KR20100108424A - 개선된 배양 배지 첨가제 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

개선된 배양 배지 첨가제 및 이를 이용한 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20100108424A
KR20100108424A KR20107017385A KR20107017385A KR20100108424A KR 20100108424 A KR20100108424 A KR 20100108424A KR 20107017385 A KR20107017385 A KR 20107017385A KR 20107017385 A KR20107017385 A KR 20107017385A KR 20100108424 A KR20100108424 A KR 20100108424A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
culture
culture medium
iron
cells
medium
Prior art date
Application number
KR20107017385A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101594046B1 (ko
Inventor
올라프 크뤼거
케르스틴 욀러스
라르스 코베르
Original Assignee
첼카 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39271361&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20100108424(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 첼카 게엠베하 filed Critical 첼카 게엠베하
Publication of KR20100108424A publication Critical patent/KR20100108424A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101594046B1 publication Critical patent/KR101594046B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 일정 함량의 폴리아민 및 철을 포함하는 개선된 세포 배양 첨가제, 이를 함유하는 배지 및 이를 이용한 개선된 세포 성장, 세포 생존력 또는 세포 생산성을 위한 방법에 관련된다.

Description

개선된 배양 배지 첨가제 및 이를 이용한 방법{IMPROVED CULTURE MEDIA ADDITIVE AND PROCESS FOR USING IT}
본 발명은 일정 함량의 폴리아민 및 철을 포함하는 개선된 세포 배양 첨가제, 이를 함유하는 배지 및 이를 이용한 개선된 세포 성장, 세포 생존력 또는 세포 생산성을 위한 방법에 관련된다.
세포 배양 방법 개발은 특히 전체 생세포 농도(IVC)를 증가시키고 세포 산물 형성을 증가시키는 것을 목표로 한다. IVC는 산물 농도와 직접 서로 관련된다(Renard, J. M. 등, Biotechnology Letters, 1988, 10(2): 91-96). IVC는 최대 생세포 농도를 증가시키거나 배양 기간을 연장시킴으로써 증가될 수 있다. 세포 생존력이 높게 유지될 경우, 예를 들어 정체 성장 단계가 연장될 수 있을 경우, 공정 시간은 연장될 수 있다. 양호한 세포 배양 배지 또는 양호한 세포 배양 방법은 전체 공정 중에 모든 필요한 기질을 세포에 제공할 것이고, 이에 따라 양호한 세포 성장, 생존력 또는 산물 형성을 유도한다.
폴리아민, 예를 들어 스페르미딘(spermidine) 또는 스페르민(spermine)은 세포 성장 및 생산성에 필수적인 보편적인 세포 성분이다. 이에 불구하고, 스페르민은 혈청 함유 배지에서 부착 성장 BHK(아기 햄스터 신장) 세포에 독성을 나타내는 것으로 보고되었다(Brunton, V. G. 등, Biochem. J., 1991, 280: 193-198). 소 혈청 알부민 단편은 폴리아민, 특히 스페르민의 세포 독성을 가속화시킨다(Katsuta, H., Jpn J Exp Med., 1975, 45(5): 345-54). 스페르민의 농도를 증가시키면서(0 내지 100 μM, 최대 20.2 mg/ℓ) 10 μM 제2철(1.6 mg/ℓ)로 CHO(중국 햄스터 난소) 세포를 처리할 경우, 혈청 함유 배지에서 투여량-의존적 방식으로 생세포의 수가 감소한다(Gaboriau, F. 등, Biochemical Pharmacology, 2004, 67: 1629-1637). 소 혈청은 소 혈청 아민 산화 효소를 함유하는데, 이것은 폴리아민의 산화적 탈아미노 반응(deamination)을 촉매화한다. WO 98/08934는 0.9 내지 18.1 mg/ℓ, 특히 9.05 mg/ℓ 스페르민을 함유하는 무혈청 배지를 개시한다. 폴리아민의 형성된 산화 산물은 세포 독성의 원인이 된다(Averill-Bates 등, Arch Biochem Biophys., 1993, 300(1): 75-9). 폴리아민의 산화 산물은 또한 세포 성장의 음성 조절자로서 작용할 수 있다.
요컨대, 공개된 데이터는 폴리아민이 세포에 필수적임에도 불구하고, 이들이 포유류 세포에 독성을 나타내는 것을 증명한다. 따라서, 당업자는 세포 배양 배지에서 폴리아민이 아니라 푸트레신(putrescine)(디아민) 농도를 최적화하는데 초점을 맞추었다. 푸트레신은 폴리아민의 전구체이다. 푸트레신 함유 배지의 몇가지 예는 WO 2004/078955에 기술된다.
적어도 0.5 mg/ℓ의 폴리아민을 포함하는 무-올리고펩티드는 WO 2007/077217에서 세포 특이적 생산성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 가장 효율적인 아민은 푸트레신인 것으로 또한 증명되었다. 스페르민 농도를 2 mg/ℓ 이상 증가시키는 것은 세포 생산성을 현저하게 증가시키지는 못한다. 이 문헌은 또한 1.067 mg/ℓ 부가적인 Fe(Ⅱ)를 이용한 배지의 보충을 개시한다. 폴리아민 및 철의 상승 효과는 보이지 않는다.
WO 98/08934는 0.28 mg/ℓ 내지 1.1 mg/ℓ의 Fe2+ 및/또는 Fe3+를 함유하는 스페르민-함유 배지를 개시한다.
따라서, 개선된 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 생산성을 제공하는, 이들을 보충할 배양 배지 및 첨가제를 제공할 필요성이 여전히 남아 있다.
본 발명의 기초가 되는 기술적 과제는 상술한 불리함을 극복하고, 특히 증가된 IVC 및/또는 증가된 세포 산물 형성 내에서 세포 배양 방법을 가능하게 하는 세포 배양 배지, 성분 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 독립 청구항의 교시를 제공함으로써 상술한 과제를 해결한다. 특히, 본 발명은 적어도 하나의 폴리아민을 바람직하게는 적어도 20 mg/ℓ 이상의 농도로, 그리고 적어도 하나의 철 공급원을 바람직하게는 적어도 2 mg/ℓ 이상의 농도로 함유하는 세포 배양 첨가제를 제공한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 폴리아민 농도가 배양 배지에서 통상보다 현저하게 높을 경우 세포에 독성을 나타내지 않고, 대신에 세포 성장, 세포 생존력 및/또는 세포 생산성을 촉진함을 발견했다. 이론에 얽매이지 않고 비-구속적인 방식으로, 본 발명자들은 세포가 배양 배지에서 푸트레신과 같은 디아민을 제공받을 경우, 이들은 세포 에너지를 이용하여 푸트레신으로부터 스페르민과 같은 세포 폴리아민을 합성한다고 믿는다. 또한, 상기 세포 폴리아민 합성은 빠른 세포 성장을 위해 충분히 큰 내부 폴리아민 풀(pool)을 만드는데 아마도 상당한 시간을 필요로 할 것이다. 다른 한편 폴리아민 농도가 세포 배양 배지에서 증가할 경우, 세포 대사는 성장 및 생산성을 위해 폴리아민을 합성하고 세포 에너지를 절약할 필요성을 갖지 않는다.
특히 높은 철 농도 및/또는 긴 공정 시간에서 형성되는 철의 산화 산물은 세포에 독성을 나타낸다고 알려져 있음에도 불구하고, 그리고 쥐 간암 세포의 미토콘드리아 DNA는 배양 배지에서 100 μM의 제1철(Fe2+) 또는 제2철(Fe3+) 이온이 존재할 때 손상된다고 알려져 있음에도 불구하고(Itoh, H. 등, Arch Biochem Biophys., 1994, 313: 120-125), 본 발명은 본 발명의 폴리아민 함유 첨가제 및 이를 함유하는 배지에 고농도의 철을 적용한다. 고농도의 철은 놀랍게도 배양 배지에 폴리아민이 존재할 경우 세포 성장을 촉진한다. 이들의 아미노기로 인해, 폴리아민은 명백하게 금속 양이온을 킬레이트화할 수 있다. 이 킬레이트의 안정도 상수는 폴리아민의 아미노기 수 및 사슬 길이에 따라 증가한다. 따라서, 이론에 얽매이지 않고 비제한적 방식으로, 본 발명자들은 폴리아민이 킬레이트 형성을 통해 철 산화에 대한 보호 역할을 한다고 믿는다. 본 발명자들은 폴리아민이 철 이온과 결합하고, 철의 산화 상태를 안정화시키며, 철을 세포로 운반하는데 도움을 준다고 믿는다. 또한, 폴리아민은 Fe2+/Fe3+ 이온의 침전을 방지하는 킬레이터로서 작용할지도 모른다.
