JP2023522059A - Ｃｙｓ－ペプチドを含む組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、システイン（Ｃｙｓ）である一つのアミノ酸を伴うアルファ－ペプチド結合のみを含む少なくとも１つのオリゴペプチドと、遊離システインとを含む組成物に関する。本発明は、さらに、培養培地、および細胞、好ましくは植物細胞、動物細胞または哺乳動物細胞を培養するための、本発明の培養培地の使用、および細胞培養産物を製造する方法に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、システイン（Ｃｙｓ）である１つのアミノ酸を伴う少なくとも１つのオリゴペプチド、好ましくはジペプチドを、遊離システインおよび必要に応じてシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）から選択されるシステイン供給源と混合することによって調製される組成物であって、ｐＨ値が少なくとも５、好ましくは少なくとも６である、組成物に関する。当該組成物は、遊離システイン／シスチンと比較して安定性／溶解性が改善されるという利点を有し、細胞、組織、器官および生物体全体へのシステイン／シスチンの供給源をもたらすために使用され得る。

さらに、本発明は、バイオテクノロジーによる産生プロセスに関する。より詳細には、本発明は、バイオテクノロジーによる産生プロセスにける使用のための改善された培養培地、そのような改善された培地を使用するプロセス、および改善された培養培地を使用するプロセスから得られる産物に関する。

システインは、ヒトの栄養補給、化粧品から、細胞および組織培養プロセスまで、種々の用途に使用される重要なアミノ酸である。システインは、タンパク質の構成単位であり、また、重要な細胞抗酸化物質であり、酸化還元恒常性の調節に関与するグルタチオンの構成単位である。経口栄養システイン／シスチン補給に関して種々の健康利益が実証されている（Ｐｌａｚａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１８、２３、５７５によって概説されている）。

システイン／シスチンはまた、細胞培養培地製剤中にも存在する。システインは必須アミノ酸ではないが、生物学的製剤産生のための細胞培養プロセスにおいて制限されると、生存能および生産性の著しい低下が導かれる恐れがある。他方では、システインの過剰摂取により毒作用が導かれる恐れがある（Ｒｉｔａｃｃｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ、２０１８、３４巻、６号）。

種々の用途のための、高度に濃縮された液体栄養液中システインの製剤に関する主要な問題は、システインが酸素の存在下で急速に酸化してシスチンになり、３から９の間のｐＨ範囲でシスチンの溶解度が＜１ｍＭと低いことである（Ｃａｒｔａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ、Ｅｎｇ、Ｄａｔａ １９９６、４１、４１４－４１７）。

この問題に対する解決法は、（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２および（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２などの十分な可溶性をもつＣｙｓ－ジペプチドをシステイン／シスチンの供給源として使用することである。これらのペプチドは、細胞培養、非経口栄養に使用されており、また、化粧品への適用に関して調査が行われている（下の参考文献を参照されたい）。

しかし、ジペプチドを生成するために追加的な合成および精製ステップが必要になるので、ジペプチドは、遊離システインおよびシスチンよりも著しく費用がかかる。したがって、費用対効果がより高い、高度に濃縮されたシステイン／シスチン製剤が依然として必要とされている。ペプチド内の他のアミノ酸の性質に応じて溶解性の増大が十分な高さにならないこともあり、それにより、製剤の可能性に対するさらなる制限が提起される。

ＥＰ２５６１０６５Ｂ１には、最大の細胞成長および／またはタンパク質またはウイルス産生を支持する一方で、溶解性および安定性の限定によって引き起こされる問題を回避する濃度のシステインおよびチロシンを含む、濃縮された供給液が開示されている。

ＵＳ２０１３／０１３０３１７Ａ１には、物質を産生する能力を有する動物細胞を培養するための方法であって、動物細胞を、１つまたは複数のＬ－システインを有し、グルタチオンを除くオリゴペプチドを補充した培地で培養するステップを含む、方法が記載されている。

同じ理由で、Ｃｙｓ－ペプチドは、非経口栄養（Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｅｒｎａｈｒｕｎｇｓｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ １９８９、２８：１９１－２００）および化粧品への適用（Ｔｓｅｎｇら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２０１５、６３：６１８１－６１８８）においてもシステインの代替として評価されている。

しかし、合成ペプチドはアミノ酸よりも著しく多くの費用がかかり、したがって、システインを沈殿に対して安定化するための、費用がより少ない解決法が望まれる。酸素を物理的に排除することができる場合には、還元剤を使用してシステインからのシスチン形成をある特定の程度まで防止することができるが（参考文献）、望ましくないことも多い。また、この手法は、例えば、細胞培養のために使用される通気バイオリアクター環境など、高い酸素濃度および酸素供給の存在下では機能しない。

欧州特許登録番号２５６１０６５Ｂ１ 米国特許公開番号２０１３／０１３０３１７Ａ１

Ｐｌａｚａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１８、２３、５７５ Ｒｉｔａｃｃｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ、２０１８、３４巻、６号 Ｃａｒｔａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ、Ｅｎｇ、Ｄａｔａ １９９６、４１、４１４－４１７ Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｅｒｎａｈｒｕｎｇｓｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ １９８９、２８：１９１－２００ Ｔｓｅｎｇら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２０１５、６３：６１８１－６１８８

いくつかのＣｙｓ－ペプチド（例えば（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２）に関しては、溶解性が、依然として、高度に濃縮されたストック溶液または供給を調製するためには十分に高いものではない。しかし、現代の細胞培養バイオプロセシングでは、プロセスを強化するため、ならびに、柔軟性および生産性を低減させる恐れがあり、下流の処理を複雑化し、また、高い環境負荷が伴う過剰な液体処理（例えば灌流系におけるもの）を回避するために、アミノ酸およびペプチドの高濃縮溶液が重要である。

