CN103180434A - 用于人多能细胞培养的简化基础培养基 - Google Patents
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Abstract
描述了支持多能干细胞活力、增殖、克隆和衍生的完全限定培养基,以及包括这些培养基的方法和组合物。还描述了用于在限定的、无异源条件下,从成熟个体衍生iPS细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
不适用。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明受到政府支持,在国立卫生研究院授予的ES017166支持下完成。政府在本发明中有一定权利。
背景技术
多能细胞,例如胚胎干(ES)细胞和诱导性多能干(iPS)细胞,具有分化为所有三种原胚层细胞的潜力(Thomson等,Science282,1145-1147(1998))。已证实多能细胞的巨大发展潜力可用于基础研究和临床应用。人多能细胞培养的许多基础方法,例如生长培养基、铺板和其它条件,已得到开发与改进(Ludwig等,Nat.Biotechnol24,185-187(2006);Ludwig等,Nat.Methods3,637-646(2006))。例如,当在含有胎牛血清(FBS)的培养基中,在鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonicfibroblast,MEF)饲养细胞上起始培养人ES细胞时,现可获得完全限定培养基(fullydefined media)和限定的蛋白质基质(Ludwig等,Nat.Biotechnol24,185-187(2006))。
在过去的十年,多能细胞培养方法有显著进展。开发了若干生长培养基,其为多能细胞的生存和扩增提供基础营养物质和生长因子,并直接决定细胞如何生长与分化。TeSRTM是首批限定培养基中的一种,其在无饲养细胞或条件培养基时,支持多能细胞经多次培养传代仍保持在未分化状态(Ludwig等,Nat.Methods3,637-646(2006);美国专利号7,449,334,各文件通过引用纳入本文并如其完整形式)。TeSRTM除本身包含52种成分的基础培养基DMEM/F12外,还包含18种成分(表1)。
可用于多能细胞培养的不同生长培养基的多样性造成了研究结果不一致。现用于多能细胞衍生和生长的培养基(包括完全限定培养基)含有会以不同方式影响多能细胞的成分。在本文描述的本发明之前,仍然未知各培养基成分在细胞培养中如何(单独地还是与其它成分联合)影响不同多能细胞的功能,如活力、多能性或分化。
例如,在大多数培养基中含量最丰富的蛋白质——白蛋白,是一种脂质载体,并且同样可以通过其联合的脂质来影响多能性的分化或保持。白蛋白及其联合的脂质的质量决定它是否能用于人多能细胞培养。然而,白蛋白的质量随其来源而定,差异很大,甚至产自重组遗传材料时差异也很大,造成在不同等效实验条件下进行的实验之间的差异。同样,虽然可获得克隆的人血清白蛋白,但由于其价格相对昂贵而很少用于常规实验。
从培养基中去除白蛋白的努力已被证实是不成功的。去除白蛋白或TeSR中存在的任何其它生长因子都会导致人ESC培养性能显著下降,例如细胞活力、增殖和多能性的减少(Ludwig等,Nat.Biotechnol24,185-187(2006))。
为充分开发多能细胞用于药物发现、测试和移植治疗的潜力,需要使这些细胞在完全限定且理想的无异源条件下衍生和生长。因此,本领域中存在对不含引起不一致性的成分的培养基的未被满足的需求,以保持对多能细胞培养条件的控制。本技术领域中特别需要多能细胞培养基,其仅包含支持对特定培养目标而言有重要性的多能细胞功能的那些成分。
简述
本发明一般涉及用于衍生和培养多能细胞的培养基、组合物和方法,更具体地涉及用于多能细胞的完全限定培养基。
本发明的第一方面概括为支持多能细胞的活力、生长和多能性的无白蛋白培养基。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基包含硒。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基包含NODAL。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基包含转铁蛋白。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基包含转化生长因子-β(TGF-β)。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素和成纤维细胞生长因子(FGF),各所述成分的量足以支持多能干细胞的活力。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞的增殖。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基支持多能细胞在传代、冷冻、增殖、多能性、衍生和克隆化后的存活。
在所述第一方面的一些实施方式中,所述培养基是无异源的。
本发明的第二方面概括为用于在限定培养基中培养多能干细胞的方法。在所述第二方面的一些实施方式中,用于培养多能细胞的所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素和FGF,各所述成分的量足以支持多能细胞的活力。在所述第二方面的一些实施方式中,用于培养多能细胞的所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞的增殖。在所述第二方面的一些实施方式中,所述培养基包含支持多能细胞的扩大生长、多能性、克隆化、冷冻或衍生的限定的因子。在所述第二方面的一些实施方式中,所述用于培养多能细胞的培养基是无异源的。
