KR20040088169A - 동물세포 배양용 무혈청 배지 - Google Patents

동물세포 배양용 무혈청 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것으로, 구체적으로는 비동물 유래의 배지 성분 및 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분을 포함하여 제조된 동물 세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것이다. 본 발명의 동물세포 배양용 무혈청 배지를 이용하면 바이러스 백신을 높은 수율로 생산할 수 있고 인체에 안전한 형태로 생산할 수 있어 고품질의 인체용 백신을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

동물세포 배양용 무혈청 배지{Serum-free media for animal cell culture}
본 발명은 동물 세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비동물 유래의 배지 성분 및 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분을 포함하여 제조된 동물 세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것이다.
수두 바이러스 백신은 수두 바이러스가 감염된 사람 폐세포를 직접 계대 배양하여 증식시킨 후, 세포 유래 수두 바이러스만을 분리해 동결 건조하여 제조되는 인체용 백신이다. 수두 바이러스는 높은 세포친화성을 갖고 있기 때문에 세포를 배양하면서 수두 바이러스를 감염시킨 후의 배양 배지내에는 세포에서 유리된 수두 바이러스가 거의 존재하지 않는다. 따라서, 현재까지는 혈청을 사용하여 바이러스를 감염시켜 백신을 제조하고 있는 것이 국내외 수두 바이러스 백신 제조의 현실이다.
국내에서 이미 1990년대 초반에 개발된 국내 자체의 수두백신은 국내에서 분리한 수두 바이러스주를 이용하고, 국내에서 분리한 사람 폐세포를 이용하여 바이러스를 약독화시킨 후, 상기 약독화된 바이러스를 계대 배양하여 세포친화 바이러스 및 세포유리 바이러스를 생산하는 백신을 개발하는 방법을 사용하며, 이어서 이미 인체용 백신생산에 사용하고 있는 MRC-5 세포주와 일본에서 상품화된 Oka 수두 바이러스주를 이용하여 추가로 백신개발에 성공하여 상품화를 성공하였지만 이들 모두는 바이러스 배양용 배지에 우태아 혈청(Fetal bovine serum)을 사용한다는 단점이 있다.
일반적으로 동물세포를 배양하는데 있어서 혈청을 사용하는 것은 거의 필수적인데, 특히 부착되어서만 증식되는 동물 세포의 경우에는 혈청 성분중에 포함되어 있는 부착인자들을 필요로 하기 때문에, 동물세포를 배양하기 위해서는 혈청을 사용하는 것이 절대적으로 필요하다고 알려져 있다. 실제로 인체용 백신이나 동물 백신, 항체, 호르몬, 성장인자, 사이토카인 및 단백질 등의 생물 의약품을 경제적으로 대량 생산하기 위해서는 혈청을 포함하고 있는 배지를 사용하여 세포를 배양하는 것이 현실이다. 그러나, 혈청을 사용하는 것은 높은 가격과 제한된 공급, 각 생산분마다 조성의 균일성 부재, 바이러스, 마이코플라즈마 및 미생물 등에 의한 감염의 위험성, 세포 성장 및 대사를 저해하는 물질의 함유 및 성분이 완벽하게 밝혀져 있지 않은 것에 기인한 여러 가지 문제점들이 있다. 이에, 1980년대부터 의약품을 생산하는데 있어서 혈청의 첨가에 따른 문제점이 부각되면서 혈청의 사용을 줄이거나 대체하기 위한 연구들이 활발하게 진행되어 오고 있다. 특히, 1990년대 중반부터 광우병이 큰 문제로 부각되면서, 주로 우혈청을 사용하던 동물세포 배양용 배지의 생산은 큰 혼란 속으로 빠져들었다. 그러나, 당장 의약품에서 혈청이나 동물유래 성분을 대체하는 것은 큰 혼란을 야기할 뿐만 아니라 아직까지도 기술적으로나 의약품 허가상의 절차적인 면에서도 어려운 점이 많다.
세포 배양 배지의 흐름을 살펴보면, 혈청을 고농도로 사용하는 방법에서, 저농도의 혈청이나 혈청 대체 물질을 사용하거나, 혈청을 전혀 사용하지 않고 혈청 유래성분으로 바꾸는 방법으로 변화되었고, 다음에는 단백질 성분을 제거한 무단백질 배지로 변화되었고, 이제는 무단백질 배지에서도 동물유래 성분을 제거한 무단백질배지로 변경되었으며, 최근에는 더욱 더 외래물질을 제거하기 위하여 첨가되는 성분 모두가 완벽하게 밝혀진 성분만으로만 구성된 배지를 사용하고 있다.
그러나, 부착용 세포를 배양하는 경우에는 혈청 사용을 제한하는 것에 한계가 있으며, 특히 바이러스 백신을 생산하는 경우에는 혈청이 바이러스의 역가 유지 및 생산에 커다란 영향을 미치며 또한 부착용 세포가 바이러스가 증식할 때까지 생존력을 유지하고 부착성을 유지하는데 반드시 필요하므로 최소한의 혈청이나 혈청성분이 첨가된다. 그럼에도 불구하고, 인체에 사용하는 백신에 혈청성분이 들어가도록 할 수는 없기 때문에, 실제로 현재 상품화 되어있는 수두 백신의 경우, 혈청을 사용하여 세포를 배양한 후 얻어진 세포를 세척하여 혈청 성분을 제거하고 있으나, 세포의 세척만으로 혈청성분을 완벽하게 제거했다고 보기에는 기술적으로 어려운 점이 있는 것이 사실이다.
세계시장 규모 약 20조원 이상을 차지하는 생물 의약품의 50%가 동물세포 배양 체계를 이용하며, 동물세포 배양 기술을 이용하여 바이러스 백신, 사이토카인, 혈액응고인자, 단일클론 항체 및 조직공학, 유전자치료에 응용하고 있으며 전체 생물산업 발전을 주도하고 있다. 인체용 바이러스 백신의 경우 사람 세포를 배양하여 바이러스를 증식시켜 생산하는데, 최근 광우병과 구제역등의 혈청의 오염 가능성으로 인해 세포 배양시 사용되는 배지의 혈청성분이 동물유래 성분인 것을 배제하려는 노력을 하고 있다. 따라서, 인체용 바이러스 백신 제조시 무혈청 배지를 사용하고 더불어 배지의 조성성분이 비동물 유래 성분인 것을 사용하여 동물세포를 배양하는 것이 필요한 실정이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 최근 기존의 생물 의약품 제조뿐만 아니라 개발되고 있는 모든 의약품에서 소유래 뿐만 아니라 동물유래 성분을 제거하는 것이 요구되고 있는 실정이므로, 혈청을 사용한 기존의 백신 생산 방법을 개선하기 위해 동물유래 성분이 제거된 무혈청 배지를 사용하면, 세포의 수율을 높이고 세포의 정제를 용이하게 하여 안전한 인체용 바이러스 백신을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.
