CN110382688B - 包含n-酰基-x-谷氨酰胺二肽的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生物技术生产方法的改良培养基、采用该改良培养基的方法和从该方法中获得的产物。本发明的细胞培养基包含来自N‑酰化二肽酰基‑X‑Q的组中的L‑谷氨酰胺和来自其他谷氨酰胺源Q源的组中的L‑谷氨酰胺，其限定的摩尔比为R＝n(酰基‑X‑Q)/n(Q源)；其中X定义为L‑氨基酸；其中Q定义为通过酰胺键与L‑氨基酸X连接的L‑谷氨酰胺；其中酰基定义为通过酰胺键连接到L‑氨基酸X的氨基末端的C1‑C7‑酰基部分；其中R定义为0.03至20；其中n(酰基‑X‑Q)是在培养基中的所述N‑酰化二肽酰基‑X‑Q的组中包含的L‑谷氨酰胺的物质总量；和其中n(Q源)是在培养基中的所述其他谷氨酰胺源Q源的组中包含的L‑谷氨酰胺的物质总量。其他L‑谷氨酰胺源(Q源)的组中的成分选自：游离的L‑谷氨酰胺、二肽Y‑Q或其混合物，其中Y定义为20种遗传编码的L‑氨基酸中的一种，其中Q定义为通过酰胺键与L‑氨基酸Y连接的L‑谷氨酰胺，其中在二肽Y‑Q中连接Y和Q的酰胺键是普通的主链酰胺键，其涉及氨基酸Y的羧基末端和谷氨酰胺Q的氨基末端。

Description

包含N-酰基-X-谷氨酰胺二肽的培养基
发明领域
本发明涉及生物技术生产方法。更具体地，本发明涉及用于生物技术生产方法的改良培养基、采用该改良培养基的方法和使用该改良培养基从该方法中获得的产物。
发明背景
生物技术方法广泛用于生物产物的生产。这些方法通常涉及在培养细胞生长和产物形成所允许的条件下在培养基中培养细胞。在生物技术生产中有用的细胞为细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞和动物或植物来源的细胞。
动物细胞培养长期以来用于生物产物的生产，所述生物产物例如治疗性蛋白质、多肽、肽或其他生物分子，例如治疗性多糖。在这种细胞培养方法中，将通常是经遗传修饰以产生所需产物的动物细胞在液体、固体或半固体培养基中进行培养，用于细胞增殖和产物形成。细胞培养的一个显著优势是动物细胞和植物细胞能够对初级产物进行翻译后修饰(例如多肽的折叠和翻译后修饰)这一事实。
在生物技术生产方法中，特别是在动物细胞培养中，细胞培养条件的控制和优化对于细胞增殖和产物形成是至关重要的。一个决定性因素是培养基组成。最终的细胞培养产物的浓度和品质在很大程度上取决于培养基组成。就所需的营养素组合物和培养条件而言，动物和植物细胞培养特别苛刻。所需的营养素不仅包括基础碳源、基础氮源和基础能源(例如糖和氨)，还包括更复杂的营养素(例如必需氨基酸)，并且可能需要维生素。为此，用复杂的营养素组合物(例如血清)补充动物细胞培养基已经用于为动物细胞提供各种各样的营养。然而，监管和安全问题以及可用的血清来源的异质性问题已经引起工业界努力从工业细胞培养方法中消除血清和其他非成分确定的培养基。然而，在无血清培养基中生长的细胞培养物经常表现出营养不良。为此，已经进行了很多努力去鉴定复杂培养基中的那些营养成分以及它们的最佳浓度，这是在细胞培养中得到令人满意的生长和蛋白质形成所需要的。
用氨基酸供给细胞培养对生长速率和生产具有显著的影响是已知的。谷氨酰胺在细胞培养基中常规性地使用，因为对于所培养的细胞来说，其是重要的碳源、氮源和能源。已经证实的是对于动物细胞培养的最佳生长所必需的谷氨酰胺的量是其他氨基酸的量的3至10倍(Eagle等人，Science 130：432-37)。然而，作为营养素的谷氨酰胺在升高的温度下(例如加热灭菌条件)溶解于水中时是不稳定的，因为在加热时形成了焦谷氨酸盐和氨(Roth等人，1988,In Vitro Cellular&Developmental Biology 24(7):696-98)。为此，在细胞培养基中经常使用谷氨酸而不是谷氨酰胺(Cell Culture Technology forPharmaceutical and Cell-based Therapies,52,Sadettin等人,Eds.,Taylor andFrancis Group,2006)。其他研究小组已经尝试通过向细胞培养基中加入包含谷氨酰胺的二肽(例如丙氨酰-谷氨酰胺或甘氨酰-谷氨酰胺)来避免形成不需要的物质，例如焦谷氨酸盐和氨(Roth等人(1988),In Vitro Cellular&Developmental Biology 24(7):696-98)。还有其他研究小组已经提出了对二肽进行酰化以使其在加热灭菌条件下更加稳定。US 5,534,538中描述了N-酰基二肽及其在经加热灭菌的肠内或肠外营养产品中的用途。
EP 0220379和DE3538310公开了含有谷氨酰胺的二肽和三肽在细胞培养基中的用途。谷氨酰胺以二肽的形式加入，以避免由于在升高的温度下谷氨酰胺的不稳定性而引起的问题。含有谷氨酰胺的二肽用作对温度不敏感的谷氨酰胺源。