本发明的第三方面针对在基本不含β-巯基乙醇和白蛋白的培养基中培养多能细胞的体外细胞培养组合物。在所述第三方面的一些实施方式中,所述培养组合物不含成纤维细胞饲养细胞、条件培养基和异源污染物。
本发明的第四方面概括为用于在完全限定的条件下从成熟个体衍生iPS细胞的方法。所述方法包括以下步骤:在培养基中培养来自成熟个体的体细胞,所述培养基包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素和FGF,所述成分的量皆足以保持活力,以及在限定条件(例如用来衍生iPS细胞的条件)中重编程所述细胞。
在所述第四方面的一些实施方式中,所述培养基在部分或全部所述重编程步骤中包含TGF-β。
在所述第四方面的一些实施方式中,所述培养基包含丁酸盐。
在所述第四方面的一些实施方式中,所述培养基包含氢化可的松。
在所述第四方面的一些实施方式中,所述培养基是无异源的。
本发明的第五方面概括为用于在无白蛋白培养基中克隆多能干细胞的方法。所述方法包括以下步骤:将多能干细胞以克隆密度在支持多能干细胞克隆化的无白蛋白培养基中铺板。
在所述第五方面的一些实施方式中,所述培养基包含ROCK抑制剂。
在所述第五方面的一些实施方式中,所述培养基包含肌球蛋白抑素(blebbistatin)。
在所述第五方面的一些实施方式中,所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞的克隆化。
本发明的第六方面概括为在无白蛋白培养基中冻存保存多能干细胞的方法。所述方法包括以下步骤:在无白蛋白培养基中冷冻多能干细胞。
在所述第六方面的一些实施方式中,所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、TGF-β和NODAL二者之一、以及二甲亚砜(DMSO)。
本发明的第七方面概括为在无白蛋白条件下衍生的iPS细胞。在无白蛋白存在时衍生的iPS细胞不受内源白蛋白的污染。
本文中描述的方法和组合物可用于各种应用以衍生、培养和使用多能细胞。本发明的一个目的是为多能细胞限定短期和长期培养条件,所述多能细胞受限于支持所需培养目标的因子。
本发明的另一个目的是为多能细胞提供培养条件,在所述培养条件下,处于未分化状态的培养细胞的百分比最大化。
本发明的另一个目的是提供培养基,所述培养基可作为必要平台用以检测各种条件如何影响多能细胞,并用于比较先前报道的在不同培养基背景下的实验。
本发明的这些及其它特征、目的和优势将从以下的说明中得到更好的理解。在该说明中,以附图作为参考,这些附图是本文的一部分,这一部分仅以说明方式呈现,而并非对本发明的限制或者实施方式。优选实施方式的说明并非限制本发明以概括所有变化形式、等价形式和可选形式。因此,应参考本文列举的权利要求来理解本发明的范围。
附图简要说明
考虑以下详细描述将更好地理解本发明,并且除以上所述之外的特征、方面和优势将会更加明显。所述详细的说明参考以下附图,其中:
图1A-E显示在培养中使人ES细胞存活和自我更新的培养基成分。图1A显示铺板在不同培养基中的个体化细胞的24小时存活指数。培养基缩写列于表1中。胰岛素和成纤维细胞生长因子(IF)、牛血清白蛋白(BSA)、β-巯基乙醇(BME)的存在以“+”表示,不存在以“-”表示。图1B显示铺板在不同培养基中的个体化细胞的24小时或96小时存活指数。胰岛素和成纤维生长因子(FGF)的添加以“+”表示,去除以“-”表示。图1C显示培养在有维生素C的TeSRTM培养基(TeSR)、无维生素C的TeSRTM培养基(TeSRTM-LAA)或DF5培养基中的个体化细胞的24小时或129小时存活指数。图1D显示各在DF5、添加硒的DF5(DF5+硒)、DF12或已去除硒的DF12(DF12-硒)中传三代后的细胞增殖。图1E显示十二种不同基础培养基的对比分析。
图2A-F显示人ES细胞和iPS细胞使用DF5S的培养条件的优化。图2A显示在DF5S(下图)或TeSRTM(上图)中以低密度(约1,500个细胞/cm2)接种,并于不同O2和CO2浓度(O15C5:15%O2和5%CO2;O15C10:15%O2和10%CO2;O5C10:5%O2和10%CO2)培养的个体化细胞的存活指数。在24小时和124小时检测细胞存活。图2B显示培养在存在小分子HA100(+HA100)或不存在小分子HA100(CM100:含100ng/ml FGF的条件培养基)的不同培养基中的H1细胞的克隆率(cloningefficiency)。图2C显示不同培养基中H1细胞和衍生自包皮成纤维细胞的iPS细胞的克隆率。图2D显示不同培养基中衍生自包皮成纤维细胞的iPS细胞的克隆率。DF5StrFe代表其中加入了全转铁蛋白的DF5S培养基。图2E显示在存在HA100(10μM,24小时)、肌球蛋白抑素(10μM,4小时)、或Y27632(10μM,24小时)的不同培养基中培养的H1细胞的克隆率,与不存在这些因子(对照)时的克隆率做比较。星号代表p<0.05。图2F显示在条件培养基(CM)、含有ROCK抑制剂(HA100)的CM、含有ROCK抑制剂的TeSR和含有ROCK抑制剂的E8中,在含氧量正常(深灰柱)和低氧(浅灰柱)条件中的H1细胞的克隆率。误差柱代表均值的标准误差;星号代表p<0.05。
图3A-B显示补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸、FGF2和TGF-β或NODAL的DMEM/F12(在本文中分别称为“E8(TGF-β)”和“E8(NODAL)”)中的多能细胞生长和基因表达。图3A显示在TeSRTM(深灰线)或E8(TGF-β)(浅灰线)中保持的H1ES细胞(上图)和iPS细胞(下图)的倍数扩增。图3B显示在E8(TGF-β)中生长的H1ES细胞和在TeSRTM中生长的H1ES细胞的全基因表达。通过用伊鲁米那基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)GAIIX(全基因表达相关系数R=0.954(斯皮尔曼相关(Spearman Correlation)))进行RNA-测序,分析在TeSR或E8(TGFβ)培养基中保持三代的H1细胞的RNA。