이에, 본 발명자들은 세포 수율 및 정제도를 향상시키고, 혈청 사용으로 인한 위험성을 최소화하며, 외래 단백질에 의한 백신의 부작용을 최소화하기 위해 비동물 유래의 성분만을 함유하는 무혈청 배지를 제조하였고, 상기 배지를 이용하여 높은 수율의 바이러스를 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 바이러스 백신을 생산하기 위한 동물 세포 배양용 무혈청 배지를 제공하는 것이다.
도 1a는 혈청 농도를 달리하여 배양한 MRC-5 세포의 시간에 따른 세포 농도를 나타낸 그래프이다.
도 1b는 혈청 농도를 달리하여 배양한 MRC-5 세포의 시간에 따른 글루코스 소비 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 세포 계대수에 따른 MRC-5 세포의 최대 세포 농도를 비교한 그래프이다.
도 3은 기본배지의 조성비를 달리하고 저농도 혈청(2% 및 4%)을 첨가하여 배양한 MRC-5 세포의 최대 세포 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 무혈청, 1% 혈청, 4% 혈청 및 10% 혈청배지에서 배양한 MRC-5 세포의 시간에 따른 세포 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 무혈청, 1% 혈청, 4% 혈청 및 10% 혈청배지에서 배양한 MRC-5 세포의 성장을 비교한 그래프이다.
도 5는 10% 혈청배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 바이러스 역가(세포 병변 효과)를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 10% 혈청배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 세포친화 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 10% 혈청배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 세포유리 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다.
도 7은 10% 혈청배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 세포유리 바이러스 역가에 대한 세포친화 바이러스 역가의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 무혈청 배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 무혈청 배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 세포친화 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 무혈청 배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 세포유리 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다.
도 10은 무혈청 배지에서 성장한 세포에 무혈청, 2% 및 10% 혈청배지를 첨가하여 수두 바이러스를 감염시켜 배양한 뒤 시간에 따른 세포유리 바이러스 역가에대한 세포친화 바이러스 역가의 비율을 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 비동물 유래의 배지 성분 및 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분을 포함하여 제조된 동물세포 배양용 무혈청 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 동물세포 배양용 무혈청 배지를 이용하여 바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 비동물 유래의 배지 성분으로 페릭 시트레이트(Ferric citrate), 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분으로 하이펩(HyPep) 및 소이프로틴 하이드롤리세이트(Soyprotein hydrolysate)를 포함하여 제조된 동물 세포 배양용 무혈청 배지를 제공한다.
상기 페릭시트레이트는 공업적으로 합성된 성분이고, 하이펩은 밀단백질 유래의 성분이며, 소이프로틴 하이드롤리세이트는 콩단백질 유래의 성분인 것이 바람직하다. 본 발명에서는 공업적으로 합성된 페릭시트레이트(Sigma, USA), 밀단백질유래의 하이펩(Sigma, USA) 및 콩단백질 유래의 소이프로틴 하이드롤리세이트(Sigma, USA)를 사용하였다.
상기에서 페릭 시트레이트는 10 내지 50 ㎎/ℓ, 하이펩은 2 내지 3 g/ℓ 및 소이프로틴 하이드롤리세이트는 84 ㎎/ℓ을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 동물세포 배양용 무혈청 배지는 상기 배양 배지 성분에 추가로 비동물 유래의 기본 배양배지 성분으로 상용배지, 아미노산류, 비타민류, 무기염류 및 기타 성분을 포함하며, 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분으로 성장인자 및 지방산류를 포함한다.
상기 상용배지로는 DME와 Ham's F12, 아미노산류로는 MEM 비필수 아미노산 및 L-글루타민, 비타민류로는 비타민 B12, 무기염류로는 트레이스 성분(CuSO4·5H2O, Fe(NO3)3·9H2O, ZnSO4), 포스포에놀 피루베이트(Phosphoenol pyruvate), 모노에탄올아민(Momoethanolamine), 소듐 셀레니트(Sodium selenite) 및 소듐 바이카보네이트(Sodium bicarbonate), 기타 성분으로는 D-글루코스, 리놀레익산(Linoleic acid), 리포익산(Lipoic acid), 소듐 피루베이트(Sodium pyruvate), 하이폭산틴 나트륨(Hypoxantine ·Na), 퓨트레신 하이드로클로라이드(Putrescine ·HCl) 및 폴리아민 용액(Polyamine solution)을 포함하여 제조한다. 또한, 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분으로 성장인자는 인슐린(Insulin) 및 재조합 인간 섬유아세포성장인자(Recombinant human fibroblastgrowth factor), 지방산류로는 지방산 용액(Fatty acid solution)를 포함한다.
상기 기본배지인 DME는 0.66 ℓ/ℓ, Ham's F12는 0.34 ℓ/ℓ, MEM 비필수 아미노산은 10 ㎖/ℓ, L-글루타민은 584 ㎎/ℓ, 비타민 B12는 3 내지 10 ㎎/ℓ, 트레이스 성분은 0.1 ㎖/ℓ, 포스포 에놀 피루베이트는 1 내지 5 ㎎/ℓ, 모노에탄올아민은 5 내지 10 mM/ℓ, 소듐 셀레니트는 0.0001 내지 0.005 ㎎/ℓ, 소듐 바이카보네이트는 1600 ㎎/ℓ, D-글루코스는 4500 ㎎/ℓ, 리놀레익산은 0.35 내지 1 ㎎/ℓ, 리포익산은 15 내지 25 ㎎/ℓ, 소듐 피루베이트는 110 내지 220 ㎎/ℓ, 하이폭산틴 나트륨은 2 내지 4 μM/ℓ, 퓨트레신 하이드로클로라이드는 116 ㎎/ℓ, 폴리아민 용액은 0.5 ㎖/ℓ, 인슐린은 2 내지 10 ㎎/ℓ, 재조합 인간 섬유아세포성장인자는 1 내지 2 ㎍/ℓ 및 지방산 용액은 0.25 내지 0.5 ㎖/ℓ을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 MEM 비필수 아미노산, L-글루타민, 비타민 B12, 트레이스 성분, 포스포 에놀 피루베이트, 모노에탄올아민, 소듐 셀레니트, 소듐 바이카보네이트, D-글루코스, 리놀레익산, 리포익산, 소듐 피루베이트, 하이폭산틴 나트륨, 퓨트레신 하이드로클로라이드 및 폴리아민 용액은 공업적으로 합성된 성분이고, 인슐린 및 재조합 인간 섬유아세포성장인자는 대장균(E. coli) 유래의 성분이고, 지방산 용액은 공업적으로 합성된 성분인 것이 바람직하다.