水を含む食品および化粧品または非経口栄養用の栄養液に関しても同様の問題が存在する。

高度に濃縮されたシステインを含有する液体製剤の上記の欠点は、本発明によって対処される。本発明は、添付の独立請求項の条項によって定義される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項によって定義される。

驚いたことに、システインを含有するオリゴペプチド、ジペプチド、および／またはそれらのジスルフィドを添加することにより、システインの高濃縮溶液を酸化的沈殿に対して安定化することができることが見いだされた。さらにいっそう驚いたことに、一部の場合では、それぞれの混合物により、さらにはそれぞれのＣｙｓ－オリゴペプチドの溶解性の増大がもたらされた。少量のシステイン（または他のチオール、調査していない）の存在下でＣｙｓ－ペプチドを添加することにより、シスチンを可溶化することができることも見いだされた。

得られる組成物は、ジペプチド単独と比較してシステイン当量あたりの費用を著しく少なく調製することができ、したがって、追加的な、現行の適用よりも費用重視の適用を可能にする、安定なシステイン形態である。さらなる利点は、ある特定の量の遊離システインが必要になる適用、例えば、システインまたはシスチンが放出されるオリゴペプチドまたはジペプチドの加水分解速度が律速になる場合に使用できることである。

組成物は、規定のモル比のＣｙｓ－オリゴペプチドまたはＣｙｓ－ジペプチドをシステインと混合することによって、または規定のモル比のＣｙｓ－ジペプチドをシステインおよびシスチンと混合することによって、調製され得る。オリゴペプチドとして結合しているシステインの遊離システインに対する好ましいモル比は１０未満、好ましくは４未満、より好ましくは２未満、より好ましくは１未満、より好ましくは０．５未満、最も好ましくは０．２未満である。混合物は、固体（結晶性粉末、集塊など）または水溶液の形態であり得る。水溶液の場合では、システインを少なくとも１ｍＭ、好ましい少なくとも１０ｍＭ、より好ましくは少なくとも５０ｍＭおよび最も好ましくは少なくとも１００ｍＭの濃度で添加し、ジペプチドを上記の適当なモル比で添加する。

本発明による組成物はまた、化粧品、栄養補助食品、臨床的栄養補給用の栄養液、または細胞もしくは組織培養培地（基本培地、供給培地または灌流培地）の成分にもなり得る。

したがって、本発明は、システイン（Ｃｙｓ）である１つのアミノ酸を伴う少なくとも１つのオリゴペプチド、好ましくは少なくとも１つのジペプチドを、遊離システインおよび必要に応じてシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）から選択されるシステイン供給源と混合することによって調製された組成物に関する。したがって、本発明は、組成物を含む培養培地に関する。

本発明は、さらに、細胞、好ましくは植物細胞、動物細胞または哺乳動物細胞を培養するための、本発明の培養培地の使用に関する。

本発明の別の態様は、細胞培養産物を製造する方法であって、（ｉ）前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、（ｉｉ）前記細胞を、本発明による培養培地と接触させるステップと、（ｉｉｉ）前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップとを含む、方法に関する。

本発明の好ましい実施形態を以下の本発明の詳細な説明にさらに詳細に記載する。

ｐＨ＝７における、漸増濃度の（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２の存在下、３７℃で２４時間にわたる１００ｍＭのシステイン溶液中での沈殿物の形成を示すグラフである。 漸増量のシステインを添加することによる、５０ｍＭの（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２懸濁液の濁度の低下を示すグラフである。 種々の濃度の（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を添加することによる、１００ｍＭのシステイン溶液の酸化的沈殿に対する安定化を示すグラフである。 ５０ｍＭのシステイン溶液に種々の濃度のＣｙｓ－ペプチドを添加することによってもたらされる、酸化的沈殿に対する安定化効果を示すグラフである。 ２５ｍＭのシステイン溶液に種々の濃度のＣｙｓ－ペプチドを添加することによってもたらされる、酸化的沈殿に対する安定化効果を例示するグラフである。

本発明に関しては、「天然アミノ酸」という表現は、上に列挙されている２０種のアミノ酸のＬ形態およびＤ形態の両方を包含すると理解されるものとする。しかし、Ｌ形態が好ましい。一実施形態では、「アミノ酸」という用語は、これらのアミノ酸の類似体または誘導体も包含する。

本発明による「遊離アミノ酸」、例えば「遊離」システインは、そのアミノ官能基および（アルファ－）カルボキシ官能基が遊離形態である、すなわち、他の分子と共有結合していないアミノ酸、例えば、ペプチド結合を形成していないアミノ酸であると理解される。遊離アミノ酸は、塩として、または水和物の形態でも存在し得る。ジペプチドの一部としてまたはジペプチド内のアミノ酸に言及する場合、それぞれのアミノ酸から生化学およびペプチド生合成の既知の機構に従って誘導されたそれぞれのジペプチド構造の一部を指すと理解されるものとする。

本発明は、一般には、システイン（Ｃｙｓ）である１つのアミノ酸を伴う、少なくとも１つのオリゴペプチドと、遊離システイン（システイン供給源として）とを含む組成物に関する。必要に応じて、遊離システインおよび遊離シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）を含めることができる。遊離システインおよび遊離シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）という用語は、システインおよびシスチンの塩または水和物の形態を包含するものとする。

オリゴペプチドはジペプチドであることが好ましい。

「ペプチド」は、アルファ－ペプチド結合（Ｒ^１－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ^２）によって互いに共有結合によりカップリングした少なくとも２つのアミノ酸を含む分子であると理解されるものとする。