JP61271985公开了一种可用于动物细胞的培养基，其包括二肽Xxx-L-谷氨酰胺，其中Xxx为甘氨酸、D/L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸或L-苯丙氨酸。
虽然在现有技术中描述的细胞培养基为某些细胞培养方法提供了令人满意的性能和性质，但是仍然需要在生物技术生产方法中促进经改善的产物形成的细胞培养基。
发明内容
在本发明的范围内，发现下列细胞培养基提高了生物技术生产方法的生产力:
细胞培养基，其包含来自N-酰化二肽酰基-X-Q的组中的L-谷氨酰胺和来自其他谷氨酰胺源Q源的组中的L-谷氨酰胺，其限定的摩尔比为R＝n(酰基-X-Q)/n(Q源)；
其中X定义为L-氨基酸；
其中Q定义为通过酰胺键与L-氨基酸X连接的L-谷氨酰胺；
其中酰基定义为通过酰胺键连接到L-氨基酸X的氨基末端的C1-C7-酰基部分；
其中R定义为0.03至20；
其中n(酰基-X-Q)是在培养基中的N-酰化二肽酰基-X-Q的组中包含的L-谷氨酰胺的物质总量；和
其中n(Q源)是在培养基中的其他谷氨酰胺源Q源的组中包含的L-谷氨酰胺的物质总量。
其他L-谷氨酰胺源Q源的组中的成分选自：游离的L-谷氨酰胺、二肽Y-Q或其混合物，其中Y定义为20种遗传编码的L-氨基酸中的一种，其中Q定义为通过酰胺键与L-氨基酸Y连接的L-谷氨酰胺，其中在二肽Y-Q中连接Y和Q的酰胺键是普通的主链酰胺键，其涉及氨基酸Y的羧基末端和谷氨酰胺Q的氨基末端。
本发明的第一方面涉及上述公开的培养基。本发明进一步涉及这种细胞培养基用于培养细胞的用途以及用于制备细胞培养产物的方法，其包括将细胞与如本文所公开的细胞培养基接触的步骤。
发明详述
根据本发明的“培养基”应理解为包含营养素的液体或固体培养基，所述培养基适合用于滋养和支持在培养物中的细胞的生命和/或产物形成。根据本发明的培养的细胞可以为细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)和/或植物细胞(例如藻类)。通常，培养基提供必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素、至少一种能源、脂质和微量元素，所有这些都是细胞维持生命、生长和/或产物形成所需要的。培养基也可以含有增强生长和/或存活高于最低速率的组分，其包括激素和生长因子。培养基优选地具有pH和盐浓度，其支持细胞的生命、生长和/或产物形成。根据本发明的培养基优选包含维持细胞培养物的生命和增殖所需的所有营养素。优选的培养基为确定的培养基。
根据本发明的“化学成分确定的培养基”是不含细胞提取物、细胞水解产物或蛋白质水解产物的培养基。化学成分确定的培养基不包含未知组成的成分。正如本领域技术人员通常理解的，化学成分确定的培养基通常不含动物来源的成分。化学成分确定的培养基的所有成分都具有已知的化学结构。除了成分确定的培养基之外的培养基可以称为“复杂”培养基。
“细胞培养基”应理解为适合用于维持动物细胞和/或植物细胞的生命、增殖和/或产物形成的培养基。
根据本发明的“营养素”是细胞生存和生长所需的化合物或物质。营养素优选地由细胞从环境中吸收。营养素可以是“有机营养素”和“无机营养素”。有机营养素包括碳水化合物、脂肪、蛋白质(或其构建单元，例如氨基酸)和维生素。无机营养素是无机化合物，例如膳食矿物质和微量元素。“必需营养素”是细胞不能自身合成并且因此其必须通过培养基提供给细胞的营养素。
根据本发明的“细胞培养产物”应理解为在细胞培养中由细胞产生的任何有用的生物化合物。本发明优选的细胞培养产物是治疗性蛋白质、诊断蛋白质、治疗性多糖(例如肝素)、抗体(例如单克隆抗体)、生长因子、白细胞介素、肽激素和酶。
根据本发明的“游离的氨基酸”理解为具有其游离形式的氨基及其游离形式的(α-)羧基官能团的氨基酸，即不与其他分子共价结合，例如不形成肽键的氨基酸。游离的氨基酸也能以盐或水合物的形式存在。当提及作为肽的一部分或在肽中的氨基酸时，应将其理解为指的是衍生自相应氨基酸的相应肽结构的那部分。
根据本发明的“生长因子”应理解为能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的任何天然存在的物质。优选的生长因子为蛋白质或类固醇激素的形式。根据本发明的一个实施方案，“生长因子”的表述应解释为涉及选自以下的生长因子：成纤维细胞生长因子(FGF)(包括酸性FGF和碱性FGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)(包括TGFα和TGFβ)、细胞因子(例如白细胞介素1、2、6)、粒细胞刺激因子和白细胞抑制因子(LIF)。
根据本发明的“肽”应理解为由2至20个氨基酸组成的肽化合物。
涉及氨基酸的“N-酰化”的表述应理解为意指通过向氨基酸的α-氨基基团添加酰基来修饰N-酰化氨基酸。
营养素组合物、培养基、细胞培养基等的“无菌形式”应理解为限定在所述组合物、培养基、细胞培养基等中不存在任何生命物质。