본 발명에서 사용되는 고농도의 폴리아민은 철 공급원과 조합하여 세포 성장, 세포 생존력 또는 세포 생산성을 촉진한다. 본 발명자들의 발견에 따르면, 폴리아민은 기질일뿐만 아니라, 배지에서 전이 금속, 예를 들어 Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+와 같은 양으로 하전된 이온의 담체로서도 작용할 수 있다. 폴리아민-철 복합체의 효율적인 형성을 위해서는, 고농도의 폴리아민 및 철이 유리하다. 상기 형성된 폴리아민-철 복합체는 세포에 의해 쉽게 섭취되고 더 나은 세포 철 및 폴리아민 공급을 보장함으로써, 높은 세포 성장, 세포 생존력 및/또는 세포 생산성을 유도한다. 따라서, 폴리아민 및 철 농도는 본 발명에 따른 배양 배지에서 본 발명의 농도로 증가되어야 한다.
본 발명에 따라 세포에 폴리아민 및 철 공급원을 공급하는 것은 고밀도 세포 생산 공정, 또는 유가(fed-batch) 공정 또는 관류(perfusion) 공정과 같은 긴 공정 시간을 갖는 생산 공정에 특히 유용하다. 공정 기간이 증가함에 따라, 배양물에 폴리아민 및 철 공급원을 첨가하여 이들의 제한을 피하는 것이 중요해진다. 두 물질, 즉 폴리아민 및 철 공급원 모두 산화에 민감할 수 있기 때문에, 따라서 산화에 대해 이들을 보호하고 고밀도의 세포에 대응하여 이들의 농도를 증가시키는 것이 중요하기 때문에, 폴리아민-철 복합체 형성을 제공하기 위해 두 물질을 함께 고농도로 공급한다는 본 발명의 교시는 매우 유용하다.
특히, 본 발명은 상기 배양 첨가제, 특히 배양 배지 첨가제를 제공함으로써, 그리고 또한 고농도의 폴리아민, 특히 스페르민 또는 스페르미딘, 및 고농도의 철 공급원의 특정 조합에 의해 정의되는 상기 배양 첨가제를 포함하는 배양 배지를 제공함으로써 상술한 과제를 해결한다.
따라서, 본 발명은 특히 바람직한 태양에서 폴리아민이 바람직하게는 적어도 25 이상, 바람직하게는 적어도 30 이상, 바람직하게는 적어도 35 이상, 바람직하게는 적어도 40 이상, 바람직하게는 적어도 45 이상, 또는 특히 바람직한 태양에서 바람직하게는 적어도 50 mg/ℓ 이상의 농도로 함유되는 상기에 따른 배양 첨가제에 관련된다. 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 철 공급원의 농도가 바람직하게는 적어도 5 이상, 바람직하게는 적어도 10 이상, 바람직하게는 적어도 15 이상, 바람직하게는 적어도 50 이상, 바람직하게는 적어도 100 이상, 바람직하게는 적어도 240 이상, 또는 특히 바람직한 태양에서 바람직하게는 적어도 480 mg/ℓ 이상인 상기에 따른 배양 첨가제를 제공한다.
본 발명의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 배지는 폴리아민의 농도가 30 내지 120 mg/ℓ, 특히 40 내지 120 mg/ℓ인 배양 배지이다. 특히 바람직한 태양에서, 배양 배지는 50 내지 900 mg/ℓ, 바람직하게는 50 내지 450 mg/ℓ의 철 공급원 농도를 갖는다. 본 발명의 더욱 바람직한 태양에서, 배양 배지는 30 내지 120 mg/ℓ의 폴리아민 농도를 갖고, 철 공급원의 농도는 50 내지 900 mg/ℓ, 특히 50 내지 450 mg/ℓ이다. 철 공급원에 대해 여기에서 주어지는 모든 농도 값은 전체 철 공급원의 질량에 관련되는데, 달리 언급되지 않을 경우 철 자체에만 관련되는 것은 아니다.
본 발명에서 배양 첨가제는 배양 배지의 성분이 되는 것을 의미하고, 일 태양에서는 본 발명에 따라 적어도 하나의 폴리아민 및 적어도 하나의 철 공급원을 필요한 농도로 본 발명의 배양 배지에 제공하도록, 통상적인 상태의 배양 배지에 다량으로 첨가될 수 있다. 물론, 본 발명의 배양 첨가제에 다양한 성분을 첨가함으로써 본 발명의 배양 배지를 형성하도록, 본 발명의 배양 배지를 제조하는 것도 가능하다. 바람직한 일 태양에서, 배양 첨가제는 배양 배지에 대해 상술한 바와 같이, 2 내지 10000배, 바람직하게는 10 내지 1000배, 특히 100배 높은 농도로 폴리아민 및 철 공급원을 포함하며, 즉 배양 첨가제는 60 내지 1200000 mg/ℓ의 폴리아민 농도를 갖고, 철 공급원의 농도는 100 내지 9000000 mg/ℓ, 특히 100 내지 4500000 mg/ℓ이다. 더욱 바람직한 태양에서, 배양 첨가제는 300 내지 120000 mg/ℓ의 폴리아민 농도를 갖고, 철 공급원의 농도는 500 내지 900000 mg/ℓ, 특히 500 내지 450000 mg/ℓ이다. 더욱 바람직한 태양에서, 배양 첨가제는 4000 내지 12000 mg/ℓ의 폴리아민 농도를 갖고, 철 공급원의 농도는 5000 내지 90000 mg/ℓ, 특히 5000 내지 45000 mg/ℓ이다. 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 배지는 본 발명의 배양 첨가제를, 배양 배지에서 적어도 하나의 폴리아민의 농도가 적어도 20, 25, 30, 35, 45 또는 특히 50 mg/ℓ, 그리고 적어도 하나의 철 공급원의 농도가 적어도 2, 5, 10, 15, 50, 100, 240 및 적어도 480 mg/ℓ가 되도록 하는 양으로 함유한다. 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 배지는 본 발명의 배양 첨가제를, 배양 배지에서 적어도 하나의 폴리아민의 농도가 30 내지 120 mg/ℓ, 그리고 적어도 하나의 철 공급원의 농도가 50 내지 900 mg/ℓ, 바람직하게는 50 내지 450 mg/ℓ가 되도록 하는 양으로 포함한다.
더욱 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제는 배양 배지 첨가제이다. 더욱 바람직한 태양에서, 배양 배지는 세포 배양 배지이다. 더욱 바람직한 태양에서, 배양 배지는 공급(feed) 배지이다.