图4A-F显示在多种限定条件下的iPS细胞衍生。图4A显示添加了各种成纤维细胞生长因子(FGF)的基于DF5SFe培养基中的包皮成纤维细胞增殖,与在含有FBS的培养基中的增殖做比较。图4B显示补充了氢化可的松的不同培养基中的成纤维细胞生长。图4C显示多能性标记物OCT4(左图)和SSEA4(右图)的表达。图4D显示由包皮成纤维细胞、hES细胞、在饲养细胞上衍生的iPS细胞(iPS细胞(饲养细胞))以及在E8培养基中衍生的iPS细胞(iPS细胞(E8))的所选基因表达。在RNA分析之前,除了成纤维细胞被保持在含有氢化可的松的E8中,所有细胞都保持在E8(TGFβ)培养基中。图4E显示在E8(TGFβ)培养基中衍生的人ES和iPS细胞的全基因表达(R=0.955)。图4F是在MEF上衍生的iPS细胞和在E8(TGFβ)培养基中衍生的iPS细胞的全基因表达。
图5A-C显示用于iPS细胞衍生的培养基的改进。图5A显示补充了TGF-β、氢化可的松、TGF-β和氢化可的松、或TGF-β和氢化可的松但不含FGF的DF5SFe培养基中的包皮(深灰柱)和PRPF8-2成熟成纤维细胞(浅灰柱)增殖。图5B显示TGF-β和丁酸盐对包皮成纤维细胞重编程的影响。在重编程转染开始后的四~五周,对转化细胞和真iPS细胞的克隆数进行评分,并计算iPS克隆与非iPS细胞克隆的比率。
图6A-B显示在未经二次传代的完全限定条件下,从成熟成纤维细胞衍生iPS细胞。图6A显示重编程方案的一个示例。图6B显示通过流式细胞术分析在补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸、FGF2以及TGF-β或NODAL(“E8”)的DMEM/F12传代20次维持的iPSC细胞系所测定的多能性标记物OCT4和SSEA4的表达。阴影峰:由OCT4(左)和SSEA4(右)特异性抗体染色;非阴影峰:小鼠IgG对照抗体。
图7A-C显示不同培养基中的人成纤维细胞重编程效率。图7A显示使用小鼠成纤维细胞饲养细胞(MEF)或在基于E8的培养基中经重编程处理的每80,000个成纤维细胞的iPS细胞克隆数。为提高效率,向两种条件中都添加了100μM丁酸钠。图7B显示在TeSRTM中或在基于E8的培养基中经重编程处理的每80,000个成纤维细胞的iPS细胞克隆数。图7C显示与TGF-β和丁酸盐的接触时间对完全限定条件下的包皮成纤维细胞重编程效率的影响。成纤维细胞在补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸和FGF2的DMEM/F12(E8无TGF-β)或在E8中(存在或不存在100μM丁酸盐)重编程。在重编程30天后检测所有条件下的重编程效率。星号代表p<0.05。
由于本发明易受不同变化和选择形式的影响,因此通过附图中实施例的方式显示示例性实施方式,并在本文中详细描述。但是应理解,对示例性实施方式的说明不是为了将本发明限制于所公开的特定形式,而与之相反,本发明适用于如所附权利要求所限定的所有落入本发明的精神和范围内的变化形式、等量形式和可选形式。
实施方式的示例性说明
本发明涉及本发明人的如下观察:曾被认为是培养多能细胞所必需的某些培养基成分可从多能细胞培养基配方中去除以达到某种的培养目的。
本文中所用术语“多能细胞(pluripotent cell)”指的是有能力分化为所有三种胚层细胞的细胞。多能细胞的例子包括胚胎干细胞和诱导性多能干(iPS)细胞。本文中所用术语“iPS细胞”指的是在遗传上与其各自分化的来源体细胞基本上相同,并显示与较高潜能细胞(比如本文所述的ES细胞)相似特性的细胞。所述细胞可通过非多能细胞(例如专能(multipotent)细胞或体细胞)的重编程而获得。
本发明涉及不含对特定培养目标非必需的因子的新培养基。培养目标的实施例包括但不限于:细胞存活、传代、增殖、多能性、克隆化和iPS细胞衍生。本发明特别涉及无白蛋白培养基。
澄清一点:“传代”和“克隆化”是不同的方法。“传代”描述的是将培养容器中已培养至一定密度的细胞分成团块,然后将其放入新培养容器中的过程。这些团块可包含任意数量的细胞,一般在100~1,000个细胞之间,其易起始在培养基中的生长。相反,“克隆化”指的是通过从单个个体ES细胞生长人ES细胞克隆来创建纯系集落。本文所用的术语“克隆率”指的是形成新细胞集落的个体化细胞的数量除以在培养物中铺板的个体化细胞的数量。克隆率根据培养条件的不同具有很大差异。例如,在限定且无异源的条件下,上的人ES细胞的克隆率很低(即少于约0.1%),而用成纤维细胞-条件培养基培养的这些细胞的克隆率尽管仍然低(即少于约2%),但就创建纯系ES细胞集落而言已足够高了。
现有所用的某些培养基成分会对培养的细胞或诱导性分化有害。例如,β-巯基乙醇会损伤或甚至杀死培养的多能细胞。血清培养基添加剂,如牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(FCS),会诱导培养的多能细胞分化。市售可得的血清成分在其组成上也可有显著差异(甚至当其由同一来源供应),引起不可预期的培养可变性。本文所述的培养基基本不含在大多数传统多能细胞培养基中存在的损伤性、有差异、不确定的因子。所公开的培养基已成功用于各种培养目的,比如支持短期多能细胞活力(例如24小时)、短期增殖(例如4~5天)、在延长的培养周期(例如在3个月内传代多于25次)中维持多能细胞以及用慢病毒和附加型载体从胎儿和成人成纤维细胞衍生iPS细胞。