在本发明的范围内，“固体培养基”应理解为任何非液体或非气体培养基。本发明优选的固体培养基为凝胶样培养基，例如琼脂、角叉菜胶或明胶。
在本发明的范围内，“细胞的传代”(也称为细胞的传代培养或分瓶)应理解为意思是将少量的细胞转移到新的培养容器中。如果细胞定期地分瓶，则其能够培养更长的时间，因为这避免了与持续很久的高细胞密度相关的衰老。悬浮培养用少量含有少许细胞的培养物稀释到更大体积的新鲜培养基中就能容易地进行传代。
本发明涉及细胞培养基，其包含来自N-酰化二肽酰基-X-Q的组中的L-谷氨酰胺和来自其他谷氨酰胺源Q源的组中的L-谷氨酰胺，其限定的摩尔比为R＝n(酰基-X-Q)/n(Q源)；
其中X定义为L-氨基酸；
其中Q定义为通过酰胺键与L-氨基酸X连接的L-谷氨酰胺；
其中酰基定义为通过酰胺键连接到L-氨基酸X的氨基末端的C1-C7-酰基部分；
其中R定义为0.03至20；
其中n(酰基-X-Q)是在培养基中的所述N-酰化二肽酰基-X-Q的组中包含的L-谷氨酰胺的物质总量；和
其中n(Q源)是在培养基中的所述其他谷氨酰胺源Q源的组中包含的L-谷氨酰胺的物质总量。
其他L-谷氨酰胺源(Q源)的组中的成分选自：游离的L-谷氨酰胺、二肽Y-Q或其混合物，其中Y定义为20种遗传编码的L-氨基酸中的一种，其中Q定义为通过酰胺键与L-氨基酸Y连接的L-谷氨酰胺，其中在二肽Y-Q中连接Y和Q的酰胺键是普通的主链酰胺键，其涉及氨基酸Y的羧基末端和谷氨酰胺Q的氨基末端。
在本发明的优选实施方案中，其他L-谷氨酰胺源(Q源)的组中的成分选自：游离的L-谷氨酰胺、二肽Y-Q或其混合物，其中Y为丙氨酸。在本发明进一步优选的实施方案中，所述其他L-谷氨酰胺源(Q源)的组中的唯一组分为二肽Y-Q，其中Y为丙氨酸。
本发明人发现这种类型的细胞培养基具有比现有技术细胞培养基更为优异的性质。本发明人发现，以指定的比例提供L-谷氨酰胺源导致细胞培养物的生产力提高。
根据本发明，在N-酰化二肽酰基-X-Q中的L-氨基酸X可以是任何天然L-氨基酸，即20种遗传编码的L-氨基酸中的任何一种，即X选自以下：
丙氨酸 (Ala/A)
精氨酸 (Arg/R)
天冬酰胺 (Asn/N)
天冬氨酸 (Asp/D)
半胱氨酸 (Cys/C)
谷氨酸 (Glu/E)
谷氨酰胺 (Gln/Q)
甘氨酸 (Gly/G)
组氨酸 (His/H)
异亮氨酸 (Ile/I)
亮氨酸 (Leu/L)
赖氨酸 (Lys/K)
甲硫氨酸 (Met/M)
苯丙氨酸 (Phe/F)
脯氨酸 (Pro/P)
丝氨酸 (Ser/S)
苏氨酸 (Thr/T)
色氨酸 (Trp/W)
酪氨酸 (Tyr/Y)
缬氨酸 (Val/V)。
在本发明的一个优选实施方案中，X选自20种遗传编码的L-氨基酸，谷氨酰胺除外。
在本发明的其他优选实施方案中，X选自：Ala、Gly、Asn。在本发明进一步的优选实施方案中，X为Ala。
根据本发明，在N-酰化二肽酰基-X-Q中连接X和Q的酰胺键是普通的主链酰胺键，其涉及氨基酸X的羧基末端和谷氨酰胺Q的氨基末端。
根据本发明，N-酰化二肽酰基-X-Q的C1-C7-酰基部分定义为酰基RA-C(O)-，其中RA为直链或支链C1-C6-烷基或C3-C6-环烷基。
有用的直链或支链C1-C6-烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、仲丁基、叔丁基、新戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基等。
有用的C3-C6-环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
优选地，N-酰化二肽酰基-X-Q的C1-C7-酰基部分为乙酰基，即优选RA为甲基。
根据本发明，N-酰化二肽酰基-X-Q的酰基通过酰胺键连接到L-氨基酸X的氨基末端。
优选地，在本发明的培养基中的N-酰化二肽酰基-X-Q的组选自乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q、乙酰基-N-Q或其混合物。非常优选地，在本发明的培养基中的N-酰化二肽酰基-X-Q的组仅含有乙酰基-A-Q。
在本发明的培养基中的所有包含L-谷氨酰胺的物质能够分配至两组不相交的物质的组中的任何一组：
(i)N-酰化二肽酰基-X-Q，其酰基和X如在各实施方案中所定义的；
(ii)其他L-谷氨酰胺源Q源的组。
因此，与N-酰化二肽酰基-X-Q(其酰基和X如在各实施方案中所定义的)的定义不相符的本发明的培养基中所包含L-谷氨酰胺的物质的组中的所有物质构成其他L-谷氨酰胺源Q源的组。
根据本发明，摩尔比R＝n(酰基-X-Q)/n(Q源)优选选自以下范围：0.03至20；R＝0.04至15.67；R＝0.05至10；R＝0.05至5。在本发明的优选实施方案中，R选自R＝0.04至15.67。
本发明的培养基可以为液体形式、可以为凝胶形式(例如含琼脂、角叉菜胶或明胶的培养基)，或者可以为粉末、颗粒、丸剂或可以为片剂形式。在优选的实施方案中，培养基为液体形式。