다음의 용어는 동의어이고 동일함을 의미한다: "배양 배지" 및 "세포 배양 배지". "배양 배지"는 세포의 배양에 적합한 배지이다. 이러한 배양 배지는 세포 보전 또는 세포 생존력 또는 세포 성장 또는 세포 생산성을 유지하기 위한 영양소를 함유할 수 있다. 배양 배지로는 액체 배양 배지가 바람직하다. 특히 바람직한 배양 배지는 WO 2007/036291에 기술되어 있는 것으로, 본 발명에 사용될 수 있다. 기본 배지는 배양 배지의 특정 태양이고 바람직하게는 다른 성분, 예를 들어 공급 배지와 조합될 수 있다. 특히 바람직한 기본 배지는 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 생산성을 위해 필요한 모든 물질을 함유한다. 특히 바람직한 기본 배지는 예를 들어 이에 한정되지 않지만, 포도당 1.0 - 6.0 g/ℓ, NaCl 2.8 - 6.2 g/ℓ, KCl 273 - 945 mg/ℓ, CaCl2 48 - 290 mg/ℓ, MgCl2 42 - 330 mg/ℓ, NaH2PO4 56 - 1130 mg/ℓ, 아르기닌 56 - 930 mg/ℓ, 아스파라긴 44 - 900 mg/ℓ, 아스파르트산 26 - 445 mg/ℓ, 시스테인 35 - 270 mg/ℓ, 글루탐산 44 - 900 mg/ℓ, 글루타민 44 - 900 mg/ℓ, 글리신 18 - 180 mg/ℓ, 히스티딘 42 - 670 mg/ℓ, 이소류신 54 - 877 mg/ℓ, 류신 59 - 1250 mg/ℓ, 리신 73 - 1120 mg/ℓ, 메티오닌 9 - 454 mg/ℓ, 페닐알라닌 35 - 677 mg/ℓ, 프롤린 17 - 828 mg/ℓ, 세린 26 - 1339 mg/ℓ, 트레오닌 24 - 989 mg/ℓ, 트립토판 9 - 441 mg/ℓ, 티로신 55 - 565 mg/ℓ, 발린 52 - 787 mg/ℓ, NaHCO3 2.4 g/ℓ를 함유할 수 있다. 바람직한 기본 배지는 또한 지방산 및 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
다음의 용어는 동의어다: "공급 배지" 및 "관류 배지". "공급 배지"는 배양 공정 중에 세포 배양물에 첨가되는 배양 배지의 특정 태양이다. 달리 말하면, 공급 배지는 세포를 제1배지, 예를 들어 기본 배지에 접종한 후 세포 배양물에 첨가되는 배지이다. 배양물에 공급 배지를 첨가하는 것은 몇가지 목적을 갖는데, 예를 들어 이것은 배양물 수명을 연장시킬 수 있고, 세포 생존력을 증가시킬 수 있으며, 세포 농도를 증가시킬 수 있고, 또는 산물 농도를 증가시킬 수 있다. 특히 바람직한 공급 배지는 WO 2007/036291에 기술되어 있는 것으로, 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 공급 배지는 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 생산성을 위해 필요한 모든 물질을 함유한다. 공급 배지는 예를 들어 염에 한정되지 않고, 바람직하게는 미량 원소, 탄수화물, 아미노산, 지방산, pH 조절제 및 뉴클레오티드를 함유한다. 상술한 물질 중 하나만 또는 그 이상으로 구성되는 공급 배지가 또한 적합하다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리아민 및 철 농도, 즉 본 발명의 배양 첨가제는 바람직한 태양에서 배양 배지, 기본 배지 또는 공급 배지에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 배양 첨가제를 함유하는 배양 또는 세포 배양 배지는 상술한 바와 같이 배양 첨가제를 함유하는 배양 배지, 기본 또는 공급 배지를 의미한다.
배양 첨가제는 특히 바람직한 태양에서 적어도 하나의 폴리아민 및 적어도 하나의 철 공급원과 함께, 물 또는 수성 염 용액과 같은 적어도 하나의 용매를 함유할 수 있다. 따라서, 배양 첨가제는 바람직한 태양에서 액체 형태일 수 있다.
본 발명의 배양 첨가제가 첨가되는 배양 배지는 통상적인 배양 배지일 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 본 발명의 배양 첨가제 이외에, 용매, 이를 테면 물, 비타민, 염, 탄소원 및/또는 질소원, 아미노산, pH 조절제, 미량 원소, 지방산, 뉴클레오티드와 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 특히, 본 발명의 배양 배지는 수성 배지이다.
포유류 세포의 세포 배양은 오늘날에는 과학 교과서 및 매뉴얼에 잘 기술된 통상적인 작업이다. 이것은 예를 들어 R. Ian Fresney, 동물 세포의 배양, 매뉴얼, 4판, Wiley-Liss/N.Y., 2000에서 상세하게 다루고 있다. 본 발명의 배양 첨가제와 조합 사용을 위한, 예를 들어 포유류 세포계용 배양 배지 및 배양 방법은 그 자체로 이 분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 배양 배지는 바람직하게는 물과 같은 용매, 탄소원, 질소원, 아미노산, pH 조절제, 미량 원소, 지방산, 뉴클레오티드로 구성된다. 본 발명을 위한 바람직한 배양 배지는 표준 세포 배양 배지인데, 이것은 또한 특정 세포 형태의 요구에 적합할 수 있고, 이에 제한되지 않지만, 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지, L-15 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 이글 최소 필수 배지(MEM), 햄 F12 배지 또는 이스코브 변형 DMEM을 포함한다. 다른 바람직한 배지는 예를 들어 햄 F10 또는 F12 배지인데, 이것은 CHO 세포 배양을 위해 특별히 고안된 것이다. 본 발명을 위한 다른 바람직한 배지는 CHO 세포 배양에 특히 적합한 것으로, 예를 들어 EP 0 481 791에 기술되어 있다. 또한, 본 발명을 위한 바람직한 배양 배지는 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 이에 한정되지 않지만, CD CHO(Gibco, 10743), ProCHO5(BioWhittaker, BE12-766Q), HyQSFM4CHO (HyClone, SH30548.02)일 수 있다.
본 발명의 세포 배양 배지는 본 발명의 바람직한 태양에서 단백질을 함유할 수 있다. 이 단백질은 재조합으로 제조될 수 있고, 또는 천연 자원, 예를 들어 트랜스페린, 인슐린 또는 소 혈청 알부민으로부터 분리된다. 단백질은 재조합으로 제조되는 것이 바람직한데, 예를 들어 재조합 인슐린 또는 재조합 소 혈청 알부민 또는 재조합 인간 혈청 알부민이다.
본 발명의 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 무-단백질이다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 무-글루타민이다.
본 발명의 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 동물 성분이 없다.
본 발명의 바람직한 배양 배지는 일 태양에서 또한 동물, 식물 또는 효모 유래의 가수분해물을 함유할 수 있다. 식물 유래의 가수분해물, 예를 들어 콩 펩톤 또는 효모 가수분해물이 바람직하다. 본 발명의 배양 배지는 일 태양에서 펩티드를 함유할 수 있다. 펩티드는 디펩티드, 트리펩티드, 올리고- 또는 폴리펩티드일 수 있다.
특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 무-혈청이다. 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 무-단백질이다. 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 동물에서 분리된 산물이 없다. 본 발명의 특히 바람직한 태양에서, 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 가수분해물이 없다. 다른 바람직한 태양에서, 배양 첨가제 및/또는 배양 배지는 펩티드가 없다.
본 발명의 배양 첨가제 또는 배양 배지는 바람직한 태양에서 하나 이상의 다른 세포 영양소, 즉 탄소원, 예를 들어 포도당, 및 질소원, 예를 들어 아미노산, 및/또는 염을 함유한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 배양 첨가제는 바람직한 태양에서 하나 이상의 모액(stock solution), 예를 들어 하나의 철 공급원 함유 모액 및 하나의 폴리아민 함유 모액의 형태일 수 있다. 또 다른 바람직한 태양에서, 모액은 둘다, 즉 적어도 하나의 폴리아민 및 적어도 하나의 철 공급원을 함유한다. 폴리아민 및/또는 철 공급원은 바람직하게는 상기 모액에 고농축될 수 있다. 모액은 염 또는 pH 조절제와 같은 부가적인 성분을 함유할 수 있다. 이러한 모액은 본 발명의 배양 배지를 형성하는 배양 배지에 또는 공급 배지에 또는 세포 배양물에 첨가됨으로써 사용될 수 있다. 모액은 또한 여기에서 "키트(kit)"로서 정의된다. 키트의 첨가를 통해, 원하는 농도의 폴리아민 및 철이 최종 배지에서 또는 세포 배양물에서 조절된다.
배양 배지 또는 배양 첨가제는 또한 부가적인 물질, 특히 오린(aurin) 트리카르복실산(ATA), 디클로로 아세트산(DCA) 및/또는 숙신산을 포함할 수 있다. 물론, 하나 이상의 산이 그 염 및 그 유도체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따르면, 폴리아민 및 철 공급원은 본 발명의 배양 첨가제 또는 배양 배지의 바람직한 태양에서 디클로로아세테이트(DCA) 또는 그 염, 예를 들어 소디움 디클로로 아세테이트와 같은 디클로로 아세트산, 또는 그 염 또는 그 유도체와 조합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 폴리아민 및 철 공급원은 본 발명의 배양 첨가제 또는 배양 배지의 바람직한 태양에서 숙신산 또는 그 염, 예를 들어 소디움 숙시네이트 2염기 6수화물과 조합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 폴리아민 및 철은 본 발명의 배양 첨가제 또는 배양 배지의 바람직한 태양에서 오린 트리카르복실산(ATA) 또는 그 염과 조합될 수 있다.
특히 바람직한 태양에서, 배양 배지 또는 배양 첨가제는 스페르민, 철 시트레이트, 소디움 디클로로 아세테이트, 소디움 숙시네이트 2염기 6수화물 및 오린 트리카르복실산을 포함한다.
