KR20230004656A

KR20230004656A - Cys-펩티드를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20230004656A
Application number: KR1020227040052A
Authority: KR
Inventors: 마르틴 쉴링; 아네 베네딕트; 크리스티나 요스트; 마리오 고메츠; 크리스티안 케슬러
Original assignee: 에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2023-01-06
Also published as: DK4138771T3; JP2023522059A; CN115397388A; CA3171556A1; US20230200424A1; EP4138771B1; WO2021213822A1; AU2021259110A1; EP4138771A1; ES2980902T3

Abstract

본 발명은 하나의 아미노산이 시스테인 (Cys)인 알파-펩티드-결합만을 포함하는 적어도 하나의 올리고펩티드, 및 유리 시스테인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 배양 배지, 및 세포, 바람직하게는 식물 세포, 동물 세포 또는 포유동물 세포를 배양하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도, 및 세포 배양 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

Cys-펩티드를 포함하는 조성물

본 발명은 하나의 아미노산이 시스테인 (Cys)인 적어도 하나의 올리고펩티드, 바람직하게는 디펩티드, 및 유리 시스테인 및 임의적으로 시스틴 (Cys-Cys)으로부터 선택된 시스테인 공급원을 혼합함으로써 제조된 조성물로서, 적어도 5, 바람직하게는 적어도 6의 pH-값을 갖는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 유리 시스테인/시스틴과 비교하여 개선된 안정성/용해도의 이점을 가지며, 세포, 조직, 기관 및 전체 유기체에 시스테인/시스틴의 공급원을 제공하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 생명공학적 생산 공정에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생명공학적 생산 공정에 사용하기 위한 개선된 배양 배지, 이러한 개선된 배지를 이용하는 공정, 및 개선된 배양 배지를 사용한 상기 공정으로부터 수득된 산물에 관한 것이다.

시스테인은 인간 영양과 화장품에서부터 세포 및 조직 배양 공정에 이르는 다양한 적용분야에서 사용되는 중요한 아미노산이다. 이는, 중요한 세포성 항산화제이며 산화환원 항상성의 조절에 관여하는 글루타티온 및 단백질을 위한 빌딩 블록이다. 경구 영양 시스테인/시스틴 보충에 대해 다양한 건강상의 이익이 입증된 바 있다 (보고 문헌 [Plaza et al., Molecules 2018, 23, 575]).

시스테인/시스틴은 또한 세포 배양 배지 제제에도 존재한다. 시스테인이 필수 아미노산이 아님에도 불구하고, 생물제제 생산을 위한 세포 배양 공정에서의 한계가 생존능 및 생산성의 극심한 손실로 이어질 수 있다. 다른 한편으로는, 시스테인의 과다투입은 독성 효과를 유발할 수 있다 (Ritacco et al., Biotechnol Prog., 2018, Vol. 34, No. 6).

다양한 용도의 고농축액 영양 용액에 시스테인을 배합하는데 있어서의 주요 문제점은, 시스테인이 산소의 존재 하에 시스틴으로 급속히 산화되고 시스틴이 3 내지 9의 pH 범위에서 < 1 mM의 낮은 용해도를 갖는다는 것이다 (Carta et al., J. Chem. Eng. Data 1996, 41, 414-417).

이러한 문제점에 대한 해결책은 시스테인/시스틴의 공급원으로서 잘 용해되는 Cys-디펩티드 예컨대 (Ala-Cys)₂ 및 (Lys-Cys)₂를 사용하는 것이다. 이들 펩티드는 세포 배양, 비경구 영양에서 사용되어 왔으며, 화장품 용도에 대해서도 조사되었다 (하기 참고문헌 참조).

그러나, 디펩티드를 생산하기 위해 요구되는 추가적인 합성 및 정제 단계로 인해, 이들은 유리 시스테인 및 시스틴보다 상당히 더 많은 비용이 든다. 그러므로 보다 더 비용-효율적인 고농축 시스테인/시스틴 제제가 여전히 요구되고 있다. 펩티드 내의 다른 아미노산의 성질에 따라, 용해도 증가가 때때로 충분히 크지 않아서, 제제화 가능성에 추가의 제한이 된다.

EP2561065B1에는 제한된 용해도 및 안정성에 의해 야기되는 문제점을 피하면서, 최대한의 세포 성장 및/또는 단백질 또는 바이러스 생산을 보조하는 소정의 농도의 시스테인 및 티로신을 포함하는 농축 공급물이 개시되어 있다.

US2013/0130317 A1에는 하나 이상의 L-시스테인을 갖는 올리고펩티드가 보충되며 글루타티온은 배제된 배지에서 동물 세포를 배양하는 것을 포함하는, 물질 생산 능력이 있는 동물 세포를 배양하는 방법이 기재되어 있다.

동일한 이유로, 비경구 영양 (Pollack et al., Zeitschrift fuer Ernaehrungswissenschaften 1989, 28: 191-200) 및 화장품 적용분야 (Tseng et al., J. Agric. Food Chem. 2015, 63: 6181-6188)에서도 시스테인에 대한 대안으로서의 Cys-펩티드가 평가되었다.

그러나, 합성 펩티드는 아미노산보다 상당히 더 많은 비용이 들기 때문에, 침전에 대해 시스테인을 안정화시키기 위한 보다 저비용의 해결책이 요망된다. 산소가 물리적으로 배제될 수 있을 때 시스테인으로부터의 시스틴 형성을 어느 정도 방지하기 위해 환원제가 사용될 수 있지만 (참고문헌), 이는 종종 바람직하지 않다. 또한, 이러한 접근법은 세포 배양을 위해 사용되는 폭기된 생물반응기 환경과 같은, 높은 산소 농도의 존재 및 공급 하에서는 유효하지 않다.

일부 Cys-펩티드 (예를 들어 (Ala-Cys)₂)의 경우에, 용해도가 여전히 고농축 스톡 또는 공급물 용액을 제조할 만큼 충분히 높지 않다. 그러나, 최신의 세포 배양 바이오프로세싱에서는, 유연성 및 생산성을 감소시킬 수 있고, 다운스트림 프로세싱을 복잡하게 하며, 보다 큰 환경 유해성이 수반되는 (예를 들어 관류 시스템에서의) 과도한 액체 프로세싱을 피하고 공정을 강화하기 위해 아미노산 및 펩티드의 고농축 용액이 중요하다.

