JP2023522059A - Cys-ペプチドを含む組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、システイン(Cys)である一つのアミノ酸を伴うアルファ-ペプチド結合のみを含む少なくとも1つのオリゴペプチドと、遊離システインとを含む組成物に関する。本発明は、さらに、培養培地、および細胞、好ましくは植物細胞、動物細胞または哺乳動物細胞を培養するための、本発明の培養培地の使用、および細胞培養産物を製造する方法に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、システイン(Cys)である1つのアミノ酸を伴う少なくとも1つのオリゴペプチド、好ましくはジペプチドを、遊離システインおよび必要に応じてシスチン(Cys-Cys)から選択されるシステイン供給源と混合することによって調製される組成物であって、pH値が少なくとも5、好ましくは少なくとも6である、組成物に関する。当該組成物は、遊離システイン/シスチンと比較して安定性/溶解性が改善されるという利点を有し、細胞、組織、器官および生物体全体へのシステイン/シスチンの供給源をもたらすために使用され得る。
さらに、本発明は、バイオテクノロジーによる産生プロセスに関する。より詳細には、本発明は、バイオテクノロジーによる産生プロセスにける使用のための改善された培養培地、そのような改善された培地を使用するプロセス、および改善された培養培地を使用するプロセスから得られる産物に関する。
システインは、ヒトの栄養補給、化粧品から、細胞および組織培養プロセスまで、種々の用途に使用される重要なアミノ酸である。システインは、タンパク質の構成単位であり、また、重要な細胞抗酸化物質であり、酸化還元恒常性の調節に関与するグルタチオンの構成単位である。経口栄養システイン/シスチン補給に関して種々の健康利益が実証されている(Plazaら、Molecules 2018、23、575によって概説されている)。
システイン/シスチンはまた、細胞培養培地製剤中にも存在する。システインは必須アミノ酸ではないが、生物学的製剤産生のための細胞培養プロセスにおいて制限されると、生存能および生産性の著しい低下が導かれる恐れがある。他方では、システインの過剰摂取により毒作用が導かれる恐れがある(Ritaccoら、Biotechnol Prog、2018、34巻、6号)。
種々の用途のための、高度に濃縮された液体栄養液中システインの製剤に関する主要な問題は、システインが酸素の存在下で急速に酸化してシスチンになり、3から9の間のpH範囲でシスチンの溶解度が<1mMと低いことである(Cartaら、J.Chem、Eng、Data 1996、41、414-417)。
この問題に対する解決法は、(Ala-Cys)2および(Lys-Cys)2などの十分な可溶性をもつCys-ジペプチドをシステイン/シスチンの供給源として使用することである。これらのペプチドは、細胞培養、非経口栄養に使用されており、また、化粧品への適用に関して調査が行われている(下の参考文献を参照されたい)。
しかし、ジペプチドを生成するために追加的な合成および精製ステップが必要になるので、ジペプチドは、遊離システインおよびシスチンよりも著しく費用がかかる。したがって、費用対効果がより高い、高度に濃縮されたシステイン/シスチン製剤が依然として必要とされている。ペプチド内の他のアミノ酸の性質に応じて溶解性の増大が十分な高さにならないこともあり、それにより、製剤の可能性に対するさらなる制限が提起される。
EP2561065B1には、最大の細胞成長および/またはタンパク質またはウイルス産生を支持する一方で、溶解性および安定性の限定によって引き起こされる問題を回避する濃度のシステインおよびチロシンを含む、濃縮された供給液が開示されている。
US2013/0130317A1には、物質を産生する能力を有する動物細胞を培養するための方法であって、動物細胞を、1つまたは複数のL-システインを有し、グルタチオンを除くオリゴペプチドを補充した培地で培養するステップを含む、方法が記載されている。
同じ理由で、Cys-ペプチドは、非経口栄養(Pollackら、Zeitschrift fur Ernahrungswissenschaften 1989、28:191-200)および化粧品への適用(Tsengら、J.Agric.Food Chem.2015、63:6181-6188)においてもシステインの代替として評価されている。
しかし、合成ペプチドはアミノ酸よりも著しく多くの費用がかかり、したがって、システインを沈殿に対して安定化するための、費用がより少ない解決法が望まれる。酸素を物理的に排除することができる場合には、還元剤を使用してシステインからのシスチン形成をある特定の程度まで防止することができるが(参考文献)、望ましくないことも多い。また、この手法は、例えば、細胞培養のために使用される通気バイオリアクター環境など、高い酸素濃度および酸素供給の存在下では機能しない。
Plazaら、Molecules 2018、23、575
Ritaccoら、Biotechnol Prog、2018、34巻、6号
Cartaら、J.Chem、Eng、Data 1996、41、414-417
Pollackら、Zeitschrift fur Ernahrungswissenschaften 1989、28:191-200
Tsengら、J.Agric.Food Chem.2015、63:6181-6188
いくつかのCys-ペプチド(例えば(Ala-Cys)2)に関しては、溶解性が、依然として、高度に濃縮されたストック溶液または供給を調製するためには十分に高いものではない。しかし、現代の細胞培養バイオプロセシングでは、プロセスを強化するため、ならびに、柔軟性および生産性を低減させる恐れがあり、下流の処理を複雑化し、また、高い環境負荷が伴う過剰な液体処理(例えば灌流系におけるもの)を回避するために、アミノ酸およびペプチドの高濃縮溶液が重要である。
水を含む食品および化粧品または非経口栄養用の栄養液に関しても同様の問題が存在する。
高度に濃縮されたシステインを含有する液体製剤の上記の欠点は、本発明によって対処される。本発明は、添付の独立請求項の条項によって定義される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項によって定義される。
驚いたことに、システインを含有するオリゴペプチド、ジペプチド、および/またはそれらのジスルフィドを添加することにより、システインの高濃縮溶液を酸化的沈殿に対して安定化することができることが見いだされた。さらにいっそう驚いたことに、一部の場合では、それぞれの混合物により、さらにはそれぞれのCys-オリゴペプチドの溶解性の増大がもたらされた。少量のシステイン(または他のチオール、調査していない)の存在下でCys-ペプチドを添加することにより、シスチンを可溶化することができることも見いだされた。
得られる組成物は、ジペプチド単独と比較してシステイン当量あたりの費用を著しく少なく調製することができ、したがって、追加的な、現行の適用よりも費用重視の適用を可能にする、安定なシステイン形態である。さらなる利点は、ある特定の量の遊離システインが必要になる適用、例えば、システインまたはシスチンが放出されるオリゴペプチドまたはジペプチドの加水分解速度が律速になる場合に使用できることである。