특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 배양 첨가제는 100 내지 900, 바람직하게는 400 mg/ℓ 폴리아민, 특히 스페르민, 1 내지 10, 바람직하게는 4 g/ℓ 철 공급원, 특히 철 시트레이트 및 선택적으로는 하나 이상의 다음 것을 포함한다: 5 내지 100, 바람직하게는 20 mM 소디움 디클로로 아세테이트, 5 내지 100, 바람직하게는 30 g/ℓ 소디움 숙시네이트 2염기 6수화물 및 5 내지 100, 바람직하게는 25 mg/ℓ 오린 트리카르복실산.
"폴리아민"이란 용어는 탄소, 질소 및 수소로 구성되고 2개 이상의 아미노기를 함유하는 유기 화합물을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 특히 바람직한 폴리아민의 예는 스페르민, 스페르미딘, 노르스페르민, 노르스페르미딘, 호모스페르민, 호모스페르미딘, 카다베린(cadaverine), 푸트레신, 아그마틴(agmatine) 및 오르니틴(ornithine)이다. 수화 또는 탈수된 형태, 다양한 염 형태 또는 하나 이상의 폴리아민의 조합은 폴리아민이란 용어에 모두 포함된다.
"철"이란 용어는 55.845의 원자량을 갖는 전이 금속 Fe를 의미한다. 철이란 용어는 하나 이상의 철 이온, 예를 들어 Fe3+ 및/또는 Fe2+ 이온을 함유하는 모든 분자를 포함하는 일반적인 용어이다. Fe3+ 및/또는 Fe2+ 이온은 철 염의 형태로 존재할 수 있다. 철 염은 수화 또는 탈수될 수 있다. 특히 바람직한 태양에서, 철 공급원은 Fe(Ⅱ) 및/또는 Fe(Ⅲ) 이온을 함유한다. 특히 바람직한 태양에서, 본 발명에서 사용되는 철 공급원은 철(Ⅲ) 포스페이트, 철(Ⅲ) 피로포스페이트, 철(Ⅲ) 니트레이트, 철(Ⅱ) 설페이트, 철(Ⅲ) 클로라이드, 철(Ⅱ) 락테이트, 철(Ⅲ) 시트레이트, 암모늄 철(Ⅲ) 시트레이트, 철-덱스트란 및 에틸렌디아민테트라아세트산 페릭 소디움 염 또는 이들의 수화 또는 탈수된 형태로 구성되는 군에서 선택된다.
철은 또한 다른 분자, 예를 들어 담체 또는 킬레이터와 복합체화될 수 있다. 킬레이터와 복합체화된 철의 특히 바람직한 몇가지 예는 철(Ⅱ) 락테이트 수화물, 철(Ⅲ) 시트레이트(CAS 번호: 3522-50-7), 암모늄 철(Ⅲ) 시트레이트, 철-덱스트란 및 에틸렌디아민테트라아세트산 페릭 소디움 염(CAS 번호: 15708-41-5)이다.
철은 또한 US 6,048,728에 기술된 바와 같이 다음의 부가적인 분자, 즉 피리독실 이소니코티노일 히드라존, 시트레이트, 콜린 시트레이트, 아세틸아세토네이트, 및 말산, 숙신산, 푸마르산 및 알파 케토글루타르산과 같은 다양한 다른 유기산과 복합체화될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 철 킬레이터는 WO 2001/016294에 주어진다.
본 발명에 사용되는 철의 특히 바람직한 몇가지 예는 철(Ⅲ) 포스페이트, 철(Ⅲ) 피로포스페이트 수화물, 철 덱스트란, 철(Ⅲ) 니트레이트 9수화물, 철(Ⅱ) 설페이트 7수화물, 철(Ⅲ) 클로라이드 6수화물, 철(Ⅲ) 시트레이트, 암모늄 철(Ⅲ) 시트레이트이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 배양 첨가제를 액체 배지, 특히 통상적인 상태의 배양 배지에 첨가하는, 배양 배지를 제조하는 방법에 관련된다.
또한, 본 발명은 배양 배지를 제조하기 위한, 본 발명에 따른 배양 첨가제의 용도에 관련된다.
본 발명의 다른 태양은 적어도 하나의 폴리아민을 바람직하게는 적어도 20 mg/ℓ 이상의 농도로, 그리고 적어도 하나의 철 공급원을 바람직하게는 적어도 2 mg/ℓ 이상의 농도로 함유하는 배양 배지에 세포를 접종하는 방법이다. 본 발명에 따른 배지로 세포를 배양하는 것은 본 발명의 바람직한 태양에서, 예를 들어 배양 용기에서 폴리아민 또는 철 또는 양자의 농도의 점진적인 증가를 또한 포함함으로써, 세포 배양 공정 중에 이들 성분의 바람직한 최종 농도가 유도된다. 하나 또는 양 물질의 농도를 증가시키는 것은 바람직한 태양에서, 하나 이상의 모액으로부터 배양 배지에 또는 세포 배양물에 폴리아민 및/또는 철 공급원을 첨가함으로써 또한 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 세포 및 제1배양 배지를 제공하는 단계, b) 상기 세포 및 상기 제1배양 배지의 유지에 적합한 조건 하에 상기 제1배양 배지에서 세포를 배양하는 단계, 및 c) 상기 제1배양 배지에 세포를 접종하기 전에 또는 상기 제1배양 배지에 세포를 접종한 후에 또는 배양 중에, 적어도 하나의 폴리아민 공급원 또는 적어도 하나의 철 공급원 또는 양자를 제1배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하고, a), b) 및 c) 단계에 존재하고 첨가되는 모든 폴리아민의 합계, 그리고 a), b) 및 c) 단계에 존재하고 첨가되는 모든 철 공급원의 합계가 본 발명에 따른 농도가 되도록 하며, 특히 적어도 하나의 폴리아민의 농도가 적어도 20 mg/ℓ, 그리고 적어도 하나의 철 공급원의 농도가 적어도 2 mg/ℓ가 되도록 하는, 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법에 관련된다.
따라서, 본 발명은 배양 중에 첨가된 폴리아민을 포함하고 가능하게는 이미 소모된 폴리아민을 포함하여 배양 배지에 존재하는 모든 폴리아민의 합계, 그리고 배양 중에 첨가된 철 공급원을 포함하고 가능하게는 이미 소모된 철 공급원을 포함하여 배양 배지에 존재하는 모든 철 공급원의 합계가 본 발명에 따른 이론적 농도가 되도록 하는, 즉 이러한 적어도 하나의 폴리아민의 합계의 이론적 농도가 적어도 20 mg/ℓ, 그리고 적어도 하나의 철 공급원의 합계의 이론적 농도가 적어도 2 mg/ℓ가 되도록 하는, 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 모든 공지된 세포 배양 공정 태양은 본 발명에 적용되기에 적합하다. 본 발명의 바람직한 공정 태양은 고밀도 세포 배양 공정이다. 고밀도 세포 배양 공정은 세포 농도가 1×105/㎖, 바람직하게는 1×106/㎖, 가장 바람직하게는 1×107/㎖를 초과하는 공정으로 정의된다.
본 발명에 따르면, 바람직한 태양은 연속식 공정, 회분식 공정, 분할-회분식 공정, 유가식 공정 또는 관류 공정이다. 특히 바람직한 태양에서, 세포 배양 공정은 유가식 공정이다. 상세한 공정 태양은 당업자에게 잘 알려져 있다. 더욱 상세한 공정 태양은 WO 2007/036291에 기술되어 있다. 비-구속적 예로서, 통상적인 유가식 공정은 배양 배지에 세포를 접종하면서 시작된다. 배양 배지에 세포를 접종한 후, 세포 배양물은 또 다른 배지, 예를 들어 공급 배지에 접종될 것이다. 공급 배지로 세포를 접종하는 것(공급)은 제한되지는 않지만 접종 후 1 내지 4일째일 수 있다. 세포 배양물에 공급 배지의 첨가는 연속식, 간헐식 또는 회분식일 수 있다. 배양물에 공급 배지를 첨가함에 따라 배양 부피는 증가할 수 있다.
본 발명에 따르면, 장기 배양 공정이 바람직하다. 장기 배양은 생산 단계(n 단계)의 공정 시간이 적어도 4일 이상, 바람직하게는 적어도 8일 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 10일 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 12일 이상, 가장 바람직하게는 적어도 14일 이상인 것으로 정의된다.