유사한 문제점이 수성 식품 및 화장품 제품 또는 비경구 영양을 위한 영양 용액에서도 발생한다.

고농축 시스테인 함유 액체 제제의 상기 단점이 본 발명에 의해 해결된다. 본 발명은 첨부된 독립항의 조건에 의해 정의된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 종속항에 의해 정의된다.

놀랍게도, 시스테인의 고농축 용액이 시스테인 함유 올리고펩티드, 디펩티드, 및/또는 그의 이황화물의 첨가에 의해 산화성 침전에 대해 안정화될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 보다 더 놀라운 점은, 해당 혼합물이 일부 경우에는 심지어 해당 Cys-올리고펩티드의 증가된 용해도를 초래한다는 것이다. 또한, 시스틴이 소량의 시스테인 (또는 다른 티올류, 조사되지 않음)의 존재 하에 Cys-펩티드의 첨가에 의해 가용화될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

수득된 조성물은 디펩티드 단독과 비교하여 시스테인-당량당 상당한 저비용으로 제조될 수 있으며, 따라서 현재 이용가능한 것보다 더 많은 비용에 민감한 용도를 추가로 가능하게 하는, 안정한 시스테인 형태를 나타낸다. 추가의 이점은, 이들이 특정 양의 유리 시스테인이 요구되는 적용분야에서, 예를 들어 시스테인 또는 시스틴을 유리시키는 올리고- 또는 디펩티드의 가수분해 속도의 속도를 제한하는 경우에 사용될 수 있다는 것이다.

조성물은 정의된 몰비의 Cys-올리고펩티드 또는 Cys-디펩티드를 시스테인과 혼합함으로써 또는 정의된 몰비의 Cys-디펩티드를 시스테인 및 시스틴과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 유리 시스테인에 대한 올리고펩티드 결합된 시스테인의 바람직한 몰비는 10 이하, 바람직하게는 4 이하, 보다 바람직하게는 2 이하, 보다 바람직하게는 1 이하, 보다 바람직하게는 0.5 이하, 가장 바람직하게는 0.2 이하이다. 혼합물은 고체 (결정질 분말, 응집체 등) 또는 수용액의 형태일 수 있다. 수용액의 경우에, 시스테인은 적어도 1 mM, 바람직하게는 적어도 10 mM, 보다 바람직하게는 적어도 50 mM, 가장 바람직하게는 적어도 100 mM의 농도로 첨가되고, 디펩티드는 상기 기재된 적절한 몰비로 첨가된다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 화장품 제품, 영양 보충제, 임상 영양을 위한 영양 용액, 또는 세포 또는 조직 배양 배지 (기초 배지, 공급 배지 또는 관류 배지)의 구성 부분일 수 있다.

따라서, 본 발명은 하나의 아미노산이 시스테인 (Cys)인 적어도 하나의 올리고펩티드, 바람직하게는 적어도 하나의 디펩티드, 및 유리 시스테인 및 임의적으로 시스틴 (Cys-Cys)으로부터 선택된 시스테인 공급원을 혼합함으로써 제조된 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 배양 배지에 관한 것이다.

추가로 본 발명은 세포, 바람직하게는 식물 세포, 동물 세포 또는 포유동물 세포를 배양하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 하기 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다: (i) 상기 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 세포를 본 발명에 따른 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 배양 배지로부터 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계.

본 발명의 바람직한 실시양태는 하기 발명의 상세한 설명에서 더욱 상세히 기재된다.

도 1은 증가하는 농도의 (Lys-Cys)₂의 존재 하에 37℃에서 24시간에 걸쳐서의 pH = 7의 100 mM 시스테인 용액 중 침전물의 형성을 도시한다.
도 2는 증가하는 양의 시스테인의 첨가에 의한 50 mM (Ala-Cys)₂ 현탁액의 탁도의 감소를 제시한다.
도 3은 다양한 농도의 (Lys-Cys)₂의 첨가에 의한 100 mM 시스테인 용액의 산화성 침전에 대한 안정화를 제시한다.
도 4는 50 mM 시스테인 용액에 다양한 농도의 Cys-펩티드의 첨가에 의해 제공된 산화성 침전에 대한 안정화 효과를 제시한다.
도 5는 25 mM 시스테인 용액에 다양한 농도의 Cys-펩티드의 첨가에 의해 제공된 산화성 침전에 대한 안정화 효과를 예시한다.

본 발명과 관련하여, 표현 "천연 아미노산"은 하기 열거된 20종의 아미노산의 L-형태 및 D-형태 둘 다를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, L-형태가 바람직하다. 한 실시양태에서, 용어 "아미노산"은 또한 이들 아미노산의 유사체 또는 유도체를 포함한다.

본 발명에 따르면, "유리 아미노산", 예를 들어 "유리" 시스테인은 유리 형태의, 즉, 다른 분자에 공유 결합되지 않은 아미노 및 (알파-) 카르복실 관능기를 갖는 아미노산, 예를 들어, 펩티드 결합을 형성하지 않은 아미노산인 것으로 이해된다. 유리 아미노산은 또한 염으로서 또는 수화물 형태로 존재할 수 있다. 디펩티드의 일부로서의 또는 디펩티드 내의 아미노산을 언급하는 경우에, 이는 생화학 및 펩티드 생합성의 공지된 메카니즘에 따라 각각의 아미노산으로부터 유래된 각각의 디펩티드 구조의 일부를 지칭하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 일반적으로 하나의 아미노산이 시스테인 (Cys)인 적어도 하나의 올리고펩티드 및 (시스테인 공급원으로서의) 유리 시스테인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의적으로 유리 시스테인 및 유리 시스틴 (Cys-Cys)이 포함될 수 있다. 유리 시스테인 및 유리 시스틴 (Cys-Cys)이라는 용어는 시스테인 및 시스틴의 염 또는 수화물 형태를 포함할 것이다.

바람직하게는, 올리고펩티드는 디펩티드이다.

"펩티드"는 알파-펩티드 결합 (R¹-CO-NH-R²)에 의해 서로 공유 커플링된 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 분자인 것으로 이해될 것이다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합 (R¹-CO-NH-R²)에 의해 서로 공유 커플링된 20개 초과의 아미노산을 포함하는 분자인 것으로 이해될 것이다.