組成物は、規定のモル比のCys-オリゴペプチドまたはCys-ジペプチドをシステインと混合することによって、または規定のモル比のCys-ジペプチドをシステインおよびシスチンと混合することによって、調製され得る。オリゴペプチドとして結合しているシステインの遊離システインに対する好ましいモル比は10未満、好ましくは4未満、より好ましくは2未満、より好ましくは1未満、より好ましくは0.5未満、最も好ましくは0.2未満である。混合物は、固体(結晶性粉末、集塊など)または水溶液の形態であり得る。水溶液の場合では、システインを少なくとも1mM、好ましい少なくとも10mM、より好ましくは少なくとも50mMおよび最も好ましくは少なくとも100mMの濃度で添加し、ジペプチドを上記の適当なモル比で添加する。
本発明による組成物はまた、化粧品、栄養補助食品、臨床的栄養補給用の栄養液、または細胞もしくは組織培養培地(基本培地、供給培地または灌流培地)の成分にもなり得る。
したがって、本発明は、システイン(Cys)である1つのアミノ酸を伴う少なくとも1つのオリゴペプチド、好ましくは少なくとも1つのジペプチドを、遊離システインおよび必要に応じてシスチン(Cys-Cys)から選択されるシステイン供給源と混合することによって調製された組成物に関する。したがって、本発明は、組成物を含む培養培地に関する。
本発明は、さらに、細胞、好ましくは植物細胞、動物細胞または哺乳動物細胞を培養するための、本発明の培養培地の使用に関する。
本発明の別の態様は、細胞培養産物を製造する方法であって、(i)前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、(ii)前記細胞を、本発明による培養培地と接触させるステップと、(iii)前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップとを含む、方法に関する。
本発明の好ましい実施形態を以下の本発明の詳細な説明にさらに詳細に記載する。
本発明に関しては、「天然アミノ酸」という表現は、上に列挙されている20種のアミノ酸のL形態およびD形態の両方を包含すると理解されるものとする。しかし、L形態が好ましい。一実施形態では、「アミノ酸」という用語は、これらのアミノ酸の類似体または誘導体も包含する。
本発明による「遊離アミノ酸」、例えば「遊離」システインは、そのアミノ官能基および(アルファ-)カルボキシ官能基が遊離形態である、すなわち、他の分子と共有結合していないアミノ酸、例えば、ペプチド結合を形成していないアミノ酸であると理解される。遊離アミノ酸は、塩として、または水和物の形態でも存在し得る。ジペプチドの一部としてまたはジペプチド内のアミノ酸に言及する場合、それぞれのアミノ酸から生化学およびペプチド生合成の既知の機構に従って誘導されたそれぞれのジペプチド構造の一部を指すと理解されるものとする。
本発明は、一般には、システイン(Cys)である1つのアミノ酸を伴う、少なくとも1つのオリゴペプチドと、遊離システイン(システイン供給源として)とを含む組成物に関する。必要に応じて、遊離システインおよび遊離シスチン(Cys-Cys)を含めることができる。遊離システインおよび遊離シスチン(Cys-Cys)という用語は、システインおよびシスチンの塩または水和物の形態を包含するものとする。
オリゴペプチドはジペプチドであることが好ましい。
「ペプチド」は、アルファ-ペプチド結合(R1-CO-NH-R2)によって互いに共有結合によりカップリングした少なくとも2つのアミノ酸を含む分子であると理解されるものとする。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合(R1-CO-NH-R2)によって互いに共有結合によりカップリングした20個を超えるアミノ酸を含む分子であると理解されるものとする。
「オリゴペプチド」は、アルファ-ペプチド結合(R1-CO-NH-R2)のみによって互いに共有結合によりカップリングした20個未満、好ましくは2~10個のアミノ酸を含む分子と理解されるものとする。グルタチオンは、ガンマ-ペプチド結合およびアルファ-ペプチド結合を含有するGlu-Cys-Glyトリペプチドであり、したがって、除外される。
「ジペプチド」は、アルファ-ペプチド結合(R1-CO-NH-R2)によって互いに共有結合によりカップリングした2つのアミノ酸を含む分子であると理解されるものとする。
「Xxx」という表現は、アミノ酸と関連して本明細書で使用される場合、以下に定義される任意の天然アミノ酸を指すと理解されるものとする。
「アミノ酸」は、本発明に関しては、アミノ官能基(-NH2)およびカルボン酸官能基(-COOH)を、それぞれのアミノ酸に特異的な側鎖と共に含む分子であると理解されるものとする。本発明に関しては、アルファアミノ酸およびベータアミノ酸のどちらも包含される。本発明の好ましいアミノ酸は、アルファアミノ酸、特に、以下の通り、シスチンを含めた20種の「天然アミノ」酸である:
アラニン(Ala/A)
アルギニン(Arg/R)
アスパラギン(Asn/N)
アスパラギン酸(Asp/D)
システイン(Cys/C)
シスチン(Cyss/C2)
グルタミン酸(Glu/E)
グルタミン(Gln/Q)
グリシン(Gly/G)
ヒスチジン(His/H)
イソロイシン(Ile/I)
ロイシン(Leu/L)
リシン(Lys/K)
メチオニン(Met/M)
フェニルアラニン(Phe/F)
プロリン(Pro/P)
セリン(Ser/S)
トレオニン(Thr/T)
トリプトファン(Trp/W)
チロシン(Tyr/Y)
バリン(Val/V)
アラニン(Ala/A)
アルギニン(Arg/R)
アスパラギン(Asn/N)
アスパラギン酸(Asp/D)
システイン(Cys/C)
シスチン(Cyss/C2)
グルタミン酸(Glu/E)
グルタミン(Gln/Q)
グリシン(Gly/G)
ヒスチジン(His/H)
イソロイシン(Ile/I)
ロイシン(Leu/L)
リシン(Lys/K)
メチオニン(Met/M)
フェニルアラニン(Phe/F)
プロリン(Pro/P)
セリン(Ser/S)
トレオニン(Thr/T)
トリプトファン(Trp/W)
チロシン(Tyr/Y)
バリン(Val/V)
本発明に関しては、「天然アミノ酸」という表現は、上に列挙されている20種のアミノ酸のL形態およびD形態の両方を包含すると理解されるものとする。しかし、L形態が好ましい。一実施形態では、「アミノ酸」という用語は、これらのアミノ酸の類似体または誘導体も含む。
本発明による「遊離アミノ酸」(例えば、「遊離システイン」)は、そのアミノ官能基および(アルファ-)カルボキシ官能基が遊離形態である、すなわち、他の分子と共有結合していないアミノ酸、例えば、ペプチド結合を形成していないアミノ酸であると理解される。遊離アミノ酸は、塩としてまたは水和物の形態でも存在し得る。ジペプチドの一部としてまたはジペプチド内のアミノ酸に言及する場合、それぞれのアミノ酸から生化学およびペプチド生合成の既知の機構に従って誘導されたそれぞれのジペプチド構造の一部を指すと理解されるものとする。
「N-アシル化」という表現は、アミノ酸などの化学化合物に関しては、N-アシル化化合物が、前記化合物の窒素官能基へのアシル基の付加によって修飾されたものであることを意味すると理解されるものとする。アシル基はアミノ酸のアルファ-アミノ基に付加されることが好ましい。
本発明に関しては、酸化されたシステイン残基を介してジスルフィド結合を形成するCys-ペプチドは、(Xxx-Cys)2と記載されるものとする。ペプチドは、塩としてまたは水和物の形態でも存在し得る。そのようなジスルフィド結合により媒介されるCys-ジペプチドの二量体、例えば(Xxx-Cys)2も本発明の意味ではなおジペプチドとみなされる。
組成物の25℃におけるpH値は少なくとも5であることが好ましい、または少なくとも6であることが好ましい。