본 발명은 어떠한 형태의 세포에도 한정되지 않는다. 세포 형태의 예는 포유류 세포, 곤충 세포, 세균 세포, 및 효모 세포를 포함한다. 세포는 또한 1차 세포 또는 줄기 세포일 수 있다. 세포는 변형 또는 세포 감염되지 않은 자연적으로 존재하는 세포일 수 있다. 세포는 또한 하나 이상의 재조합 유전자 발현용 벡터로 세포 간염되거나 변형된 재조합 세포일 수 있다. 세포는 어떠한 산물, 예를 들어 바이러스성 산물을 제조하기 위해 바이러스를 이용하여 변형될 수 있다. 세포는 햄스터, 쥐, 인간 또는 다른 동물에서 유래할 수 있다. 세포는 또한 세포계, 예를 들어 이에 한정되지 않지만, CHO 세포, NS0 세포, Per.C6 세포, BHK 세포, SP2/0 세포일 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 a) 본 발명에 따른 세포 및 배양 배지를 제공하는 단계, 및 b) 유지, 즉 상기 배양 배지에서 상기 세포를 배양하기에, 특히 세포의 성장 및/또는 증폭을 위한 그리고/또는 이 세포의 산물 생산을 위한 조건을 제공하기에 적절하고 적합한 조건 하에 상기 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법에 관련된다. 특히 바람직한 태양에서, 세포는 상기 배지에서 2계대(passage) 이상 동안 또는 4일 이상 동안 배양된다. 더욱 바람직한 태양에서, 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법은 세포 산물, 특히 발현, 특히 세포에서 발현되고 분비되는 단백질을 위한 생산 방법이다.
더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 a) 세포 및 제1배양 배지, 특히 통상적인 배양 배지를 제공하는 단계, b) 상기 배양 배지에서 세포의 유지에 적합한 조건 하에 상기 제1배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 본 발명에 따른 배양 첨가제를 a) 배양 배지에 세포를 접종하기 전에 및/또는 b) 배양 배지에 세포를 접종한 후에 및/또는 c) 배양 중에 및/또는 d) 처음 및 배양 중에 첨가함으로써, 연속적으로 제조되는 방식, 즉 폴리아민 및/또는 철 공급원 농도를 본 발명의 고농도로 점차적으로 증가시키는 방식으로, 본 발명의 배양 배지인 제2배양 배지를 제공하는, 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법에 관련된다.
본 발명의 다른 바람직한 태양은 종속항의 주제이다.
다음의 실시예 및 첨부 도면은 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 배양 첨가제를 사용할 경우 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 생산성을 개선할 수 있다.
도 1은 고밀도 세포 유가식 공정에서 폴리아민 및 철의 상승 효과를 증명한다.
도 2는 회분식 공정에서 100 mg/ℓ 철(Ⅲ) 피로포스페이트가 존재할 때 폴리아민 공급원으로서 스페르미딘의 효과를 증명한다.
도 3은 고밀도 세포 유가식 공정에서 100 mg/ℓ 철(Ⅲ) 피로포스페이트가 존재할 때 스페르민 농도의 효과를 증명한다.
도 4는 회분식 공정에서 40 mg/ℓ 스페르민이 존재할 때 철 농도의 효과를 증명한다.
도 5는 회분식 공정에서 철 공급원 단독 및 스페르민과의 조합의 효과를 증명한다.
도 6은 고밀도 세포 유가식 공정에서 철 공급원 단독 및 스페르민과의 조합의 효과를 증명한다.
도 7은 철(Ⅲ) 시트레이트가 존재할 때 스페르민 농도의 긍정적인 효과를 증명한다.
도 8은 철(Ⅲ) 포스페이트가 존재할 때 스페르민 농도의 효과를 증명한다.
도 9는 철-덱스트란이 존재할 때 스페르민 농도의 효과를 증명한다.
실시예
재료 및 방법
세포
모든 실험에 대해 CHO DG44 숙주 세포계(Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77: 4216)를 사용하였다. 이 숙주 세포계를 lgG 항체의 유전자를 보유하는 벡터로 세포 간염시켰다. 세포 간염체를 배양 배지에서 MTX를 이용하여 증폭시켰다. 항체 생산 클론을 분리한 후 이 클론을 모든 실험에 사용하였다.
세포 배양 조건
보존 배양(stock culture) 세포를 쉐이크 플라스크 또는 스피너 플라스크에 두었다. 보존 배양물을 매 2일 또는 3일마다 새로운 배양 배지에 분할하였다. 즉, 소량의 세포 배양물을 접종원으로 사용하고 새로운 플라스크에 옮기고 새로운 배양 배지를 보충하였다. 세포를 인큐베이터에서 CO2 대기에서 37℃에서 배양하였다. 이런 식으로 세포를 몇 계대로 배양하였다. 1계대는 2-4일의 배양 기간으로 정의된다. 여러 시점에서 접종 세포를 보존 배양물에서 취하고 다양한 규모로, 예를 들어 6-웰 플레이트, 쉐이크 플라스크, T-플라스크, 스피너 플라스크 및 생물반응기에서 실험을 수행하였다.
배양 배지
다음과 같은 기본 배지(이하에서는 전매 배양 배지로도 불린다)를 모든 단계, 예를 들어 보존 배양, 배양 증식 단계 및 생산 단계에서 세포의 배양용으로 사용하였다. 기본 배지는 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 생산성에 필요한 모든 물질을 함유한다. 기본 배지는 포도당 1.0 - 6.0 g/ℓ, NaCl 2.8 - 6.2 g/ℓ, KCl 273 - 945 mg/ℓ, CaCl2 48 - 290 mg/ℓ, MgCl2 42 - 330 mg/ℓ, NaH2PO4 56 - 1130 mg/ℓ, 아르기닌 56 - 930 mg/ℓ, 아스파라긴 44 - 900 mg/ℓ, 아스파르트산 26 - 445 mg/ℓ, 시스테인 35 - 270 mg/ℓ, 글루탐산 44 - 900 mg/ℓ, 글루타민 44 - 900 mg/ℓ, 글리신 18 - 180 mg/ℓ, 히스티딘 42 - 670 mg/ℓ, 이소류신 54 - 877 mg/ℓ, 류신 59 - 1250 mg/ℓ, 리신 73 - 1120 mg/ℓ, 메티오닌 9 - 454 mg/ℓ, 페닐알라닌 35 - 677 mg/ℓ, 프롤린 17 - 828 mg/ℓ, 세린 26 - 1339 mg/ℓ, 트레오닌 24 - 989 mg/ℓ, 트립토판 9 - 441 mg/ℓ, 티로신 55 - 565 mg/ℓ, 발린 52 - 787 mg/ℓ, NaHCO3 2.4 g/ℓ를 함유한다. 기본 배지는 또한 지방산 및 뉴클레오티드를 포함한다. 달리 기재되지 않는 한, 모든 회분식 및 유가식 실험에서 동일한 전매 배양 배지 및 전매 공급 배지를 사용하였다. 유가식 실험에서 사용한 공급 배지(이하에서는 "전매 공급 배지"로도 불린다)는 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 생산성에 필요한 모든 물질, 특히, 염, 미량 원소, 탄수화물, 아미노산, 지방산, pH 조절제, 뉴클레오티드를 갖는다. 여기에서 상술한 물질을 함유하는 풍부한 공급 배지를 사용하더라도, 공급 배지는 이들 성분 모두를 포함해야 하는 것은 아니다. 상술한 물질 중 하나 이상으로 구성되는 공급 배지 또한 적합하다. 기본 배지 및 공급 배지 모두 무혈청, 무단백질, 무펩톤 및 무펩티드이다. 그러나, 상술한 첨가제 중 하나 이상을 배지에 보충하는 것이 가능하다. 따라서, 두 배지는 화학적으로 정의되고, 오직 단일의, 완전히 정의된 화학물질들로 구성된다.