"올리고펩티드"는 알파-펩티드-결합 (R¹-CO-NH-R²)에 의해서만 서로 공유 커플링된 20개 미만, 바람직하게는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 분자인 것으로 이해될 것이다. 따라서, 감마-펩티드-결합 및 알파-펩티드-결합을 함유하는 글루타티온, 즉, Glu-Cys-Gly 트리펩티드는 배제된다.

"디펩티드"는 알파-펩티드-결합 (R¹-CO-NH-R²)에 의해 서로 공유 커플링된 2개의 아미노산을 포함하는 분자인 것으로 이해될 것이다.

표현 "Xxx"는, 본원에서 아미노산과 관련하여 사용되는 경우에, 하기에 정의된 바와 같은 임의의 천연 아미노산을 지칭하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명과 관련하여, "아미노산"은 각각의 아미노산에 대해 특이적인 측쇄와 함께, 아미노 관능기 (-NH₂) 및 카르복실산 관능기 (-COOH)를 포함하는 분자인 것으로 이해될 것이다. 본 발명과 관련하여, 알파- 및 베타-아미노산 둘 다가 포함된다. 본 발명의 바람직한 아미노산은 알파-아미노산, 특히 하기와 같은 시스틴을 포함한 20종의 "천연 아미노산"이다:

알라닌 (Ala / A)

아르기닌 (Arg / R)

아스파라긴 (Asn / N)

아스파르트산 (Asp / D)

시스테인 (Cys / C)

시스틴 (Cyss/C2)

글루탐산 (Glu / E)

글루타민 (Gln / Q)

글리신 (Gly / G)

히스티딘 (His / H)

이소류신 (Ile / I)

류신 (Leu / L)

리신 (Lys / K)

메티오닌 (Met / M)

페닐알라닌 (Phe / F)

프롤린 (Pro / P)

세린 (Ser / S)

트레오닌 (Thr / T)

트립토판 (Trp / W)

티로신 (Tyr / Y)

발린 (Val/V)

본 발명과 관련하여, 표현 "천연 아미노산"은 상기 열거된 20종의 아미노산의 L-형태 및 D-형태 둘 다를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, L-형태가 바람직하다. 한 실시양태에서, 용어 "아미노산"은 또한 이들 아미노산의 유사체 또는 유도체를 포함한다.

본 발명에 따르면, "유리 아미노산" (예를 들어 "유리 시스테인")은 유리 형태의, 즉, 다른 분자에 공유 결합되지 않은 아미노 및 (알파-) 카르복실 관능기를 갖는 아미노산, 예를 들어, 펩티드 결합을 형성하지 않은 아미노산인 것으로 이해된다. 유리 아미노산은 또한 염으로서 또는 수화물 형태로 존재할 수 있다. 디펩티드의 일부로서의 또는 디펩티드 내의 아미노산을 언급하는 경우에, 이는 생화학 및 펩티드 생합성의 공지된 메카니즘에 따라 각각의 아미노산으로부터 유래된 각각의 디펩티드 구조의 일부를 지칭하는 것으로 이해될 것이다.

화학적 화합물, 예컨대 아미노산과 관련하여 표현 "N-아실화된"은 N-아실화된 화합물이 상기 화합물의 질소 관능기에 아실 기를 부가함으로써 변형된 것임을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 아실 기는 아미노산의 알파-아미노 기에 부가된다.

본 발명과 관련하여, 산화된 시스테인 잔기를 통해 이황화 결합을 형성하는 Cys-펩티드는 (Xxx-Cys)₂로 기술될 것이다. 펩티드는 또한 염으로서 또는 수화물 형태로 존재할 수 있다. Cys-디펩티드의 이러한 이황화 결합 매개되는 이량체, 예를 들어 (Xxx-Cys)₂는 본 발명의 관점에서 여전히 디펩티드로 간주된다.

바람직하게는, 조성물은 25℃에서 적어도 5, 또는 바람직하게는 적어도 6의 pH-값을 갖는다.

본 발명의 유리한 구성에서, 유리 시스테인에 대한 펩티드-결합된 시스테인의 몰비는 0.1 내지 10, 바람직하게는 0.2 내지 4 또는 그 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 2이다. 바람직한 실시양태에서, 올리고- 또는 디펩티드는 환원된 상태 (= 유리 티올) 또는 산화된 상태 (= 이황화 결합됨), 바람직하게는 산화된 상태이다.

대안적 실시양태에서, 조성물은 디펩티드의 혼합 이황화물 및 시스테인 공급원을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 올리고- 또는 디펩티드는 pH 6 내지 pH 9의 pH 범위에서 적어도 > 10 g/l의 용해도를 갖는 하나 이상의 천연 아미노산을 추가로 포함하며, 이는 바람직하게는 글리신 (Gly), 알라닌 (Ala), 세린 (Ser), 프롤린 (Pro), 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu), 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg)으로부터 선택된다.

상기 올리고펩티드가 Xxx-Cys 또는 Cys-Xxx인 디펩티드이며, 여기서 Xxx는 천연 아미노산인 경우에 바람직하고, 바람직하게는 디펩티드는 Asp-Cys, Cys-Asp, Lys-Cys, Cys-Lys, Ala-Cys 또는 Pro-Cys인 것이 바람직하다. 바람직한 구성에서, 상기 디펩티드는 적어도 1mM, 바람직하게는 적어도 10 mM, 보다 바람직하게는 적어도 50 mM, 보다 바람직하게는 적어도 100 mM의 농도로 상기 배양 배지에 존재한다. 이러한 고농도에서, 본 발명에 따른 조성물은 시스테인-함유 디펩티드가 시스테인을 산화성 침전에 대해 안정화시키는 이점을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 올리고- 또는 디펩티드는 N-아실화되지 않는다. N-아실화는 특정 디펩티드의 열 안정성을 개선시키는 것으로 공지되어 있지만; N-아실화된 디펩티드가 한편으로는 열등한 생존 세포 밀도 및 생존능을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 화장품 제품, 영양 보충제 또는 임상 영양을 위한 영양 용액에 관한 것이다.

화장품 제품은 샴푸, 컨디셔너, 로션, 크림, 또는 피부 또는 모발을 트리트먼트하는데 사용되는 그 외 다른 제제일 수 있다. 영양 보충제는 액체 형태, 예컨대 시럽 또는 샷, 또는 고체 형태, 예컨대 캡슐, 연질-겔, 구미일 수 있다. 조성물은 또한 임상 경장 또는 비경구 영양을 위한 영양 용액의 부분, 예를 들어 아미노벤(Aminoven) (프레제니우스 카비(Fresenius Kabi))과 같은 아미노산 용액의 부분일 수 있다.

