の無血清培地に用いられて
いたトランスフェリンを添加することなしに細胞の増
殖、維持及び産生物である抗体等の生成の維持が可能と
なることを見いだし、本発明を完成するに至った。
清培養において、培地中の有効成分の無タンパク化、全
成分加熱殺菌可能培地を目標として研究を行った結果、
鉄散体を糖溶液に溶かして加熱殺菌する手段を案出し、
これによって上記目的を達成することができた。すなわ
ち、熱不安定でかつ必須成分であるグルタミンの耐熱安
定代替物であるグルタミンペプチド含有培地を用いれば
トランスフェリン以外は加熱殺菌可能であるので、熱不
安定であるトランスフェリンの代替として鉄錯体を培地
の成分に添加する時、鉄錯体を糖溶液に溶解し、加熱殺
菌して添加することで、従来の無血清培地に用いられて
いたトランスフェリンを添加することなしに細胞の増
殖、維持及び産生物である抗体等の生成の維持が可能と
なることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、鉄錯体を糖を含む溶液に溶解
し、加熱殺菌してから添加することを特徴とする細胞培
養用培地の調製方法に関するものである。
し、加熱殺菌してから添加することを特徴とする細胞培
養用培地の調製方法に関するものである。
本発明の方法が適用される鉄錯体はトランスフェリン
の代替物となりうるものであって例えばグリシルグリシ
ン（GG）鉄、ベータグリセロリン酸（βGP）鉄、イミノ
ジ酢酸（IDA）鉄等である。GG鉄とβGP鉄が特に好まし
い。この鉄錯体はGG、βGP等のキレート化剤と第２鉄塩
例えば塩化第２鉄を水に溶解するだけで形成される。
の代替物となりうるものであって例えばグリシルグリシ
ン（GG）鉄、ベータグリセロリン酸（βGP）鉄、イミノ
ジ酢酸（IDA）鉄等である。GG鉄とβGP鉄が特に好まし
い。この鉄錯体はGG、βGP等のキレート化剤と第２鉄塩
例えば塩化第２鉄を水に溶解するだけで形成される。
糖はグルコース、マンノース、ガラクトース等の単糖
類、等を挙げることができる。鉄錯体を加熱殺菌する際
のキレート化剤の濃度は0.1−100mM、好ましくは１−20
mMが適当である。また、第２鉄塩の添加量としては、0.
1−200μＭ、好ましくは５−50μＭ程度の添加が適当で
ある。キレート化剤及び第二鉄塩の溶解に用いる糖液の
濃度は0.001−10.0g/、特に0.03−1.0g/の濃度が望
ましい。
類、等を挙げることができる。鉄錯体を加熱殺菌する際
のキレート化剤の濃度は0.1−100mM、好ましくは１−20
mMが適当である。また、第２鉄塩の添加量としては、0.
1−200μＭ、好ましくは５−50μＭ程度の添加が適当で
ある。キレート化剤及び第二鉄塩の溶解に用いる糖液の
濃度は0.001−10.0g/、特に0.03−1.0g/の濃度が望
ましい。
加熱殺菌条件は細菌、ウイルス、マイコプラズマ等が
完全に死滅するまでであり、110〜140℃で10〜40分間程
度、特に120〜130℃で15〜20分間適当が適当である。
完全に死滅するまでであり、110〜140℃で10〜40分間程
度、特に120〜130℃で15〜20分間適当が適当である。
加熱殺菌した鉄錯体を添加する他の培地構成成分とし
ては、タンパク質成分以外の物で、通常の細胞培養に必
要と考えられる有効成分の添加が必要である。そのよう
な例としては、栄養成分としてピルビン酸ナトリウム、
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、エタノールアミン、ビタ
ミン類（例:X100Vitamins:Flow Labo.社製）、亜セレン
酸などを添加した上で、さらに基本的栄養源として必要
な必須アミノ酸成分を含む基礎培地を添加する。本発明
で使用する基礎培地は、一般市販されているもの、例え
ば、イーグルMEM培地、ハムF12培地、ダルベッコ変法イ
ーグル培地、RPMI−1640培地またはASF104無血清培地等
を用いることができ、これらの基礎培地は単独または２
種以上の任意の割合の組合せにより使用することが出来
る。尚、上記培地成分のうち、糖に関しては鉄錯体の加
熱殺菌の際に使用した分を減じることができる。
ては、タンパク質成分以外の物で、通常の細胞培養に必