실험은 회분식 또는 유가식 방식으로 수행하였다. 실험을 유가식 방식으로 설계할 경우, 생산 배지(배양 배지)에 보존 배양 세포를 포함하는 플라스크에 접종함으로써 시작하였다. 배양 플라스크는 밀리리터 당 2 내지 4×105 생세포의 접종 세포 농도로 접종하였다. 세포는 1 내지 4일 동안 배양하였다. 그 후에 공급 배지를 처음으로 배양물에 보충하였다. 공급은 매 1 내지 3일마다 회분식으로 수행하였다. 배양물에 공급 배지를 공급하는 것은 회분식(1회분 첨가)으로 수행하였다. 배양물의 공급은 또한 연속적으로, 특히 생물반응기에서 수행할 수 있다. 유가식 실험에서 2개의 다른 공급 배지를 사용하였다. 그러나, 하나 또는 2개 이상의 다른 공급 배지를 사용하는 것도 가능하다. 배양물은 세포 생존력이 50% 이상일 때까지 배양하였다. 따라서, 배양 기간은 약 10 내지 18일이었다. 매일 배양물에서 샘플을 취하고, 세포 계수 및 대사산물 측정과 같은 분석 공정을 수행하였다. 항체 농도는 ELISA 또는 단백질 A HPLC를 이용하여 세포 배양물의 상등액에서 측정하였다.
모액을 시험 물질로부터 제조하고 기본 배지 및/또는 공급 배지를 보충하여 이들의 최종 농도를 얻었다. 달리 기재되지 않는 한, 모든 화학물질은 Sigma(St. Louise, MO)에서 구입하였다. 본 실시예에서는, 화학물질의 Sigma 카탈로그 번호가 주어진다. 시험 물질을 함유하는 생산 플라스크에 접종하기 전에 보존 배양 세포를 원심분리하였다. 대응 배지에서 세포 펠렛을 재현탁하였다. 이런 식으로 접종 배양물을 통한 물질의 이월(carry-over) 효과를 피하였다. 그러나, 실제 생산 조건 하에서 접종 배양물의 원심분리는 필요로 하지 않아서 수행되지 않을 것이다.
실시예 1: 폴리아민 및 철 단독 및 조합의 시험
이 실시예에서는 고농도의 폴리아민 및 철의 조합의 상승 효과를 증명하였다. 세포 배양 배지를 철 공급원 없이 그리고 (w/o) 폴리아민 공급원 없이 제조하였다. 해당량의 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 시험 물질(즉, 폴리아민 및 철 공급원)의 최종 농도를 조절하였다. 이후, 이렇게 제조된 배양 배지에 세포를 접종하였다. 실험은 유가식 방식으로 수행하였다. 폴리아민 및 철이 없는 공급 배지를 사용하였다. 도 1에서 증명되듯이, 철은 세포 성장에 필수적이었다. 가장 중요하게는, 스페르민 및 철 모두가 동시에 고농도로 이용가능할 경우 세포 성장을 촉진하였다. 놀랍게도, 두 물질 모두 세포 성장에 대해 상승 효과를 나타내었다.
실시예 2: 회분식 공정에서 고농도의 폴리아민 공급원으로서 스페르미딘의 시험(SF40)
이 실시예의 목적은 스페르미딘이 세포 성장에 대해 스페르민과 유사하게 긍정적인 효과를 갖는지를 증명하는 것이었다.
100 mg/ℓ 철(Ⅲ) 피로포스페이트 수화물(P6526)을 포함하고 폴리아민 공급원을 포함하지 않은 세포 배양 배지를 제조하였다. 스페르미딘(S4139)의 모액을 제조하였다. 도 2의 범례로부터 명백하듯이, 해당량의 스페르미딘 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 스페르미딘의 최종 농도를 조절하였다. 이후, 이렇게 제조된 배양 배지에 세포를 접종하였다. 실험은 회분식 방식으로 수행하였다. 도 2에서 증명되듯이, 스페르미딘이 이용가능할 경우, 세포는 회분식 공정에서 고농도에 도달하였다. 놀랍게도, 스페르미딘의 독성은 시험된 고농도에서 볼 수 없었다.
실시예 3: 고밀도 세포 유가식 공정에서 고농도의 스페르민이 필요한가(FB117)?
통상적으로, 유가식 공정에서의 최대 세포 농도가 회분식 공정에서보다 더 높다. 따라서, 영양소 농도에 대한 수요는 회분식 공정과 비교하여 높다. 특히 세포 농도가 1×107/㎖를 초과하는 고밀도 세포 배양 공정에서는, 더 많은 스페르민 및 철이 필요할 수 있다.
100 mg/ℓ 철(Ⅲ) 피로포스페이트 수화물(P6526)을 포함하고 폴리아민 공급원을 포함하지 않은 세포 배양 배지를 제조하였다. 스페르민(S4264)의 모액을 40 g/ℓ의 농도로 제조하였다. 도 3의 범례로부터 명백하듯이, 해당량의 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 스페르민의 최종 농도를 조절하였다. 이후, 이렇게 제조된 배양 배지에 세포를 접종하였다. 실험은 유가식 방식으로 수행하였다. 아미노산 및 포도당과 같이 세포 성장 및 생존을 위한 기질을 함유하는 전매 공급 배지를 모든 배양물에 공급하였다. 공급 배지는 폴리아민을 포함하지 않고 철(Ⅲ) 피로포스페이트 수화물을 800 mg/ℓ의 농도로 함유하였다.
도 3에서 증명되듯이, 스페르민 농도가 증가할수록 세포는 더 잘 성장하였다. 주어진 철 농도에서 스페르민의 최적 농도는 본 실시예에서 40 내지 120 mg/ℓ이었다.
실시예 4: 고농도의 스페르민을 포화시키기 위해 고농도의 철이 필요한가(SF57)?
실시예 3에서 40 mg/ℓ의 스페르민 농도가 좋은 것을 발견하였다. 40 mg/ℓ의 일정한 스페르민 농도를 갖는 세포 배양 배지를 제조하였다. 철(Ⅲ) 피로포스페이트 수화물(P6526)의 모액을 5 g/ℓ 및 50 g/ℓ의 농도로 제조하였다. 도 4의 범례로부터 명백하듯이, 해당량의 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 배양 배지에서 철의 최종 농도를 조절하였다. 이후, 이렇게 제조된 배양 배지에 세포를 접종하였다. 실험은 회분식 방식으로 수행하였다. 도 4에서 증명되듯이, 극히 고농도의 철은 스페르민이 존재할 때 세포에 내성이 있었다.
실시예 5: 회분식 공정에서 질산철과의 조합시 스페르민의 분석(SF107)
이 실시예에서는 철 및 스페르민과 대체 철 공급원의 상승 효과를 증명하였다. 세포 배양 배지를 철 없이 그리고 폴리아민 공급원 없이 제조하였다. 질산철(Ⅲ) 9수화물(CAS 번호: 7782-61-8) 및 스페르민의 모액을 제조하였다. 도 5의 범례로부터 명백하듯이, 해당량의 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 시험 물질의 최종 농도를 조절하였다. 이후, 이렇게 제조된 배양 배지에 세포를 접종하였다. 실험은 회분식 방식으로 수행하였다. 도 5에서 증명되듯이, 스페르민 및 철 모두가 고농도로 이용가능할 경우, 세포는 회분식 공정에서 고농도에 도달함으로써, 두 물질의 상승 효과를 나타내었다.
실시예 6: 유가식 공정에서 철 시트레이트와의 조합시 스페르민 농도의 분석(FB188)
이 실험에서는 고밀도 세포 유가식 공정에서 철(Ⅲ) 시트레이트와 스페르민의 상승 효과를 분석하였다. 철 공급원은 철(Ⅲ) 시트레이트(CAS 번호: 3522-50-7)이었다. 세포 배양 배지를 철 없이 그리고 폴리아민 없이 제조하였다.
스페르민(S4264)의 모액을 40 g/ℓ로 제조하였다. 철(Ⅲ) 시트레이트의 모액을 50 g/ℓ로 제조하였다. 도 6의 범례로부터 명백하듯이, 해당량의 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 배양 배지에서 스페르민 및 철(Ⅲ) 시트레이트의 원하는 최종 농도를 조절하였다. 공급 배지는 철이 없고 스페르민도 없었다. 제조된 배지에 세포를 옮겼다. 실험은 유가식 방식으로 수행하였다. 아미노산 및 포도당과 같이 세포 성장 및 생존을 위한 기질을 함유하는 공급 배지를 모든 배양물에 공급하였다. 6일째에 철(Ⅲ) 시트레이트를 모든 배양물에 추가로 보충하여 400 mg/ℓ의 최종 농도가 되게 하였다. 도 6에서 증명되듯이, 최적 세포 성장을 위해 스페르민 및 철 모두가 필요하였다. 또한, 현저히 고농도의 스페르민 및 철이 필요하였다. 이러한 고농도의 스페르민 및 철은 특히 세포 농도가 1×107/㎖를 초과하는 고밀도 세포 유가식 공정에서 필요하였다.