더욱이, 본 발명은 또한 세포 또는 조직 배양 배지에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 발명에 따른 조성물을 포함하며, 추가로 적어도 1종의 탄수화물, 적어도 1종의 유리 아미노산, 적어도 1종의 무기 염, 완충제 및/또는 적어도 1종의 비타민을 포함하는 세포 또는 조직 배양 배지에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 적어도 1종의 탄수화물, 적어도 1종의 유리 아미노산, 적어도 1종의 무기 염, 완충제 및 적어도 1종의 비타민을 모두 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 배양 배지는 성장 인자를 함유하지 않는다. 이러한 실시양태에 따르면, 본 발명의 올리고- 또는 디펩티드가 성장 인자 대신에 배양물에서의 세포의 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 배양 배지는 임의의 지질을 함유하지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 배양 배지는 액체 형태, 겔 형태, 분말 형태, 과립 형태, 펠릿 형태 또는 정제 형태이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 배지는 한정 배지 또는 무혈청 배지이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 밀테니 바이오테크 (Miltenyi Biotech; 독일 베르기슈 글라트바흐 소재)의 CHOMACS CD 배지, 론자 (LONZA; 스위스 바젤 소재)로부터 입수가능한 PowerCHO-2 CD 배지, PAA (PAA 래보러토리즈(PAA Laboratories), 오스트리아 파싱 소재)의 Acti-CHO P 배지, SAFC로부터 입수가능한 Ex-Cell CD CHO 배지, 써모피셔 (ThermoFisher; 미국 월섬 소재)의 SFM4CHO 배지 및 CDM4CHO 배지에 보충될 수 있다. 본 발명의 디펩티드는 또한 DMEM 배지 (라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corp.), 미국 칼스배드 소재)에 보충될 수 있다. 그러나, 본 발명이 상기 배지의 보충으로 제한되지는 않는다.

다른 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 사용 시의 상기 배지의 농도에 비해 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배 또는 10배 농축된 형태 (부피/부피)의 액체 배지이다. 이는 농축된 배지의 해당 부피의 멸균수를 사용한 단순 희석에 의한 "즉시 사용가능한" 배양 배지의 제조를 가능하게 한다. 또한 본 발명의 배지의 이러한 농축된 형태는, 예를 들어, 유가 배양 또는 관류 배양 공정에서 배양물에 대한 그의 첨가를 통해 사용될 수 있다.

본 발명의 세포 배양 배지 (세포 또는 조직 배양 기초 배지, 공급 배지 또는 관류 배지)는 바람직하게는 지속적인 성장 및 산물 형성을 위해 요구되는 모든 영양소를 함유할 수 있다. 배양 배지, 특히 세포 배양 배지를 제조하기 위한 레시피는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Oeztuerk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006] 참조). 다양한 배양 배지가 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.

본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 탄수화물 공급원을 포함할 수 있다. 세포 배양 배지에 사용되는 주요 탄수화물은 글루코스이며, 일상적으로 5 내지 25 mM로 보충된다. 추가로, 임의의 헥소스, 예컨대 갈락토스, 프룩토스 또는 만노스 또는 조합이 사용될 수 있다.

전형적으로 배양 배지는 적어도 필수 아미노산 (즉, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Try, Val) 뿐만 아니라 비-필수 아미노산을 또한 포함할 수 있다. 비-필수 아미노산은, 세포주가 아미노산을 합성할 수 없거나 또는 세포주가 최대한의 성장을 보조하기에 충분한 양의 아미노산을 생산할 수 없다면, 세포 배양 배지에 전형적으로 포함된다. 추가로, 포유동물 세포는 또한 주요 에너지원으로서 글루타민을 사용할 수 있다. 글루타민은 종종 다른 아미노산보다 더 높은 농도로 포함된다 (2-8 mM). 그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 글루타민은 자발적으로 분해되어 암모니아를 형성할 수 있으며, 특정 세포주는 독성인 암모니아를 보다 빨리 생산한다.

본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 염을 포함할 수 있다. 염은 등장성 상태를 유지하고 삼투압의 불균형을 방지하기 위해 세포 배양 배지에 첨가된다. 본 발명의 배양 배지의 오스몰랄농도는 약 300 mOsm/kg이지만, 많은 세포주가 이 값의 대략 10 퍼센트 변동 또는 그 초과를 견딜 수 있다. 일부 곤충 세포 배양물의 오스몰랄농도는 300 mOsm/kg 초과인 경향이 있으며, 이는 300 mOsm/kg의 0.5 퍼센트, 1 퍼센트, 2 내지 5 퍼센트, 5-10 퍼센트, 10-15 퍼센트, 15-20 퍼센트, 20-25 퍼센트, 25-30 퍼센트 초과일 수 있다. 세포 배양 배지에 가장 통상적으로 사용되는 염은 Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Cl^-, SO₄ ^2-, PO₄ ^3-, 및 HCO₃ ^- (예를 들어, CaCl₂, KCl, NaCl, NaHCO₃, Na₂HPO₄)을 포함한다.

다른 무기 원소가 배양 배지에 존재할 수 있다. 이들은 Mn, Cu, Zn, Mo, Va, Se, Fe, Ca, Mg, Si, 및 Ni를 포함한다. 이들 원소 중 다수가 효소적 활성에 관여한다. 이들은 염 예컨대 CaCl₂, Fe(NO₃)₃, MgCl₂, MgSO₄, MnCl₂, NaCl, NaHCO₃, Na₂HPO₄, 및 미량 원소, 예컨대, 셀레늄, 바나듐 및 아연의 이온의 형태로 제공될 수 있다. 이들 무기 염 및 미량 원소는, 예를 들어 시그마 (Sigma; 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 상업적으로 입수될 수 있다.

본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 비타민을 포함한다. 비타민은 전형적으로 세포에 의해 보조인자로서 사용된다. 각각의 세포주의 비타민 요구량은 매우 다양하지만, 일반적으로는 세포 배양 배지가 혈청을 거의 또는 전혀 함유하지 않거나 또는 세포가 고밀도로 성장된다면, 과잉의 비타민을 필요로 한다. 본 발명의 배양 배지에 바람직하게 존재하는 예시적인 비타민은 비오틴, 염화콜린, 엽산, i-이노시톨, 니코틴아미드, D-Ca⁺⁺-판토테네이트, 피리독살, 리보플라빈, 티아민, 피리독신, 니아신아미드, A, B₆, B₁₂, C, D₃, E, K, 및 p-아미노벤조산 (PABA)을 포함한다.