开发了为某些细胞培养目的而特别定制的新型最简培养基。测试单一或联合的各种培养基成分,例如盐、维生素、葡萄糖源、矿物质和氨基酸,以测定它们对于活力、增殖或多能性的单独影响。开发了新的存活分析方法,并将其用于测定哪些成分对解离(dissociation)后多能细胞的存活是必需的。测试了新型培养基支持增殖和保持多能性的能力。这些培养基也用于克隆分析,以测定各培养基如何影响单个细胞及其克隆率。表1列出了本文所述的各新型培养基的完整成分列表(浅色和深色阴影区域代表该培养基中存在该成分,格纹区域表示可互换的成分,无色区域表示该培养基中不存在该成分)。
表1.培养基成分
本文所述的各种培养基可由所述基础成分制备。或者,本领域技术人员理解使用基础培养基作为初始原料来制备所公开的新型培养基的有利功效。本文中所用术语“基础培养基”指的是支持不需特殊培养基添加剂的某些单细胞生物体和细胞生长的培养基。本领域已知典型基础培养基的成分,其包括:盐、氨基酸、维生素和碳源(例如葡萄糖)。也可包括不改变所述培养基基础特性但是另外所需的其它成分,例如pH指示剂酚红。例如,达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle medium):营养混合物(Nutrient Mixture)F-12(DMEM/F12)是制备用于哺乳动物细胞培养的合适生长培养基的基础培养基。DMEM/F12的完整成分列表列于表2中。
表2.DMEM:F-12培养基配方(ATCC目录编号30-2006)。
除非另外定义,本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同。尽管本发明的实行或测试可使用与本文所述的方法和材料相似或相等的任何方法和材料,但仍优选本文中所述的方法和材料。
在所述实施方式的说明和本发明的权利要求中,将根据以下列出的定义使用以下术语。
本文中所用术语“约”指的是在所称浓度范围的5%之内或者在所称时间区间的5%之内。
本文中所用术语“基本无血清”指的是培养基不含血清或血清替代物,或者所述培养基基本不包含血清或血清替代物。例如,基本无血清的培养基可包含少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的血清,其中,仍观察到所述培养基的培养能力。
本文中所用术语“限定的培养培养基”或“限定培养基”指的是各培养基成分的特性和量是已知的。
本文中所用的术语“培养基基本由……组成”指的是培养基包含特定成分和可选的其它成分,所述其它成分本质上不影响其基础特性。
本文中所用术语“有效量”指的是足以引起如本发明所述的特定细胞效果的试剂的量。
本文中所用术语“活力”指的是处于能生存的状态。能生存的多能细胞贴附在细胞板表面,并且由于细胞膜无损而不被碘化丙啶染料染色。短期活力与细胞在培养中铺板后的最初24小时相关。细胞在该期间内通常不增殖。
本文中所用术语“短期生长”指的是细胞在培养中增殖4~5天。
本文中所用术语“延长的生长”指的是生长至少五代。通常,测试培养基支持多能细胞生长多于二十代(大约2~3个月)的能力。
本文中所用术语“长期培养”指的是多于15代(在培养中大约两个月)。
本文中所用术语“多能性”指的是细胞分化为所有三种胚层细胞的能力。
本文中所用术语“克隆化(cloning)”指的是从起始培养物开始细胞培养的过程,所述起始培养物理想上是单个多能细胞或至少非常少的细胞。允许未分化多能细胞克隆培养的培养条件可以是在正常多能细胞培养和增殖中所需的所有那些条件中最苛刻的条件。
本文中所用的术语“iPS细胞衍生”指的是重编程非多能细胞,使其成为多能性。
本文中所用的术语“无异源的”指的是细胞培养条件不含不同于所述培养细胞品种的任何细胞或细胞产物。
本文中所用的术语“含氧量正常的条件”指的是有约20%氧气的条件。
本文中所用的术语“低氧条件”指的是有少于约20%氧气(例如约5%氧气)的条件。
通过考虑以下非限制性的实施例将更充分地理解本发明。
实施例
实施例1:多能细胞存活测试。
在添加细胞前,向12孔板的各孔装入500μL各种测试培养基。用TrypLE(英杰公司(Invitrogen))解离贴壁多能细胞5分钟或直至其从培养板完全脱离。向所述培养物中添加等体积培养基以中和TrypLE。对细胞计数、清洗并用新鲜培养基以300,000~1,000,000个细胞/mL的浓度重悬。向所述12孔板的各孔中加入约100μL该细胞溶液,并在37°C,有5%O2和10%CO2的条件中孵育所述细胞。在不同时间点用0.4mL TrypLE再次解离细胞,然后,用等体积含有10%FBS的DMEM中和TrypLE。通过流式细胞仪对所述细胞计数。向各样品添加5000粒康特布莱特珠(count bright bead)作为内参(各样品计数约200粒珠子)。所有实验进行三次。
实施例2:用于存活与短期生长的生长因子。
除在基础培养基中存在的生长因子以外,TeSR培养基还包含六种生长因子:成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子β(TGF-β)、γ-氨基丁酸(GABA)、哌啶酸、氯化锂(LiCl)和胰岛素(表1)。配制含有所有TeSRTM成分但不含这六种生长因子的基础营养培养基(NM)。解离约2×105个H1ES细胞并在基质胶(Matrigel)上铺板。24h后测定存活指数。解离后,单一的NM无法支持细胞存活。向NM添加胰岛素所致的细胞存活与使用TeSRTM观察到的相似,但没有支持细胞生长(图1A)。添加胰岛素(20μg/ml)和FGF2(100ng/ml)在96h内支持细胞存活并且还引起细胞生长,这与使用TeSRTM培养基所观察到的结果相当(图1B)。因此,补充了FGF和胰岛素的NM支持人ES细胞培养。如上文所述补充的十二种不同基础营养培养基能够支持细胞存活和生长(图1E)。
实施例3:L-抗坏血酸支持短期增殖。