본 발명자들은 상기 비동물 유래의 조성 성분을 적정 함유한 동물세포 배양용 무혈청 배지를 제조하고, 이를 'SM 004-01'이라 명명하였다. 상기 SM 004-01배양 배지는 인체용 수두 바이러스 백신의 제조에 용이한 동물세포 배양용 무혈청 배지이며, 본 발명에서는 상기 배양 배지의 조성을 기초로 하여 세포의 부착성을 증대시키기 위해 추가로 단백질을 미량 첨가하여 수두 바이러스 이외의 바이러스를 생산하기 위한 무혈청 배지를 제조한 후 'SM 003-01' 및 'SM 003-02'라 명명하였다. 상기 SM 003-01은 SM 004-01 배지에 트랜스페린(transferrin)을 0.1 내지 0.3 ㎎/ℓ을 첨가하여 제조하고 SM 003-02는 SM 004-01 배지에 트랜스페린을 0.1 내지 0.3 ㎎/ℓ, BSA를 0.2 내지 0.5 g/ℓ첨가하여 제조한 것이다.
본 발명의 비동물 유래 성분으로만 조성된 동물세포 배양용 무혈청 배지는 재조합 의약품 또는 바이러스 백신을 생산하기 위한 동물세포를 배양하기 위해 사용되는 배지로서, 상기 동물세포는 재조합 의약품을 생산하기 위해 사용하는 모든 동물세포를 포함하고, 바이러스 백신을 생산하기 위한 동물세포는 바이러스가 감염된 동물세포이거나 바이러스를 감염시켜 바이러스 백신을 생산하기 위해 사용하는 모든 동물세포를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 동물 세포로 사람 배아의 폐세포인 'MRC-5 세포'를 사용하였지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명의 동물세포 배양용 무혈청 배지를 이용하여 바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바이러스 백신을 제조하는 방법은 본 발명의 동물세포 배양용 무혈청 배지에 동물세포를 배양한 후 바이러스를 감염시킨 후 이로부터 바이러스를 수득하거나, 본 발명의 동물세포 배양용 무혈청 배지에 바이러스 감염된 동물세포를 배양하여 이로부터 바이러스를 수득하여 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 제조하는 바이러스 백신은 인체용 수두 바이러스 백신인 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 배양한 사람 폐세포에 수두바이러스를 감염시킨 경우와 혈청배지를 이용하여 배양한 사람 폐세포에 수두 바이러스를 감염시킨 경우를 비교한 결과, 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 것이 혈청 배지를 이용한 것과 동등한 바이러스 역가를 가짐을 확인함으로써 본 발명의 무혈청 배지는 바이러스 백신을 제조하기에 용이한 동물세포 배양 배지임을 알 수 있음을 확인하였다(도 5및도 8참조). 또한, 본 발명의 무혈청 배지는 동물 유래 성분을 비동물 유래 성분으로 대체하였기 때문에, 인체용 바이러스의 제조시 가장 큰 문제인 동물 유래 성분에 의한 안전성 문제를 극복할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> MRC-5 세포 성장에 미치는 혈청의 영향
부착성 동물세포 배양에서 사용되는 혈청의 종류 및 농도는 세포의 성장과목적 산물의 생산에 중요한 영향을 미친다. 혈청은 고가이기 때문에 대량 세포배양을 하기 전에 소규모 배양에서부터 미리 세포 성장에 대한 자료를 갖고 있어야 하며, 특히 무혈청 배양을 위한 배지 개발을 위해서는 기존 세포의 성장 정도를 미리 알고 있어야 하기 때문에 본 발명자들은 부착성 동물세포인 'MRC-5 세포'의 성장에 혈청이 미치는 효과를 조사하였다.
<1-1> MRC-5 세포 배양
본 발명자들은 사람태아의 폐 조직에서 분리한 19계대의 사람 폐세포(human embryonic lung cell)를 미국 ATCC로부터 세포를 구입한 후 계대 배양하여 MCB(master cell bank)와 MWCB(master working cell bank)를 제조하였으며, MWCB로부터 세포를 융해한 후 T-175 플라스크(Greiner, USA) 조직배양용 용기에 배양하여 실험에 사용하였다. 세포 계대수에 따른 실험 오차를 줄이기 위해 계대수 23 내지 28의 세포를 실험에 사용하였다. MRC-5 세포를 배양하기 위해 사용한 배지는 DME 배지(JBI, LM 001-62, 한국)에 10% 우태아 혈청(JBI, S 001-01)을 첨가하고 100 ×MEM 비필수 아미노산 용액을 첨가한 배지를 사용하였다. T-플라스크 안에 상기 세포를 배양배지에 잘 섞은 후 수평을 유지하여 5% 농도의 CO2배양기에서 배양하였다. 세포 제조에 사용되는 기구 및 용기류는 121℃에서 30분간 멸균한 것을 사용하였으며, 무균 작업대는 최소 사용 30분전에 가동하였다.
<1-2> 혈청 농도에 따른 MRC-5 세포의 성장
본 발명자들은 T-25 플라스크(Greiner, USA)에 4%, 6%, 8% 및 10% 중량 비의 우태아 혈청(Fetal bovine serum)을 함유한 DME 배지 및 MEM 비필수 아미노산을 첨가하고 2.5 ×104세포수/㎠ 농도로 MRC-5 세포를 접종하여 37℃의 CO2배양기에서 배양하면서 매일 세포수 및 글루코스 농도를 측정하였다.