要と考えられる有効成分の添加が必要である。そのよう
な例としては、栄養成分としてピルビン酸ナトリウム、
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、エタノールアミン、ビタ
ミン類（例:X100Vitamins:Flow Labo.社製）、亜セレン
酸などを添加した上で、さらに基本的栄養源として必要
な必須アミノ酸成分を含む基礎培地を添加する。本発明
で使用する基礎培地は、一般市販されているもの、例え
ば、イーグルMEM培地、ハムF12培地、ダルベッコ変法イ
ーグル培地、RPMI−1640培地またはASF104無血清培地等
を用いることができ、これらの基礎培地は単独または２
種以上の任意の割合の組合せにより使用することが出来
る。尚、上記培地成分のうち、糖に関しては鉄錯体の加
熱殺菌の際に使用した分を減じることができる。
本発明の培地を用いての細胞の培養は、通常の動物細
胞培養の条件下で行うことによって良好な結果を得ら
れ、細胞の増殖状態等は、従来のトランスフェリンを含
む無血清培地を用いて細胞培養した場合と比較して、何
等劣る事なく、また細胞の物質（抗体等）産生において
も何等問題はない。
胞培養の条件下で行うことによって良好な結果を得ら
れ、細胞の増殖状態等は、従来のトランスフェリンを含
む無血清培地を用いて細胞培養した場合と比較して、何
等劣る事なく、また細胞の物質（抗体等）産生において
も何等問題はない。
本発明の培地は、浮遊性細胞の培養または付着性細胞
の培養のいずれにも用いることができ、動作由来の各種
の細胞の培養が可能である。そのような細胞としては、
例えば、ミエローマ細胞と融合して作製されたモノクロ
ーナル抗体産生能を有する融合細胞（ハイブリドー
マ）、またはBALL−1,WISH、HeLa,K562等のヒト及び動
物細胞が挙げられる。
の培養のいずれにも用いることができ、動作由来の各種
の細胞の培養が可能である。そのような細胞としては、
例えば、ミエローマ細胞と融合して作製されたモノクロ
ーナル抗体産生能を有する融合細胞（ハイブリドー
マ）、またはBALL−1,WISH、HeLa,K562等のヒト及び動
物細胞が挙げられる。
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
実施例１ 表１に示す主剤成分１分、表２に示す緩衝剤成分１
分を各々別々に蒸留水500mlに溶解し、120℃、20分間
オートクレーブし、放冷後混合して１としてトランス
フェリンを除去した基本培地（ASF104 TF-）とした。
分を各々別々に蒸留水500mlに溶解し、120℃、20分間
オートクレーブし、放冷後混合して１としてトランス
フェリンを除去した基本培地（ASF104 TF-）とした。
表１ 主剤成分 mg/ Ｌ−アルギニン塩酸塩 200.0 グリシン 30.0 Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン 500.0 グリシル−Ｌ−グルタミン 500.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（一水塩） 42.0 Ｌ−イソロイシン 104.8 Ｌ−ロイシン 104.8 Ｌ−リジン塩酸塩 146.2 Ｌ−メチオニン 30.0 Ｌ−フェニルアラニン 66.0 Ｌ−セリン 80.0 Ｌ−スレオニン 95.2 Ｌ−トリプトファン 25.0 Ｌ−チロシン 64.0 Ｌ−バリン 93.6 Ｌ−アラニン 20.0 Ｌ−アスパラギン（一水塩） 56.0 Ｌ−アスパラギン酸 20.0 Ｌ−システィン塩酸塩（一水塩） 70.0 Ｌ−グルタミン酸ナトリウム 20.0 Ｌ−プロリン 20.0 Ｌ−オルニチン 100.0 グルコース 2000.0 マンノース 500.0 ガラクトース 200.0 コハク酸 106.0 コハク酸ナトリウム 27.0 ピルビン酸ナトリウム 220.0 ピチオン 0.2 フォルニック酸 0.01 ｉ−イノシトール 20.0 アスコルビン酸ナトリウム 5.0 ビタミンB12 0.1 ａ−サイクロデキストリン・リノール酸 10.0 ａ−サイクロデキストリン 2200.0 グルタチオン 