本発明の有利な構成では、ペプチド結合システインの遊離システインに対するモル比は、0.1から10の間、好ましくは0.2から4未満の間、最も好ましくは0.5から2の間である。好ましい実施形態では、オリゴペプチドまたはジペプチドは、還元された状態(=遊離チオール)または酸化された状態(=ジスルフィド結合した状態)のいずれか、好ましくは酸化された状態である。
代替の実施形態では、組成物は、ジペプチドとシステイン供給源の混合ジスルフィドを含む。
本発明の好ましい実施形態では、オリゴペプチドまたはジペプチドは、6から9の間のpH範囲における溶解度が少なくとも>10g/lの1種または複数の天然アミノ酸をさらに含み、好ましくはグリシン(Gly)、アラニン(Ala)、セリン(Ser)、プロリン(Pro)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、リシン(Lys)またはアルギニン(Arg)から選択される。
前記オリゴペプチドがXxx-CysまたはCys-Xxxであるジペプチドであり、Xxxが天然アミノ酸であり、ジペプチドは、好ましくはAsp-Cys、Cys-Asp、Lys-Cys、Cys-Lys、Ala-CysまたはPro-Cysであることが好ましい。好ましい構成では、前記ジペプチドは、前記培養培地中に、少なくとも1mM、好ましくは少なくとも10mM、より好ましくは少なくとも50mM、より好ましくは少なくとも100mMの濃度で存在する。そのような高濃度において、本発明による組成物により、システインを含有するジペプチドによってシステインが酸化的沈殿に対して安定化されるという利点がもたらされる。
好ましい実施形態では、オリゴペプチドまたはジペプチドはN-アシル化されていない。N-アシル化により、ある特定のジペプチドの熱安定性が改善されることが分かっているが、N-アシル化ジペプチドにより劣等の生存細胞密度および生存能が導かれる可能性もあることが見いだされている。
本発明はまた、本発明による組成物を含む化粧品、栄養補助食品または臨床的栄養補給用の栄養液にも関する。
化粧品は、皮膚または毛髪を処置するために使用されるシャンプー、コンディショナー、ローション、クリームまたは他の製剤であり得る。栄養補助食品は、シロップもしくはショットなどの液体の形態、または、カプセル剤、ソフトゲル剤、グミなどの固体の形態であり得る。組成物はまた、臨床的な経腸または非経口栄養用の栄養液の一部、例えば、Aminoven(Fresenius Kabi)などのアミノ酸溶液の一部であり得る。
さらに、本発明は、細胞または組織培養培地も指す。
本発明の別の主題は、本発明による組成物を含む細胞または組織培養培地であって、少なくとも1種の炭水化物、少なくとも1つの遊離アミノ酸、少なくとも1種の無機塩、緩衝剤および/または少なくとも1種のビタミンをさらに含む、細胞または組織培養培地に関する。特に好ましい実施形態では、培養培地は、少なくとも1種の炭水化物、少なくとも1つの遊離アミノ酸、少なくとも1種の無機塩、緩衝剤および少なくとも1種のビタミンの全てを含む。
本発明の一実施形態では、培養培地は、増殖因子を含有しない。この実施形態によると、本発明のオリゴペプチドまたはジペプチドを、培養下の細胞の成長および/または増殖を促進するための増殖因子の代わりに使用することができる。本発明の別の実施形態では、培養培地は、いかなる脂質も含有しない。
本発明の別の実施形態によると、培養培地は、液体の形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態またはタブレットの形態である。
好ましい実施形態では、本発明の培養培地は、限定培地、または無血清培地である。例えば、本発明の組成物を、Miltenyi Biotech(Bergisch Gladbach、Germany)のCHOMACS CD培地、LONZA(Basel、Switzerland)から入手可能なPower CHO-2 CD培地、PAA(PAA Laboratories、Pasching、Austria)のActi-CHO P培地、SAFCから入手可能なEx-Cell CD CHO培地、ThermoFisher(Waltham、USA)のSFM4CHO培地およびCDM4CHO培地に補充することができる。本発明のジペプチドをDMEM培地(Life Technologies Corp.、Carlsbad、USA)に補充することもできる。しかし、本発明は上記の培地への補充に限定されない。
他の好ましい実施形態では、培養培地は、使用時の前記培地の濃度に対して2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍または10倍濃縮された形態(体積/体積)の液体培地である。これにより、濃縮された培地をそれぞれの体積の滅菌水で単に希釈することによって「すぐに使える」培養培地を調製することが可能になる。本発明のそのような濃縮された形態の培地はまた、それを、例えば、流加培養(cultivation)または灌流プロセスにおいて培養物に添加することによって使用することもできる。
本発明の細胞培養培地(細胞または組織培養用の基本培地、供給培地または灌流培地)は、好ましくは持続的な成長および産物形成のために必要な全ての栄養分を含み得る。培養培地、特に細胞培養培地を調製するための配合は、当業者に周知である(例えば、Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Ozturk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006を参照されたい)。種々の培養培地が種々の供給源から市販されている。
本発明の培養培地は、好ましくは炭水化物源を含み得る。細胞培養培地に使用される主要な炭水化物はグルコースであり、常套的に5~25mMで補充される。さらに、ガラクトース、フルクトース、またはマンノースなどの任意のヘキソースまたは組合せを使用することができる。
培養培地は、典型的に、少なくとも必須アミノ酸(すなわち、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Try、Val)ならびに非必須アミノ酸も含み得る。非必須アミノ酸は、典型的に、細胞株がそのアミノ酸を合成することができない場合、または細胞株がそのアミノ酸を、最大の成長を支持するために十分な分量で産生することができない場合に、細胞培養培地に含められる。さらに、哺乳動物細胞は、主要なエネルギー源としてグルタミンも使用し得る。グルタミンは、多くの場合、他のアミノ酸よりも高い濃度(2~8mM)で含められる。しかし、上記の通り、グルタミンは、自然発生的に分解しアンモニアを形成する可能性があり、また、ある特定の細胞株はアンモニアをより速く産生し、これは毒性である。
本発明の培養培地は、好ましくは塩を含み得る。塩は、等張性の状態を維持し、浸透の不均衡を防止するために、細胞培養培地に添加される。本発明の培養培地の重量オスモル濃度は約300mOsm/kgであるが、多くの細胞株はこの値以上のおよそ10パーセントの変動を許容し得る。いくつかの昆虫細胞培養物の重量オスモル濃度は300mOsm/kgよりも高い傾向があり、300mOsm/kgよりも0.5パーセント、1パーセント、2~5パーセント、5~10パーセント、10~15パーセント、15~20パーセント、20~25パーセント、25~30パーセント高くなり得る。細胞培養培地に最も一般的に使用される塩としては、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO4
2-、PO4