NM包含11种营养成分,即,DMEM/F12、微量元素B、微量元素C、L-抗坏血酸、硫胺素、硒、L-谷氨酰胺、BSA、BME、碳酸氢钠(NaHCO3)和转铁蛋白(表1)。DMEM/F12作为基础培养基而NaHCO3用于调整pH。为检测在胰岛素和FGF存在下,还有哪些其它营养成分是必需的,向DMEM/F12、NaHCO3、胰岛素和FGF单独地添加各个因子。没有一种营养因子是传代后的存活所必需的,但L-抗坏血酸(64mg/L)对传代后的细胞增殖是必需的(图1C)。被称为维生素C的L-抗坏血酸是主要的抗氧化剂和若干酶的辅助因子。羟脯氨酸能部分替代L-抗坏血酸。在DMEM/F12、NaHCO3、L-抗坏血酸、胰岛素和FGF(限定因子5,“DF5”表1)中铺板的人ES细胞保持与在TeSR中铺板的人ES细胞相似的形态。
实施例4:用于延长的传代的培养基成分。
DF5仅支持细胞的一次传代生长。在第二次传代后,细胞贴壁不佳且最终死亡(图1C)。细胞可在NM+胰岛素+FGF(数据未显示)和DF12中传代(图1D,表1),这表明在NM+胰岛素+FGF和DF12中存在一种或多种因子对延长的传代而言是重要的。向DF5中单独地添加在NM中存在的各种营养因子,以测定其支持多次传代后细胞扩增的能力。单独添加硒就足以支持经多次传代后的细胞增殖(图1D,DF5+硒,“DF5S”,表1)。
将DF5S用于扩增H1细胞。与在TeSRTM中生长的细胞相比,在DF5S中生长的细胞更倾向于分化。然而,H1细胞可生长数周(多于15代),在此期间所述细胞保持人ES细胞的形态和高水平的OCT4表达(图1E、图1F)。与在DF5S中培养的H1细胞相比,在添加了NODAL(100ng/mL)或TGF-β(2ng/mL)的DF5S中生长的H1细胞的表达了明显较高水平的NANOG mRNA。由多能性标记物OCT4的高表达确定了DF5S+NODAL也支持所述两种测试的人iPS细胞系的多能性。在含有NODAL或TGF-β的DF5S中生长的所有细胞(hES细胞和iPS细胞)在长期传代后皆保持正常核型。
实施例5:低氧改善细胞生长和克隆化。
与在TeSRTM中生长的细胞相比,H1细胞在DF5S培养基中生长更快(图1C和2A)。为最优化多能细胞生长条件,使细胞在有不同渗透压、pH、氧气水平和CO2水平的DF5S中生长。为增加测试的灵敏度,在各孔中仅接种5,000个细胞,并分析其存活(24h)和增殖(124h)。随O2和CO2水平的变化,观察到了最大的改善。普通的培养条件使用约15%的氧气和5%的CO2(O15C5)。较高的CO2通常造成24小时后的存活轻微提高。较低的氧气水平增加了DF5S和TeSRTM中的细胞生长。15%氧气和10%CO2(O15C10),以及5%氧气和10%CO2(O5C10)提高了细胞存活(图2A)。在较高O2水平(O15C5和O15C10)的细胞生长不旺盛,而其在较低氧气水平(O5C10)增殖(图2A)。与在TeSRTM中生长的那些细胞相比,DF5S中的细胞生长较快,而在5%氧气和10%CO2时生长最快(图2A)。与5%O2相比,将氧气水平进一步降低至2%减少了细胞生长。
为测定不同氧气和CO2浓度下的克隆率,向每孔中接种500个细胞。即便在低氧时,克隆率都过低(<2%)以致无法测定不同条件对克隆化的影响。使用已知用于提高克隆率的ROCK抑制剂——HA100来提高克隆率以供氧气和CO2浓度测试。使用已知用于克隆化的最好培养基——条件培养基(CM)作为对照。添加HA100明显促进了在O5C10和O15C5条件下CM中的克隆率,并且O5C10条件下的克隆率高于O15C5(图2B)。在两种条件下,在DF5S中的细胞的克隆率与在CM中的细胞的克隆率相当(图2B)。
由于低氧对细胞存活的积极效果,后续实施例中的一些在细胞保持在低密度时使用低氧条件。但是,当细胞不以低细胞密度培养时,实验在含氧量正常或低氧条件下进行(图2B)。
实施例6:改善的iPS细胞克隆率。
为测定DF5S如何影响克隆率,使两种iPS细胞系在DF5S中生长,并以克隆密度(12孔板的每孔中约500个细胞)在HA100存在下铺板。在DF5S中生长的iPS细胞的克隆率低于在TeSRTM或CM中生长的iPS细胞的克隆率(图2C),这表明提高克隆率的因子存在于TeSRTM培养基中,但不存在于DF5S中。为鉴别该因子,向DF5S单独添加单一的TeSRTM成分,并测试其对克隆率的影响。向DF5S添加全转铁蛋白(DF5SFe)造成与使用TeSRTM相当的克隆率(图2D)。转铁蛋白还引起DF5S培养基中的H1细胞的克隆率明显改善。
在补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸、FGF和TGF-β(或NODAL;“E8”)的DMEM/F12中,ROCK抑制剂HA100和Y27632,以及肌球蛋白抑素提高了H1细胞的克隆率(图2E),该克隆率通过添加转铁蛋白以及通过在低氧条件下培养进一步提高(图2F)。所述细胞在传代多于25代后仍保持正常核型。
实施例7:NODAL和TGF-β支持H1和iPS细胞多能性在无白蛋白培养基中的长
期保持。
如实施例3所述,人多能细胞,例如H1、H9和iPS细胞,可在DF5S中生长并传代超过15次,但有分化倾向,因此需要额外照料以维持在DF5S中的多能性。由于在TeSRTM中可更容易保持多能性,向H1细胞生长所用的DF5SFe中单独添加在TeSRTM中存在的生长因子,其中所述H1细胞预先培养在DF5S中且未分化,以此来鉴别支持长期多能性的因子。在细胞达到融合后约一天给细胞传代,促进细胞分化,并用通过流式细胞术评价的Oct4表达作为多能性指标。
在DF5SFe中生长的人多能细胞在临分化之前伸长并沿彼此排列,类似“纺锤”形。神经分化开始时通常会观察到该表型,其通常被TGF-β/BMP通路抑制。因此,测试所述TGF-β通路的重组蛋白支持长期多能性的能力。以TeSRTM浓度使用的补充了NODAL的DF5SFe(“E8(NODAL)”)维持了高Oct4表达。补充了TGF-β的DF5SFe(“E8(TGF-β)”)在以TeSRTM浓度(0.6ng/mL)使用时维持低水平Oct4表达,但在以较高浓度(1ng/mL)使用时能维持高Oct4表达。