优选地，培养基为无菌形式。
在优选的实施方案中，本发明的培养基为化学成分确定的培养基或无血清培养基。在进一步优选的实施方案中，本发明的培养基为化学成分确定的培养基。为获得这样的培养基，例如，N-酰化二肽酰基-X-Q可以补充到Miltenyi Biotech(Bergisch Gladbach，Germany)的CHOMACS CD培养基、可从LONZA(Basel,Switzerland)获得的PowerCHO-2CD培养基、PAA(PAA Laboratories，Pasching，Austria)的Acti-CHO P培养基、可从SAFC获得的Ex-Cell CD CHO培养基、ThermoFisher(Waltham，USA)的SFM4CHO培养基和CDM4CHO培养基、DMEM培养基(Life Technologies Corp.,Carlsbad,USA)中，从而产生如本发明所指定的合适的化学计量比的L-谷氨酰胺源。但是，本发明不限于对上述培养基的补充。
在本发明的一个实施方案中，培养基不含生长因子。在本发明的一些实施方案中，培养基不含任何脂质。
在其他优选的实施方案中，本发明的培养基为以相对于所述使用的培养基的浓度的2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍的浓缩形式(体积/体积)的液体培养基浓缩物。这允许通过用相应体积的无菌水对浓缩培养基进行简单稀释来制备“即用型”培养基。本发明的这种浓缩形式的培养基也可以通过将其加入培养物进行使用，例如在补料分批培养方法中。
本发明的培养基优选含有持续生长和产物形成所需的所有营养素。用于制备培养基(特别是细胞培养基)的配方是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Cell CultureTechnology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,and Wei-ShouHu eds.,Taylor and Francis Group 2006)。可从各种来源商购获得各种培养基。
本发明的培养基优选包括碳水化合物源。在细胞培养基中使用的主要碳水化合物为葡萄糖，以5至25nM进行常规补充。此外，可以使用任何己糖(例如半乳糖)、果糖或甘露糖或其组合。
培养基通常至少还包括必需氨基酸(即His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Tyr、Val)以及某些非必需氨基酸。如果细胞系不能合成非必需氨基酸或者如果细胞系不能产生足够数量的非必需氨基酸来支持最大生长，则通常将非必需氨基酸包括在细胞培养基中。
本发明的培养基优选包含盐。将盐加入细胞培养基中来维持等渗条件并且防止渗透不平衡。本发明的培养基的渗透压为大约300mOsm/kg，但是许多细胞系能够耐受在该值的大约10％的变化或更高的变化。一些昆虫细胞培养的渗透压倾向于高于300mOsm/kg，这可能比300mOsm/kg高0.5％、1％、2％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％。在细胞培养基中最常用的盐包括Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO4 2-、PO4 3-和HCO3 -(例如CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)。
其他无机元素可以存在于培养基中。它们包括Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si和Ni。这些元素多数涉及酶活性。它们可以以盐(例如CaCl2、Fe(NO3)3、MgCl2、MgSO4、MnCl2，NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)以及微量元素(例如硒、钒和锌)的离子的形式提供。这些无机盐和微量元素可以商购获得，例如从Sigma(Saint Louis，Missouri)获得。
本发明的培养基优选包含维生素。维生素通常被细胞用作辅因子。每种细胞系的维生素需求差异很大，但是如果细胞培养基含有少量或没有血清或者如果细胞以高密度生长，则通常需要额外的维生素。优选地存在于本发明的培养基中的示例性维生素包括生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-Ca++-泛酸盐、吡哆醛、核黄素、硫胺素、吡哆醇、烟酰胺、维生素A、B6、B12、C、D3、E、K和对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid，PABA)。