그 결과, 혈청 농도가 증가함에 따라 MRC-5 세포의 성장이 증가하였는데, 배양 1일차에는 세포가 플라스크 표면에 부착하는데 시간이 필요하기 때문에 세포 성장이 느리나 2일차부터는 대수증가기의 세포성장을 보이는 전형적인 세포성장 곡선의 형태를 보였고, 8% 혈청을 사용한 배양과 10% 혈청을 사용한 배양에서는 유사한 세포성장을 보였다(도 1a). 또한, 글루코스 농도는 최초 농도 4500 ㎎/ℓ 중의 약 20 내지 30%만이 세포가 최대 농도에 도달될 때까지 소모되는 경향을 보였는데, 이로부터 MRC-5 세포 성장에 글루코스가 효율적으로 사용되고 있지 못하고 있음을 알 수 있으며, 세포가 최대에 도달된 후 세포가 더 이상 자랄 수 있는 표면적의 제한으로 인한 결과로 세포 증식이 멈추었음을 알 수 있었다(도 1b). 따라서, 주요 에너지원인 글루코스(glucose) 농도의 변화는 세포성장과 관련이 있음을 알 수 있었다. 또한, 세포 계대수에 따른 세포성장의 차이를 보기 위해 계대수 23 내지 28 계대수의 세포를 배양하여 최대로 성장한 세포의 농도를 측정한 결과, 세포의 성장은 세포의 계대수에 따라 거의 차이를 보이지 않았다(도 2).
상기 결과로부터, 앞으로의 MRC-5 세포 성장에 관한 실험에서는 표준이 되는 혈청 농도를 10%로 결정하였다.
<실시예 2> 무혈청 배지 조성화
<2-1> 무혈청 배지의 기본 배지 결정
본 발명자들은 MRC-5 세포의 무혈청 배양을 위한 기본 배지를 조사하기 위해 일반적으로 동물세포를 무혈청 배양할 때 사용하는 상용화된 무혈청 배지인 Ham's F12 배지(LM 010-01, JBI)(표 1및표 2)와 MRC-5 세포 성장에 사용된 DME 배지를 적절하게 조합하여 제조한 후 혈청 농도를 감소시켰을 때 세포 성장이 최대를 보이는 기본배지 조성을 결정하였다. 구체적으로, T-25 플라스크에 DME 배지와 Ham's F12 배지와의 비율을 1 : 1, 2 : 1, 3 : 1 또는 4 : 1로 하고 여기에 100 ×MEM 비필수 아미노산 10 ㎖/ℓ을 넣고 우태아 혈청을 2% 또는 4% 첨가한 후 초기 세포 농도를 2.5 ×104세포수/㎠로 MRC-5 세포를 접종하여 37℃의 CO2배양기에서 배양하면서 매일 세포수를 측정하였다.
상용 배지의 조성(㎎/ℓ)
조성 성분 DME Ham's F-12 DME/F-12
무기염류 무수칼슘클로라이드(CaCl2anhydrous) 200.00 33.20 116.60
황화구리(CuSO4·5H2O) - 0.0025 0.0013
황화철(FeSO4·7H2O) - 0.83 0.417
질산철(Fe(NO3)3·9H2O) 0.10 - 0.05
칼륨클로라이드(KCl) 400.00 223.60 311.8
무수마그네슘클로라이드(MgCl2anhydrous) - 57.22 28.64
무수황화마그네슘(MgSO4anhydrous) 97.67 - 48.84
소듐클로라이드(NaCl) 6400.00 7599.000 6996.00
소듐바이카보네이트(NaHCO3) 3700.00 1176.00 1200.00
소듐포스페이트(NaH2PO4·H2O) 125.00 - 62.50
무수소듐포스페이트(Na2HPO4anhydrous) - 142.00 71.02
황화아연(ZnSO4·7H2O) - 0.86 0.432
기타 D-글루코스(D-Glucose) 4500.00 1802.00 3151.00
HEPES 15.00 - 3574.50
하이폭산틴나트륨(Hypoxanthine·Na) - 4.77 2.39
리놀레익 산(Linoleic Acid) - 0.08 0.042
리포익 산(Lipoic Acid) - 0.21 0.105
페놀 레드(Phenol Red) - 1.20 8.10
퓨트레신하이드로클로라이드(Putrescine·HCl) - 0.161 0.081
소듐 피루베이트(Sodium Pyruvate) 110.00 110.00 55.00
* 상기 배지의 제조사는 JBI이고, 제품의 번호는 DME: LM 001-05, Ham's F-12 배지: LM 010-01, DME/F-12: LM 002-04이다.
상용 배지의 조성(㎎/ℓ)
조성 성분 DME Ham's F-12 DME/F-12
아미노산 L-알라닌(L-Alanine) - 8.90 4.45
L-아르기닌하이드로클로라이드(L-Arginine·HCl) 84.00 211.00 147.5
L-아스파라긴(L-Asparagine·H2O) - 15.00 7.50
L-아스파틱 산(L-Aspartic Acid) - 13.00 6.69
L-시스테인하이드로클로라이드(L-Cysteine·HCl·H2O) - 35.00 17.56
L-시스테인2하이드로클로라이드(L-Cystine·2HCl) 63.00 - 31.29
L-글루타믹 산(L-Glutamic Acid) - 14.70 7.35
L-글루타민(L-Glutamine) 584.00 146.00 365.00
글리신(Glycine) 30.00 7.50 18.75
L-히스티딘하이드로클로라이드(L-Histidine·HCl·H2O) 42.00 21.00 31.48
L-이소루이신(L-Isoleucine) 105.00 4.00 54.47
L-루이신(L-Leucine) 105.00 13.00 59.05
L-리신하이드로클로라이드(L-Lysin·HCl) 146.00 36.50 91.25
L-메티오닌(L-Methionine) 30.00 4.50 17.24
L-페닐알라닌(L-Phenylalanine) 66.00 5.00 35.48
L-프롤린(L-Proline) - 34.50 17.25
L-세린(L-Serine) 42.00 10.50 26.25
L-트레오닌(L-Threonine) 95.00 12.00 53.45
L-트립토판(L-Tryptophan) 16.00 2.00 9.02
L-티로신2나트륨(L-Tyrosine·2Na·2H2O) 104.00 7.80 55.79
L-발린(L-Valine) 94.00 11.70 52.85
비타민 바이오틴(Biotin) - 0.007 0.0035
D 칼슘 판토테네이트(D Ca Pantothenate) 4.00 0.50 2.24
콜린 클로라이드(Choline Chloride) 4.00 14.00 8.98
폴릭 에시드(Folic Acid) 4.00 1.30 2.65
i-이노시톨(i-Inositol) 7.20 18.00 12.6
니아신아마이드(Niacinamide) 4.00 0.04 2.02
피리독신하이드로클로라이드(Pyridoxine·HCl) 4.00 0.06 2.031
리보플라빈(Riboflavin) 0.40 0.04 0.219
티아민하이드로클로라이드(Thiamine·HCl) 4.00 0.30 2.17
티미딘(Thymidine) - 0.70 0.365
비타민 B12(Vitamin B12) - 1.40 0.68
* 상기배지의 제조사는 JBI이고, 제품의 번호는 DME: LM 001-05, Ham's F-12 배지: LM 010-01, DME/F-12: LM 002-04이다.