「ポリペプチド」は、ペプチド結合（Ｒ^１－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ^２）によって互いに共有結合によりカップリングした２０個を超えるアミノ酸を含む分子であると理解されるものとする。

「オリゴペプチド」は、アルファ－ペプチド結合（Ｒ^１－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ^２）のみによって互いに共有結合によりカップリングした２０個未満、好ましくは２～１０個のアミノ酸を含む分子と理解されるものとする。グルタチオンは、ガンマ－ペプチド結合およびアルファ－ペプチド結合を含有するＧｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙトリペプチドであり、したがって、除外される。

「ジペプチド」は、アルファ－ペプチド結合（Ｒ^１－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ^２）によって互いに共有結合によりカップリングした２つのアミノ酸を含む分子であると理解されるものとする。

「Ｘｘｘ」という表現は、アミノ酸と関連して本明細書で使用される場合、以下に定義される任意の天然アミノ酸を指すと理解されるものとする。

「アミノ酸」は、本発明に関しては、アミノ官能基（－ＮＨ_２）およびカルボン酸官能基（－ＣＯＯＨ）を、それぞれのアミノ酸に特異的な側鎖と共に含む分子であると理解されるものとする。本発明に関しては、アルファアミノ酸およびベータアミノ酸のどちらも包含される。本発明の好ましいアミノ酸は、アルファアミノ酸、特に、以下の通り、シスチンを含めた２０種の「天然アミノ」酸である：
アラニン（Ａｌａ／Ａ）
アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）
アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）
アスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）
システイン（Ｃｙｓ／Ｃ）
シスチン（Ｃｙｓｓ／Ｃ２）
グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）
グルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）
グリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）
ヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）
イソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）
ロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）
リシン（Ｌｙｓ／Ｋ）
メチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）
フェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ）
プロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）
セリン（Ｓｅｒ／Ｓ）
トレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）
トリプトファン（Ｔｒｐ／Ｗ）
チロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）
バリン（Ｖａｌ／Ｖ）

本発明に関しては、「天然アミノ酸」という表現は、上に列挙されている２０種のアミノ酸のＬ形態およびＤ形態の両方を包含すると理解されるものとする。しかし、Ｌ形態が好ましい。一実施形態では、「アミノ酸」という用語は、これらのアミノ酸の類似体または誘導体も含む。

本発明による「遊離アミノ酸」（例えば、「遊離システイン」）は、そのアミノ官能基および（アルファ－）カルボキシ官能基が遊離形態である、すなわち、他の分子と共有結合していないアミノ酸、例えば、ペプチド結合を形成していないアミノ酸であると理解される。遊離アミノ酸は、塩としてまたは水和物の形態でも存在し得る。ジペプチドの一部としてまたはジペプチド内のアミノ酸に言及する場合、それぞれのアミノ酸から生化学およびペプチド生合成の既知の機構に従って誘導されたそれぞれのジペプチド構造の一部を指すと理解されるものとする。

「Ｎ－アシル化」という表現は、アミノ酸などの化学化合物に関しては、Ｎ－アシル化化合物が、前記化合物の窒素官能基へのアシル基の付加によって修飾されたものであることを意味すると理解されるものとする。アシル基はアミノ酸のアルファ－アミノ基に付加されることが好ましい。

本発明に関しては、酸化されたシステイン残基を介してジスルフィド結合を形成するＣｙｓ－ペプチドは、（Ｘｘｘ－Ｃｙｓ）_２と記載されるものとする。ペプチドは、塩としてまたは水和物の形態でも存在し得る。そのようなジスルフィド結合により媒介されるＣｙｓ－ジペプチドの二量体、例えば（Ｘｘｘ－Ｃｙｓ）_２も本発明の意味ではなおジペプチドとみなされる。

組成物の２５℃におけるｐＨ値は少なくとも５であることが好ましい、または少なくとも６であることが好ましい。

本発明の有利な構成では、ペプチド結合システインの遊離システインに対するモル比は、０．１から１０の間、好ましくは０．２から４未満の間、最も好ましくは０．５から２の間である。好ましい実施形態では、オリゴペプチドまたはジペプチドは、還元された状態（＝遊離チオール）または酸化された状態（＝ジスルフィド結合した状態）のいずれか、好ましくは酸化された状態である。

代替の実施形態では、組成物は、ジペプチドとシステイン供給源の混合ジスルフィドを含む。

本発明の好ましい実施形態では、オリゴペプチドまたはジペプチドは、６から９の間のｐＨ範囲における溶解度が少なくとも＞１０ｇ／ｌの１種または複数の天然アミノ酸をさらに含み、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）から選択される。

前記オリゴペプチドがＸｘｘ－ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｘｘｘであるジペプチドであり、Ｘｘｘが天然アミノ酸であり、ジペプチドは、好ましくはＡｓｐ－Ｃｙｓ、Ｃｙｓ－Ａｓｐ、Ｌｙｓ－Ｃｙｓ、Ｃｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－ＣｙｓまたはＰｒｏ－Ｃｙｓであることが好ましい。好ましい構成では、前記ジペプチドは、前記培養培地中に、少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも１０ｍＭ、より好ましくは少なくとも５０ｍＭ、より好ましくは少なくとも１００ｍＭの濃度で存在する。そのような高濃度において、本発明による組成物により、システインを含有するジペプチドによってシステインが酸化的沈殿に対して安定化されるという利点がもたらされる。

好ましい実施形態では、オリゴペプチドまたはジペプチドはＮ－アシル化されていない。Ｎ－アシル化により、ある特定のジペプチドの熱安定性が改善されることが分かっているが、Ｎ－アシル化ジペプチドにより劣等の生存細胞密度および生存能が導かれる可能性もあることが見いだされている。