3-、およびHCO3
-(例えば、CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)が挙げられる。
他の無機の元素も培養培地中に存在し得る。それらとして、Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、およびNiが挙げられる。これらの元素の多くは、酵素活性に関与する。これらの元素は、CaCl2、Fe(NO3)3、MgCl2、MgSO4、MnCl2、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4などの塩、ならびにセレン、バナジウムおよび亜鉛などの微量元素のイオンの形態で提供される。これらの無機塩および微量元素は、例えばSigma(Saint Louis、Missouri)から、購入することができる。
本発明の培養培地は、好ましくはビタミンを含む。ビタミンは、典型的に、細胞によって補助因子として使用される。各細胞株のビタミン要件は著しく変動するが、一般に、細胞培養培地が血清をほとんどもしくは全く含有しない場合、または細胞を高密度で成長させる場合には、余分のビタミンが必要である。本発明の培養培地中に存在することが好ましい例示的なビタミンとしては、ビオチン、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ニコチンアミド、D-パントテン酸Ca++、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ナイアシンアミド、A、B6、B12、C、D3、E、K、およびp-アミノ安息香酸(PABA)が挙げられる。
本発明の培養培地は、血清も含み得る。血清は、凝固した血液の上清である。血清成分としては、付着因子、微量栄養素(例えば、微量元素)、増殖因子(例えば、ホルモン、タンパク質分解酵素)、および保護要素(例えば、抗毒素、抗酸化物質、抗タンパク質分解酵素)が挙げられる。血清は、ヒト血清、ウシ血清またはウマ血清を含めた種々の動物供給源から入手可能である。本発明による細胞培養培地に含める場合、血清は、一般には、5~10%(体積)の濃度で添加される。好ましい細胞培養培地は無血清である。
血清の非存在下または血清を減少させた培地での細胞成長を促進するために、以下のポリペプチドのうちの1種または複数を本発明の細胞培養培地に添加することができる:例えば、酸性FGFおよび塩基性FGFを含めた線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、上皮増殖因子(EGF)、神経増殖因子(NGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、ならびに、TGFアルファおよびTGFベータを含めたトランスフォーミング増殖因子(TGF)、インターロイキン1、2、6などの任意のサイトカイン、顆粒球刺激因子、白血病抑制因子(LIF)など。
他の実施形態では、細胞培養培地は、ポリペプチド(すなわち、20個を超えるアミノ酸を有するペプチド)を含まない。
リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸、および/または炭素原子が12個、14個、16個、18個、20個、または24個の脂肪酸(各炭素原子が分枝または非分枝)、リン脂質、レシチン(ホスファチジルコリン)、ならびにコレステロールなどの1種または複数の脂質も本発明の細胞培養培地に添加することができる。これらの脂質の1種または複数を補充として無血清培地に含めることができる。ホスファチジン酸およびリゾホスファチジン酸は、ある特定の足場依存性細胞、例えば、MDCK、マウス上皮、および他の腎細胞株などの成長を刺激し、一方、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルイノシトールは、無血清培地におけるヒト線維芽細胞の成長を刺激する。エタノールアミンおよびコレステロールも、ある特定の細胞株の成長を促進することが示されている。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は脂質を含有しない。
ウシ血清アルブミン(BSA)またはトランスフェリンなどの1種または複数の担体タンパク質も細胞培養培地に添加され得る。担体タンパク質は、ある特定の栄養分または微量元素の輸送を補助し得る。BSAは、一般には、水溶液に不溶性であるリノール酸およびオレイン酸などの脂質の担体として使用される。さらに、BSAは、ある特定の金属、例えば、Fe、Cu、およびNiなどの担体としての役割も果たし得る。タンパク質を含まない製剤では、BSAの非動物由来の代用品、例えばシクロデキストリンなどを脂質担体として使用することができる。
足場依存性細胞の基質への付着の促進を補助するために、フィブロネクチン、ラミニン、およびプロネクチンなどの1種または複数の付着タンパク質も細胞培養培地に含められ得る。
細胞培養培地は、必要に応じて、1種または複数種の緩衝剤を含み得る。適切な緩衝剤としては、これだけに限定されないが、N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-N’-[2-エタンスルホン酸](HEPES)、MOPS、MES、リン酸、重炭酸塩および細胞培養への適用における使用に適した他の緩衝剤が挙げられる。適切な緩衝剤は、培養される細胞に対する実質的な細胞傷害性を伴わずに緩衝能をもたらすものである。適切な緩衝剤の選択は、細胞培養分野における通常の技術の範囲内に入る。
懸濁液中の細胞の凝集を防止し、細胞の成長を促進するために、ポリアニオン性またはポリカチオン性化合物も培養培地に添加することができる。
好ましい実施形態では、培養培地は、液体の形態である。しかし、培養培地は、ゲル様培地、例えば、寒天含有培地、カラゲーン含有培地またはゼラチン含有培地(粉末、凝集した粉末、インスタント化された粉末など)などの固形培地であってもよい。好ましくは培養培地は滅菌形態である。
本発明の培養培地は、濃縮された形態であり得る。本発明の培養培地は、例えば、2~100倍濃縮された形態、好ましくは2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍または100倍濃縮された形態であり得る(細胞の成長および産物形成を支持する濃度に対して)。そのような濃縮された培養培地は、濃縮された培養培地を水などの水性溶媒で希釈することによって使用する培養培地の調製に役立つ。そのような濃縮された培養培地は、バッチ培養に使用することができるが、流加または連続培養においても有利に使用され、その場合、例えば、培養中に細胞によって消費される栄養分を補給するために、濃縮された栄養組成物が進行中の細胞培養(cultivation)に添加される。
本発明の他の実施形態では、培養培地は、乾燥形態、例えば、乾燥粉末の形態、または顆粒剤の形態、またはペレットの形態、またはタブレットの形態である。
本発明は、細胞を培養するための、本発明の培養培地の使用にも関する。本発明の別の態様は、細胞培養産物を産生させるための、本発明の培養培地の使用に関する。
本発明の好ましい実施形態は、動物細胞または植物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞を培養するための、本発明による培養培地の使用に関する。特定の実施形態では、培養される細胞は、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HEK細胞、HELA細胞、AE-1細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞およびハイブリドーマ細胞である。本発明の好ましい細胞は、CHO細胞およびハイブリドーマ細胞である。本発明の最も好ましい細胞はCHO細胞である。本発明の特に好ましいCHO細胞はCHO DG44細胞およびCHO DP12細胞である。