그 결과, DME 배지와 Ham's F12 배지와의 비율을 2 : 1로 하고 100 ×MEM 비필수 아미노산 10 ㎖/ℓ를 넣어 제조한 배지(DME/Ham's F-12)에 다양한 농도의 혈청을 첨가하여 배양한 MRC-5 세포는 혈청 농도와는 무관하게 최대 세포농도를 얻었고, 혈청의 비율이 높을수록 세포 성장 정도가 다소 낮아졌으며, 2% 및 4% 혈청을 사용한 최대 세포농도는도 1에서 얻어진 최대 세포농도의 약 70% 및 85% 수준으로, 혈청 농도가 10%를 사용한 대조군에 비해 20% 및 40% 낮은 수준임에도 불구하고 높은 세포농도를 얻었다(도 3). 따라서, DME 배지와 Ham's F-12 배지와의 비율을 2 : 1로 한 배지에서 배양한 MRC-5 세포는 혈청 농도를 낮추어도 세포 성장이 정상에 근접하게 성장할 수 있음을 발견하여 DME 배지와 Ham's F-12 배지와의 비율을 2 : 1 비율로 결정하였다.
<2-2> 무혈청 배지의 조성화
본 발명자들은 상기에서 DME 배지와 Ham's F-12 배지와의 비율을 2 : 1 비율로 결정한 것을 토대로 하여 기존의 무혈청 배지의 조성에 사용된 동물유래 성분인 인혈청 알부민 또는 우혈청 알부민, 페튜인(Fetuin), 소유래의 인슐린, 트란스페린 등을 대신하기 위한 다른 성분들을 조사하였다. 구체적으로, 비동물 배지 성분으로 아미노산류, 무기염류, 비타민류 및 기타 성분 등의 원료 자재를 탐색하여 공업적으로 합성한 것을 선별하여 사용하고 혈청 대체 성분으로 성장인자, 지방산류 및 펩타이드류를 대장균, 공업적 합성 및 식물 유래의 성분을 사용하여 제조하였다(표 3). 본 발명에서는 비동물 배지 성분으로 페릭시트레이트(Ferric Citrate), 혈청 대체 성분으로 소이프로틴 하이드롤리세이트(SoyProtein Hydrolysate) 및하이펩(HyPep)을 추가로 포함하여 제조하였다. 또한, 상기에서 제조한 무혈청 배지에서 배양한 세포의 성장을 기존의 혈청 배지 및 무혈청 배지에서 배양한 세포의 성장과 비교하였다.
무혈청 배지의 조성 성분
조성 성분 함량(/ℓ)
기본 배지 DME 배지 0.66 ℓ
Ham's F-12 배지 0.34 ℓ
아미노산류 100 ×MEM 비필수 아미노산 10 ㎖
L-글루타민(L-Glutamine) 584 ㎎
비타민 비타민 B12(Vitamin B12) 3 - 10 ㎎
무기염류 트레이스 성분(CuSO4·5H2O, Fe(NO3)3·9H2O, ZnSO4) 0.1 ㎖
포스포 에놀 피루베이트(Phospho enol pyruvate) 1 - 5 ㎎
모노에탄올아민(Monoethanloamine) 5 - 10 mM
소듐 셀레니트(Sodium Selenite) 0.0001 - 0.0005 ㎎
소듐 바이카보네이트(Sodium bicarbonate) 1600 ㎎
기타 D-글루코스(D-Glucose) 4500 ㎎
리놀레익산(Linoleic Acid) 0.35 - 1 ㎎
리포익산(Lipoic Acid) 15 - 25 ㎎
소듐 피루베이트(Sodium Pyruvate) 110 - 220 ㎎
하이폭산틴 나트륨(Hypoxanthine·Na) 2 - 4 μM
퓨트레신 하이드로클로라이드(Putrescine·HCl) 116 ㎎
페릭 시트레이트(Ferric Citrate) 10 - 50 ㎎
폴리아민 용액(Polyamine solution) 0.5 ㎖
성장인자 인슐린(Insulin) 2 - 10 ㎎
재조합 인간 섬유아세포성장인자(FGF, recombinant human) 1 - 2 ㎍
지방산류 지방산 용액(Fatty Acid solution) 0.25 - 0.5 ㎖
펩타이드류 하이펩(HyPep) 2 - 3 g
소이프로틴 하이드롤리세이트(SoyProtein Hydrolysate) 84 ㎎
그 결과, 본 발명에서 제조한 무혈청 배지에서 성장한 세포는 10% 혈청을 첨가한 MRC-5 성장배지에서 성장한 세포에 비하여 약 85%의 최대 세포농도를 보였으나, 4% 혈청을 첨가한 배지에서 성장한 세포에 비해서는 다소 높은 세포 농도를 보였다(도 4a). 또한, 전체적인 세포성장 정도는 10% 혈청을 사용한 배지에 비하여 무혈청 배지(SFM)에서의 세포성장이 낮았으나, 무혈청 배지에 1%정도의 혈청을 첨가하였을 때는 10% 혈청을 첨가한 배지를 사용한 것에 비하여 약 91%에 가까운 세포성장을 보였다(도 4b). 따라서,표 3의 조성으로 제조된 본 발명의 무혈청 배지에서의 세포 성장은 10% 혈청을 첨가하여 배양한 경우에 비하여 세포성장이 15% 정도 떨어지지만 MRC-5 세포가 플라스크 표면에 부착 성장하는데는 적합하다고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 무혈청 배지가 10% 혈청배지에 비하여 낮은 세포농도를 가지는 것을 극복하기 위해서는 배지의 최적화가 더 필요하며, 배양 방법상의 조건들을 변경함으로써 개선할 수 있는 여지가 있다고 할 수 있다.
<실시예 3> 혈청 배지에서 성장한 세포에서의 바이러스 역가 분석
본 발명자들은 무혈청 배지를 이용한 세포 배양보다는 무혈청 배지를 이용한 바이러스 배양에 목표를 두고 있으므로 지금까지 얻어진 결과를 바탕으로 세포 배양을 실시하여 세포가 단층을 형성한 다음 바이러스를 감염시켜 무혈청 배지에서의 바이러스 증식을 혈청배지에서의 바이러스 증식와 비교하여 바이러스 역가를 분석하였다.