본 발명의 배양 배지는 또한 혈청을 포함할 수 있다. 혈청은 응고된 혈액의 상청액이다. 혈청 성분은 부착 인자, 미량영양소 (예를 들어, 미량 원소), 성장 인자 (예를 들어, 호르몬, 프로테아제), 및 보호 요소 (예를 들어, 항독소, 항산화제, 항프로테아제)를 포함한다. 혈청은 인간, 소 또는 말 혈청을 포함한, 다양한 동물 공급원으로부터 입수가능하다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지에 포함되는 경우에, 혈청은 전형적으로 5-10%(vol.)의 농도로 첨가된다. 바람직한 세포 배양 배지는 무혈청이다.

혈청의 부재 하에서의 또는 혈청이 감소된 배지에서의 세포 성장을 촉진하기 위해, 하기 폴리펩티드 중 1종 이상이 본 발명의 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다: 예를 들어, 산성 FGF 및 염기성 FGF를 포함한 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 상피 성장 인자 (EGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 및 TGF알파 및 TGF베타를 포함한 형질전환 성장 인자 (TGF), 임의의 시토카인, 예컨대 인터류킨 1, 2, 6, 과립구 자극 인자, 백혈구 억제 인자 (LIF) 등.

다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 폴리펩티드 (즉, 20개 초과의 아미노산을 갖는 펩티드)를 포함하지 않는다.

1종 이상의 지질, 예컨대 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 팔미톨레산, 올레산, 폴리엔산, 및/또는 각각의 탄소 원자가 분지되거나 또는 비분지된 것인, 12, 14, 16, 18, 20 또는 24개의 탄소 원자의 지방산, 인지질, 레시틴 (포스파티딜콜린), 및 콜레스테롤이 또한 본 발명의 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 이들 지질 중 1종 이상이 무혈청 배지에 보충물로서 포함될 수 있다. 무혈청 배지에서, 포스파티드산 및 리소포스파티드산은 특정 고착-의존성 세포, 예컨대 MDCK, 마우스 상피, 및 다른 신장 세포주의 성장을 자극하는 반면, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 및 포스파티딜이노시톨은 인간 섬유모세포의 성장을 자극한다. 에탄올아민 및 콜레스테롤이 또한 특정 세포주의 성장을 촉진하는 것으로 제시된 바 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지는 지질을 함유하지 않는다.

1종 이상의 운반체 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 트랜스페린이 또한 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 운반체 단백질은 특정 영양소 또는 미량 원소의 수송을 도울 수 있다. BSA는 전형적으로 수용액에서 불용성인 지질, 예컨대 리놀레산 및 올레산의 운반체로서 사용된다. 추가로, BSA는 또한 특정 금속, 예컨대 Fe, Cu, 및 Ni의 운반체의 역할을 할 수 있다. 단백질-무함유 제제에서, BSA의 비-동물 유래 대체물, 예컨대 시클로덱스트린이 지질 운반체로서 사용될 수 있다.

1종 이상의 부착 단백질, 예컨대 피브로넥틴, 라미닌, 및 프로넥틴이 또한 고착-의존성 세포의 기질에의 부착을 촉진하도록 돕기 위해 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다.

세포 배양 배지는 임의적으로 1종 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 N-[2-히드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄술폰산] (HEPES), MOPS, MES, 인산염, 중탄산염, 및 세포 배양 적용분야에서 사용하기에 적합한 그 외 다른 완충제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 완충제는 배양되는 세포에 대한 실질적인 세포독성 없이, 완충 능력을 제공하는 것이다. 적합한 완충제의 선택은 세포 배양 기술분야의 통상의 기술의 범위 내에 있다.

다가음이온성 또는 다가양이온성 화합물이 세포 군집을 방지하고 현탁 상태에서의 세포의 성장을 촉진하기 위해 배양 배지에 첨가될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 액체 형태이다. 그러나, 배양 배지는 또한 고체 배지, 예컨대 겔-유사 배지, 예를 들어 한천-, 카라긴- 또는 젤라틴-함유 배지 (분말, 조립화 분말, 과립화 분말 등)일 수도 있다. 바람직하게는, 배양 배지는 멸균 형태이다.

본 발명의 배양 배지는 농축된 형태일 수 있다. 이는, 예를 들어, (세포의 성장 및 산물 형성을 보조하는 농도에 비해) 2배 내지 100배, 바람직하게는 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 농축된 형태일 수 있다. 이러한 농축된 배양 배지는 농축된 배양 배지의 수성 용매, 예컨대 물을 사용한 희석에 의해, 사용하기 위한 배양 배지를 제조하는데 유용하다. 이러한 농축된 배양 배지는 회분 배양에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 또한 유가 또는 연속 배양에도 유리하게 사용될 수 있으며, 여기서 농축된 영양소 조성물이, 예를 들어, 배양 동안 세포에 의해 소모된 영양소를 다시 채우기 위해 진행 중인 세포의 배양에 첨가된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 배양 배지는 건조 형태, 예를 들어, 건조 분말 형태, 또는 과립 형태, 또는 펠릿 형태, 또는 정제 형태이다.

또한 본 발명은 세포를 배양하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 세포 배양 산물을 생산하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 동물 세포 또는 식물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 세포를 배양하기 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서, 배양되는 세포는 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HEK 세포, HELA 세포, AE-1 세포, 곤충 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 피부 세포, 내피 세포 및 하이브리도마 세포이다. 본 발명의 바람직한 세포는 CHO 세포 및 하이브리도마 세포이다. 본 발명의 가장 바람직한 세포는 CHO 세포이다. 본 발명의 특히 바람직한 CHO 세포는 CHO DG44 및 CHO DP12 세포이다.