細胞を培養する方法であって、前記細胞を、本発明による細胞培養培地と接触させるステップを含む、方法も本発明の範囲に含まれる。本発明の一実施形態では、細胞を培養する方法は、細胞を、基本培養培地と、細胞の培養(cultivation)を支持する条件下で接触させるステップと、基底細胞培養培地に、本発明による濃縮された培地を補充するステップとを含む。好ましい実施形態では、基本培養培地に濃縮された供給液または培地を1日よりも多くの日に補充する。
本発明の別の態様は、本発明による培養培地を作製する方法であって、前記培養培地が、本発明による組成物を含む、方法に関する。本発明による培養培地を作製する方法は、本発明の組成物を培養培地に添加する少なくとも1つのステップを含む。同様に、本発明の態様は、細胞培養培地を作製するための、本発明の組成物の使用に関する。
本発明の別の態様は、培養培地を改変する方法であって、前記培養培地の前記改変が、本発明の組成物を前記培養培地に添加することを含む、方法に関する。
本発明の別の態様は、液体培養培地を作製する方法であって、例えば、乾燥粉末の形態、または顆粒剤の形態、またはペレットの形態、またはタブレットの形態の本発明による固形培地を準備するステップと、前記固形培養培地を水などの水性媒体に溶解させるステップを含む、方法に関する。
本発明の別の態様は、細胞を培養するための培養培地への、本発明による組成物の使用に関する。本発明の別の態様は、細胞培養のための、本発明による組成物の使用に関する。
本発明は、細胞培養産物を製造する方法であって、(i)前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、(ii)前記細胞を、本発明の培養培地と接触させるステップと、(iii)前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップとを含む、方法にも関する。同様に、本発明は、細胞培養産物を製造するための、本発明による組成物の使用に関する。
好ましい方法では、細胞培養産物は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、ヘパリンなどの多糖、抗体、モノクローナル抗体、増殖因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子または酵素である。
本発明による細胞の培養(cultivation)は、バッチ培養、流加培養または連続培養で実施され得る。
項目
本発明は、以下の項目に関する:
1.システイン(Cys)である一つのアミノ酸を伴うアルファ-ペプチド結合のみを含む少なくとも1つのオリゴペプチドと、遊離システインとを含む組成物。
2.遊離システインおよび遊離シスチン(Cys-Cys)を含む、項目1に記載の組成物。
3.オリゴペプチドが、ジペプチドである、項目1または2に記載の組成物。
4.組成物の25℃におけるpH値が、少なくとも5、好ましくは少なくとも6である、項目1から3のいずれか1項に記載の組成物。
5.オリゴペプチドとして結合しているシステインの遊離システインに対するモル比が、約0.1から10、好ましくは約0.2から4、最も好ましくは約0.5から2である、項目1から4のいずれか1項に記載の組成物。
6.オリゴペプチドが、還元された状態(=遊離チオール)または酸化された状態(=ジスルフィド結合した状態)のいずれか、好ましくは酸化された状態である、項目1から5のいずれか1項に記載の組成物。
7.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Xxx-CysまたはCys-Xxxであり、Xxxが、天然アミノ酸である、項目1から6のいずれか1項に記載の組成物。
8.オリゴペプチドが、25℃、pH6からpH9までのpH範囲における溶解度が少なくとも10g/lの1種または複数の天然アミノ酸をさらに含み、好ましくはグリシン(Gly)、アラニン(Ala)、セリン(Ser)、プロリン(Pro)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、リシン(Lys)またはアルギニン(Arg)から選択され、より好ましくはAla、Pro、Asp、Lysから選択される、項目1から7のいずれか1項に記載の組成物。
9.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Asp-Cys、Cys-Asp、Lys-Cys、Cys-Lys、Ala-CysまたはPro-Cysであり、最も好ましくはLys-CysまたはCys-Lysである、項目1から8のいずれか1項に記載の組成物。
10.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、(Xxx-Cys)2または(Cys-Xxx)2であり、Xxxが、天然アミノ酸である、項目1から6、または8に記載の組成物。
11.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、(Asp-Cys)2、(Cys-Asp)2、(Lys-Cys)2、(Cys-Lys)2、(Ala-Cys)2、(Pro-Cys)2、(Lys-Cys)2および(Cys-Lys)2から選択される、項目10に記載の組成物。
12.(Lys-Cys)2 および/または(Cys-Lys)2が、1~100mMの濃度で含まれ、システインが、1~100mMの濃度で含まれる、項目10または11に記載の組成物。
13.(Ala-Cys)2、(Asp-Cys)2、(Cys-Asp)2(Pro-Cys)2が、20~60mMの濃度で含まれ、システインが、1~100mMの濃度で含まれる、項目10または11に記載の組成物。
14.システインが、水溶液に少なくとも1mM、好ましくは少なくとも10mM、より好ましくは少なくとも25mM、最も好ましくは少なくとも50mMの濃度で添加されている、項目1から13のいずれか1項に記載の組成物。
15.項目1から14のいずれか1項に記載の組成物を含む、化粧品、栄養補助食品、臨床的栄養補給用の栄養液。
16.項目1から14のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞培養培地であって、少なくとも1種の炭水化物、および/または少なくとも1種の追加的な遊離アミノ酸、および/または少なくとも1種の無機塩、および/または緩衝剤および/または少なくとも1種のビタミンをさらに含む、培養培地。
17.液体の形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態またはタブレットの形態である、項目16に記載の培養培地。
18.前記培養培地が、使用時の培養培地の濃度に対して2~100倍濃縮された形態、好ましくは2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍または100倍濃縮された形態である、項目16または17に記載の培養培地。
19.細胞を培養するための、好ましくはストック水溶液または供給水溶液としての、項目16から18のいずれか1項に記載の培養培地の使用。
20.前記細胞が、動物細胞または植物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である、項目19の使用。
21.前記細胞が、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HEK細胞、HELA細胞、AE-1細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞、NK細胞またはT細胞などの免疫細胞およびハイブリドーマ細胞からなる一覧から選択される、項目19または20に記載の使用。
22.細胞培養産物を製造する方法であって、
- 前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、
- 前記細胞を、項目16から18のいずれか1つの培養培地と接触させるステップと、
- 前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップと
を含む、方法。
23.前記細胞培養産物が、治療用タンパク質、診断用タンパク質、ヘパリンなどの多糖、抗体、モノクローナル抗体、増殖因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子および酵素からなる群から選択される、項目22に記載の方法。
本発明は、以下の項目に関する:
1.システイン(Cys)である一つのアミノ酸を伴うアルファ-ペプチド結合のみを含む少なくとも1つのオリゴペプチドと、遊離システインとを含む組成物。
2.遊離システインおよび遊離シスチン(Cys-Cys)を含む、項目1に記載の組成物。
3.オリゴペプチドが、ジペプチドである、項目1または2に記載の組成物。
4.組成物の25℃におけるpH値が、少なくとも5、好ましくは少なくとも6である、項目1から3のいずれか1項に記載の組成物。
5.オリゴペプチドとして結合しているシステインの遊離システインに対するモル比が、約0.1から10、好ましくは約0.2から4、最も好ましくは約0.5から2である、項目1から4のいずれか1項に記載の組成物。
6.オリゴペプチドが、還元された状態(=遊離チオール)または酸化された状態(=ジスルフィド結合した状態)のいずれか、好ましくは酸化された状態である、項目1から5のいずれか1項に記載の組成物。
7.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Xxx-CysまたはCys-Xxxであり、Xxxが、天然アミノ酸である、項目1から6のいずれか1項に記載の組成物。
8.オリゴペプチドが、25℃、pH6からpH9までのpH範囲における溶解度が少なくとも10g/lの1種または複数の天然アミノ酸をさらに含み、好ましくはグリシン(Gly)、アラニン(Ala)、セリン(Ser)、プロリン(Pro)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、リシン(Lys)またはアルギニン(Arg)から選択され、より好ましくはAla、Pro、Asp、Lysから選択される、項目1から7のいずれか1項に記載の組成物。
9.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Asp-Cys、Cys-Asp、Lys-Cys、Cys-Lys、Ala-CysまたはPro-Cysであり、最も好ましくはLys-CysまたはCys-Lysである、項目1から8のいずれか1項に記載の組成物。
10.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、(Xxx-Cys)2または(Cys-Xxx)2であり、Xxxが、天然アミノ酸である、項目1から6、または8に記載の組成物。
11.オリゴペプチドが、ジペプチドであり、(Asp-Cys)2、(Cys-Asp)2、(Lys-Cys)2、(Cys-Lys)2、(Ala-Cys)2、(Pro-Cys)2、(Lys-Cys)2および(Cys-Lys)2から選択される、項目10に記載の組成物。
12.(Lys-Cys)2 および/または(Cys-Lys)2が、1~100mMの濃度で含まれ、システインが、1~100mMの濃度で含まれる、項目10または11に記載の組成物。
13.(Ala-Cys)2、(Asp-Cys)2、(Cys-Asp)2(Pro-Cys)2が、20~60mMの濃度で含まれ、システインが、1~100mMの濃度で含まれる、項目10または11に記載の組成物。
14.システインが、水溶液に少なくとも1mM、好ましくは少なくとも10mM、より好ましくは少なくとも25mM、最も好ましくは少なくとも50mMの濃度で添加されている、項目1から13のいずれか1項に記載の組成物。
15.項目1から14のいずれか1項に記載の組成物を含む、化粧品、栄養補助食品、臨床的栄養補給用の栄養液。
16.項目1から14のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞培養培地であって、少なくとも1種の炭水化物、および/または少なくとも1種の追加的な遊離アミノ酸、および/または少なくとも1種の無機塩、および/または緩衝剤および/または少なくとも1種のビタミンをさらに含む、培養培地。
17.液体の形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態またはタブレットの形態である、項目16に記載の培養培地。
18.前記培養培地が、使用時の培養培地の濃度に対して2~100倍濃縮された形態、好ましくは2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍または100倍濃縮された形態である、項目16または17に記載の培養培地。
19.細胞を培養するための、好ましくはストック水溶液または供給水溶液としての、項目16から18のいずれか1項に記載の培養培地の使用。
20.前記細胞が、動物細胞または植物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である、項目19の使用。
21.前記細胞が、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HEK細胞、HELA細胞、AE-1細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞、NK細胞またはT細胞などの免疫細胞およびハイブリドーマ細胞からなる一覧から選択される、項目19または20に記載の使用。
22.細胞培養産物を製造する方法であって、
- 前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、
- 前記細胞を、項目16から18のいずれか1つの培養培地と接触させるステップと、
- 前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップと
を含む、方法。
23.前記細胞培養産物が、治療用タンパク質、診断用タンパク質、ヘパリンなどの多糖、抗体、モノクローナル抗体、増殖因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子および酵素からなる群から選択される、項目22に記載の方法。
[実施例1]
Cys-ジペプチド(Lys-Cys)2を添加することによる、沈殿に対するシステインの安定化
全ての実施例の全ての実験において、物質の溶液およびその希釈物をpH=7の100mMリン酸緩衝液中で調製した。pH=7の100mMのリン酸緩衝剤中システインの100mM溶液では、適切な濃度の(Lys-Cys)2を添加することによって沈殿を回避することができた。
Cys-ジペプチド(Lys-Cys)2を添加することによる、沈殿に対するシステインの安定化
全ての実施例の全ての実験において、物質の溶液およびその希釈物をpH=7の100mMリン酸緩衝液中で調製した。pH=7の100mMのリン酸緩衝剤中システインの100mM溶液では、適切な濃度の(Lys-Cys)2を添加することによって沈殿を回避することができた。
沈殿が原因の濁度を、マイクロタイタープレートを用いたアッセイで測光法により600nmにおいて測定した。ウェル当たりの液体体積は200μlであり、マイクロプレートリーダー(Tecan)で、37℃で24時間にわたって測定を行った。プレートに蓋はしなかった。
0mM、100mM、200mMまたは400mMの(Lys-Cys)2×2HClを用いてpH=7でシステインの100mM溶液を調製したところ、驚くべき結果が得られた。ペプチド添加の非存在下では沈殿が見られ、測定された。しかし、100mMの(Lys-Cys)2では沈殿の加速さえ認められたが、一方、200mMおよび400mMの(Lys-Cys)2では、沈殿が有効に防止された。沈殿物を目視観察し、濁度測定によって測定することができた(図1参照)。
図1は、pH=7における、漸増濃度の(Lys-Cys)2の存在下、37℃で24時間にわたる100mMのシステイン溶液中での沈殿物の形成を示す。
[実施例2]
(Lys-Cys)2およびシステインを添加することによるシスチンの可溶化
表1に記載の組成物20mlを、100mMのリン酸緩衝剤、pH=7中に調製し、閉じた50mlのポリプロピレン管(Falcon)中、24時間インキュベートした。(Lys-Cys)2を十分な濃度で添加したところ、透明な溶液が得られたが、低濃度では、混合物は混濁した懸濁液のままであった。
(Lys-Cys)2およびシステインを添加することによるシスチンの可溶化
表1に記載の組成物20mlを、100mMのリン酸緩衝剤、pH=7中に調製し、閉じた50mlのポリプロピレン管(Falcon)中、24時間インキュベートした。(Lys-Cys)2を十分な濃度で添加したところ、透明な溶液が得られたが、低濃度では、混合物は混濁した懸濁液のままであった。
[実施例3]
システインを添加することによる(Ala-Cys)2の可溶化
(Ala-Cys)2の最大溶解度は、pH=7および37℃で50mM以下である。リン酸緩衝液、pH=7中50mM(Ala-Cys)2の混濁した懸濁液を調製し、漸増量のシステインを添加した。混合物をマイクロタイタープレート中(ウェル当たりの液体体積は200μlであった)、37℃で30分インキュベートした後に600nmにおける濁度を測定した。20mMのシステインおよびそれ以上の濃度で、(Ala-Cys)2が完全に可溶化し、濁度のさらなる低下は測定されなかった。溶液は目視で透明であった(図2参照)。
システインを添加することによる(Ala-Cys)2の可溶化
(Ala-Cys)2の最大溶解度は、pH=7および37℃で50mM以下である。リン酸緩衝液、pH=7中50mM(Ala-Cys)2の混濁した懸濁液を調製し、漸増量のシステインを添加した。混合物をマイクロタイタープレート中(ウェル当たりの液体体積は200μlであった)、37℃で30分インキュベートした後に600nmにおける濁度を測定した。20mMのシステインおよびそれ以上の濃度で、(Ala-Cys)2が完全に可溶化し、濁度のさらなる低下は測定されなかった。溶液は目視で透明であった(図2参照)。
図1は、漸増量のシステインを添加することによる、50mMの(Ala-Cys)2懸濁液の濁度の低下を示す。
[実施例4]
酸化条件下でCys-ジペプチド(Lys-Cys)2を添加することによる、100mMのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
実施例1に記載の実験をマイクロタイタープレートで行った。37℃で2時間インキュベートした後、5重量%のH2O2溶液14μlを各ウェルに添加して酸化を加速させ、十分に酸化された条件下で安定化を評価した。システインのみを含有する試料はH2O2を添加した直後に混濁し、これは、シスチンの形成によって引き起こされた可能性が最も高い。(Lys-Cys)2を含有する試料については、即時の濁度の増大は観察されなかった。続けて、マイクロプレートリーダーにおける濁度測定を継続した。結果が図に示されている。濁度の増大は漸増濃度の(Lys-Cys)2で強力に低減し、400mM(Lys-Cys)2を添加した場合には沈殿物は観察されなかった。
酸化条件下でCys-ジペプチド(Lys-Cys)2を添加することによる、100mMのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
実施例1に記載の実験をマイクロタイタープレートで行った。37℃で2時間インキュベートした後、5重量%のH2O2溶液14μlを各ウェルに添加して酸化を加速させ、十分に酸化された条件下で安定化を評価した。システインのみを含有する試料はH2O2を添加した直後に混濁し、これは、シスチンの形成によって引き起こされた可能性が最も高い。(Lys-Cys)2を含有する試料については、即時の濁度の増大は観察されなかった。続けて、マイクロプレートリーダーにおける濁度測定を継続した。結果が図に示されている。濁度の増大は漸増濃度の(Lys-Cys)2で強力に低減し、400mM(Lys-Cys)2を添加した場合には沈殿物は観察されなかった。
図2は、種々の濃度の(Lys-Cys)2を添加することによる、100mMのシステイン溶液の酸化的沈殿に対する安定化を示す。混合物をマイクロプレート中、37℃で2時間インキュベートし、濁度を測光法により測定した。続いて、H2O2を添加して、酸化を加速させ、十分に酸化された条件下で沈殿に対する安定性を評価した。H2O2添加直後に濁度測定を継続した。システイン単独では、H2O2を添加すると溶液が直接、目視で混濁した。漸増量の(Lys-Cys)2を添加した場合には、濁度によって測定される沈殿物の量が減少した。400mMの(Lys-Cys)2では、混合物は、測定の経過中、完全に透き通ったままであった。
[実施例5]
種々のCys-ジペプチドを酸化条件下で添加することによる、25mMおよび50mMのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
上記の安定化が、他のCys-ジペプチドを添加することによっても可能であるかどうかを評価するために、システイン濃度を50mMおよび25mMに低下させて使用したこと、ならびに添加するCys-ジペプチドの濃度を0mM(=対照)、5mM、10mM、25mMおよび50mMにしたことを除いて実施例4に記載されている実験を行った。(Asp-Cys)2、(Cys-Asp)2、(Lys-Cys)2、(Cys-Lys)2、(Ala-Cys)2および(Pro-Cys)2の効果を評価した。全てのCys-ペプチドにより、H2O2の添加後のシステイン溶液からの沈殿を防止することができた。50mMのシステイン濃度において種々のCys-ペプチド間で安定化効率の差異が認められた。リシン残基を含有するCys-ジペプチドが最も効率的な安定剤であり、1:2から1:5の間のCys-ペプチドとシステインのモル濃度比で十分な安定性がもたらされた。4.5時間後の、50mMのシステインを用いた濁度測定の結果を表2に示す。
種々のCys-ジペプチドを酸化条件下で添加することによる、25mMおよび50mMのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
上記の安定化が、他のCys-ジペプチドを添加することによっても可能であるかどうかを評価するために、システイン濃度を50mMおよび25mMに低下させて使用したこと、ならびに添加するCys-ジペプチドの濃度を0mM(=対照)、5mM、10mM、25mMおよび50mMにしたことを除いて実施例4に記載されている実験を行った。(Asp-Cys)2、(Cys-Asp)2、(Lys-Cys)2、(Cys-Lys)2、(Ala-Cys)2および(Pro-Cys)2の効果を評価した。全てのCys-ペプチドにより、H2O2の添加後のシステイン溶液からの沈殿を防止することができた。50mMのシステイン濃度において種々のCys-ペプチド間で安定化効率の差異が認められた。リシン残基を含有するCys-ジペプチドが最も効率的な安定剤であり、1:2から1:5の間のCys-ペプチドとシステインのモル濃度比で十分な安定性がもたらされた。4.5時間後の、50mMのシステインを用いた濁度測定の結果を表2に示す。
漸減濃度のシステインを用いたところ、十分な安定化のために必要なジペプチドのシステインに対するモル比は最低測定比1:10まで低下した。これは25mMのシステイン溶液を用いた濁度測定の結果に関して表3に示される。
表2および表3の結果が図4および図に視覚化されている。
図3は、50mMのシステイン溶液に種々の濃度のCys-ペプチドを添加することによってもたらされる、酸化的沈殿に対する安定化効果を示す。
図4は、25mMのシステイン溶液に種々の濃度のCys-ペプチドを添加することによってもたらされる、酸化的沈殿に対する安定化効果を示す。
[実施例6]
酸化条件下で還元型および酸化型Cys-ジペプチドを添加することによる、50mMのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
上記の安定化が、還元型Cys-ジペプチド(=遊離チオール)を添加することによっても可能であるかどうかを評価するために、実施例4に記載のものと同じ実験設定を選択した。この場合、種々の濃度の還元型ジペプチドCys-Glyおよび種々の濃度の酸化型ジペプチド(Cys-Gly)2を50mMのシステイン溶液に添加した。どちらのCys-ペプチドも、H2O2添加後のシステイン溶液からの沈殿を防止することができた。酸化型ジペプチド(Cys-Gly)2は25mMのペプチド濃度で沈殿を完全に抑制することができたが、一方、還元型ジペプチドCys-Glyを用いた場合には完全な安定化が50mMでしか得られなかったので、酸化型ジペプチド(Cys-Gly)2の方が沈殿の防止に関してより効率的であった。結果を表4に要約する。
酸化条件下で還元型および酸化型Cys-ジペプチドを添加することによる、50mMのシステイン溶液の沈殿に対する安定化
上記の安定化が、還元型Cys-ジペプチド(=遊離チオール)を添加することによっても可能であるかどうかを評価するために、実施例4に記載のものと同じ実験設定を選択した。この場合、種々の濃度の還元型ジペプチドCys-Glyおよび種々の濃度の酸化型ジペプチド(Cys-Gly)2を50mMのシステイン溶液に添加した。どちらのCys-ペプチドも、H2O2添加後のシステイン溶液からの沈殿を防止することができた。酸化型ジペプチド(Cys-Gly)2は25mMのペプチド濃度で沈殿を完全に抑制することができたが、一方、還元型ジペプチドCys-Glyを用いた場合には完全な安定化が50mMでしか得られなかったので、酸化型ジペプチド(Cys-Gly)2の方が沈殿の防止に関してより効率的であった。結果を表4に要約する。
Claims (15)
- システイン(Cys)である一つのアミノ酸を伴うアルファ-ペプチド結合のみを含む少なくとも1つのオリゴペプチドと、遊離システインとを含む組成物。
- オリゴペプチドが、ジペプチドである、請求項1に記載の組成物。
- 組成物の25℃におけるpH値が、少なくとも5、好ましくは少なくとも6である、請求項1または2に記載の組成物。
- オリゴペプチド結合システインの遊離システインに対するモル比が、約0.1から10まで、好ましくは約0.2から4まで、最も好ましくは約0.5から2までである、請求項1から3のいずれか1項に記載の組成物。
- オリゴペプチドが、還元された状態(=遊離チオール)または酸化された状態(=ジスルフィド結合した状態)のいずれか、好ましくは酸化された状態である、記請求項1から4のいずれか1項に記載の組成物。
- オリゴペプチドが、25℃、pH6からpH9までのpH範囲における溶解度が少なくとも10g/lの1種または複数の天然アミノ酸をさらに含み、好ましくはグリシン(Gly)、アラニン(Ala)、セリン(Ser)、プロリン(Pro)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、リシン(Lys)またはアルギニン(Arg)から選択され、より好ましくはAla、Pro、Asp、Lysから選択される、請求項1から5のいずれか1項に記載の組成物。
- オリゴペプチドが、ジペプチドであり、Xxx-CysまたはCys-Xxxであり、Xxxが天然アミノ酸であり、ジペプチドが、好ましくはAsp-Cys、Cys-Asp、Lys-Cys、Cys-Lys、Ala-CysまたはPro-Cysであり、最も好ましくはLys-CysまたはCys-Lysである、請求項1から6のいずれか1項に記載の組成物。
- システインが、水溶液に少なくとも1mM、好ましくは少なくとも10mM、より好ましくは少なくとも25mM、最も好ましくは少なくとも50mMの濃度で添加されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物を含む、化粧品、栄養補助食品、臨床的栄養補給用の栄養液。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞培養培地であって、少なくとも1種の炭水化物、および/または少なくとも1種の追加的な遊離アミノ酸、および/または少なくとも1種の無機塩、および/または緩衝剤および/または少なくとも1種のビタミンをさらに含む、培養培地。
- 液体の形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態またはタブレットの形態である、請求項10に記載の培養培地。
- 使用時の培養培地の濃度に対して2~100倍濃縮された形態、好ましくは2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍または10倍濃縮された形態である、請求項10または11のいずれか1項に記載の培養培地。
- 細胞を培養するための、好ましくはストック水溶液または供給水溶液としての、請求項10から12のいずれか一項に記載の培養培地の使用。
- 前記細胞が、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、HEK細胞、HELA細胞、AE-1細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞、NK細胞またはT細胞などの免疫細胞およびハイブリドーマ細胞からなる一覧から選択される、請求項13に記載の使用。
- 細胞培養産物を製造する方法であって、
前記細胞培養産物を産生することが可能な細胞を準備するステップと、
前記細胞を、請求項10から12のいずれか一項に記載の培養培地と接触させるステップと、
前記細胞培養産物を前記培養培地または前記細胞から得るステップと
を含む、方法。
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