本発明はまた、本発明による組成物を含む化粧品、栄養補助食品または臨床的栄養補給用の栄養液にも関する。

化粧品は、皮膚または毛髪を処置するために使用されるシャンプー、コンディショナー、ローション、クリームまたは他の製剤であり得る。栄養補助食品は、シロップもしくはショットなどの液体の形態、または、カプセル剤、ソフトゲル剤、グミなどの固体の形態であり得る。組成物はまた、臨床的な経腸または非経口栄養用の栄養液の一部、例えば、Ａｍｉｎｏｖｅｎ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）などのアミノ酸溶液の一部であり得る。

さらに、本発明は、細胞または組織培養培地も指す。

本発明の別の主題は、本発明による組成物を含む細胞または組織培養培地であって、少なくとも１種の炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１種の無機塩、緩衝剤および／または少なくとも１種のビタミンをさらに含む、細胞または組織培養培地に関する。特に好ましい実施形態では、培養培地は、少なくとも１種の炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１種の無機塩、緩衝剤および少なくとも１種のビタミンの全てを含む。

本発明の一実施形態では、培養培地は、増殖因子を含有しない。この実施形態によると、本発明のオリゴペプチドまたはジペプチドを、培養下の細胞の成長および／または増殖を促進するための増殖因子の代わりに使用することができる。本発明の別の実施形態では、培養培地は、いかなる脂質も含有しない。

本発明の別の実施形態によると、培養培地は、液体の形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態またはタブレットの形態である。

好ましい実施形態では、本発明の培養培地は、限定培地、または無血清培地である。例えば、本発明の組成物を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＣＨＯＭＡＣＳ ＣＤ培地、ＬＯＮＺＡ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能なＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２ ＣＤ培地、ＰＡＡ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）のＡｃｔｉ－ＣＨＯ Ｐ培地、ＳＡＦＣから入手可能なＥｘ－Ｃｅｌｌ ＣＤ ＣＨＯ培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）のＳＦＭ４ＣＨＯ培地およびＣＤＭ４ＣＨＯ培地に補充することができる。本発明のジペプチドをＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）に補充することもできる。しかし、本発明は上記の培地への補充に限定されない。

他の好ましい実施形態では、培養培地は、使用時の前記培地の濃度に対して２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍または１０倍濃縮された形態（体積／体積）の液体培地である。これにより、濃縮された培地をそれぞれの体積の滅菌水で単に希釈することによって「すぐに使える」培養培地を調製することが可能になる。本発明のそのような濃縮された形態の培地はまた、それを、例えば、流加培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）または灌流プロセスにおいて培養物に添加することによって使用することもできる。

本発明の細胞培養培地（細胞または組織培養用の基本培地、供給培地または灌流培地）は、好ましくは持続的な成長および産物形成のために必要な全ての栄養分を含み得る。培養培地、特に細胞培養培地を調製するための配合は、当業者に周知である（例えば、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｏｚｔｕｒｋ ａｎｄ Ｗｅｉ－Ｓｈｏｕ Ｈｕ ｅｄｓ．， Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ ２００６を参照されたい）。種々の培養培地が種々の供給源から市販されている。

本発明の培養培地は、好ましくは炭水化物源を含み得る。細胞培養培地に使用される主要な炭水化物はグルコースであり、常套的に５～２５ｍＭで補充される。さらに、ガラクトース、フルクトース、またはマンノースなどの任意のヘキソースまたは組合せを使用することができる。

培養培地は、典型的に、少なくとも必須アミノ酸（すなわち、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｙ、Ｖａｌ）ならびに非必須アミノ酸も含み得る。非必須アミノ酸は、典型的に、細胞株がそのアミノ酸を合成することができない場合、または細胞株がそのアミノ酸を、最大の成長を支持するために十分な分量で産生することができない場合に、細胞培養培地に含められる。さらに、哺乳動物細胞は、主要なエネルギー源としてグルタミンも使用し得る。グルタミンは、多くの場合、他のアミノ酸よりも高い濃度（２～８ｍＭ）で含められる。しかし、上記の通り、グルタミンは、自然発生的に分解しアンモニアを形成する可能性があり、また、ある特定の細胞株はアンモニアをより速く産生し、これは毒性である。

本発明の培養培地は、好ましくは塩を含み得る。塩は、等張性の状態を維持し、浸透の不均衡を防止するために、細胞培養培地に添加される。本発明の培養培地の重量オスモル濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであるが、多くの細胞株はこの値以上のおよそ１０パーセントの変動を許容し得る。いくつかの昆虫細胞培養物の重量オスモル濃度は３００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも高い傾向があり、３００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも０．５パーセント、１パーセント、２～５パーセント、５～１０パーセント、１０～１５パーセント、１５～２０パーセント、２０～２５パーセント、２５～３０パーセント高くなり得る。細胞培養培地に最も一般的に使用される塩としては、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｌ^－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^３－、およびＨＣＯ_３ ^－（例えば、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４）が挙げられる。

他の無機の元素も培養培地中に存在し得る。それらとして、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｖａ、Ｓｅ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｉ、およびＮｉが挙げられる。これらの元素の多くは、酵素活性に関与する。これらの元素は、ＣａＣｌ_２、Ｆｅ（ＮＯ_３）_３、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４などの塩、ならびにセレン、バナジウムおよび亜鉛などの微量元素のイオンの形態で提供される。これらの無機塩および微量元素は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から、購入することができる。