실시예 7: 유가식 공정에서 여러 농도의 철 시트레이트와의 조합시 스페르민의 시험(FB171-3)
이 실시예의 목적은 또 다른 철 공급원과 조합할 경우에도 세포 성장에 대한 폴리아민의 긍정적인 효과를 볼 수 있는지를 시험하는 것이었다. 이 실험에서는 스페르민 유무에 따라 유가식 공정에서 철 시트레이트를 시험하였다. 세포 배양 배지를 철 없이 그리고 폴리아민 없이 제조하였다. 스페르민(S4264)의 모액을 40 g/ℓ로 제조하였다. 철(Ⅲ) 시트레이트(CAS 번호: 3522-50-7)의 모액을 50 g/ℓ로 제조하였다.
도 7의 범례로부터 명백하듯이, 해당량의 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 스페르민 및 철(Ⅲ) 시트레이트의 원하는 최종 농도를 조절하였다. 폴리아민 및 철이 없는 배지에서 접종 세포를 3일 동안 배양하여 세포내 철 및 폴리아민 풀을 고갈시켰다. 이후 이렇게 조절된 세포를 접종원으로 사용하였다. 실험은 유가식 방식으로 수행하였다. 아미노산 및 포도당과 같이 세포 성장 및 생존을 위한 기질을 함유하는 공급 배지를 모든 배양물에 공급하였다. 공급 배지는 폴리아민이 없고 철(Ⅲ) 시트레이트를 3200 mg/ℓ의 농도로 함유하였다. 도 7에서 증명되듯이, 다른 철 공급원이 존재할 때에도 스페르민의 긍정적인 효과가 보였다. 또한, 세포는 스페르민이 존재할 때 800 mg/ℓ까지 매우 고농도의 철에 내성을 가졌다.
실시예 8: 유가식 공정에서 철(Ⅲ) 포스페이트와의 조합시 스페르민의 시험(171-2)
이 실시예의 목적은 또 다른 철 공급원과 조합할 경우에도 세포 성장에 대한 이전에 분석된 폴리아민 농도의 긍정적인 효과를 볼 수 있는지를 시험하는 것이었다. 이 실험에서는 스페르민 유무에 따라 철(Ⅲ) 포스페이트(F1523)를 시험하였다. 세포 배양 배지를 철 없이 그리고 폴리아민 없이 제조하였다. 스페르민(S4264)의 모액을 40 g/ℓ로 제조하였다. 철(Ⅲ) 포스페이트의 모액을 50 g/ℓ로 제조하였다.
도 8의 범례로부터 명백하듯이, 해당량의 모액을 피펫으로 배양 배지에 첨가하여 스페르민 및 철(Ⅲ) 포스페이트의 원하는 최종 농도를 조절하였다. 이후 이렇게 제조된 배양 배지에 세포를 접종하였다. 실험은 유가식 방식으로 수행하였다. 아미노산 및 포도당과 같이 세포 성장 및 생존을 위한 기질을 함유하는 공급 배지를 모든 배양물에 공급하였다. 공급 배지는 폴리아민이 없고 철(Ⅲ) 포스페이트를 800 mg/ℓ의 농도로 함유하였다.
도 8에서 증명되듯이, 철(Ⅲ) 포스페이트가 존재할 때에도 스페르민의 긍정적인 효과가 보였다. 놀랍게도, 이러한 고농도의 철은 스페르민이 존재할 때 세포에 독성을 나타내지 않고, 오히려 세포 성장을 촉진함을 알았다.
실시예 9: 유가식 공정에서 철 덱스트란과의 조합시 스페르민의 시험(174-1)
이 실시예의 목적은 또 다른 철 공급원과 조합할 경우에도 세포 성장에 대한 이전에 분석된 폴리아민 농도의 긍정적인 효과를 볼 수 있는지를 시험하는 것이었다. 이 실험에서는 철 덱스트란(D8517)을 시험하였다. 40 mg/ℓ의 스페르민 농도를 갖는 세포 배양 배지를 제조하였다. 이 배지에는 철 공급원이 없었다.
100 g/ℓ의 농도를 갖는 철-덱스트란 용액을 Sigma에서 구입하였다. 실험의 시작 전에, 철 공급원이 없는 배지에서 세포를 2일 동안 배양하였다. 이런 식으로, 세포내 철 풀을 고갈시켰다. 그러나, 철에 대한 세포의 사전 결핍 상태는 스페르민 및 철-덱스트란의 기능성에 대한 요건은 아니다. 세포는 철 결핍 상태이었다. 이러한 세포를 상술한 바와 같이 제조된 배지에 옮겼다. 실험은 유가식 방식으로 수행하였다. 공급 배지에는 스페르민이 없고 철도 없었다. 아미노산 및 포도당과 같이 세포 성장 및 생존을 위한 기질을 함유하는 공급 배지를 모든 배양물에 공급하였다. 6일째에 철 덱스트란을 성장하는 배양물에 추가로 공급하여 250 mg/ℓ의 최종 철 덱스트란 농도가 되도록 하였다. 도 9에서 증명되듯이, 스페르민이 존재할 때 최적 세포 성장을 위해 매우 고농도의 철 덱스트란이 필요하였다. 놀랍게도, 이러한 고농도의 철은 세포에 독성을 나타내지 않고 세포 성장을 촉진함을 알았다.

Claims (34)

  1. 적어도 하나의 폴리아민을 적어도 20 mg/ℓ의 농도로, 그리고 적어도 하나의 철 공급원을 적어도 2 mg/ℓ의 농도로 함유하는 배양 첨가제.
  2. 제1항에 있어서, 폴리아민 농도가 적어도 35 mg/ℓ인 배양 첨가제.
  3. 제1항에 있어서, 폴리아민 농도가 적어도 50 mg/ℓ인 배양 첨가제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 철 공급원의 농도가 적어도 5 mg/ℓ인 배양 첨가제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 철 공급원의 농도가 적어도 240 mg/ℓ인 배양 첨가제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 철 공급원의 농도가 적어도 480 mg/ℓ인 배양 첨가제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 철 공급원이 Fe(Ⅱ) 이온을 함유하는 배양 첨가제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 철 공급원이 Fe(Ⅲ) 이온을 함유하는 배양 첨가제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 철 공급원이 철(Ⅲ) 포스페이트, 철(Ⅲ) 피로포스페이트, 철(Ⅲ) 니트레이트, 철(Ⅱ) 설페이트, 철(Ⅲ) 클로라이드, 철(Ⅱ) 락테이트, 철(Ⅲ) 시트레이트, 암모늄 철(Ⅲ) 시트레이트, 철-덱스트란 및 에틸렌디아민테트라아세트산 페릭 소디움 염 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염 또는 이의 수화 또는 탈수된 형태인 배양 첨가제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아민이 스페르미딘, 스페르민, 노르스페르민, 노르스페르미딘, 호모스페르민, 호모스페르미딘 및 카다베린 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염 또는 이의 수화 또는 탈수된 형태인 배양 첨가제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아민이 스페르민인 배양 첨가제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 배양 첨가제를 함유하는 배양 배지.
  13. 제12항에 있어서, 폴리아민의 농도가 30 내지 120 mg/ℓ인 배양 배지.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 적어도 하나의 철 공급원의 농도가 50 내지 450 mg/ℓ인 배양 배지.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아민의 농도가 30 내지 120 mg/ℓ이고, 철 공급원의 농도가 50 내지 450 mg/ℓ인 배양 배지.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 또는 배양 첨가제가 수성 용매, 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 오린 트리카르복실산(ATA), 디클로로 아세트산(DCA), 숙신산, 이의 염 및 이의 유도체 중에서 적어도 하나를 함유하는 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, a) ATA, b) DCA 및 c)숙신산 중 3개 모두 또는 이의 염 또는 유도체를 함유하는 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청인 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 무글루타민인 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 무단백질인 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 무가수분해물인 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  23. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 배지인 배양 배지.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 키트 형태로 제공되는 배양 배지 또는 배양 첨가제.
  25. 배양 배지를 제조하는 방법에 있어서, 제1항 내지 제11항 및 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 배양 첨가제를 액체 배지에 첨가하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 액체 배양 배지가 수성 용매, 탄소원 및 질소원을 함유하는 통상적인 배양 배지인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항의 방법에 따라 제조되는 배양 배지.