<3-1> 바이러스 감염
T-25 플라스크에 상기표 3의 조성을 가진 무혈청 배지 또는 DME 배지에 100 ×MEM 비필수 아미노산 10 ㎖/ℓ를 넣고 혈청농도를 2% 또는 10%로 하여 제조한 혈청 배지를 넣은 후, 초기 세포 농도를 3 ×104세포/㎠ 농도로 MRC-5 세포를 접종하여 37℃의 CO2배양기에서 4일간 배양한 후, 40 내지 60% 세포 병변 효과를 보이는 수두 바이러스로 일본 비켄 수두백신에서 분리한 Oka 바이러스를 0.2 moi( multiplicity of infection, 중복 감염도)의 감염비율로 감염시켜 35℃의 CO2배양기에서 배양하였다.
<3-2> 바이러스 감염 세포의 수득 및 바이러스 역가 분석용 시료 준비
본 발명자들은 바이러스 감염된 세포의 바이러스 역가를 분석하기 위해, 상기 배양으로 바이러스 감염된 세포를 수득한 후 냉장 보관된 PBS로 세척하고, CO2배양기에 넣어 30분 간격으로 세포 배양면을 흔들어 주면서 3시간 동안 방치하였다. 상기 PBS가 든 플라스크에 400 ㎖의 바이러스 초음파 처리용 안정제(젤라틴용액 1%, 젤라틴 가수분해물 용액 20%, 정제 백당용액 50%, 글루타민산나트륨 용액10%, 황산가나마이신용액 10 ㎎/㎖, 에리스로마이신용액 및 인산완충액, pH7.0, 0.2 ㎛ 여과, 냉동보관)를 가하고 세차게 흔들어서 감염세포를 수확하였다. 상기 수확된 세포를 50 ㎖ 원심관에 분주하여 3000 rpm에서 5분간 원심한 뒤 상층액을 제거하였다. 각 원심관의 침전된 세포에 바이러스 초음파 처리용 안정제를 넣어 부유시키고 50 ㎖ 튜브에 40 ㎖씩 분주하여 미리 준비된 얼음상자 안에 놓아 팁의 크기는 지름 10 ㎜, 파장은 50%, 출력은 35%, 파동의 켜짐은 1초, 파동의 꺼짐은 1초, 파동의 횟수는 20회 및 팁의 깊이는 10 ㎜인 소니케이션 조건으로 소니케이터에서 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄가 끝난 용액을 1500 rpm에서 5분간 원심하여 상층액을 모으고, 원심 분리하여 생긴 침전물을 모아서 재부유한 후 상기와 동일 조건으로 초음파 처리하고 원심 분리하여 상층액을 모았다. 상기 모아진 용액 모두를 수두 바이러스 원액으로 하고 전체 액량을 확인하여 상기 용액 중 일부를 취하여 세포유리 바이러스 시험용으로 사용하였다.
<3-3> 바이러스 역가의 분석
본 발명자들은 상기 실시예 <3-2>에서 수확한 수두 바이러스 원액을 희석하여 바이러스 역가를 분석하였다. 구체적으로, 상기에서 수확한 수두 바이러스 원액을 0.1% BSA(Sigma, USA)와 0.1% D-글루코스(Sigma, USA)를 포함한 D-PBS(LB 001-02, JBI)로 제조된 희석액으로 각 웰당 바이러스 플락(plaque)수가 50 내지 200개 정도가 되도록 5배수로 중복 희석하여 3개의 연속 희석액을 만들고, MRC-5 세포가 배양되고 있는 각 웰에 바이러스 감염세포 희석액을 0.2 ㎖씩 넣고 60분 동안 15분마다 세포표면에 고루 묻도록 반복한 후, DME 배지에 100 ×MEM 비필수 아미노산 10 ㎖/ℓ를 넣고 혈청농도를 10%로 하여 제조한 바이러스 역가 분석용 혈청배지를 각 웰당 2 ㎖씩 넣고 35℃의 CO2배양기에서 배양하면서 매일 플락 형성을 현미경으로 관찰하였다. 상기 배양후 3 내지 5일 후 나타난 플락수를 계산하여 원액의 바이러스 역가를 결정하였다.
그 결과, 바이러스 감염한지 24시간 후 세포 병변 효과는 10% 정도로 모든 배지에서 비슷하였으나, 바이러스 역가가 가장 높은 2일째에는 10% 혈청 배지에서 60% 정도로 가장 높았고 나머지는 50% 정도로 다소 낮았으며, 배양시간이 경과함에 따라 세포 병변 효과 발생 정도가 늘어나는 현상을 보여 4일째는 세포 병변 효과가 거의 100% 였으나 바이러스 감염된 세포가 플라스크에서 탈착되는 현상을 보였다(도 5). 이것은 실제적으로 바이러스 역가가 떨어지는 것을 의미하는 것으로 세포 병변 효과가 100% 정도 되면 바이러스에 감염된 세포가 파쇄되거나 활성을 잃게되어 수두 바이러스의 역가가 떨어짐을 알 수 있었다.
<3-4> 세포친화 바이러스 및 세포유리 바이러스의 역가 분석
본 발명자들은 상기에서 실시한 바이러스 역가를 토대로 하여 세포친화 바이러스 및 세포유리 바이러스로 분리하여 바이러스의 역가를 비교하였다. 구체적으로, 10% 혈청배지에서 배양된 MRC-5 세포의 배양 상층액을 제거하고, PBS로 2회 세척하여 혈청 성분을 제거한 후 무혈청 배지, 2% 혈청 배지 및 10% 혈청 배지를 넣고 바이러스를 감염시킨 후 세포를 수득하여 바이러스 역가를 분석하였다.
그 결과, 무혈청 배지에서 바이러스를 감염시킨 경우는 대조군인 10% 혈청 배지 및 2% 혈청배지에서 바이러스를 감염시킨 경우과 비교하였을때 동등하거나 약 15% 정도 높은 세포친화 바이러스(CAV: cell assosiated virus) 역가를 보였다. 세포친화 바이러스의 역가는 바이러스 감염 후 2일째에 가장 높았으며 배양기간이 길어질수록 바이러스 역가가 떨어지는 경향을 보였다(도 6a). 이는도 5의 세포병변 효과와 관련 있는 것으로 4일째에 가장 높은 세포 병변 효과를 보이나 실제로 감염력을 가진 바이러스는 줄어든다고 할 수 있다.