本発明の培養培地は、好ましくはビタミンを含む。ビタミンは、典型的に、細胞によって補助因子として使用される。各細胞株のビタミン要件は著しく変動するが、一般に、細胞培養培地が血清をほとんどもしくは全く含有しない場合、または細胞を高密度で成長させる場合には、余分のビタミンが必要である。本発明の培養培地中に存在することが好ましい例示的なビタミンとしては、ビオチン、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ニコチンアミド、Ｄ－パントテン酸Ｃａ^＋＋、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ナイアシンアミド、Ａ、Ｂ_６、Ｂ_１２、Ｃ、Ｄ_３、Ｅ、Ｋ、およびｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）が挙げられる。

本発明の培養培地は、血清も含み得る。血清は、凝固した血液の上清である。血清成分としては、付着因子、微量栄養素（例えば、微量元素）、増殖因子（例えば、ホルモン、タンパク質分解酵素）、および保護要素（例えば、抗毒素、抗酸化物質、抗タンパク質分解酵素）が挙げられる。血清は、ヒト血清、ウシ血清またはウマ血清を含めた種々の動物供給源から入手可能である。本発明による細胞培養培地に含める場合、血清は、一般には、５～１０％（体積）の濃度で添加される。好ましい細胞培養培地は無血清である。

血清の非存在下または血清を減少させた培地での細胞成長を促進するために、以下のポリペプチドのうちの１種または複数を本発明の細胞培養培地に添加することができる：例えば、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦを含めた線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ならびに、ＴＧＦアルファおよびＴＧＦベータを含めたトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インターロイキン１、２、６などの任意のサイトカイン、顆粒球刺激因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）など。

他の実施形態では、細胞培養培地は、ポリペプチド（すなわち、２０個を超えるアミノ酸を有するペプチド）を含まない。

リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸、および／または炭素原子が１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、または２４個の脂肪酸（各炭素原子が分枝または非分枝）、リン脂質、レシチン（ホスファチジルコリン）、ならびにコレステロールなどの１種または複数の脂質も本発明の細胞培養培地に添加することができる。これらの脂質の１種または複数を補充として無血清培地に含めることができる。ホスファチジン酸およびリゾホスファチジン酸は、ある特定の足場依存性細胞、例えば、ＭＤＣＫ、マウス上皮、および他の腎細胞株などの成長を刺激し、一方、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルイノシトールは、無血清培地におけるヒト線維芽細胞の成長を刺激する。エタノールアミンおよびコレステロールも、ある特定の細胞株の成長を促進することが示されている。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は脂質を含有しない。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはトランスフェリンなどの１種または複数の担体タンパク質も細胞培養培地に添加され得る。担体タンパク質は、ある特定の栄養分または微量元素の輸送を補助し得る。ＢＳＡは、一般には、水溶液に不溶性であるリノール酸およびオレイン酸などの脂質の担体として使用される。さらに、ＢＳＡは、ある特定の金属、例えば、Ｆｅ、Ｃｕ、およびＮｉなどの担体としての役割も果たし得る。タンパク質を含まない製剤では、ＢＳＡの非動物由来の代用品、例えばシクロデキストリンなどを脂質担体として使用することができる。

足場依存性細胞の基質への付着の促進を補助するために、フィブロネクチン、ラミニン、およびプロネクチンなどの１種または複数の付着タンパク質も細胞培養培地に含められ得る。

細胞培養培地は、必要に応じて、１種または複数種の緩衝剤を含み得る。適切な緩衝剤としては、これだけに限定されないが、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］－ピペラジン－Ｎ’－［２－エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸、重炭酸塩および細胞培養への適用における使用に適した他の緩衝剤が挙げられる。適切な緩衝剤は、培養される細胞に対する実質的な細胞傷害性を伴わずに緩衝能をもたらすものである。適切な緩衝剤の選択は、細胞培養分野における通常の技術の範囲内に入る。

懸濁液中の細胞の凝集を防止し、細胞の成長を促進するために、ポリアニオン性またはポリカチオン性化合物も培養培地に添加することができる。

好ましい実施形態では、培養培地は、液体の形態である。しかし、培養培地は、ゲル様培地、例えば、寒天含有培地、カラゲーン含有培地またはゼラチン含有培地（粉末、凝集した粉末、インスタント化された粉末など）などの固形培地であってもよい。好ましくは培養培地は滅菌形態である。

本発明の培養培地は、濃縮された形態であり得る。本発明の培養培地は、例えば、２～１００倍濃縮された形態、好ましくは２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍濃縮された形態であり得る（細胞の成長および産物形成を支持する濃度に対して）。そのような濃縮された培養培地は、濃縮された培養培地を水などの水性溶媒で希釈することによって使用する培養培地の調製に役立つ。そのような濃縮された培養培地は、バッチ培養に使用することができるが、流加または連続培養においても有利に使用され、その場合、例えば、培養中に細胞によって消費される栄養分を補給するために、濃縮された栄養組成物が進行中の細胞培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）に添加される。

本発明の他の実施形態では、培養培地は、乾燥形態、例えば、乾燥粉末の形態、または顆粒剤の形態、またはペレットの形態、またはタブレットの形態である。

本発明は、細胞を培養するための、本発明の培養培地の使用にも関する。本発明の別の態様は、細胞培養産物を産生させるための、本発明の培養培地の使用に関する。

本発明の好ましい実施形態は、動物細胞または植物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞を培養するための、本発明による培養培地の使用に関する。特定の実施形態では、培養される細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＡＥ－１細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞およびハイブリドーマ細胞である。本発明の好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞およびハイブリドーマ細胞である。本発明の最も好ましい細胞はＣＨＯ細胞である。本発明の特に好ましいＣＨＯ細胞はＣＨＯ ＤＧ４４細胞およびＣＨＯ ＤＰ１２細胞である。