세포를 배양하는 방법으로서, 상기 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포를 배양하는 방법은 세포의 배양을 보조하는 조건 하에 세포를 기초 배양 배지와 접촉시키고, 기초 세포 배양 배지에 본 발명에 따른 농축된 배지를 보충하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 기초 배양 배지는 1일 초과 동안 농축된 공급물 또는 배지가 보충된다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 배양 배지를 생산하는 방법으로서, 여기서 상기 배양 배지가 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배양 배지를 생산하는 방법은 본 발명의 조성물을 배양 배지에 첨가하는 적어도 1회의 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 한 측면은 세포 배양 배지를 생산하기 위한 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 배양 배지를 변형시키는 방법으로서, 여기서 상기 배양 배지의 상기 변형이 본 발명의 조성물의 상기 배양 배지에의 첨가를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 액체 배양 배지를 생산하는 방법으로서, 본 발명에 따른 고체 배지를, 예를 들어, 건조 분말의 형태로, 또는 과립의 형태로, 또는 펠릿의 형태로, 또는 정제의 형태로 제공하고; 상기 고체 배양 배지를 수성 매질, 예컨대 물에 용해시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 세포를 배양하기 위한 배양 배지에서의 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 세포 배양을 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다: (i) 상기 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 세포를 본 발명의 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 배양 배지로부터 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계. 또한, 본 발명은 세포 배양 산물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.

바람직한 방법에서, 세포 배양 산물은 치료용 단백질, 진단용 단백질, 폴리사카라이드, 예컨대 헤파린, 항체, 모노클로날 항체, 성장 인자, 인터류킨, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 효소이다.

본 발명에 따르면, 세포의 배양은 회분 배양, 유가 배양 또는 연속 배양으로 수행될 수 있다.

항목들

본 발명은 하기 항목들에 관한 것이다:

1. 하나의 아미노산이 시스테인 (Cys)인 알파-펩티드-결합만을 포함하는 적어도 하나의 올리고펩티드, 및 유리 시스테인을 포함하는 조성물.

2. 항목 1에 있어서, 유리 시스테인 및 유리 시스틴 (Cys-Cys)을 포함하는 조성물.

3. 항목 1 또는 2에 있어서, 올리고펩티드가 디펩티드인 조성물.

4. 상기 항목들 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 25℃에서 적어도 5, 바람직하게는 적어도 6의 pH-값을 갖는 것인 조성물.

5. 상기 항목들 중 어느 하나에 있어서, 유리 시스테인에 대한 올리고펩티드 결합된 시스테인의 몰비가 약 0.1 내지 10, 바람직하게는 약 0.2 내지 4, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 2인 조성물.

6. 상기 항목들 중 어느 하나에 있어서, 올리고펩티드가 환원된 상태 (= 유리 티올) 또는 산화된 상태 (= 이황화 결합됨), 바람직하게는 산화된 상태인 조성물.

7. 상기 항목들 중 어느 하나에 있어서, 올리고펩티드가 디펩티드로서, Xxx-Cys 또는 Cys-Xxx이며, 여기서 Xxx는 천연 아미노산인 조성물.

8. 상기 항목들 중 어느 하나에 있어서, 올리고펩티드가 25℃, pH 6 내지 pH 9의 pH 범위에서 적어도 10 g/l의 용해도를 갖는 하나 이상의 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신 (Gly), 알라닌 (Ala), 세린 (Ser), 프롤린 (Pro), 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu), 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg)으로부터 선택된 것, 보다 바람직하게는 Ala, Pro, Asp, Lys로부터 선택된 것을 추가로 포함하는 것인 조성물.

9. 상기 항목들 중 어느 하나에 있어서, 올리고펩티드가 디펩티드로서, Asp-Cys, Cys-Asp, Lys-Cys, Cys-Lys, Ala-Cys 또는 Pro-Cys이고, 가장 바람직하게는 Lys-Cys 또는 Cys-Lys인 조성물.

10. 항목 1 내지 6 또는 8 중 어느 하나에 있어서, 올리고펩티드가 디펩티드로서, (Xxx-Cys)₂ 또는 (Cys-Xxx)₂이며, 여기서 Xxx는 천연 아미노산인 조성물.

11. 항목 10에 있어서, 올리고펩티드가 디펩티드로서, (Asp-Cys)₂, (Cys-Asp)₂, (Lys-Cys)₂, (Cys-Lys)₂, (Ala-Cys)₂, (Pro-Cys)₂, (Lys-Cys)₂ 및 (Cys-Lys)₂로부터 선택되는 것인 조성물.

12. 항목 10 또는 11에 있어서, (Lys-Cys)₂ 및/또는 (Cys-Lys)₂가 1 내지 100 mM의 농도로 포함되고, 시스테인이 1 내지 100 mM의 농도로 포함되는 것인 조성물.

13. 항목 10 또는 11에 있어서, (Ala-Cys)₂, (Asp-Cys)₂, (Cys-Asp)₂, (Pro-Cys)₂가 20 내지 60 mM의 농도로 포함되고, 시스테인이 1 내지 100 mM의 농도로 포함되는 것인 조성물.

14. 상기 항목들 중 어느 하나에 있어서, 시스테인이 적어도 1mM, 바람직하게는 적어도 10 mM, 보다 바람직하게는 적어도 25 mM, 가장 바람직하게는 적어도 50 mM의 농도로 수용액에 첨가되는 것인 조성물.

15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 조성물을 포함하는 화장품 제품, 영양 보충제, 임상 영양을 위한 영양 용액.

16. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 조성물을 포함하는 세포 배양 배지로서, 적어도 1종의 탄수화물, 및/또는 적어도 1종의 추가의 유리 아미노산, 및/또는 적어도 1종의 무기 염, 및/또는 완충제, 및/또는 적어도 1종의 비타민을 추가로 포함하는 배양 배지.

17. 항목 16에 있어서, 상기 배양 배지가 액체 형태, 겔 형태, 분말 형태, 과립 형태, 펠릿 형태 또는 정제 형태인 배양 배지.

18. 항목 16 또는 17에 있어서, 상기 배양 배지가 사용 시의 배양 배지의 농도에 비해 2배 내지 100배 농축된 형태, 바람직하게는 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배, 10배 또는 100배 농축된 형태인 배양 배지.

19. 세포를 배양하기 위한, 바람직하게는 수성 스톡 또는 공급물 용액으로서의 항목 16 내지 18 중 어느 하나에 따른 배양 배지의 용도.

20. 항목 19에 있어서, 상기 세포가 동물 세포 또는 식물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포인 용도.

21. 항목 19 또는 20에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HEK 세포, HELA 세포, AE-1 세포, 곤충 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 피부 세포, 내피 세포, 면역 세포 예컨대 NK 또는 T-세포 및 하이브리도마 세포로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인 용도.

22. 하기 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법:

- 상기 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계;

- 상기 세포를 항목 16 내지 18 중 어느 하나의 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및

- 상기 배양 배지로부터 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계.

23. 항목 22에 있어서, 상기 세포 배양 산물이 치료용 단백질, 진단용 단백질, 폴리사카라이드, 예컨대 헤파린, 항체, 모노클로날 항체, 성장 인자, 인터류킨, 바이러스, 바이러스-유사 입자 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

실시예

실시예 1: Cys-디펩티드 (Lys-Cys) ₂ 의 첨가에 의한 시스테인의 침전에 대한 안정화

모든 실시예의 모든 실험에서 물질의 용액 및 그의 희석액을 pH = 7의 100 mM 인산염 완충액으로 제조하였다. pH = 7의 100 mM 인산염 완충액 중 시스테인의 100 mM 용액에서 적합한 농도의 (Lys-Cys)₂의 첨가에 의해 침전을 피할 수 있었다.

침전으로 인한 탁도를 마이크로타이터 플레이트-기반 검정에서 광도계로 600 nm에서 측정하였다. 웰당 액체 부피는 200 μl였고, 측정은 마이크로플레이트 판독기 (테칸(Tecan))로 37℃에서 24시간에 걸쳐 수행되었다. 플레이트는 뚜껑으로 덮여 있지 않았다.

pH = 7에서 시스테인의 100 mM 용액을 0, 100, 200 또는 400 mM (Lys-Cys)₂ x 2 HCl을 사용하여 제조하였을 때, 놀라운 결과가 얻어졌다. 첨가되는 펩티드가 없을 때 침전이 확인되고 측정될 수 있었다. 그러나, 100 mM의 (Lys-Cys)₂는 심지어 침전을 가속화한 반면, 200 mM 및 400 mM의 (Lys-Cys)₂는 침전을 효과적으로 방지하였다. 침전물을 육안으로 관찰할 수 있었고, 비탁법을 통해 측정하였다 (도 1 참조).

도 1은 증가하는 농도의 (Lys-Cys)₂의 존재 하에 37℃에서 24시간에 걸쳐서의 pH = 7의 100 mM 시스테인 용액 중 침전물의 형성을 제시한다.

실시예 2: (Lys-Cys) ₂ 및 시스테인의 첨가에 의한 시스틴의 가용화

표 1에 기재된 20 ml의 조성물을 pH = 7의 100 mM 인산염 완충액으로 제조하고, 밀폐된 50 ml 폴리프로필렌 튜브 (팔콘(Falcon))에서 24 h 동안 인큐베이션하였다. (Lys-Cys)₂를 충분한 농도로 첨가한 경우에는 투명한 용액이 수득된 반면, 보다 낮은 농도에서는 혼합물이 혼탁한 현탁액으로 남아있었다.

표 1: 100 mM 인산염 완충액으로 제조하고, 진탕 하에 25℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 혼합물 성분의 밀리몰 농도. 육안 검사는 다음 날에 수행하였다.

실시예 3: 시스테인의 첨가에 의한 (Ala-Cys) ₂ 의 가용화

pH = 7 및 37℃에서 (Ala-Cys)₂의 최대 용해도는 50 mM 미만이다. pH = 7의 인산염 완충액 중 50 mM (Ala-Cys)₂의 혼탁한 현탁액을 제조하고, 증가하는 양의 시스테인을 첨가하였다. 마이크로타이터 플레이트 내 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였고 (웰당 액체 부피는 200 μl였음), 30분 후에 600 nm에서의 탁도를 측정하였다. 20 mM 이상의 시스테인 농도에서, (Ala-Cys)₂는 완전히 가용화되었고, 탁도의 추가의 감소가 측정되지 않았다. 용액은 육안으로 투명하였다 (도 2 참조).

도 1은 증가하는 양의 시스테인의 첨가에 의한 50 mM (Ala-Cys)₂ 현탁액의 탁도의 감소를 제시한다.

실시예 4: 산화성 조건 하에 Cys-디펩티드 (Lys-Cys) ₂ 의 첨가에 의한 100 mM 시스테인 용액의 침전에 대한 안정화

실시예 1에 기재된 바와 같은 실험을 마이크로타이터 플레이트로 수행하였다. 37℃에서 2시간의 인큐베이션 후에, 14 μl의 5 중량% H₂O₂ 용액을 각각의 웰에 첨가하여 산화를 가속화하고, 완전히 산화된 상태에서 안정화를 평가하였다. 시스테인만을 함유하는 샘플은 H₂O₂의 첨가 직후에 혼탁해졌으며, 이는 아마도 시스틴의 형성 때문일 가능성이 가장 크다. (Lys-Cys)₂를 함유하는 샘플의 경우에는 탁도의 즉각적인 증가가 관찰되지 않았다. 후속적으로 마이크로플레이트 판독기로의 탁도 측정을 계속하였다. 그 결과가 제시되어 있다. (Lys-Cys)₂의 농도가 증가할수록 탁도 증가가 크게 감소되었고, 400 mM (Lys-Cys)₂가 첨가된 경우에는 침전물이 관찰되지 않았다.

도 2는 다양한 농도의 (Lys-Cys)₂의 첨가에 의한 100 mM 시스테인 용액의 산화성 침전에 대한 안정화를 제시한다. 마이크로플레이트 내 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였고, 탁도를 광도계로 측정하였다. 후속적으로 H₂O₂를 첨가하여 산화를 가속화하고, 완전히 산화된 상태에서 침전에 대한 안정성을 평가하였다. H₂O₂ 첨가 직후에 탁도 측정을 계속하였다. 시스테인 단독의 경우에는, H₂O₂가 첨가되었을 때 용액이 바로 가시적으로 혼탁해졌다. 첨가되는 (Lys-Cys)₂의 양이 증가할수록, 탁도를 통해 측정된 침전물의 양이 감소되었다. 400 mM (Lys-Cys)₂에서, 측정 동안 계속해서 혼합물이 완전히 투명하게 남아있었다.

실시예 5: 산화성 조건 하에 다양한 Cys-디펩티드의 첨가에 의한 25 mM 및 50 mM 시스테인 용액의 침전에 대한 안정화

상기 기재된 안정화가 또한 다른 Cys-디펩티드의 첨가에 의해서도 가능한지를 평가하기 위해, 50 mM 및 25 mM의 감소된 시스테인 농도가 사용되었고, 첨가된 Cys-디펩티드의 농도가 0 (= 대조군), 5, 10, 25 및 50 mM인 것을 제외하고는, 실시예 4에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. (Asp-Cys)₂, (Cys-Asp)₂, (Lys-Cys)₂, (Cys-Lys)₂, (Ala-Cys)₂ 및 (Pro-Cys)₂의 효과를 평가하였다. 모든 Cys-펩티드가 H₂O₂의 첨가 후에 시스테인 용액으로부터 침전을 방지할 수 있었다. 50 mM의 시스테인 농도에서 다양한 Cys-펩티드 간에 안정화 효율에서의 차이가 관찰되었다. 리신 잔기를 함유하는 Cys-디펩티드가 가장 효율적인 안정화제였고, 1:2 내지 1:5의 Cys-펩티드 대 시스테인의 몰비가 충분한 안정성을 제공하였다. 4.5시간 후에 50 mM 시스테인에서의 탁도 측정의 결과가 표 2에 제시되어 있다.

표 2: 다양한 농도의 Cys-디펩티드와 혼합된 50 mM 시스테인 용액의 탁도. 탁도는 4.5시간 후에 600 nm에서 측정되었다 (AU).

시스테인의 농도가 감소할수록, 완전한 안정화를 위해 요구되는 디펩티드 대 시스테인의 몰비가 1:10의 가장 낮은 측정 비로 감소하였다. 이는 25 mM 시스테인 용액의 탁도 측정의 결과인 표 3에 나타나 있다.

표 3: 다양한 농도의 Cys-디펩티드와 혼합된 25 mM 시스테인 용액의 탁도. 탁도는 4.5시간 후에 600 nm에서 측정되었다 (AU).

표 2 및 3의 결과가 시각화되어 있다.

도 3은 50 mM 시스테인 용액에 다양한 농도의 Cys-펩티드의 첨가에 의해 제공된 산화성 침전에 대한 안정화 효과를 제시한다.

도 4는 25 mM 시스테인 용액에 다양한 농도의 Cys-펩티드의 첨가에 의해 제공된 산화성 침전에 대한 안정화 효과를 제시한다.

실시예 6: 산화성 조건 하에 환원 및 산화된 Cys-디펩티드의 첨가에 의한 50 mM 시스테인 용액의 침전에 대한 안정화

상기 기재된 안정화가 또한 환원된 Cys-디펩티드 (= 유리 티올)의 첨가에 의해서도 가능한지를 평가하기 위해, 실시예 4에 기재된 것과 동일한 실험 설정을 선택하였다. 이 경우에는, 다양한 농도의 환원된 디펩티드 Cys-Gly 및 산화된 디펩티드 (Cys-Gly)₂를 50 mM 시스테인 용액에 첨가하였다. 이들 Cys-펩티드가 둘 다 H₂O₂의 첨가 후에 시스테인 용액으로부터 침전을 방지할 수 있었다. 산화된 디펩티드 (Cys-Gly)₂는 25 mM의 펩티드 농도에서 이미 침전을 완전히 억제할 수 있었고, 반면에 환원된 디펩티드 Cys-Gly에 의한 완전한 안정화는 50 mM에서만 획득되었기 때문에, 산화된 디펩티드 (Cys-Gly)₂가 침전의 방지에 있어서 보다 더 효율적이었다. 그 결과가 표 4에 요약되어 있다.

표 4: 다양한 농도의 환원된 Cys-Gly 및 산화된 (Cys-Gly)₂와 혼합된 50 mM 시스테인 용액의 탁도. 탁도는 4.5시간 후에 600 nm에서 측정되었다 (AU).

Claims

하나의 아미노산이 시스테인 (Cys)인 알파-펩티드-결합만을 포함하는 적어도 하나의 올리고펩티드, 및 유리 시스테인을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 올리고펩티드가 디펩티드인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 25℃에서 적어도 5, 바람직하게는 적어도 6의 pH-값을 갖는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유리 시스테인에 대한 올리고펩티드 결합된 시스테인의 몰비가 약 0.1 내지 10, 바람직하게는 약 0.2 내지 4, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 2인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고펩티드가 환원된 상태 (= 유리 티올) 또는 산화된 상태 (= 이황화 결합됨), 바람직하게는 산화된 상태인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고펩티드가 25℃, pH 6 내지 pH 9의 pH 범위에서 적어도 10 g/l의 용해도를 갖는 하나 이상의 천연 아미노산, 바람직하게는 글리신 (Gly), 알라닌 (Ala), 세린 (Ser), 프롤린 (Pro), 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu), 리신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg)으로부터 선택된 것, 보다 바람직하게는 Ala, Pro, Asp, Lys로부터 선택된 것을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고펩티드가 디펩티드로서, Xxx-Cys 또는 Cys-Xxx이며, 여기서 Xxx는 천연 아미노산이고, 바람직하게는 디펩티드가 Asp-Cys, Cys-Asp, Lys-Cys, Cys-Lys, Ala-Cys 또는 Pro-Cys이고, 가장 바람직하게는 Lys-Cys 또는 Cys-Lys인 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인이 적어도 1mM, 바람직하게는 적어도 10 mM, 보다 바람직하게는 적어도 25 mM, 가장 바람직하게는 적어도 50 mM의 농도로 수용액에 첨가되는 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 화장품 제품, 영양 보충제, 임상 영양을 위한 영양 용액.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 세포 배양 배지로서, 적어도 1종의 탄수화물, 및/또는 적어도 1종의 추가의 유리 아미노산, 및/또는 적어도 1종의 무기 염, 및/또는 완충제, 및/또는 적어도 1종의 비타민을 추가로 포함하는 배양 배지.
제10항에 있어서, 상기 배양 배지가 액체 형태, 겔 형태, 분말 형태, 과립 형태, 펠릿 형태 또는 정제 형태인 배양 배지.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 배양 배지가 사용 시의 배양 배지의 농도에 비해 2배 내지 100배 농축된 형태, 바람직하게는 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배 또는 10배 농축된 형태인 배양 배지.
세포를 배양하기 위한, 바람직하게는 수성 스톡 또는 공급물 용액으로서의 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지의 용도.
제13항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HEK 세포, HELA 세포, AE-1 세포, 곤충 세포, 섬유모세포, 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 피부 세포, 내피 세포, 면역 세포 예컨대 NK 또는 T-세포 및 하이브리도마 세포로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인 용도.
하기 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법:
- 상기 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계;
- 상기 세포를 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및
- 상기 배양 배지로부터 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계.