또한, 상기와 같은 방법으로 바이러스 감염된 세포를 PBS로 세척한 후 0.05% EDTA로 세포를 플라스크에서 탈착시키고 세포를 수확하여 1500 rpm에서 5분간 원심하여 상층액을 버리고, 남은 세포 침전물을 초음파 파쇄용 안정제에 잘 부유하여 초음파 파쇄한 후의 세포유리 바이러스(CFV: cell-free virus)의 역가를 비교한 결과, 10% 혈청배지에서 MRC-5 세포를 증식시킨 후 배지를 제거하고 무혈청 배지, 2% 혈청배지 및 10% 혈청배지를 이용하여 바이러스를 감염 배양한 경우에, 무혈청 배지를 사용하여 감염시킨 세포유리 바이러스의 역가는 2% 혈청배지 및 10% 혈청배지을 사용한 경우와 유사한 세포유리 바이러스 역가를 보였다(도 6b). 따라서, 기존 수두바이러스 백신을 생산하는데 이용한 바이러스 배양을 하기 위해 사용되는 혈청배지를 본 발명의 무혈청 배지로 교환할 경우 비슷한 바이러스 역가를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 상기에서 실시한 세포유리 바이러스 및 세포친화 바이러스의 역가 결과를 이용해 비율을 계산해 본 결과, 10% 혈청 배지나 무혈청 배지에서의 세포유리 바이러스와 세포친화 바이러스의 역가 비율은 바이러스 역가(도 6)와 비슷했지만 세포친화 바이러스 100개당 얻어지는 세포유리 바이러스는 약 5개 정도로 매우 낮았다(도 7). 상기 결과로부터, 세포유리 바이러스를 얻는 방법의 개선이 필요함을알 수 있었다.
<실시예 4> 무혈청 배지에서 성장한 세포에서의 바이러스 역가 분석
<4-1> 바이러스 역가 분석
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 혈청 배양으로 성장한 MRC-5 세포를 이용해 바이러스 역가를 분석한 것에 더하여 무혈청 배양으로 성장된 MRC-5 세포에 무혈청 배지, 2% 혈청배지 및 10% 혈청배지를 사용하여 수두 바이러스를 감염시킨 후 바이러스의 역가를 비교하고자 하였다. 구체적으로, 무혈청 배지(표 3참조)에 배양한 MRC-5 세포를 3 ×104세포수/㎠ 농도로 T-25 플라스크에 세포를 접종하고 상기 무혈청 배지, 2% 혈청 배지 및 10% 혈청 배지를 첨가하여 50% 세포 병변 효과를 보이는 수두 바이러스를 0.2 moi의 감염비율로 감염시켜 35℃ CO2배양기에서 4일간 배양한 후 바이러스 역가를 비교하였다.
그 결과, 무혈청 배지에서 성장한 MRC-5 세포에 2% 혈청, 10% 혈청 및 무혈청 배지를 넣어 바이러스를 감염시켜 배양한 경우 바이러스 감염에 의한 세포 병변 효과 발생은 혈청배지에서 성장한 MRC-5 세포에 바이러스를 감염시킬 때 보다 빨리 나타났으며 세포 병변 효과 발생 정도는 배양 기간이 진행됨에 따라 발생이 급속하게 진행되었다. 2% 혈청배지와 10% 혈청배지의 차이는 거의 없었으며 무혈청 배지와도 세포 병변 효과 발생 정도는 차이를 거의 보이지 않았다. 4일째는 세포 병변효과가 모두 100%로 나타났으며 바이러스 감염된 세포가 플라스크에서 탈착되는 현상을 보였다. 이것은 실제적으로 바이러스 역가가 떨어지는 것을 의미하는 것으로도 6과 같은 결과를 보였으며, 세포 병변 효과가 100% 정도 되면 바이러스에 감염된 세포가 파쇄되거나 활성을 잃게되어 수두바이러스도 감염력 있는 바이러스 역가가 떨어지는 경향을 보였다(도 8).
<4-2> 세포친화 바이러스 및 세포유리 바이러스 역가 분석
본 발명자들은 상기 실시예 <4-1>의 방법으로 바이러스 감염을 한뒤 세포친화 바이러스 역가를 조사하였다.
그 결과, 무혈청 배지에서 배양된 MRC-5 세포에 무혈청 배지를 넣고 바이러스를 감염시킨 경우, 세포친화 바이러스 역가는 대조구인 10% 혈청배지에 비하여 10% 이상 낮은 역가를 보였으며, 2% 혈청배지을 사용한 배양과는 유사한 바이러스 역가를 보였으나 혈청배지에서 배양된 세포에 바이러스를 감염시켜 조사한도 6의 결과와 비교한다면 바이러스 역가가 떨어짐을 알 수 있었다. 또한, 세포친화 바이러스 역가는 바이러스 감염 후 2일째에 가장 높았으며 배양기간이 길어질수록 바이러스 역가가 떨어지는 경향을 보였다(도 9a). 이는도 6과 유사한 경향이나 보다 빨리 역가가 떨어지는 것이다. 이러한 결과는 혈청성분에 의한 세포 부착력이 보다 적었기 때문이라 할 수 있으며, 또한 바이러스 역가가 세포 병변 효과와 관련이 있기 때문이라고 할 수 있다.
또한, 상기 방법으로 바이러스 감염된 세포를 감염세포 세척액으로 세척한 후 0.05% EDTA로 세포를 플라스크에서 탈착시키고 세포를 수확한 후, 1500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 버리고, 세포침전은 초음파 파쇄용 안정제에 잘 부유하여 초음파 파쇄한 후의 세포유리 바이러스의 역가를 비교하였다.
그 결과, 무혈청 배지에서의 세포유리 바이러스의 역가는 혈청배지에서의 세포유리 바이러스의 역가에 비해 10% 이하의 역가 차이를 보였다(도 9b). 바이러스 역가에서의 10% 전후는 큰 의미가 없으므로, 상기 결과를 토대로 할 때 본 발명의 무혈청 배지는 혈청배지를 대체하기에 충분하다고 할 수 있다. 즉, 기존 수두 바이러스 백신을 생산하는데 사용되는 혈청배지를 이용한 바이러스 배양을 본 발명의 무혈청 배지로 교환할 경우 비슷한 바이러스 역가를 얻을 수 있음을 보여주는 결과라 할 수 있다.