細胞を培養する方法であって、前記細胞を、本発明による細胞培養培地と接触させるステップを含む、方法も本発明の範囲に含まれる。本発明の一実施形態では、細胞を培養する方法は、細胞を、基本培養培地と、細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）を支持する条件下で接触させるステップと、基底細胞培養培地に、本発明による濃縮された培地を補充するステップとを含む。好ましい実施形態では、基本培養培地に濃縮された供給液または培地を１日よりも多くの日に補充する。

本発明の別の態様は、本発明による培養培地を作製する方法であって、前記培養培地が、本発明による組成物を含む、方法に関する。本発明による培養培地を作製する方法は、本発明の組成物を培養培地に添加する少なくとも１つのステップを含む。同様に、本発明の態様は、細胞培養培地を作製するための、本発明の組成物の使用に関する。

本発明の別の態様は、培養培地を改変する方法であって、前記培養培地の前記改変が、本発明の組成物を前記培養培地に添加することを含む、方法に関する。

本発明の別の態様は、液体培養培地を作製する方法であって、例えば、乾燥粉末の形態、または顆粒剤の形態、またはペレットの形態、またはタブレットの形態の本発明による固形培地を準備するステップと、前記固形培養培地を水などの水性媒体に溶解させるステップを含む、方法に関する。

本発明の別の態様は、細胞を培養するための培養培地への、本発明による組成物の使用に関する。本発明の別の態様は、細胞培養のための、本発明による組成物の使用に関する。

本発明は、細胞培養産物を製造する方法であって、（ｉ）前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、（ｉｉ）前記細胞を、本発明の培養培地と接触させるステップと、（ｉｉｉ）前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップとを含む、方法にも関する。同様に、本発明は、細胞培養産物を製造するための、本発明による組成物の使用に関する。

好ましい方法では、細胞培養産物は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、ヘパリンなどの多糖、抗体、モノクローナル抗体、増殖因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子または酵素である。

本発明による細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）は、バッチ培養、流加培養または連続培養で実施され得る。

項目
本発明は、以下の項目に関する：
１．システイン（Ｃｙｓ）である一つのアミノ酸を伴うアルファ－ペプチド結合のみを含む少なくとも１つのオリゴペプチドと、遊離システインとを含む組成物。
２．遊離システインおよび遊離シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）を含む、項目１に記載の組成物。
３．オリゴペプチドが、ジペプチドである、項目１または２に記載の組成物。
４．組成物の２５℃におけるｐＨ値が、少なくとも５、好ましくは少なくとも６である、項目１から３のいずれか１項に記載の組成物。
５．オリゴペプチドとして結合しているシステインの遊離システインに対するモル比が、約０．１から１０、好ましくは約０．２から４、最も好ましくは約０．５から２である、項目１から４のいずれか１項に記載の組成物。
６．オリゴペプチドが、還元された状態（＝遊離チオール）または酸化された状態（＝ジスルフィド結合した状態）のいずれか、好ましくは酸化された状態である、項目１から５のいずれか１項に記載の組成物。
７．オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Ｘｘｘ－ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｘｘｘであり、Ｘｘｘが、天然アミノ酸である、項目１から６のいずれか１項に記載の組成物。
８．オリゴペプチドが、２５℃、ｐＨ６からｐＨ９までのｐＨ範囲における溶解度が少なくとも１０ｇ／ｌの１種または複数の天然アミノ酸をさらに含み、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）から選択され、より好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓから選択される、項目１から７のいずれか１項に記載の組成物。
９．オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Ａｓｐ－Ｃｙｓ、Ｃｙｓ－Ａｓｐ、Ｌｙｓ－Ｃｙｓ、Ｃｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－ＣｙｓまたはＰｒｏ－Ｃｙｓであり、最も好ましくはＬｙｓ－ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｌｙｓである、項目１から８のいずれか１項に記載の組成物。
１０．オリゴペプチドが、ジペプチドであり、（Ｘｘｘ－Ｃｙｓ）_２または（Ｃｙｓ－Ｘｘｘ）_２であり、Ｘｘｘが、天然アミノ酸である、項目１から６、または８に記載の組成物。
１１．オリゴペプチドが、ジペプチドであり、（Ａｓｐ－Ｃｙｓ）_２、（Ｃｙｓ－Ａｓｐ）_２、（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２、（Ｃｙｓ－Ｌｙｓ）_２、（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２、（Ｐｒｏ－Ｃｙｓ）_２、（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２および（Ｃｙｓ－Ｌｙｓ）_２から選択される、項目１０に記載の組成物。
１２．（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２ および／または（Ｃｙｓ－Ｌｙｓ）_２が、１～１００ｍＭの濃度で含まれ、システインが、１～１００ｍＭの濃度で含まれる、項目１０または１１に記載の組成物。
１３．（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２、（Ａｓｐ－Ｃｙｓ）_２、（Ｃｙｓ－Ａｓｐ）_２（Ｐｒｏ－Ｃｙｓ）_２が、２０～６０ｍＭの濃度で含まれ、システインが、１～１００ｍＭの濃度で含まれる、項目１０または１１に記載の組成物。
１４．システインが、水溶液に少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも１０ｍＭ、より好ましくは少なくとも２５ｍＭ、最も好ましくは少なくとも５０ｍＭの濃度で添加されている、項目１から１３のいずれか１項に記載の組成物。
１５．項目１から１４のいずれか１項に記載の組成物を含む、化粧品、栄養補助食品、臨床的栄養補給用の栄養液。
１６．項目１から１４のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞培養培地であって、少なくとも１種の炭水化物、および／または少なくとも１種の追加的な遊離アミノ酸、および／または少なくとも１種の無機塩、および／または緩衝剤および／または少なくとも１種のビタミンをさらに含む、培養培地。
１７．液体の形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態またはタブレットの形態である、項目１６に記載の培養培地。
１８．前記培養培地が、使用時の培養培地の濃度に対して２～１００倍濃縮された形態、好ましくは２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍、１０倍または１００倍濃縮された形態である、項目１６または１７に記載の培養培地。
１９．細胞を培養するための、好ましくはストック水溶液または供給水溶液としての、項目１６から１８のいずれか１項に記載の培養培地の使用。
２０．前記細胞が、動物細胞または植物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である、項目１９の使用。
２１．前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＡＥ－１細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞およびハイブリドーマ細胞からなる一覧から選択される、項目１９または２０に記載の使用。
２２．細胞培養産物を製造する方法であって、
－ 前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、
－ 前記細胞を、項目１６から１８のいずれか１つの培養培地と接触させるステップと、
－ 前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップと
を含む、方法。
２３．前記細胞培養産物が、治療用タンパク質、診断用タンパク質、ヘパリンなどの多糖、抗体、モノクローナル抗体、増殖因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子および酵素からなる群から選択される、項目２２に記載の方法。