根据本发明的复杂培养基还可以包含血清。血清是凝结的血液的上清液。血清成分包括附着因子、微量营养素(例如微量元素)、生长因子(例如激素、蛋白酶)和保护性元素(例如抗毒素、抗氧化剂、抗蛋白酶)。血清可从多种动物来源获得，包括人、牛或马血清。当包括在根据本发明的细胞培养基中时，血清通常以5-10％(体积)的浓度进行添加。优选的细胞培养基为无血清的细胞培养基。
为了在无血清或血清减少的培养基中促进细胞生长，可以将下述多肽中的一种或多种加入到本发明的细胞培养基中：例如，成纤维细胞生长因子(FGF)(包括酸性FGF和碱性FGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)(包括TGFα和TGFβ)、任何细胞因子(例如白细胞介素1、2、6、粒细胞刺激因子、白细胞抑制因子(LIF)等)。但是，本发明的培养基也可以不包括上述列出的生长因子。
在其他实施方案中，所述细胞培养基不含多肽(即具有超过20个氨基酸的肽)。
还可以将一种或多种脂质加入到本发明的细胞培养基中，例如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、棕榈油酸、油酸、多烯酸和/或12、14、16、18、20或24个碳原子的脂肪酸(各碳原子分支或未分支)、磷脂、卵磷脂(磷脂酰胆碱)和胆固醇。可以将这些脂质中的一种或多种作为补充物包括在无血清培养基中。磷脂酸和溶血磷脂酸刺激某些锚定依赖性细胞(例如MDCK、小鼠上皮细胞和其他肾脏细胞系)的生长，而磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇刺激人成纤维细胞在无血清培养基中的生长。乙醇胺和胆固醇也已被证明促进某些细胞系的生长。在某些实施方案中，细胞培养基不含脂质。
还可以将一种或多种载体蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)或转铁蛋白)加入到细胞培养基中。载体蛋白质能够帮助运输某些营养素或微量元素。BSA通常用作脂质(例如亚油酸和油酸，其不溶于水溶液)的载体。此外，BSA还能够作为某些金属(例如Fe、Cu和Ni)的载体。在无蛋白质制剂中，非动物来源的BSA的替代物(例如环糊精)能够用作脂质载体。
还可以将一种或多种附着蛋白(例如纤连蛋白、层粘连蛋白和pronectin)添加到细胞培养基中来帮助促进锚定依赖性细胞附着至基质。
细胞培养基可任选包括一种或多种缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于N-[2-羟乙基]-哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸盐、碳酸氢盐和其它适用于细胞培养应用的缓冲剂。合适的缓冲剂是提供缓冲能力而对所培养的细胞没有实质的细胞毒性的缓冲剂。合适的缓冲剂的选择是在细胞培养领域普通技术的范围之内。
可以将聚阴离子或聚阳离子化合物加入到培养基中以防止细胞聚集并且促进细胞的悬浮生长。
在优选的实施方案中，存在于根据本发明的液体培养基中的N-酰化二肽酰基-X-Q的总浓度为0.01克/升至20克/升或0.1克/升至10克/升或0.5克/升至5克/升。在其他优选的实施方案中，存在于根据本发明的液体培养基中的N-酰化二肽酰基-X-Q的总浓度高于0.01mM、0.02mM、0.04mM、0.08mM、0.2mM、0.4mM或1mM。还优选为液体培养基，其中存在的N-酰化二肽酰基-X-Q的总浓度低于50mM、20mM、10mM、5mM或2mM。优选地，存在于根据本发明的液体培养基中的N-酰化二肽酰基-X-Q的总浓度为0.01mM至40mM或0.1mM至20mM或0.1mM至10mM或0.5mM至10mM或1mM至10mM或1mM至8mM或1mM至6mM。在一个非常优选的实施方案中，存在于根据本发明的液体培养基中的N-酰化二肽酰基-X-Q的总浓度为1mM至8mM，酰基为乙酰基，并且X为丙氨酸。上述浓度以在非浓缩培养基中的浓度给出，即在实际的培养物中存在的浓度。浓缩培养基可包括X倍的浓度。
本发明的培养基可以为浓缩形式。它可以是例如2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的浓缩形式(相对于支持细胞的生长和产物形成的浓度)。这种浓缩培养基有助于制备通过用含水溶剂(例如水)稀释浓缩培养基来使用的培养基。这种浓缩培养基可以用于分批培养，但也有利地用于补料分批培养或连续培养，其中将浓缩营养素组合物加入正在进行的细胞培养中，例如补充培养期间被细胞消耗的营养素。
本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞的用途。本发明的另一方面涉及本发明的培养基用于制备细胞培养产物的用途。