또한, 상기에서 실시한 세포유리 바이러스와 세포친화 바이러스의 역가 비율을 계산한 결과, 혈청배지에서 배양한 세포에서의 세포유리 바이러스 및 세포친화 바이러스의 역가 비교 곡선(도 7)과는 다소 다른 곡선을 보였으나 세포친화 바이러스에 대한 세포유리 바이러스의 비율(CFV/CAV)은 유사한 값을 보였으며, 10% 혈청배지나 무혈청 배지에서는 세포친화 바이러스 100개 당 얻어지는 세포유리 바이러스는 약 4 내지 5개 정도로 매우 낮음을 보였다(도 10).
<실시예 5> 바이러스 생산용 무혈청 배지의 제조
본 발명자들은 상기에서 세포의 성장 및 바이러스 생산 수율이 높은 것을 확인한 상기 무혈청 배지를 산업화하고 대량생산하기 위해 시제품을 제조하고자 하였다. 구체적으로, 상기의 결과를 바탕으로 조성화된 무혈청 배지에서의 수두 바이러스 안정성을 증대하기 위하여 식물 유래 단백질 하이드롤리세이트의 농도를 최적화하고, 세포 부착성을 상승시키기 위한 부착성 인자 및 성장 인자의 농도를 증가시키고, 각 구성 성분을 최적화하였다. 또한, 생산 공정 및 각 성분의 원료에 대한 검증 자료 구축을 통하여 산업화에의 적용 가능성을 높이고, 무혈청 배지를 액상으로 자동화하는 생산 공정기술, 공정의 제어기술, 유효성 검증기술 및 제품화의 전반적 공정체계를 확립하여 비동물 유래 성분으로 구성된 수두 바이러스 백신 생산용 무혈청 배지를 제조하고 이를 'SM 004-01'라 명명하였다. 상기 배지 조성을 기초로 부착성을 증대시키기 위하여 단백질을 미량 첨가하여 조성화하고 상기 수두 바이러스 이외의 바이러스를 생산하기 위한 무혈청 배지를 제조하였으며, 이를 'SM 003-01' 및 'SM 003-02'라 명명하였다.
상기 SM 003-01은 SM 004-01 배지에 트랜스페린(transferrin)을 0.1 내지 0.3 ㎎/ℓ를 첨가하여 제조하고 SM 003-02는 SM 004-01 배지에 트랜스페린을 0.1 내지 0.3 ㎎/ℓ, BSA를 0.2 내지 0.5 g/ℓ첨가하여 제조하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 비동물 유래의 성분으로만 조성된 본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 동물 세포를 배양하면 고품질의 인체 수두 바이러스 백신을고수율로 제조할 수 있으므로 인체용으로 사용하기에 적합한 의약품을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 비동물 유래의 배지 성분으로 페릭시트레이트(Ferric citrate)를 포함하고, 동물 유래의 혈청 성분을 대체하여 하이펩(HyPep) 및 소이프로틴 하이드롤리세이트(Soyprotein hydrolysate)를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 페릭시트레이트는 공업적으로 합성한 성분이고, 하이펩은 밀단백질 유래의 성분이며, 소이프로틴 하이드롤리세이트는 콩단백질 유래의 성분인 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  3. 제 1항에 있어서, 페릭 시트레이트는 10 내지 50 ㎎/ℓ, 하이펩은 2 내지 3 g/ℓ 및 소이프로틴 하이드롤리세이트는 84 ㎎/ℓ를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  4. 제 1항에 있어서, 추가로 아미노산류, 비타민류, 무기염류, 기타 성분 및 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분을 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 아미노산류로는 MEM 비필수 아미노산 및 L-글루타민, 비타민류로는 비타민 B12, 무기염류로는 트레이스 성분(CuSO4·5H2O, Fe(NO3)3·9H2O, ZnSO4), 포스포 에놀 피루베이트(Phospho enol pyruvate), 모노에탄올아민(Momoethanolamine), 소듐 셀레니트(Sodium selenite) 및 소듐 바이카보네이트(Sodium bicarbonate), 기타 성분으로는 D-글루코스, 리놀레익산(Linoleic acid), 리포익산(Lipoic acid), 소듐 피루베이트(Sodium pyruvate), 하이폭산틴 나트륨(Hypoxantine ·Na), 퓨트레신 하이드로클로라이드(Putrescine ·HCl) 및 폴리아민 용액(Polyamine solution)을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 동물 유래의 혈청을 대체하는 성분으로는 인슐린(Insulin) 및 재조합 인간 섬유아세포성장인자(Recombinant human fibroblast growth factor)를 포함하는 성장인자, 지방산 용액(Fatty acid solution)을 포함하는 지방산류인 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  7. 제 5항 내지 제 6항에 있어서, MEM 비필수 아미노산은 10 ㎖/ℓ, L-글루타민은 584 ㎎/ℓ, 비타민 B12는 3 내지 10 ㎎/ℓ, 트레이스 성분은 0.1 ㎖/ℓ, 포스포 에놀 피루베이트는 1 내지 5 ㎎/ℓ, 모노에탄올아민은 5 내지 10 mM/ℓ, 소듐 셀레니트는 0.0001 내지 0.005 ㎎/ℓ, 소듐 바이카보네이트는 1600 ㎎/ℓ, D-글루코스는 4500 ㎎/ℓ, 리놀레익 산은 0.35 내지 1 ㎎/ℓ, 리포익산은 15 내지 25 ㎎/ℓ, 소듐 피루베이트는 110 내지 220 ㎎/ℓ, 하이폭산틴 나트륨은 2 내지 4 μM/ℓ, 퓨트레신 하이드로클로라이드는 116 ㎎/ℓ, 폴리아민 용액은 0.5 ㎖/ℓ, 인슐린은 2 내지 10 ㎎/ℓ, 재조합 인간 섬유아세포성장인자는 1 내지 2 ㎍/ℓ 및 지방산 용액은 0.25 내지 0.5 ㎖/ℓ를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 동물세포는 사람 폐세포인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.
  9. 제 1항의 동물세포 배양용 무혈청 배지에 동물세포를 배양한 뒤 바이러스를감염시켜 이로부터 바이러스를 수득하거나, 바이러스가 감염된 세포를 배양하여 이로부터 바이러스를 수득하는 것을 특징으로 하는 바이러스 백신의 제조 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 바이러스 백신은 인체용 수두 바이러스 백신인 것을 특징으로 하는 바이러스 백신의 제조 방법.
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