[実施例１]
Ｃｙｓ－ジペプチド（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を添加することによる、沈殿に対するシステインの安定化
全ての実施例の全ての実験において、物質の溶液およびその希釈物をｐＨ＝７の１００ｍＭリン酸緩衝液中で調製した。ｐＨ＝７の１００ｍＭのリン酸緩衝剤中システインの１００ｍＭ溶液では、適切な濃度の（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を添加することによって沈殿を回避することができた。

沈殿が原因の濁度を、マイクロタイタープレートを用いたアッセイで測光法により６００ｎｍにおいて測定した。ウェル当たりの液体体積は２００μｌであり、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で、３７℃で２４時間にわたって測定を行った。プレートに蓋はしなかった。

０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭまたは４００ｍＭの（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２×２ＨＣｌを用いてｐＨ＝７でシステインの１００ｍＭ溶液を調製したところ、驚くべき結果が得られた。ペプチド添加の非存在下では沈殿が見られ、測定された。しかし、１００ｍＭの（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２では沈殿の加速さえ認められたが、一方、２００ｍＭおよび４００ｍＭの（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２では、沈殿が有効に防止された。沈殿物を目視観察し、濁度測定によって測定することができた（図１参照）。

図１は、ｐＨ＝７における、漸増濃度の（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２の存在下、３７℃で２４時間にわたる１００ｍＭのシステイン溶液中での沈殿物の形成を示す。

[実施例２]
（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２およびシステインを添加することによるシスチンの可溶化
表１に記載の組成物２０ｍｌを、１００ｍＭのリン酸緩衝剤、ｐＨ＝７中に調製し、閉じた５０ｍｌのポリプロピレン管（Ｆａｌｃｏｎ）中、２４時間インキュベートした。（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を十分な濃度で添加したところ、透明な溶液が得られたが、低濃度では、混合物は混濁した懸濁液のままであった。

[実施例３]
システインを添加することによる（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２の可溶化
（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２の最大溶解度は、ｐＨ＝７および３７℃で５０ｍＭ以下である。リン酸緩衝液、ｐＨ＝７中５０ｍＭ（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２の混濁した懸濁液を調製し、漸増量のシステインを添加した。混合物をマイクロタイタープレート中（ウェル当たりの液体体積は２００μｌであった）、３７℃で３０分インキュベートした後に６００ｎｍにおける濁度を測定した。２０ｍＭのシステインおよびそれ以上の濃度で、（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２が完全に可溶化し、濁度のさらなる低下は測定されなかった。溶液は目視で透明であった（図２参照）。

図１は、漸増量のシステインを添加することによる、５０ｍＭの（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２懸濁液の濁度の低下を示す。

[実施例４]
酸化条件下でＣｙｓ－ジペプチド（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を添加することによる、１００ｍＭのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
実施例１に記載の実験をマイクロタイタープレートで行った。３７℃で２時間インキュベートした後、５重量％のＨ_２Ｏ_２溶液１４μｌを各ウェルに添加して酸化を加速させ、十分に酸化された条件下で安定化を評価した。システインのみを含有する試料はＨ_２Ｏ_２を添加した直後に混濁し、これは、シスチンの形成によって引き起こされた可能性が最も高い。（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を含有する試料については、即時の濁度の増大は観察されなかった。続けて、マイクロプレートリーダーにおける濁度測定を継続した。結果が図に示されている。濁度の増大は漸増濃度の（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２で強力に低減し、４００ｍＭ（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を添加した場合には沈殿物は観察されなかった。

図２は、種々の濃度の（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を添加することによる、１００ｍＭのシステイン溶液の酸化的沈殿に対する安定化を示す。混合物をマイクロプレート中、３７℃で２時間インキュベートし、濁度を測光法により測定した。続いて、Ｈ_２Ｏ_２を添加して、酸化を加速させ、十分に酸化された条件下で沈殿に対する安定性を評価した。Ｈ_２Ｏ_２添加直後に濁度測定を継続した。システイン単独では、Ｈ_２Ｏ_２を添加すると溶液が直接、目視で混濁した。漸増量の（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２を添加した場合には、濁度によって測定される沈殿物の量が減少した。４００ｍＭの（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２では、混合物は、測定の経過中、完全に透き通ったままであった。