1.0 プトレッシン二塩酸塩 0.3 ヒポキサンチン 2.0 ウリジン 5.0 チミジン 0.2 デオキシシチジン 0.03 デオキシアデノシン 1.0 6,8ジハイドロオキシプリン 0.3 重酒石酸コリン 7.2 葉酸 4.0 ニコチン酸アミド 4.0 パントテン酸カルシウム 4.0 ピリドキサール塩酸塩 4.0 リボフラピン 0.4 チアミン塩酸酸 4.0 塩化ナトリウム 6400.0 塩化カリウム 400.0 塩化カルシウム（無水） 200.0 硫酸マグネシウム 97.7 リン酸二水素ナトリウム（二水塩） 125.0 硝酸第二鉄（九水塩） 0.1 硫酸銅（五水塩） 0.001 硫酸亜鉛（七水塩） 0.01 亜セレン酸ナトリウム 0.004 結晶インシュリン 5.0 ホスホエタノールアミン 28.0 コレステロール 0.1 硫酸カナマイシン 60.0 フェノールレッド 5.0 表２ 緩衝剤成分 mg/ β−グリセロリン酸二ナトリウム 1500.0 HEPES 1200.0 重曹 1800.0 表３に示す鉄錯体を鉄として2mMになるように糖溶液
（グルコース1.0g/）又は水に溶解し、0.22μｍのポ
アサイズのフィルターによる濾過滅菌、または120℃、2
0分間オートクレーブ殺菌したものを夫々ASF104 Tf-に
対し1/100量添加した。この培地に1F7細胞（マウスハイ
ブリドーマ細胞）を1X105（Cells/ml）の初発密度に播
種し、５％CO2、37℃下で５日間培養した。
（グルコース1.0g/）又は水に溶解し、0.22μｍのポ
アサイズのフィルターによる濾過滅菌、または120℃、2
0分間オートクレーブ殺菌したものを夫々ASF104 Tf-に
対し1/100量添加した。この培地に1F7細胞（マウスハイ
ブリドーマ細胞）を1X105（Cells/ml）の初発密度に播
種し、５％CO2、37℃下で５日間培養した。
培養後の細胞密度をエオシンＹ染色法と血球計算盤に
て生細胞密度を計測し、トランスフェリンを濾過滅菌し
てASF104 Tf-に添加（5mg/）した培地と、通常の濾過
滅菌にて調製した10％FBS添加RPMI1640培地及び処方ど
うり調製したASF104培地を対照培地として用いて、細胞
の増殖状態を比較した。
て生細胞密度を計測し、トランスフェリンを濾過滅菌し
てASF104 Tf-に添加（5mg/）した培地と、通常の濾過
滅菌にて調製した10％FBS添加RPMI1640培地及び処方ど
うり調製したASF104培地を対照培地として用いて、細胞
の増殖状態を比較した。
結果を表３に示す。
表３に示すように鉄錯体は、水に溶解し、濾過滅菌し
てASF104 Tf-に添加した場合では、良好な細胞増殖が認
められたが、これを加熱殺菌してASF104 Tf-に添加した
場合は、細胞の増殖は低下した。しかし鉄錯体を糖液
（グルコース）に溶解して、加熱殺菌してASF104 Tf-に
添加することによって良好な細胞増殖が得られた。
てASF104 Tf-に添加した場合では、良好な細胞増殖が認
められたが、これを加熱殺菌してASF104 Tf-に添加した
場合は、細胞の増殖は低下した。しかし鉄錯体を糖液
（グルコース）に溶解して、加熱殺菌してASF104 Tf-に
添加することによって良好な細胞増殖が得られた。
実施例２ 実施例１と同様に調製したASF104 Tf-にGGとβGPを夫
々1M混合したものに、塩化第２鉄を最終濃度が表４に示
す濃度になるように加えた。120℃、20分間オートクレ
ーブした後、夫々をASF104 Tf-に対して1/100量添加し
た培地で、1F7細胞を培養した。
々1M混合したものに、塩化第２鉄を最終濃度が表４に示
す濃度になるように加えた。120℃、20分間オートクレ
ーブした後、夫々をASF104 Tf-に対して1/100量添加し
た培地で、1F7細胞を培養した。
培養法、培養後の生細胞数の計測は、実施例１と同様
に行った。
に行った。
結果を表４に示す。
実施例３ 実施例１に示すASF104 Tf-を調製した。これに塩化第
２鉄の濃度を1mMとし、GGおよびβGPそれぞれを最終培
地濃度が表５に示すようになるように加えて120℃、20
分間オートクレーブした。ASF104 Tf-に対し1/100量添