  28. 배양 배지의 제조를 위한 제1항 내지 제11항 및 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 배양 첨가제의 용도.
  29. 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법에 있어서, a) 세포 및 제12항 내지 제24항 및 제27항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지를 제공하는 단계, 및 b) 상기 배양물에서 상기 세포의 유지에 적합한 조건 하에 상기 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 세포를 상기 배양 배지에서 2계대 이상 또는 4일 이상 동안 배양하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 방법이 연속식 방법, 반-연속식 방법, 회분식 방법, 분할-회분식 방법, 유가식 방법 또는 관류식 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 상기 세포로부터 적어도 하나의 단백질을 제조하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법에 있어서, a) 세포 및 제1배양 배지를 제공하는 단계, 및 b) 상기 배양물에서 상기 세포의 유지에 적합한 조건 하에 상기 제1배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 제1항 내지 제11항 및 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 배양 첨가제를 제1배양 배지에, 상기 제1배양 배지에 세포를 접종하기 전에 또는 상기 제1배양 배지에 세포를 접종한 후에 또는 배양 중에 첨가함으로써, 상기 배양 중에 제2배양 배지를 형성하는 방법.
  34. 배양 배지에서 세포를 배양하는 방법에 있어서,
    a) 세포 및 제1배양 배지를 제공하는 단계,
    b) 상기 제1배양 배지에서 상기 세포의 유지에 적합한 조건 하에 상기 제1배양 배지에서 세포를 배양하는 단계, 및
    c) 적어도 하나의 폴리아민 공급원 또는 적어도 하나의 철 공급원 또는 양자를 제1배양 배지에, 상기 제1배양 배지에 세포를 접종하기 전에 또는 상기 제1배양 배지에 세포를 접종한 후에 또는 배양 중에 첨가하는 단계를 포함하며,
    a), b) 및 c) 단계에서 존재하고 첨가되는 모든 폴리아민의 합계, 그리고 a), b) 및 c) 단계에서 존재하고 첨가되는 모든 철 공급원의 합계가 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 농도가 되도록 하는 방법.
KR1020107017385A 2008-01-09 2009-01-07 개선된 배양 배지 첨가제 및 이를 이용한 방법 KR101594046B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08000244 2008-01-09
EP08000244.7 2008-01-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100108424A true KR20100108424A (ko) 2010-10-06
KR101594046B1 KR101594046B1 (ko) 2016-02-15

Family

ID=39271361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107017385A KR101594046B1 (ko) 2008-01-09 2009-01-07 개선된 배양 배지 첨가제 및 이를 이용한 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8637312B2 (ko)
EP (1) EP2250251B1 (ko)
JP (1) JP5431361B2 (ko)
KR (1) KR101594046B1 (ko)
CN (1) CN102317440B (ko)
CA (1) CA2707524C (ko)
DK (1) DK2250251T3 (ko)
IL (1) IL206900A (ko)
WO (1) WO2009087087A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150082820A (ko) * 2014-01-08 2015-07-16 서울대학교산학협력단 스퍼미딘 또는 스퍼민을 이용함으로써 생육 저해제에 대한 내성이 증진된 효모의 배양방법

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2707524C (en) 2008-01-09 2016-04-12 Cellca Gmbh Improved culture media additive and process for using it
KR20140077977A (ko) 2011-10-21 2014-06-24 화이자 인코포레이티드 철을 첨가하여 세포 배양을 개선하는 방법
WO2014062535A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
DK3122869T3 (da) 2014-03-24 2019-09-09 Biogen Ma Inc Fremgangsmåder til afhjælpning af glutamindeprivation under pattedyrecellekultur
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
CN108485976B (zh) * 2018-03-16 2020-12-08 华中科技大学 一种重金属抗性微生物的筛选方法
CN112997885B (zh) * 2021-04-19 2023-06-06 辽宁省农业科学院 一种郁金香不定芽的诱导培养基
CN114164166A (zh) * 2021-12-16 2022-03-11 无锡多宁生物科技有限公司 一种ata在用来培养cho细胞系细胞的基础培养基当中的新应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6184232B1 (en) * 1986-12-02 2001-02-06 University Of Florida Analogs of biologically active, naturally occurring polyamines, pharmaceutical compositions and methods of treatment
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
GB9022545D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
CA2111984A1 (en) 1991-06-21 1993-01-07 Peter B. Suhr-Jessen Iron chelate culture medium additive
EP0953041A4 (en) 1996-08-30 2003-01-29 Life Technologies Inc SERUM-FREE CULTURAL MEDIUM FOR MAMMAL CELLS AND THEIR USE
WO2001016294A2 (en) 1999-08-27 2001-03-08 Invitrogen Corporation Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
AU2001275897A1 (en) 2000-07-12 2002-01-21 Immunex Corporation Improvement of cell culture performance
BR0116797A (pt) 2000-12-22 2005-01-18 Monsanto Technology Llc Processo de transformação de plantas com seleção e identificação inicial de eventos na linhagem germinativa
EP1360314B1 (en) * 2001-02-15 2009-01-14 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
PT2087908T (pt) 2001-06-26 2018-07-16 Amgen Inc Anticorpos contra opgl
JP2006508692A (ja) 2002-08-19 2006-03-16 ガミダ セル リミテッド 単核細胞培養物における造血幹細胞集団のエクスビボ拡大
GB0304799D0 (en) 2003-03-03 2003-04-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel method
KR20040088169A (ko) 2003-04-09 2004-10-16 주식회사 제일생명공학서비스 동물세포 배양용 무혈청 배지
EP1667727B1 (en) * 2003-09-09 2008-07-09 University of Florida Research Foundation, Inc. Polyamine-metal chelator conjugates
US20060115901A1 (en) * 2004-10-22 2006-06-01 Bahram Valamehr Method and media for single cell serum-free culture of CHO cells
US20060094104A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
CA2585547A1 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
DE102005046225B4 (de) 2005-09-28 2012-01-05 Cellca Gmbh Verbessertes Zellkulturmedium
PL2522717T3 (pl) * 2006-01-04 2014-08-29 Baxalta Inc Pożywki do hodowli komórkowych wolne od oligopeptydów
MY161866A (en) 2006-09-13 2017-05-15 Abbvie Inc Cell culture improvements
CA2707524C (en) 2008-01-09 2016-04-12 Cellca Gmbh Improved culture media additive and process for using it

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150082820A (ko) * 2014-01-08 2015-07-16 서울대학교산학협력단 스퍼미딘 또는 스퍼민을 이용함으로써 생육 저해제에 대한 내성이 증진된 효모의 배양방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101594046B1 (ko) 2016-02-15
CA2707524C (en) 2016-04-12
JP2011509089A (ja) 2011-03-24
CA2707524A1 (en) 2009-07-16
US8637312B2 (en) 2014-01-28
IL206900A (en) 2017-10-31
EP2250251A1 (en) 2010-11-17
EP2250251B1 (en) 2017-11-22
WO2009087087A1 (en) 2009-07-16
CN102317440A (zh) 2012-01-11
IL206900A0 (en) 2010-12-30
US20100285533A1 (en) 2010-11-11
DK2250251T3 (en) 2018-01-22
JP5431361B2 (ja) 2014-03-05
CN102317440B (zh) 2014-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101594046B1 (ko) 개선된 배양 배지 첨가제 및 이를 이용한 방법
KR101362805B1 (ko) 개선된 세포 배양 배지
US6406909B1 (en) Serum-free medium for culturing animal cells
US20060115901A1 (en) Method and media for single cell serum-free culture of CHO cells
CN1962857A (zh) 一种哺乳动物细胞无血清培养基
US20110183375A1 (en) Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
KR102601321B1 (ko) 세포 내 글루타티온 수준을 증가시키는 방법
AU2018231364A1 (en) Culture medium comprising oligopeptides
EP0659880B1 (en) Medium for culturing animal cells or antibody-producing cells
WO2001016294A2 (en) Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
CN110382688B (zh) 包含n-酰基-x-谷氨酰胺二肽的培养基
AU2004263723B2 (en) Myeloma cell culture in transferrin-free low iron medium
US20120264208A1 (en) Materials and methods for enhanced iron uptake in cell culture
KR20240055110A (ko) 디펩티드 및 미량 원소를 포함하는 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190116

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200128

Year of fee payment: 5