人ES细胞系(例如H1和H9)的培养经历包括接触不同复合培养成分,例如FBS、饲养细胞和敲除血清替代品(knockout serum replacer)。接触这些成分能够可信地产生对这些成分的依赖性,因而改变对简化培养基的细胞应答。由于衍生条件较不复杂,培养经历可能对衍生自重编程体细胞的iPS细胞起到较小作用。因此,用在DF5SFe中生长的两种原始慢病毒iPS细胞系(Yu等,Science318:1917(2007))测试不同因子。从MEF板直接将细胞一次传代转移至DF5SFe培养基,然后将其传代至不同的生长因子条件。向DF5SFe添加TGF-β(2ng/mL)或NODAL(100ng/mL)(分别是“E8(TGF-β)”和“E8(NODAL)”)支持iPS细胞的长期多能性。也表达了多能性表面标记物SSEA4、SSEA3、Tra-1-60和Tra-1-81。正常核型的细胞连续维持了超过20代。所述细胞在被注射进入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠5~7周后能形成畸胎瘤。
E8(TGF-β)和E8(NODAL)支持所测试的每种多能细胞系的多能性,即,两种人ES细胞系(H1和H9)和五种iPSC细胞系在传代多于25次(约3个月)时没有分化迹象(图3)。在E8培养基中生长的H1ES细胞与在TeSRTM中生长的H1ES细胞相比具有相似的基因表达谱(图3B)。
实施例8:在无白蛋白培养基中的iPS细胞分化。
可用的重编程方案包括:在病毒转导或电穿孔后的最初数天内在FBS中孵育所述细胞,然后转移所述细胞至UM100(美国专利号7,439,064,其全文通过引用纳入本文)或CM。测试如上文实施例中所述的简化培养基支持重编程的能力。使用慢病毒或附加型载体并于起始两天在或不在含有FBS的培养基中培养,来自ES的体细胞可在DF5S培养基中有效地重编程。但是,使用Nanog、Oct4、Sox2和Lin28,DF5S不支持原代包皮细胞的重编程。DF5SFe支持包皮和成熟细胞在基质胶(Matrigel)或MEF上使用改良慢病毒处理的重编程(当所述细胞最初在含有FBS的培养基中孵育情况下)(Ebert等,Nature457(7227):277-280(2009),其全文通过引用纳入本文)。然而,DF5SFe与CM在支持重编程方面一样有效,最初接触FBS显示对重编程的重要性。
包皮细胞在DF5SFe中的生长明显慢于在FBS培养基中的生长。为确定能帮助原代包皮细胞生长的生长因子,测试了FBS中所包含的单一生长因子。生长因子的FGF家族有若干成员,其中的一种或多种常用于成纤维细胞培养。DF5SFe包含100ng/mL斑马鱼重组子FGF2。测试各FGF家族成员支持包皮细胞生长的能力。将包皮细胞等分加入培养板的孔中,并在不含FGF的DF5SFe中孵育24小时。以100ng/mL的浓度添加单一FGF类型,孵育96h。FGF1、zFGF2、FGF4、FGF6和FGF9对包皮细胞生长的支持最为有效,但其对细胞生长的支持都不及包含FBS的培养基对细胞生长的支持(图4A)。为鉴别非FGF家族成员生长因子对包皮细胞生长的促进能否与使用FBS所见结果相当,测试了若干已知的成纤维细胞生长促进因子。向DF5SFe加入用来替代FBS的氢化可的松(图4B)、其衍生物和地塞米松显著促进了细胞生长。DF5SFe+氢化可的松(“DF5SFeC”)也改善了iPS细胞的克隆率。
为了测定基于DF5S的培养基能否用于无病毒的iPS细胞衍生,在低氧条件下(O5C10)使用无病毒的附加型载体重编程包皮细胞(如Yu等,Science324:797(2009)中所描述,其全文通过引用纳入本文)。使用质粒组合物4号(pEP4EP2SCK2MEN2L和pEP4EO2SET2K,表3)、6号(pEP4EO2SEN2L、pEP4EO2SET2K和pEP4EO2SEM2K,表3)和19号(pEP4EO2SEN2K、pEP4EO2SET2K和pCEP4-M2L,表3),并在第二次传代后从106个细胞分离2个克隆。
表3重编程载体成分和载体组合物
将质粒组合物6号和19号用于所述重编程。为了促进质粒进入细胞核,将ENBA mRNA与质粒DNA一同进行电穿孔。转移约一百万个细胞至两块6孔板的DF5SFeC中,放置5天。然后,将培养基更换为DF5SFe,再放置18~25天。在不同时间点,以1:6的比率对所述孔中的一些孔内的细胞进行第二次传代。质粒组合物19号比质粒组合物6号产生更多集落,但它们中的大多数与典型的人ES细胞形态不相似。约25天后,两种质粒组合物的初始培养板上均出现了人ES细胞样集落,使用质粒组合物19号的每一百万个包皮细胞有估计24个重编程的细胞,使用质粒组合物6号的每一百万个包皮细胞有估计8个重编程的细胞。二次传代后,培养板上的人ES细胞样集落数量显著增加,各质粒组合物有估计>500个/一百万个包皮细胞。在第二次传代板上所述iPS细胞集落的增加可能归因于iPS细胞在初始培养板上的分裂。在一些情况中,初始培养板不具有与典型人ES细胞形态相似的任何集落,但在第二次传代后出现许多iPS细胞,这表明一些iPS细胞可能因为与体细胞混在一起而未能被辨识。
在DF5SFe中衍生的iPS细胞集落中的细胞传代仅两次后即开始分化。从所述初始培养板上挑取六个iPS细胞集落,并直接转移入含有Nodal的DF5SFeN(E8(NODAL))。这些细胞能在E8(Nodal)中保持多于15代,保持其ES细胞样形态与使用TeSRTM所观察到的结果相似。所述细胞具有正常核型,表达Oct4和SSEA4(图4C),并在注射入SCID小鼠后5~7周后形成畸胎瘤。
在E8培养基中也重编程了包皮成纤维细胞。在E8培养基中衍生的iPS细胞的全基因表达与H1细胞(图4D和E)或在饲养细胞上衍生的iPS细胞(图4D和F)的全基因表达相似。ES和iPS细胞中的多能性标记物均高表达,而成纤维细胞特异性标记物基因则不表达(图4D)。还能运用各种策略在E8培养基中衍生iPS细胞,例如,使用慢病毒或附加型载体。