[実施例５]
種々のＣｙｓ－ジペプチドを酸化条件下で添加することによる、２５ｍＭおよび５０ｍＭのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
上記の安定化が、他のＣｙｓ－ジペプチドを添加することによっても可能であるかどうかを評価するために、システイン濃度を５０ｍＭおよび２５ｍＭに低下させて使用したこと、ならびに添加するＣｙｓ－ジペプチドの濃度を０ｍＭ（＝対照）、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭにしたことを除いて実施例４に記載されている実験を行った。（Ａｓｐ－Ｃｙｓ）_２、（Ｃｙｓ－Ａｓｐ）_２、（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）_２、（Ｃｙｓ－Ｌｙｓ）_２、（Ａｌａ－Ｃｙｓ）_２および（Ｐｒｏ－Ｃｙｓ）_２の効果を評価した。全てのＣｙｓ－ペプチドにより、Ｈ_２Ｏ_２の添加後のシステイン溶液からの沈殿を防止することができた。５０ｍＭのシステイン濃度において種々のＣｙｓ－ペプチド間で安定化効率の差異が認められた。リシン残基を含有するＣｙｓ－ジペプチドが最も効率的な安定剤であり、１：２から１：５の間のＣｙｓ－ペプチドとシステインのモル濃度比で十分な安定性がもたらされた。４．５時間後の、５０ｍＭのシステインを用いた濁度測定の結果を表２に示す。

漸減濃度のシステインを用いたところ、十分な安定化のために必要なジペプチドのシステインに対するモル比は最低測定比１：１０まで低下した。これは２５ｍＭのシステイン溶液を用いた濁度測定の結果に関して表３に示される。

表２および表３の結果が図４および図に視覚化されている。

図３は、５０ｍＭのシステイン溶液に種々の濃度のＣｙｓ－ペプチドを添加することによってもたらされる、酸化的沈殿に対する安定化効果を示す。

図４は、２５ｍＭのシステイン溶液に種々の濃度のＣｙｓ－ペプチドを添加することによってもたらされる、酸化的沈殿に対する安定化効果を示す。

[実施例６]
酸化条件下で還元型および酸化型Ｃｙｓ－ジペプチドを添加することによる、５０ｍＭのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
上記の安定化が、還元型Ｃｙｓ－ジペプチド（＝遊離チオール）を添加することによっても可能であるかどうかを評価するために、実施例４に記載のものと同じ実験設定を選択した。この場合、種々の濃度の還元型ジペプチドＣｙｓ－Ｇｌｙおよび種々の濃度の酸化型ジペプチド（Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）_２を５０ｍＭのシステイン溶液に添加した。どちらのＣｙｓ－ペプチドも、Ｈ_２Ｏ_２添加後のシステイン溶液からの沈殿を防止することができた。酸化型ジペプチド（Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）_２は２５ｍＭのペプチド濃度で沈殿を完全に抑制することができたが、一方、還元型ジペプチドＣｙｓ－Ｇｌｙを用いた場合には完全な安定化が５０ｍＭでしか得られなかったので、酸化型ジペプチド（Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）_２の方が沈殿の防止に関してより効率的であった。結果を表４に要約する。

Claims (15)

1. システイン（Ｃｙｓ）である一つのアミノ酸を伴うアルファ－ペプチド結合のみを含む少なくとも１つのオリゴペプチドと、遊離システインとを含む組成物。
2. オリゴペプチドが、ジペプチドである、請求項１に記載の組成物。
3. 組成物の２５℃におけるｐＨ値が、少なくとも５、好ましくは少なくとも６である、請求項１または２に記載の組成物。
4. オリゴペプチド結合システインの遊離システインに対するモル比が、約０．１から１０まで、好ましくは約０．２から４まで、最も好ましくは約０．５から２までである、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
5. オリゴペプチドが、還元された状態（＝遊離チオール）または酸化された状態（＝ジスルフィド結合した状態）のいずれか、好ましくは酸化された状態である、記請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
6. オリゴペプチドが、２５℃、ｐＨ６からｐＨ９までのｐＨ範囲における溶解度が少なくとも１０ｇ／ｌの１種または複数の天然アミノ酸をさらに含み、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）から選択され、より好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓから選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。
7. オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Ｘｘｘ－ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｘｘｘであり、Ｘｘｘが天然アミノ酸であり、ジペプチドが、好ましくはＡｓｐ－Ｃｙｓ、Ｃｙｓ－Ａｓｐ、Ｌｙｓ－Ｃｙｓ、Ｃｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－ＣｙｓまたはＰｒｏ－Ｃｙｓであり、最も好ましくはＬｙｓ－ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｌｙｓである、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物。
8. システインが、水溶液に少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも１０ｍＭ、より好ましくは少なくとも２５ｍＭ、最も好ましくは少なくとも５０ｍＭの濃度で添加されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を含む、化粧品、栄養補助食品、臨床的栄養補給用の栄養液。
10. 請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞培養培地であって、少なくとも１種の炭水化物、および／または少なくとも１種の追加的な遊離アミノ酸、および／または少なくとも１種の無機塩、および／または緩衝剤および／または少なくとも１種のビタミンをさらに含む、培養培地。
11. 液体の形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態またはタブレットの形態である、請求項１０に記載の培養培地。
12. 使用時の培養培地の濃度に対して２～１００倍濃縮された形態、好ましくは２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍または１０倍濃縮された形態である、請求項１０または１１のいずれか１項に記載の培養培地。
13. 細胞を培養するための、好ましくはストック水溶液または供給水溶液としての、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の培養培地の使用。
14. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＡＥ－１細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞およびハイブリドーマ細胞からなる一覧から選択される、請求項１３に記載の使用。
15. 細胞培養産物を製造する方法であって、
    前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、
    前記細胞を、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の培養培地と接触させるステップと、
    前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップと
    を含む、方法。

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