本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的培养基用于培养动物细胞或植物细胞(最优选为哺乳动物细胞)的用途。在具体的实施方案中，待培养的细胞为CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。本发明优选的细胞为CHO细胞和杂交瘤细胞。本发明最优选的细胞为CHO细胞。本发明特别优选的CHO细胞为CHO DG44和CHODP12细胞。
在本发明的范围内还包括培养细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与根据本发明的细胞培养基接触。在本发明的一个实施方案中，培养细胞的方法包括在支持所述细胞培养的条件下将所述细胞与基础培养基接触，并且用本发明的浓缩培养基补充基础细胞培养基。在优选的实施方案中，在超过一天的时间上用浓缩补料或浓缩培养基补充基础培养基。
本发明的另一方面涉及制备根据本发明的培养基的方法。制备根据本发明的培养基的方法至少包括一个向培养基中加入至少一种本发明的N-酰化二肽酰基-X-Q的步骤。同样地，本发明的一个方面涉及本发明的至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于制备细胞培养基的用途。
本发明的另一方面涉及修饰培养基的方法，其中所述培养基的所述修饰包括向所述培养基中加入至少一种本发明的N-酰化二肽酰基-X-Q。
本发明的另一方面涉及制备液体培养基的方法，所述方法包括提供根据本发明的固体培养基，例如以干粉形式、或以颗粒形式、或以丸剂形式或以片剂形式；并且将所述固体培养基溶解在含水介质(例如水)中。
本发明的另一方面涉及根据本发明的至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于培养细胞的用途。本发明的另一方面涉及根据本发明的至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途。
本发明还涉及制造细胞培养产物的方法，其包括以下的步骤：(i)提供能够制备所述细胞培养产物的细胞；(ii)将所述细胞与本发明的培养基接触；和(iii)从所述培养基或从所述细胞中获得所述细胞培养产物。同样地，本发明涉及根据本发明的至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于制造细胞培养产物的用途。
在优选的方法中，细胞培养产物为治疗性蛋白质、诊断蛋白质、多糖(例如肝素)、抗体、单克隆抗体、生长因子、白细胞介素、病毒、病毒样颗粒或酶。
根据本发明的细胞培养能以分批培养、补料分批培养或连续培养进行。
在根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以1至8mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以1至8mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以1至8mM的浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.5至10mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.5至10mM的浓度存在，并且细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.5至10mM的浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.1至20mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.1至20mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.1至20mM的浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以1至8mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以1至8mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以1至8mM的浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.5至10mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.5至10mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.5至10mM的浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.1至20mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.1至20mM的浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q，乙酰基-A-Q以0.1至20mM的浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以1至8mM的总浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以1至8mM的总浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以1至8mM的总浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以0.5至10mM的总浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以0.5至10mM的总浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以0.5至10mM的总浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以0.1至20mM的总浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以0.1至20mM的总浓度存在，并且所述细胞为CHO细胞或杂交瘤细胞。在另一个根据本发明的优选的培养细胞的方法或至少一种N-酰化二肽酰基-X-Q用于细胞培养的用途中，所述N-酰化二肽酰基-X-Q为乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q或其混合物，N-酰化二肽酰基-X-Q以0.1至20mM的总浓度存在，并且所述细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的优选的实施方案中的所述N-酰化二肽酰基-X-Q的组、所述其它L-谷氨酰胺源Q源的组，其摩尔比R＝n(酰基-X-Q)/n(Q源)限定如下：在这些优选的实施方案中，所述细胞培养基为化学成分确定的培养基，N-酰化二肽酰基-X-Q以1mM至8mM的总浓度存在；在优选的细胞培养产品的使用和制备的方法中，将CHO细胞与这种优选的细胞培养基接触：
实施例
实施例1：在分批培养中乙酰基-A-Q与不同的谷氨酰胺源的混合物将乙酰基-A-Q与游离的谷氨酰胺或A-Q以0至100％的摩尔比混合。将混合物加入不含谷氨酰胺的培养基(PowerCHO-2CD，Lonza AG，Visp，Switzerland)中，在最终的培养基中获得的谷氨酰胺总浓度为8mM。使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Subclone DG44；Life TechnologiesCooperation，Carlsbad，USA)来测量生长和生产力。培养持续至培养物的存活率降至80％以下。使用来自第三次传代的数据。将乙酰基-A-Q与游离的谷氨酰胺(Q)混合的结果总结在表1中。相对于100％游离的谷氨酰胺的滴度给出所有的滴度相关的信息。因此，通过首先将相对滴度除以活细胞密度积分(integrated viable cell density，IVCD)，然后将该数除以100％游离的谷氨酰胺的滴度/IVCD比，以获得相对细胞特异性生产力。通过将相对滴度除以直到取样时的培养持续时间，然后将该数除以游离的谷氨酰胺的滴度/培养时间比，以获得相对时间特异性生产力。
表1:
使用100％乙酰基-A-Q产生相对滴度和细胞特异性生产力的最佳值，但亚临界细胞密度可以使培养物不那么稳健。令人惊讶的是，加入游离的谷氨酰胺会增加相对时间相关的生产力。相对滴度和时间相关的生产力的最佳组合发现在用75％乙酰基-A-Q和25％游离的谷氨酰胺时。
在同一实验活动中的第二组实验中，将乙酰基-A-Q与A-Q混合并且在与上述相同的条件下进行测试。乙酰基-A-Q以及游离的谷氨酰胺参考的100％点与第一个实施例相同。
表2：
令人惊讶的是，通过将75％乙酰基-A-Q与25％A-Q组合而制成的补充剂导致细胞特异性生产力和时间特异性生产力以及相对滴度的最佳组合。它也优于乙酰基-A-Q和游离的谷氨酰胺的组合。目前的行业标准(用100％A-Q的补充)在所有相关类别中以较低的水平进行。
实施例2：在补料分批培养中乙酰基-A-Q与不同谷氨酰胺源的混合物
将游离的谷氨酰胺、A-Q或乙酰基-A-Q加入到不含谷氨酰胺的培养基(PowerCHO-2CD，Lonza AG，Visp，Switzerland)中，在最终的培养基中获得的谷氨酰胺总浓度为8mM。此外，将这些物质以及75％的乙酰基-A-Q和A-Q的混合物加入到商业补料补充剂(CHOMACSFeed Supplement，Miltenyi Biotech，Germany)的不含谷氨酰胺的制剂中，以得到5.5克/升的谷氨酰胺浓度。使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Subclone DG44；Life TechnologiesCooperation，Carlsbad，USA)来测量生长和生产力。结果总结在表3中。所有的滴度相关的信息以相对于通过向基础培养基和补料中加入游离的谷氨酰胺获得的滴度给出。因此，通过首先将相对滴度除以活细胞密度积分(IVCD)，然后将该数除以100％游离的谷氨酰胺的滴度/IVCD比，以获得相对细胞特异性生产力。通过将相对滴度除以直到取样时的培养持续时间，然后将该数除以游离谷氨酰胺的滴度/培养时间比，以获得相对时间特异性生产力。
表3：
令人惊讶的是，对于补料分批操作发现了相同的趋势。仅用乙酰基-A-Q培养导致非常高的细胞特异性生产力，但是细胞密度非常低。在该具体组的实验中，它甚至导致非常低的滴度水平。这些实验也表明，先前选择的75％/25％比的乙酰基-A-Q和A-Q的组合也能够成功地用作补料补充剂的谷氨酰胺源。总之，在基础培养基中将谷氨酰胺源(例如Q或A-Q)与补料中的乙酰基-A-Q组合总是比与在补料中的Q或A-Q的组合更好。将在基础培养基中的A-Q与补料中的乙酰基-A-Q和A-Q的混合物组合导致总体上得到最佳性能组合。

Claims (13)

1.细胞培养基，其包含来自N-酰化二肽酰基-X-Q的组中的L-谷氨酰胺和来自其他谷氨酰胺源Q源的组中的L-谷氨酰胺，其限定的摩尔比为R＝n(酰基-X-Q)/n(Q源)；
其中X定义为L-氨基酸；
其中Q定义为通过酰胺键与L-氨基酸X连接的L-谷氨酰胺；
其中酰基定义为通过酰胺键连接到L-氨基酸X的氨基末端的C1-C7-酰基部分；
其中R定义为0.03至20；
其中n(酰基-X-Q)是在培养基中的所述N-酰化二肽酰基-X-Q的组中包含的L-谷氨酰胺的物质总量；和
其中n(Q源)是在培养基中的所述其他谷氨酰胺源Q源的组中包含的L-谷氨酰胺的物质总量，
其中其他L-谷氨酰胺源Q源的组中的成分选自：游离的L-谷氨酰胺、二肽Y-Q或其混合物，其中Y定义为20种遗传编码的L-氨基酸中的一种，
其中Q定义为通过酰胺键与L-氨基酸Y连接的L-谷氨酰胺，其中在二肽Y-Q中连接Y和Q的酰胺键是普通的主链酰胺键，其涉及氨基酸Y的羧基末端和谷氨酰胺Q的氨基末端，
其中所述N-酰化二肽酰基-X-Q的组定义为如下：乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q、乙酰基-N-Q中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基是无血清的细胞培养基。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基是化学成分确定的细胞培养基。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中在所述其他L-谷氨酰胺源Q源的组中的唯一成分为二肽Y-Q，其中Y为丙氨酸。
5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中在所述其他L-谷氨酰胺源Q源的组中的唯一成分为游离的L-谷氨酰胺。
6.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中N-酰化二肽酰基-X-Q的总浓度为1mM至8mM。
7.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中摩尔比R＝n(酰基-X-Q)/n(Q源)定义为0.04至15.67。
8.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述N-酰化二肽酰基-X-Q的组定义为如下：乙酰基-A-Q、乙酰基-G-Q中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述N-酰化二肽酰基-X-Q的组定义为如下：乙酰基-A-Q。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基是化学成分确定的细胞培养基；
其中在所述其他L-谷氨酰胺源Q源的组中的唯一成分为二肽Y-Q，其中Y为丙氨酸；
其中摩尔比R＝n(酰基-X-Q)/n(Q源)定义为0.04至15.67；
其中所述N-酰化二肽酰基-X-Q的组定义为如下：乙酰基-A-Q；和其中乙酰基-A-Q的浓度为1mM至8mM。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的细胞培养基用于培养细胞的用途。
12.用于制备细胞培养产物的方法，其包括步骤：将细胞与根据权利要求1至10中任一项所述的细胞培养基接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中与细胞培养基接触的细胞为CHO细胞。
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