加して、1F7細胞の培養を行った。細胞の培養法、培養
後の生細胞数の計測は、実施例１と同様に行った。
２鉄の濃度を1mMとし、GGおよびβGPそれぞれを最終培
地濃度が表５に示すようになるように加えて120℃、20
分間オートクレーブした。ASF104 Tf-に対し1/100量添
加して、1F7細胞の培養を行った。細胞の培養法、培養
後の生細胞数の計測は、実施例１と同様に行った。
結果を表５に示す。
実施例４ GGとβGPそれぞれ1Mおよび塩化第２鉄を2mMになるよ
うに表６に示す濃度のマンノース液に溶解し、120℃、2
0分間オートクレーブした。実施例１と同様に調製したA
SF104 Tf-に対して各々を1/100量添加し、1F7細胞を培
養した。
うに表６に示す濃度のマンノース液に溶解し、120℃、2
0分間オートクレーブした。実施例１と同様に調製したA
SF104 Tf-に対して各々を1/100量添加し、1F7細胞を培
養した。
培養法、生細胞数の計測は、実施例１と同様に行っ
た。
た。
結果を表６に示す。
実施例５ GGとβGPをそれぞれが1Mおよび塩化第２鉄を2mMにな
るように、グルコース、マンノース、ガラクトースの各
1g/の液に溶解して、120℃、20分間オートクレーブし
た。
るように、グルコース、マンノース、ガラクトースの各
1g/の液に溶解して、120℃、20分間オートクレーブし
た。
実施例１に示したASF104 Tf-に対して夫々1/100量を
添加した培地にBALL−１細胞を3X105（Cells/ml）の初
発密度で播種し、５％CO2、37℃下で５日間培養し細胞
の増殖性、抗体の産生能をASF104および10％FBS添加RPM
I1640培地と比較した。培養後の生細胞数は実施例１と
同様に測定した。また抗体（IgM）量の測定は酵素免疫
測定法（ELISA）で行った。
添加した培地にBALL−１細胞を3X105（Cells/ml）の初
発密度で播種し、５％CO2、37℃下で５日間培養し細胞
の増殖性、抗体の産生能をASF104および10％FBS添加RPM
I1640培地と比較した。培養後の生細胞数は実施例１と
同様に測定した。また抗体（IgM）量の測定は酵素免疫
測定法（ELISA）で行った。
結果を表７に示す。
実施例６ 実施例１に示したASF104 Tf-に、GGとβGPをそれぞれ
1Mおよび塩化第２鉄を2mMになるように1g/濃度マンノ
ース溶液に溶解し、120℃、20分間、オートクレーブし
た。ASF104 Tf-に対して各々1/100量添加し、全成分加
熱殺菌無血清培地を調製した。
1Mおよび塩化第２鉄を2mMになるように1g/濃度マンノ
ース溶液に溶解し、120℃、20分間、オートクレーブし
た。ASF104 Tf-に対して各々1/100量添加し、全成分加
熱殺菌無血清培地を調製した。
上記培地を用いて、1F7、K562、UMCL、BALL−１の浮
遊細胞および付着性細胞のWISH、HeLa細胞の増殖性を、
ASF104、10％FBS添加RPMI1640培地10％FBS添加MEM培地
と比較した。
遊細胞および付着性細胞のWISH、HeLa細胞の増殖性を、
ASF104、10％FBS添加RPMI1640培地10％FBS添加MEM培地
と比較した。
1F7細胞は1X105（Cells/ml）、K562細胞、UMCL細胞は
2X105（Cells/ml）、BALL−１細胞は３×105（Cells/m
l）の初発播種密度で５日間、WISH細胞、HeLa細胞はコ
ラーゲンコートディッシュ（コーニング社製）を用いて
2X105（Cells/dish）の初発播種密度で４日間、５％C
O2、37℃下で培養した。
2X105（Cells/ml）、BALL−１細胞は３×105（Cells/m
l）の初発播種密度で５日間、WISH細胞、HeLa細胞はコ
ラーゲンコートディッシュ（コーニング社製）を用いて
2X105（Cells/dish）の初発播種密度で４日間、５％C
O2、37℃下で培養した。
培養後の生細胞密度の測定を、1F7、K562、UMCLおよ
びBALL−１細胞は、実施例１と同様に行った。
びBALL−１細胞は、実施例１と同様に行った。
またWISH、HeLa細胞の場合は、0.075％トリプシン液