实施例9:在无白蛋白培养基中从患者细胞衍生iPS细胞。
为了测定能否使用无病毒的附加型载体在简化培养基中重编程来自成人供者的细胞,用质粒组合物4号或6号与EBNA mRNA一同电穿孔患者细胞系OAT或PRPT8的两百万个细胞,并转移所述细胞至两块10cm板上。为使重编程最大化,在最初6天使用包含FBS的培养基。将细胞保持在O15C5以符合常规成熟细胞的维持条件。然后,将培养基更换为DF5SFe,再放置14~21天。在不同的时间点以1:2的比率对一块板上的细胞传代。相比于质粒组合物4号,质粒组合物6号产生更多集落(约5个/一百万个细胞),但所述细胞中的大多数的形态与典型的人ES细胞形态不类似。约22天后,在质粒组合物4号的初始培养板上出现了人ES细胞样集落。在使用质粒组合物6号,在第二次传代板上出现了更多人ES细胞样集落,每一百万个细胞估计有约40个集落。使用质粒组合物4号时没有产生iPS细胞。在初始培养板上,在其它稠密生存的细胞中间出现了iPS细胞集落,但其无法生长超出它们的边界。然而,在二次培养板上的集落扩大至适合于集落分离的大尺寸。挑取集落并将其直接转移至TeSRTM,32个挑取的集落存活并显示了ES细胞形态。遗传分析证实,这些集落衍生自所述OAT细胞系并显示正常核型。
为了改善成熟细胞的重编程效率,向所述重编程培养基添加TGF-β。iPS克隆没有显著增加,但集落的总数显著增加。在移除氢化可的松时从所述培养基移除TGF-β的时候,iPS细胞集落的数量显著增加,这表明TGF-β在该过程的最初几天内支持重编程。
许多看似非iPS克隆在二次传代后能产生iPS克隆,这表明iPS细胞衍生可能会受到周围细胞的抑制。测试若干试剂克服该效应的能力。丁酸盐改善重编程效率。向所述培养基加入TGF-β和丁酸盐时,观察到包皮细胞的重编程效率增长10倍(图5B)。TGF-β看来在重编程的早期阶段中展示了其积极效果,而丁酸盐在晚期阶段起积极作用。添加TGF-β导致重编程过程中集落数的增加,但是真正iPS细胞集落的数量仍保持在低水平。丁酸盐不增加集落数,但显著改善真正iPS细胞/非iPS细胞集落的比率(图5C)。
使用TGF-β和丁酸盐,在完全限定条件下使用附加型载体系统能够使来自成熟个体的体细胞成功重编程。从三种独立成熟体细胞系(OAT、GRC M1-29和PRPF8-2)衍生iPS细胞的效率如下,从1×106个PRPF8-2细胞衍生出1~100个iPS细胞,从100,000个GRC1-29细胞中衍生出1个iPS细胞。
实施例10:在完全限定条件下从成熟个体衍生iPS细胞。
从男性成人供者的皮肤获取活检物,用含有抗生素和抗真菌剂的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)清洗数次,并在2mL0.25%胰蛋白酶/EDTA(表4)或TrypLE选择液(TrypLE select)中于4°C过夜孵育。漂洗所述样品三次,在第二次漂洗后使用胰蛋白酶抑制剂(表4)。用无菌钳分离真皮和表皮。将所述真皮切成小片,并使其在0.75mL含限定酶的酶溶液(表4)中,在室温下(12孔或24孔板)孵育3小时。约35分钟后,组织结构开始崩解。添加含10μg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的等体积培养基,并用移液管吹打约10次以机械分解所述组织。在室温下以400g离心该样品10分钟,并用新鲜培养液/PVP清洗两次。弃去上清,用3mL完全培养基重悬沉淀物,并转移1mL细胞悬液至以3μg/孔玻连蛋白包被的6孔板的孔中。在5%CO2,37°C孵育所述培养板,并每天更换培养基。在更换所述培养基时,成纤维细胞贴附于所述培养板,而非贴壁细胞和碎片被去除。
表4.用于试样消化的试剂和方法
20天后,通过电穿孔将重编程质粒介导进入所述成纤维细胞。在接下来的25天内,出现多个iPS集落,挑取所述集落用于进一步分析。重编程效率为未经二次传代的1百万个电穿孔的成纤维细胞产生约10个。对iPS细胞进一步传代以分离无载体细胞系。
实施例11:在无白蛋白培养基中从未经二次传代的成人个体到iPS细胞的衍
化。
按照图6A中所示的总体方法在E8(补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸、FGF2和TGF-β(或NODAL)的DMEM/F12)中重编程成熟成纤维细胞。在E8中保持多于20次传代的重编程的iPS细胞系持续表达多能性标记物OCT4和SSEA4(图6B)。
与使用小鼠成纤维细胞饲养细胞(MEF)(图7A)或TeSRTM(图7B)的重编程效率相比,E8培养基显著提高了重编程效率。在TGF-β存在(E8)或TGF-β不存在(E8无TGF-β,即DF5SFe)时,丁酸盐(100μM)进一步提高重编程效率(图7C)。
实施例12:多能干细胞在无白蛋白培养基中的冻存。
基本如上所述,在6孔板中于E8培养基内培养多能细胞。从各孔吸出所述培养基,并用1.0mL EDTA/PBS(0.5mM EDTA的PBS溶液,渗透压340)清洗所述细胞两次。然后在37°C于EDTA/PBS内孵育所述细胞5分钟。移除PBS/EDTA,用1mLE8培养基迅速漂洗细胞。然后用等体积20%二甲亚砜(DMSO)和E8培养基(终浓度:10%DMSO的E8培养基溶液)重悬细胞,等份分装入冻存管,并用CRYOBOXTM在-80°C冷冻。然后,将所述细胞移至液氮罐。
结合目前考虑最实用并且最优化的实施方式描述本发明。但是,本发明通过说明方式提出,并不表示其受限于所述公开实施方式。因此,本领域的那些技术人员应认识到本发明旨在包含如附加权利要求所阐述的属于本发明精神和范围内的所有变化和可选的安排。
Claims (29)
1.一种无白蛋白培养基,所述培养基支持多能干细胞增殖。
2.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述培养基包含:
水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞增殖。
3.一种用于培养多能干细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
将多能干细胞置于基质上;以及
使所述细胞接触无白蛋白培养基,所述培养基支持多能干细胞增殖。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述培养基包含:
水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞增殖。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述基质包含层粘连蛋白。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述基质包含玻连蛋白。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,使所述细胞在低氧条件下接触所述培养基。
8.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述多能干细胞是胚胎干细胞。
9.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述多能干细胞是诱导性多能干细胞。
10.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述多能干细胞是人细胞。
11.一种用于克隆多能干细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
在无白蛋白培养基中以克隆密度将多能干细胞铺板,所述培养基支持多能干细胞克隆。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述培养基包含:
水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞克隆。
13.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述培养基还包含ROCK抑制剂。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述ROCK抑制剂选自HA100和Y27632。
15.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述培养基还包含肌球蛋白抑素。
16.一种冻存多能干细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
在无白蛋白培养基中冷冻多能干细胞。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述培养基包含:
水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞增殖。
18.一种用于在限定条件下衍生诱导性多能干(iPS)细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
在无白蛋白培养基中重编程体细胞,所述培养基支持体细胞的重编程以衍生iPS细胞。
19.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述培养基包含:
水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持iPS细胞衍生。
20.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述重编程步骤包括使所述细胞接触TGF-β5~10天。
21.如权利要求20所述的方法,其还包括以下步骤:
在5~10天后移除TGF-β;以及
使所述细胞接触培养基,所述培养基基本由以下成分组成:
水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒和转铁蛋白。
22.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述重编程步骤包括使所述细胞接触氢化可的松。
23.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述重编程步骤包括使所述细胞接触丁酸盐。
24.如权利要求18所述的方法,其特征在于,在无异源条件下衍生所述iPS细胞。
25.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述体细胞是成熟体细胞。
26.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述重编程步骤包括使用病毒载体。
27.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述重编程步骤包括使用附加型载体。
28.一种无白蛋白生长培养基,所述培养基支持多能干细胞的长期培养,所述培养基基本由以下成分组成:水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞的长期培养。
29.一种用于培养多能干细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
将多能干细胞置于基质上;以及
使所述细胞接触无白蛋白培养基,所述培养基基本由以下成分组成:
水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一,各所述成分的量足以支持多能干细胞的长期培养。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |