JP2009509514A - 改良された細胞培地 - Google Patents
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Abstract
Description
栄養培地は100g/l以下、好ましくは25g/l以下、さらに好ましくは5g/l以下、特に好ましくは1g/l以下、特に好ましくは0.1g/l以下のグルコースを含むことが好ましい。栄養培地はグルコースを含まないことが好ましい。
a)ホルモン及びその他の増殖因子、例えばIGF-1、インスリン、トランスフェリン、表皮増殖因子
b)塩類及び緩衝剤、例えばカルシウム、マグネシウム及びリン酸塩
c)ヌクレオシド及び塩基、例えばアデノシン、チミジン、ヒポキサンチン
d)タンパク質及び組織加水分解物。
細胞培養条件
細胞を液体窒素の気相中に保存した。1〜2個のアンプルを37℃に温めた栄養培地で解凍し、スピナーフラスコ、振とうフラスコ又はT形ボトルに移した。最初の2,3日の培養中に、クローンに応じて培地の取替えを行った。
接種後の栄養培地で、本発明に基づく物質の下記の最終濃度を得た。
コハク酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
リンゴ酸、栄養培地中の最終濃度1g/l
αケトグルタル酸塩、栄養培地中の最終濃度1g/l
フマル酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
酒石酸、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
アジピン酸、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
乳酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
オルニチン、栄養培地中の最終濃度1g/l
シトルリン、栄養培地中の最終濃度1g/l
ピルビン酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
接種後の栄養培地で、本発明に基づく物質の下記の最終濃度を得た。
コハク酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
リンゴ酸、栄養培地中の最終濃度1g/l
αケトグルタル酸塩、栄養培地中の最終濃度1g/l
フマル酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
酒石酸、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
アジピン酸、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
乳酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
オルニチン、栄養培地中の最終濃度1g/l
ピルビン酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
栄養培地(Sigma社の無血清、無タンパク質CHO培地 CR1020、ロット番号:64K2403)はグルコース濃度が4.7g/l、グルタミン濃度が0.7mMであった。使用した流加培地はHyQ社のものであった(R05.2サプリメント、カタログ番号:SH30584.04、ロット番号:APF21457G)。流加培地はグルタミンを含まなかった(表2)。
接種後の培地で、本発明に基づく物質の下記の最終濃度を得た。
対照、添加物なし
コハク酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
αケトグルタル酸塩、栄養培地中の最終濃度1g/l
乳酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
接種後の栄養培地で、本発明に基づく物質の下記の最終濃度を得た。
対照、添加物なし
コハク酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度1g/l
αケトグルタル酸塩、栄養培地中の最終濃度1g/l
乳酸ナトリウム、栄養培地中の最終濃度0.5g/l
市販の無グルコース、無グルタミン栄養培地を入手した。この培地に表6のように本発明に基づく物質を補充し、こうして最終的な栄養培地を用意した。表6に示す濃度は培地の各物質の最終濃度である。この栄養培地は本発明に基づく物質を含む無血清、無タンパク質、無ペプトン培地に相当する。従って細胞培養のための最終的な栄養培地は無グルコース、無グルタミンであり、ガラクトースと乳酸を含む。
第1の略語(MEL):使用した細胞の明細。これはMEL(metabolically engineered[代謝的に遺伝子操作された])又はSt(標準、野生型)のいずれかでありうる。
第2の略語(St):使用した基礎培地の明細。これはMEL(本発明に基づく基礎培地)又はSt(標準基礎培地)のいずれかでありうる。
第3の略語(MEL):使用した流加培地の明細。これはMEL(本発明に基づく流加培地)又はSt(標準流加培地)のいずれかでありうる。
この流加式実験のために次の培地組合せを使用した。
S1:MEL-MEL-MEL=代謝最適化細胞、本発明に基づく基礎培地、本発明に基づく流加培地
標準細胞(遺伝的に改変されていない野生型細胞)を次の培地組合せにより流加条件のもとでテストした。
S6:St-MEL-MEL=標準細胞(野生型細胞)、本発明に基づく基礎培地、本発明に基づく流加培地
S6:St-MEL-St=標準細胞(野生型細胞)、本発明に基づく基礎培地、標準流加培地
S2:MEL-MEL-St=代謝最適化細胞、本発明に基づく基礎培地、標準流加培地
この実験では、本発明に基づく2つの物質(乳酸塩及びコハク酸塩)を流加式実験で組み合わせた。この流加式実験のために次の栄養培地の組合せを使用した。
S5:MEL-MEL-MEL-S=代謝最適化細胞、乳酸塩及びコハク酸塩を含む本発明基礎培地、乳酸塩及びコハク酸塩を含む本発明流加培地
Claims (46)
- 栄養培地がクエン酸、コハク酸、リンゴ酸、αケトグルタル酸、フマル酸、オキサロ酢酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、酒石酸、アジピン酸、乳酸及びこれらの混合物、並びにこれらの酸の塩、誘導体又は複合体からなる群から選ばれた少なくとも1つの物質を含むことを特徴とする、細胞培養のための栄養培地。
- 栄養培地がコハク酸、リンゴ酸、αケトグルタル酸、フマル酸、オキサロ酢酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、酒石酸、アジピン酸、乳酸及びこれらの混合物、並びにこれらの酸の塩又は複合体からなる群から選ばれた少なくとも1つの物質を含むことを特徴とする、細胞培養のための栄養培地。
- 栄養培地が少なくとも1つの物質を0.03g/l以上の濃度で含む、請求項1又は2に記載の栄養培地。
- 栄養培地が乳酸及び/又は乳酸誘導体を含む、請求項1〜3のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が乳酸誘導体としてアラニン及び/又はアラニン含有ペプチドを含む、請求項1〜4のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が乳酸誘導体としてピルビン酸及び/又はピルビン酸誘導体を含む、請求項1〜5のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が少なくとも1つの炭水化物を含む、請求項1〜6のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 少なくとも1つの炭水化物がグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、リボース、グルコサミン、スクロース、ラクトース及びこれらの混合物からなる群から選ばれた、請求項7に記載の栄養培地。
- 栄養培地がガラクトースを含む、請求項1〜8のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が0.1g/l以上の濃度の炭水化物を含む、請求項1〜9のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が25g/l以下の濃度のグルコースを含む、請求項1〜10のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルコースを含まない、請求項1〜10のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルコースを含まず、栄養培地がグルタミン含有ペプチド、乳酸及びガラクトースを含む、請求項1〜12のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が8mmol/l未満の濃度のグルタミンを含む、請求項1〜13のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルタミンを含まない、請求項1〜13のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が少なくとも1つのグルタミン誘導体を含む、請求項1〜15のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルタミン誘導体を全濃度0.05g/l以上で含む、請求項16に記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルタミン誘導体を含まない、請求項1〜15のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がアスパラギンを含む、請求項1〜18のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が少なくとも1つのアスパラギン誘導体を含む、請求項1〜19のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルタミン酸を含む、請求項1〜20のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が少なくとも1つのグルタミン酸誘導体を含む、請求項1〜21のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルコース及びグルタミンを含まず、栄養培地が少なくとも0.05g/lの濃度のアスパラギンと、乳酸及びガラクトースとを含む、請求項1〜13のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地がグルコース及びグルタミンを含まず、栄養培地が少なくとも0.05g/lの濃度のグルタミン酸と、乳酸及びガラクトースとを含む、請求項1〜13のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が液体栄養培地である、請求項1〜24のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が240〜360mOsmol/kg H2Oの重量オスモル濃度を有する基礎培地である、請求項1〜25のいずれか1つに記載の栄養培地。
- 栄養培地が150〜1500mOsmol/kg H2Oの重量オスモル濃度を有する流加培地である、請求項1〜25のいずれか1つに記載の培地。
- 少なくとも1個の細胞を含む細胞培養物を培養するための請求項1〜27のいずれか1つに記載の栄養培地の使用。
- 細胞培養物を栄養培地に入れて培養し、栄養培地のpH値が、培養時間の少なくとも5分の1の間、pH7.2以上に塩基性であることを特徴とする、少なくとも1個の細胞を含む細胞培養物の培養方法。
- 細胞培養物を請求項1〜27のいずれか1つに記載の栄養培地に入れて培養することを特徴とする、少なくとも1個の細胞を含む細胞培養物の培養方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項29又は30に記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項29〜31のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項29又は30に記載の方法。
- 培養の終了時の栄養培地のpH値が7.2以上に塩基性である、請求項29〜33のいずれか1つに記載の方法。
- 培養時間の少なくとも5分の1の間、培地のpH値がpH7.2以上に塩基性である、請求項30〜34のいずれか1つに記載の方法。
- 培養過程の間、栄養培地のpH値がpH7.2以上に塩基性である、請求項29〜35のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1個の細胞を含む細胞培養物で、請求項29〜36のいずれか1つに基づき細胞を培養して、細胞培養物及び/又は栄養培地から生物学的産物を得ることを特徴とする、生物学的産物の製造方法。
- 生物学的産物が少なくとも1つのポリペプチド、少なくとも1つのタンパク質、少なくとも1つのウイルス成分、少なくとも1つのウイルス又はこれらの混合物から選ばれたものである、請求項37に記載の方法。
- 細胞集団から遺伝子改変細胞、特に代謝最適化細胞を選択するための方法であって、
a)細胞集団としての細胞培養物を、請求項1〜26のいずれか1つに記載の栄養培地中で、請求項29〜36のいずれか1つに基づき少なくとも1週間培養し、続いて
b)細胞をそこから単離する、
ことを特徴とする上記方法。 - 段階b)で単離した細胞を別の段階c)で新しい栄養培地に移す、請求項39に記載の方法。
- 段階c)で単離した細胞を増やす、請求項40に記載の方法。
- 単離した細胞を1継代以上にわたり継代培養する、請求項39〜41のいずれか1つに記載の方法。
- 単離した細胞を1:4より大きい分割比に達するまで継代培養する、請求項39〜41のいずれか1つに記載の方法。
- 請求項39〜43のいずれか1つに記載の方法で得られる、選択された細胞。
- 細胞の増殖率(μ)が24時間未満である、請求項44に記載の細胞。
- 請求項44又は45のいずれか1つに記載の細胞を含む細胞培養物又は細胞集団。
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