を用いて、細胞を分散し、細胞数を血球計算盤を用いて
測定した。
を用いて、細胞を分散し、細胞数を血球計算盤を用いて
測定した。
結果を表８、表９に示す。
〔発明の効果〕 鉄錯体を糖溶液に溶かして加熱殺菌しこれを添加する
ことによって従来の無血清培地に必須とされていた熱に
不安定なトランスフェリンを添加することなしに全成分
加熱殺菌した培地で培養したい細胞をこれまでと同様に
培養することが可能となる。
ことによって従来の無血清培地に必須とされていた熱に
不安定なトランスフェリンを添加することなしに全成分
加熱殺菌した培地で培養したい細胞をこれまでと同様に
培養することが可能となる。
本発明の培地を用いることによる最大の利点は、培地
の全成分が加熱殺菌可能であるので、マイコプラズマや
ウイルスの汚染防止が可能である。また培地全成分を加
熱殺菌することで無菌管理がしやすくなる。従来はトラ
ンスフェリンを加熱殺菌できないため濾過滅菌や煩雑な
放射線照射による殺菌を行なっていたが本発明法では簡
単な殺菌法で代替することができる。また、有用物質の
分離精製における操作が簡便となる点にある。さらに、
このような技術面での利点に加えて、培地のコスト面お
いても大きく低減することが可能である。
の全成分が加熱殺菌可能であるので、マイコプラズマや
ウイルスの汚染防止が可能である。また培地全成分を加
熱殺菌することで無菌管理がしやすくなる。従来はトラ
ンスフェリンを加熱殺菌できないため濾過滅菌や煩雑な
放射線照射による殺菌を行なっていたが本発明法では簡
単な殺菌法で代替することができる。また、有用物質の
分離精製における操作が簡便となる点にある。さらに、
このような技術面での利点に加えて、培地のコスト面お
いても大きく低減することが可能である。
Claims (1)
- 【請求項１】鉄錯体と糖を含む溶液を加熱殺菌してから
添加することを特徴とする細胞培養用培地の調製方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1344182A JP2800338B2 (ja) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | 細胞培養用無血清培地の調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1344182A JP2800338B2 (ja) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | 細胞培養用無血清培地の調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03201981A JPH03201981A (ja) | 1991-09-03 |
| JP2800338B2 true JP2800338B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=18367263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1344182A Expired - Fee Related JP2800338B2 (ja) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | 細胞培養用無血清培地の調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2800338B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4572940B2 (ja) | 2008-02-19 | 2010-11-04 | セイコーエプソン株式会社 | 放電灯の駆動方法、駆動装置、及びプロジェクタ |
-
1989
- 1989-12-29 JP JP1344182A patent/JP2800338B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03201981A (ja) | 1991-09-03 |
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