KR102536543B1 - N-아실-x-글루타민 디펩티드를 포함하는 배양 배지 - Google Patents

N-아실-x-글루타민 디펩티드를 포함하는 배양 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생명공학 생산 프로세스에 사용하기 위한 개선된 배양 배지, 이러한 개선된 배지를 이용하는 프로세스, 및 이러한 프로세스로부터 수득된 산물에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 배지는 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트로부터의 L-글루타민 및 다른 글루타민-공급원 Q공급원의 세트로부터의 L-글루타민을 규정된 몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)으로 포함하며; 여기서 X는 L-아미노산으로서 규정되고; 여기서 Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고; 여기서 아실은 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X의 아미노- 말단에 부착된 C1-C7-아실 모이어티로서 규정되고; 여기서 R은 0.03 내지 20의 범위 내에 있는 것으로 규정되고; 여기서 n(아실-X-Q)는 배양 배지 중의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이고; 여기서 n(Q공급원)은 배양 배지 중의 다른 글루타민 공급원 Q공급원의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이다. 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 구성성분은 하기: 유리 L-글루타민, 디펩티드 Y-Q, 또는 그의 혼합물로부터 선택되며, 여기서 Y는 20개의 유전적으로 코딩된 L-아미노산 중 하나로서 규정되고, Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 Y에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고, 디펩티드 Y-Q에서 Y와 Q를 연결하는 아미드 결합은 아미노산 Y의 카르복시 말단 및 글루타민 Q의 아미노 말단을 수반하는 규칙적인 주쇄 아미드 결합이다.

Description

N-아실-X-글루타민 디펩티드를 포함하는 배양 배지
본 발명은 생명공학 생산 프로세스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생명공학 생산 프로세스에 사용하기 위한 개선된 배양 배지, 이러한 개선된 배지를 이용하는 프로세스, 및 개선된 배양 배지를 사용하여 상기 프로세스로부터 수득된 산물에 관한 것이다.
생명공학 프로세스는 생물학적 산물의 생산에 널리 사용된다. 이들 프로세스는 전형적으로, 배양된 세포에 의한 성장 및 산물 형성이 허용되는 조건 하에 배양 배지에서 세포의 배양을 수반한다. 생명공학 생산에 유용한 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 및 동물 또는 식물 기원의 세포이다.
동물 세포 배양은 생물학적 산물, 예컨대 치료용 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 다른 생물학적 분자, 예컨대 치료용 폴리사카라이드의 생산에 오랫동안 사용되어 왔다. 이러한 세포 배양 프로세스에서, 원하는 산물을 생산하도록 정상적으로 유전적으로 변형된 동물 세포는 세포 증식 및 산물 형성을 위해 액체, 고체 또는 반고체 배양 배지에서 배양된다. 세포 배양의 한 가지 중요한 이점은 동물 세포 및 식물 세포가 1차 산물의 번역 후 변형, 예컨대 폴리펩티드의 폴딩 및 번역 후 변형을 수행할 수 있다는 사실이다.
생명공학 생산 프로세스, 특히 동물 세포 배양에서, 세포 배양 조건의 제어 및 최적화는 세포 증식 및 산물 형성에 매우 중요하다. 한 가지 결정적인 요인은 배지 조성이다. 최종 세포 배양 산물의 농도 및 품질은 배지 조성에 따라 아주 많이 좌우된다. 동물 및 식물 세포 배양은 특히, 필요한 영양소 조성물 및 배양 조건의 관점에서 요구된다. 필요한 영양소는 탄소, 질소 및 에너지에 대한 기본 공급원, 예컨대 당 및 암모니아를 포함할 뿐만 아니라 더 복잡한 영양소, 예컨대 필수 아미노산, 및 비타민이 필요할 수 있다. 이러한 이유로, 동물 세포 배양 배지를 혈청과 같은 복합 영양소 조성물로 보충하는 것은 동물 세포에 광범위한 영양소를 제공하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 규제 및 안전성 문제 뿐만 아니라 이용가능한 혈청 공급원의 이질성 문제로 인해 산업계는 산업 세포 배양 프로세스로부터 혈청 및 다른 비-규정된 배지를 제거하기 위해 노력하여 왔다. 그러나, 무혈청 배지에서 성장된 세포 배양물은 종종, 영양 결핍을 나타낸다. 이러한 이유로, 복합 배지의 영양 성분 뿐만 아니라 세포 배양물에서 만족스러운 성장 및 단백질 형성에 필요한 그의 최적의 농도를 확인하기 위해 많은 노력이 이루어졌다.
세포 배양물에 아미노산을 공급하는 것은 성장 속도 및 생산에 상당한 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 글루타민은 배양된 세포에 대한 중요한 탄소, 질소 및 에너지 공급원이기 때문에, 세포 배양 배지에서 일상적으로 사용된다. 동물 세포 배양물의 최적 성장에 필요한 글루타민의 양은 다른 아미노산의 양보다 3 내지 10배 더 많은 것으로 입증되었다 (Eagle et al., Science 130:432-37). 그러나, 열 멸균 조건과 같이 고온에서 물에 용해되는 경우 영양소로서의 글루타민은 불안정한데, 이는 피로글루타메이트 및 암모니아가 열에 의해 형성되기 때문이다 (Roth et al. 1988, In Vitro Cellular & Developmental Biology 24(7): 696-98). 이러한 이유로, 글루타메이트는 종종, 글루타민 대신 세포 배양 배지에 사용된다 (Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-based Therapies, 52, Sadettin et al., Eds., Taylor and Francis Group, 2006). 다른 군은 글루타민-함유 디펩티드, 예컨대 알라닐-글루타민 또는 글리실-글루타민을 세포 배양 배지에 부가함으로써 원치 않는 물질, 예컨대 피로글루타메이트 및 암모니아의 형성을 피하려고 노력하였다 (Roth et al. (1988), In Vitro Cellular & Developmental Biology 24(7): 696-98). 또 다른 군은 열 멸균 조건 하에 보다 안정하게 하기 위해 디펩티드를 아실화하는 것을 제안하였다. US 5,534,538에는 N-아실 디펩티드 및 열 멸균된 장내 또는 비경구 영양 산물에서의 그의 용도가 기재되어 있다.
EP 0220379 및 DE3538310은 세포 배양 배지에서의 글루타민-함유 디펩티드 및 트리펩티드의 용도를 개시한다. 글루타민은 고온 하에서의 글루타민의 불안정성으로 인한 문제를 피하기 위해 디펩티드의 형태로 부가된다. 글루타민-함유 디펩티드는 온도 비감수성 글루타민 공급원으로서 사용된다.
JP61271985는 디펩티드 Xxx-L-글루타민 (여기서 Xxx는 글리신, D/L-알라닌, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-발린, L-류신, L-세린, L-리신 또는 L-페닐알라닌임)을 포함한, 동물 세포에 유용한 배양 배지를 개시한다.
선행 기술분야에 기재된 세포 배양 배지는 특정의 세포 배양 프로세스에 대해 만족스러운 성능 및 특성을 제공하지만, 생명공학 생산 프로세스에서 개선된 산물 형성을 촉진시켜 주는 세포 배양 배지가 여전히 필요하다.
본 발명의 맥락에서, 하기 세포 배양 배지가 생명공학 생산 프로세스의 생산성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다:
N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트로부터의 L-글루타민 및 다른 글루타민-공급원 Q공급원의 세트로부터의 L-글루타민을 규정된 몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)으로 포함하는 세포 배양 배지:
여기서 X는 L-아미노산으로서 규정되고;
여기서 Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고;
여기서 아실은 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X의 아미노-말단에 부착된 C1-C7-아실 모이어티로서 규정되고;
여기서 R은 0.03 내지 20의 범위 내에 있는 것으로 규정되고;
여기서 n(아실-X-Q)는 배양 배지 중의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이고;
여기서 n(Q공급원)은 배양 배지 중의 다른 글루타민 공급원 Q공급원의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이다.
다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 구성성분은 하기: 유리 L-글루타민, 디펩티드 Y-Q, 또는 그의 혼합물로부터 선택되며, 여기서 Y는 20개의 유전적으로 코딩된 L-아미노산 중 하나로서 규정되고, Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 Y에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고, 디펩티드 Y-Q에서 Y와 Q를 연결하는 아미드 결합은 아미노산 Y의 카르복시 말단 및 글루타민 Q의 아미노 말단을 수반하는 규칙적인 주쇄 아미드 결합이다.
제1 측면에서 본 발명은 상기 개시된 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 세포를 배양하기 위한 이러한 세포 배양 배지의 용도 뿐만 아니라 세포를 본원에 개시된 바와 같은 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 배양 산물의 제조를 위한 프로세스에 관한 것이다.
본 발명에 따른 "배양 배지"는 영양소를 함유하는 액체 또는 고체 배지인 것으로서 이해될 것이며, 이러한 배지는 배양물 중의 세포에 영양소를 제공하고 세포의 수명 및/또는 산물 형성을 지원하는데 적합하다. 본 발명에 따라서 배양된 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 곤충 세포, 및/또는 식물 세포, 예를 들어 조류일 수 있다. 전형적으로, 배양 배지는 필수 및 비-필수 아미노산, 비타민, 적어도 하나의 에너지 공급원, 지질, 및 미량 원소를 제공하는데, 이는 모두 수명, 성장 및/또는 산물 형성을 유지하기 위해 세포에 의해 요구된다. 배양 배지는 또한, 호르몬 및 성장 인자를 포함하여, 최소 속도 초과로 성장 및/또는 생존을 증강시키는 성분을 함유할 수 있다. 배양 배지는 바람직하게는, 세포의 수명, 성장 및/또는 산물 형성을 지원하는 pH 및 염 농도를 갖는다. 본 발명에 따른 배양 배지는 바람직하게는, 세포 배양물의 수명 및 증식을 유지하는데 필요한 모든 영양소를 포함한다. 바람직한 배양 배지는 규정된 배지이다.
본 발명에 따른 "화학적으로 규정된 배지"는 세포 추출물, 세포 가수분해물, 또는 단백질 가수분해물을 함유하지 않는 배지이다. 화학적으로 규정된 배지는 공지되지 않은 조성의 성분을 포함하지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이, 화학적으로 규정된 배지는 통상적으로, 동물 유래 성분을 함유하지 않는다. 화학적으로 규정된 배지의 모든 성분은 공지된 화학 구조를 가지고 있다. 규정된 배양 배지 이외의 배양 배지는 "복합" 배양 배지로서 지칭될 수 있다.
"세포 배양 배지"는 동물 세포 및/또는 식물 세포의 수명, 증식 및/또는 산물 형성을 유지하는데 적합한 배양 배지인 것으로서 이해될 것이다.
본 발명에 따른 "영양소"는 세포가 생존하고 성장하는데 필요한 화학적 화합물 또는 물질이다. 영양소는 바람직하게는, 환경으로부터 세포에 의해 흡수된다. 영양소는 "유기 영양소" 및 "무기 영양소"일 수 있다. 유기 영양소는 탄수화물, 지방, 단백질 (또는 그의 빌딩 블록, 예를 들어 아미노산), 및 비타민을 포함한다. 무기 영양소는 무기 화합물, 예컨대, 예를 들어 식이 미네랄 및 미량 원소이다. "필수 영양소"는 세포가 스스로 합성할 수 없는 영양소이며, 따라서 배양 배지에 의해 세포에 제공되어야만 한다.
본 발명에 따른 "세포 배양 산물"은 세포 배양물 중의 세포에 의해 생산된 임의의 유용한 생물학적 화합물인 것으로서 이해될 것이다. 본 발명의 바람직한 세포 배양 산물은 치료용 단백질, 진단용 단백질, 치료용 폴리사카라이드, 예컨대 헤파린, 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 성장 인자, 인터류킨, 펩티드 호르몬, 및 효소이다.
본 발명에 따른 "유리 아미노산"은 그의 아미노 및 그의 (알파-) 카르복실 작용기를 유리 형태로 갖는, 즉 다른 분자와 공유적으로 결합되지 않은 아미노산, 예를 들어, 펩티드 결합을 형성하지 않는 아미노산인 것으로서 이해된다. 유리 아미노산은 또한, 염 또는 수화물 형태로 존재할 수 있다. 펩티드의 일부로서 또는 펩티드에서 아미노산을 지칭할 때, 이는 각각의 아미노산으로부터 유래된 각각의 펩티드 구조의 일부를 지칭하는 것으로서 이해될 것이다.
본 발명에 따른 "성장 인자"는 세포 성장, 증식 및 세포 분화를 자극할 수 있는 임의의 자연적으로 발생하는 물질인 것으로서 이해될 것이다. 바람직한 성장 인자는 단백질 또는 스테로이드 호르몬의 형태이다. 본 발명의 한 실시양태에 따르면, 표현 "성장 인자"는 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 염기성 FGF를 포함한 FGF, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 상피 성장 인자 (EGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 전환 성장 인자 (TGF)알파 및 TGF베타를 포함한 TGF, 시토카인, 예컨대 인터류킨 1, 2, 6, 과립구 자극 인자, 및 백혈구 억제 인자 (LIF)로 이루어진 목록으로부터 선택된 성장 인자와 관련이 있는 것으로서 해석될 것이다.
본 발명에 따른 "펩티드"는 2 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 화합물인 것으로서 이해될 것이다.
아미노산과 관련하여 표현 "N-아실화된"은 아미노산의 알파-아미노 기에 아실 기를 부가함으로써 N-아실화된 아미노산이 변형되는 것을 의미하는 것으로서 이해될 것이다.
영양소 조성물, 배양 배지, 세포 배양 배지 등의 "멸균 형태"는 상기 조성물, 배양 배지, 세포 배양 배지 등에 임의의 살아있는 물질의 부재를 규정하는 것으로서 이해될 것이다.
본 발명의 맥락에서 "고체 배양 배지"는 임의의 비-액체 또는 비-기체 배양 배지인 것으로서 이해될 것이다. 본 발명의 바람직한 고체 배양 배지는 겔 유사 배양 배지, 예컨대 한천-한천, 카라긴 또는 젤라틴이다.
본 발명의 맥락에서, "세포의 계대 접종" (세포의 계대 배양 또는 분할로서 공지되기도 함)은 적은 수의 세포를 새로운 배양 용기로 옮기는 것을 의미하는 것으로서 이해된다. 세포는 장기간 높은 세포 밀도와 연관된 노화를 피하기 때문에, 이들이 규칙적으로 분할되는 경우에 더 오랜 시간 동안 배양될 수 있다. 현탁 배양은 더 큰 부피의 신선한 배지에 희석된 몇 개의 세포를 함유하는 소량의 배양물로 용이하게 계대 접종된다.
본 발명은 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트로부터의 L-글루타민 및 다른 글루타민-공급원 Q공급원의 세트로부터의 L-글루타민을 규정된 몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)으로 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다:
여기서 X는 L-아미노산으로서 규정되고;
여기서 Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고;
여기서 아실은 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X의 아미노-말단에 부착된 C1-C7-아실 모이어티로서 규정되고;
여기서 R은 0.03 내지 20의 범위 내에 있는 것으로 규정되고;
여기서 n(아실-X-Q)는 배양 배지 중의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이고;
여기서 n(Q공급원)은 배양 배지 중의 다른 글루타민 공급원 Q공급원의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이다.
다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 구성성분은 하기: 유리 L-글루타민, 디펩티드 Y-Q, 또는 그의 혼합물로부터 선택되며, 여기서 Y는 20개의 유전적으로 코딩된 L-아미노산 중 하나로서 규정되고, Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 Y에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고, 디펩티드 Y-Q에서 Y와 Q를 연결하는 아미드 결합은 아미노산 Y의 카르복시 말단 및 글루타민 Q의 아미노 말단을 수반하는 규칙적인 주쇄 아미드 결합이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 구성성분은 하기: 유리 L-글루타민, 디펩티드 Y-Q (여기서 Y는 알라닌임), 또는 그의 혼합물로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 유일한 구성성분은 디펩티드 Y-Q이며, 여기서 Y는 알라닌이다.
본 발명자들은 이러한 종류의 세포 배양 배지가 선행 기술분야의 세포 배양 배지보다 우월한 특성을 갖는다는 것을 밝혀내었다. 본 발명자들은 명시된 바와 같은 비율로 L-글루타민의 공급원을 제공하면 세포 배양물의 생산성이 증가된다는 것을 밝혀내었다.
본 발명에 따르면, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q에서 L-아미노산 X는 임의의 천연 L-아미노산, 즉 20개의 유전적으로 코딩된 L-아미노산 중 임의의 것일 수 있으며, 즉 X는 하기로부터 선택된다:
알라닌 (Ala / A)
아르기닌 (Arg / R)
아스파라긴 (Asn / N)
아스파르트산 (Asp / D)
시스테인 (Cys / C)
글루탐산 (Glu / E)
글루타민 (Gln / Q)
글리신 (Gly / G)
히스티딘 (His / H)
이소류신 (Ile / I)
류신 (Leu / L)
리신 (Lys / K)
메티오닌 (Met / M)
페닐알라닌 (Phe / F)
프롤린 (Pro / P)
세린 (Ser / S)
트레오닌 (Thr / T)
트립토판 (Trp / W)
티로신 (Tyr / Y)
발린 (Val/V).
본 발명의 바람직한 실시양태에서, X는 글루타민을 제외하고는 20개의 유전적으로 코딩된 L-아미노산으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, X는 Ala, Gly, Asn으로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서 X는 Ala이다.
본 발명에 따르면, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q에서 X와 Q를 연결하는 아미드 결합은 아미노산 X의 카르복시 말단 및 글루타민 Q의 아미노 말단을 수반하는 규칙적인 주쇄 아미드 결합이다.
본 발명에 따르면 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 C1-C7-아실 모이어티는 아실 기 RA-C(O)-로서 규정되고, 여기서 RA는 선형 또는 분지된 C1-C6-알킬 또는 C3-C6-시클로알킬이다.
유용한 선형 또는 분지된 쇄 C1-C6-알킬 기는 특히, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, 이소프로필, sec-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸을 포함한다.
유용한 C3-C6-시클로알킬 기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실을 포함한다.
바람직하게는, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 C1-C7-아실 모이어티는 아세틸-기, 즉 바람직하게는 RA가 메틸이다.
본 발명에 따르면, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 아실 기는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X의 아미노-말단에 부착된다.
바람직하게는 본 발명의 배양 배지 중의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트는 아세틸-A-Q, 아세틸-G-Q, 아세틸-N-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택된다. 매우 바람직하게는 본 발명의 배양 배지 중의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트는 아세틸-A-Q 만을 함유한다.
본 발명의 배양 배지 중의 모든 L-글루타민 함유 물질은 2개의 분리된 물질의 세트 중 하나에 배정될 수 있다:
(i) N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q (아실 및 X는 각각의 실시양태에서 규정된 바와 같음);
(ii) 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트.
따라서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q (아실 및 X는 각각의 실시양태에서 규정된 바와 같음)의 규정를 충족시키지 않는 본 발명의 배양 배지에 함유된 L-글루타민 함유 물질의 세트 내의 모든 물질은 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트를 구성한다.
본 발명에 따르면 몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)은 바람직하게는, 하기 범위로부터 선택된다: 0.03 내지 20; R = 0.04 내지 15.67; R = 0.05 내지 10; R = 0.05 내지 5. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 R은 범위 R = 0.04 내지 15.67로부터 선택된다.
본 발명의 배양 배지는 액체 형태, 겔 형태, 예를 들어 한천-한천-, 카라긴- 또는 젤라틴-함유 배지일 수 있거나, 또는 분말, 과립, 펠릿 또는 정제 형태일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 액체 형태이다.
바람직하게는, 배양 배지는 멸균 형태이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 배지는 화학적으로 규정된 배지, 또는 무혈청 배지이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 배지는 화학적으로 규정된 배지이다. 이러한 배지를 수득하기 위해, 예를 들어, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotech; 독일 베르기슈 글라트바흐)의 CHOMACS CD 배지, 론자 (LONZA; 스위스 바젤)로부터 입수가능한 파워CHO-2 CD 배지, PAA [PAA 래보러토리즈 (PAA Laboratories; 오스트리아 파싱)]의 악티-CHO P 배지, SAFC로부터 입수가능한 엑스-셀(Ex-Cell) CD CHO 배지, 써모피셔 (ThermoFisher; 미국 월섬)의 SFM4CHO 배지 및 CDM4CHO 배지, DMEM 배지 [라이프 테크놀로지스 코포레이션 (Life Technologies Corp.; 미국 칼즈배드)]에 보충될 수 있으므로, 본 발명에 의해 명시된 바와 같이, L-글루타민의 공급원의 적합한 화학량론적 비율을 산출한다. 그러나, 본 발명은 상기 배지의 보충으로 제한되지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 배양 배지는 성장 인자를 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 배양 배지는 임의의 지질을 함유하지 않는다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 배지는, 사용 중인 상기 배지의 농도에 비해, 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배 또는 10배 농축된 형태 (부피/부피)의 액체 배지 농축물이다. 이는 상기 농축된 배지를 각각의 부피의 멸균 수로 간단히 희석시킴으로써 "즉시 사용가능한" 배양 배지의 제조를 가능하게 한다. 이러한 본 발명의 배지의 농축된 형태는 또한, 예를 들어 공급 배치식 배양 프로세스에서 배양물에 이를 부가함으로써 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는, 지속적인 성장 및 산물 형성에 필요한 모든 영양소를 함유한다. 배양 배지, 특히 세포 배양 배지를 제조하기 위한 레시피는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Oeztuerk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006] 참조). 다양한 배양 배지는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 탄수화물 공급원을 포함한다. 세포 배양 배지에 사용되는 주요 탄수화물은 글루코스이며, 일상적으로 5 내지 25 nM로 보충된다. 또한, 임의의 헥소스, 예컨대 갈락토스, 프룩토스, 또는 만노스 또는 조합이 사용될 수 있다.
배양 배지는 전형적으로 또한, 적어도 필수 아미노산 (즉, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Tyr, Val) 뿐만 아니라 특정의 비-필수 아미노산을 포함한다. 비-필수 아미노산은 전형적으로, 세포주가 아미노산을 합성할 수 없는 경우 또는 세포주가 최대 성장을 지원하기에 충분한 양의 아미노산을 생산할 수 없는 경우에 세포 배양 배지에 포함된다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는, 염을 포함한다. 염은 등장 조건을 유지하고 삼투 불균형을 방지하기 위해 세포 배양 배지에 부가된다. 본 발명의 배양 배지의 삼투압은 약 300 mOsm/kg이지만, 많은 세포주가 이러한 값의 대략 10 퍼센트 이상의 변동을 견딜 수 있다. 일부 곤충 세포 배양물의 삼투압은 300 mOsm/kg 보다 더 높은 경향이 있으며, 이는 300 mOsm/kg 보다 0.5 퍼센트, 1 퍼센트, 2 내지 5 퍼센트, 5 내지 10 퍼센트, 10 내지 15 퍼센트, 15 내지 20 퍼센트, 20 내지 25 퍼센트, 25 내지 30 퍼센트 더 높을 수 있다. 세포 배양 배지에서 가장 흔히 사용되는 염은 Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, 및 HCO3 -을 포함한다 (예를 들어, CaCl2, KCl, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4).
다른 무기 원소가 배양 배지에 존재할 수 있다. 이는 Mn, Cu, Zn, Mo, Va, Se, Fe, Ca, Mg, Si, 및 Ni를 포함한다. 이들 원소 중 다수가 효소 활성에 수반된다. 이들은 염, 예컨대 CaCl2, Fe(NO3)3, MgCl2, MgSO4, MnCl2, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, 및 미량 원소, 예컨대 셀레늄, 바나듐 및 아연의 이온 형태로 제공될 수 있다. 이들 무기 염 및 미량 원소는, 예를 들어 시그마 (Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 상업적으로 수득될 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는, 비타민을 포함한다. 비타민은 전형적으로, 보조인자로서 세포에 의해 사용된다. 세포 배양 배지가 혈청을 거의 또는 전혀 함유하지 않는 경우 또는 세포가 높은 밀도로 성장하는 경우에 일반적으로 여분의 비타민이 필요하지만, 각각의 세포주의 비타민 요구량은 크게 다양하다. 본 발명의 배양 배지에 바람직하게는 존재하는 예시적인 비타민은 비오틴, 염화콜린, 엽산, i-이노시톨, 니코틴아미드, D-Ca++-판토테네이트, 피리독살, 리보플라빈, 티아민, 피리독신, 니아신아미드, A, B6, B12, C, D3, E, K, 및 p-아미노벤조산 (PABA)을 포함한다.
본 발명에 따른 복합 배양 배지는 또한 혈청을 포함할 수 있다. 혈청은 응고된 혈액의 상등액이다. 혈청 성분은 부착 인자, 미량 영양소 (예를 들어, 미량 원소), 성장 인자 (예를 들어, 호르몬, 프로테아제), 및 보호 요소 (예를 들어, 항독소, 항산화제, 항프로테아제)를 포함한다. 혈청은 사람, 소 또는 말 혈청을 포함하여 각종 동물 공급원으로부터 입수가능하다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지에 포함될 때, 혈청은 전형적으로, 5 내지 10% (부피)의 농도로 부가된다. 바람직한 세포 배양 배지는 무혈청이다.
혈청의 부재하에 또는 혈청 감소된 배지에서 세포 성장을 촉진시키기 위해, 하기 폴리펩티드 중 하나 이상이 본 발명의 세포 배양 배지에 부가될 수 있다: 예를 들어, 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 염기성 FGF를 포함한 FGF, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 상피 성장 인자 (EGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 전환 성장 인자 (TGF)알파 및 TGF베타를 포함한 TGF, 임의의 시토카인, 예컨대 인터류킨 1, 2, 6, 과립구 자극 인자, 백혈구 억제 인자 (LIF) 등. 그러나, 본 발명의 배양 배지는 또한, 상기 열거된 성장 인자 중 어느 것도 포함하지 않을 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 폴리펩티드 (즉, 20개 초과의 아미노산을 수반한 펩티드)를 포함하지 않는다.
하나 이상의 지질, 예컨대 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 팔미톨레산, 올레산, 폴리엔산, 및/또는 12, 14, 16, 18, 20 또는 24개의 탄소 원자의 지방산 (각각의 탄소 원자는 분지되거나 또는 분지되지 않음), 인지질, 레시틴 (포스파티딜콜린) 및 콜레스테롤이 또한, 본 발명의 세포 배양 배지에 부가될 수 있다. 이들 지질 중 하나 이상이 무혈청 배지에 보충물로서 포함될 수 있다. 포스파티드산 및 리소포스파티드산은 특정의 고정 의존성 세포, 예컨대 MDCK, 마우스 상피, 및 다른 신장 세포주의 성장을 자극하는 반면, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨은 무혈청 배지에서 인간 섬유모세포의 성장을 자극한다. 에탄올아민 및 콜레스테롤은 또한, 특정 세포주의 성장을 촉진시키는 것으로 나타났다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지는 지질을 함유하지 않는다.
하나 이상의 운반체 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 트랜스페린이 또한, 세포 배양 배지에 부가될 수 있다. 운반체 단백질은 특정 영양소 또는 미량 원소의 수송을 도와줄 수 있다. BSA는 전형적으로, 수용액에 불용성인 지질, 예컨대 리놀레산 및 올레산의 운반체로서 사용된다. 또한, BSA는 특정 금속, 예컨대 Fe, Cu 및 Ni에 대한 운반체로서 제공될 수도 있다. 단백질-무함유 제형에서, BSA에 대한 비-동물 유래 대체물, 예컨대 시클로덱스트린이 지질 운반체로서 사용될 수 있다.
하나 이상의 부착 단백질, 예컨대 피브로넥틴, 라미닌 및 프로넥틴이 또한, 세포 배양 배지에 부가되어, 기질에 대한 고정-의존성 세포의 부착을 촉진시키는데 도움을 줄 수 있다.
세포 배양 배지는 임의로, 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 N-[2-히드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄술폰산] (HEPES), MOPS, MES, 포스페이트, 중탄산염, 및 세포 배양 적용에 사용하기 적합한 다른 완충제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 완충제는 배양된 세포에 실질적인 세포 독성 없이 완충 능력을 제공하는 것이다. 적합한 완충제의 선택은 세포 배양 분야의 통상의 기술자의 영역 내에 있다.
폴리음이온성 또는 폴리양이온성 화합물은 세포가 응집되는 것을 방지하고 현탁액 중에서의 세포의 성장을 촉진시키기 위해 배양 배지에 부가될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 액체 배양 배지에 존재하는 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 총 농도는 0.01 g/l 내지 20 g/l, 또는 0.1 g/l 내지 10 g/l, 또는 0.5 g/l 내지 5 g/l의 범위이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 액체 배양 배지에 존재하는 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 총 농도는 0.01 mM, 0.02 mM, 0.04 mM, 0.08 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 또는 1 mM 초과이다. 또한 바람직한 것은 존재하는 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 총 농도가 50 mM, 20 mM, 10 mM, 5 mM, 또는 2 mM 미만인 액체 배양 배지이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 액체 배양 배지에 존재하는 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 총 농도는 0.01 mM 내지 40 mM, 또는 0.1 mM 내지 20 mM, 또는 0.1 mM 내지 10 mM, 또는 0.5 mM 내지 10 mM, 또는 1 mM 내지 10 mM, 또는 1 mM 내지 8 mM, 또는 1 mM 내지 6 mM의 범위이다. 매우 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 액체 배양 배지에 존재하는 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 총 농도는 1 mM 내지 8 mM이고, 아실은 아세틸 기로서 존재하며, X는 알라닌이다. 상기 농도는 비-농축된 배지 중의 농도, 즉 실제 배양물에 존재하는 바와 같은 농도로서 제공된다. 농축된 배지는 X배 더 높은 농도를 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 농축된 형태일 수 있다. 이는, 예를 들어, 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 농축된 형태일 수 있다 (세포의 성장 및 산물 형성을 지원하는 농도에 비해). 이러한 농축된 배양 배지는 농축된 배양 배지를 수성 용매, 예컨대 물로 희석함으로써 사용하기 위한 배양 배지를 제조하는데 도움이 된다. 이러한 농축된 배양 배지는 배치식 배양에 사용될 수 있지만, 공급 배치식 또는 연속식 배양에 또한 유리하게 사용되며, 여기서 농축된 영양소 조성물은 세포의 지속적인 배양에 부가되어, 예를 들어, 배양 동안 세포에 의해 소비되는 영양소를 보충시켜 준다.
본 발명은 또한, 세포를 배양하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 세포 배양 산물을 생산하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 동물 세포 또는 식물 세포, 가장 바람직한 포유동물 세포를 배양하기 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서 배양될 세포는 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HEK 세포, HELA 세포, AE-1 세포, 곤충 세포, 섬유모 세포, 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 피부 세포, 내피 세포 및 하이브리도마 세포이다. 본 발명의 바람직한 세포는 CHO 세포 및 하이브리도마 세포이다. 본 발명의 가장 바람직한 세포는 CHO 세포이다. 본 발명의 특히 바람직한 CHO 세포는 CHO DG44 및 CHO DP12 세포이다.
본 발명의 범위에는 또한, 세포를 배양하는 방법이 포함되며, 이러한 방법은 상기 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포를 배양하는 방법은 세포의 배양을 지원하는 조건 하에 세포를 기초 배양 배지와 접촉시키고, 이러한 기초 세포 배양 배지를 본 발명에 따른 농축된 배지로 보충하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 기초 배양 배지에는 농축된 피드 또는 배지가 하루 초과로 보충된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 배양 배지를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배양 배지를 생산하는 방법은 본 발명의 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q를 배양 배지에 부가하는 적어도 하나의 단계를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 한 측면은 세포 배양 배지를 생산하기 위한 본 발명의 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 배양 배지를 변형시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 배양 배지를 변형시키는 것은 본 발명의 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q를 상기 배양 배지에 부가하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 액체 배양 배지를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명에 따른 고체 배지를, 예를 들어, 건조 분말 형태, 또는 과립 형태, 또는 펠릿 형태, 또는 정제 형태로 제공하고; 상기 고체 배양 배지를 수성 배지, 예컨대 물에 용해시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포를 배양하기 위한 본 발명에 따른 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 세포 배양을 위한 본 발명에 따른 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (i) 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 세포를 본 발명의 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 배양 배지 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 세포 배양 산물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에 관한 것이다.
바람직한 방법에서, 세포 배양 산물은 치료용 단백질, 진단용 단백질, 폴리사카라이드, 예컨대 헤파린, 항체, 모노클로날 항체, 성장 인자, 인터류킨, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 효소이다.
본 발명에 따른 세포의 배양은 배치식 배양, 공급 배치식 배양 또는 연속식 배양으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 1 내지 8 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 1 내지 8 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 1 내지 8 mM의 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 0.5 내지 10 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 0.5 내지 10 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 0.5 내지 10 mM의 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 0.1 내지 20 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 0.1 내지 20 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아세틸-A-Q이고, 아세틸-A-Q는 0.1 내지 20 mM의 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 1 내지 8 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 1 내지 8 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 1 내지 8 mM의 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 0.5 내지 10 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 0.5 내지 10 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 0.5 내지 10 mM의 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 0.1 내지 20 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 0.1 내지 20 mM의 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q이고, 아실-A-Q는 0.1 내지 20 mM의 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 1 내지 8 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 1 내지 8 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 1 내지 8 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 0.5 내지 10 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 0.5 내지 10 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 0.5 내지 10 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 0.1 내지 20 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 0.1 내지 20 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 본 발명에 따라서, 세포를 배양하는 또 다른 바람직한 방법, 또는 세포의 배양을 위한 적어도 하나의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 용도에서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 아실-A-Q, 아실-G-Q 또는 그의 혼합물로부터 선택되고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 0.1 내지 20 mM의 총 농도로 존재하며, 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트, 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트 및 몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)은 하기에 열거된 바와 같이 규정되고; 이러한 바람직한 실시양태에서 세포 배양 배지는 화학적으로 규정된 배지이고, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q는 1 mM 내지 8 mM의 총 농도로 존재하며; 세포 배양 산물의 바람직한 용도 및 이를 제조하는 프로세스에서, CHO 세포는 그러한 바람직한 세포 배양 배지와 접촉된다:
Figure 112019101327525-pct00001
Figure 112019101327525-pct00002
Figure 112019101327525-pct00003
실시예
실시예 1: 배치식 배양에서 아세틸-A-Q와 상이한 글루타민 공급원의 혼합물
아세틸-A-Q를 유리 글루타민 또는 A-Q와 0 내지 100%의 몰 비로 혼합하였다. 이 혼합물을 글루타민 없는 배지 (파워CHO-2 CD, 론자 AG; 스위스 비스프)에 부가하여 최종 배지에서 8 mM의 총 글루타민 농도를 수득하였다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (서브클론 DG44; 라이프 테크놀로지스 코포레이션; 미국 칼즈배드)를 사용하여 성장 및 생산성을 측정하였다. 배양물의 생육력이 80% 아래로 떨어지는 시점까지 배양을 지속하였다. 제3 계대로부터의 데이터를 사용하였다. 아세틸-A-Q를 유리 글루타민 (Q)과 혼합한 결과가 표 1에 요약되어 있다. 모든 역가-관련 정보는 100% 유리 글루타민의 역가와 비교하여 제공된다. 따라서, 상대적 세포-특이적 생산성은 먼저, 상대 역가를 통합 생육성 세포 밀도 (IVCD)로 나눈 다음, 이러한 수치를 100% 유리 글루타민에 대한 역가/IVCD 비율로 나눔으로써 수득되었다. 상대적 시간-특이적 생산성은 상대 역가를 샘플링까지의 배양 지속 기간으로 나눈 다음, 이러한 수치를 유리 글루타민에 대한 역가/배양 시간 비율로 나눔으로써 수득되었다.
표 1:
Figure 112019101327525-pct00004
100% 아세틸-A-Q를 사용하면, 상대 역가 및 세포-특이적 생산성에 대한 가장 우수한 값이 산출되지만, 임계 미만 세포 밀도는 배양을 덜 견고하게 만들 수 있다. 놀랍게도, 유리 글루타민을 부가하면 상대적 시간-관련 생산성이 증가한다. 상대 역가 및 시간-관련 생산성의 최상의 조합은 75% 아세틸-A-Q와 25% 유리 글루타민에서 발견되었다.
동일한 실험 캠페인 내의 두 번째 실험의 세트에서는, 아세틸-A-Q를 A-Q와 혼합하고 상기 언급된 바와 동일한 조건 하에서 시험하였다. 유리 글루타민 참조 뿐만 아니라 아세틸-A-Q에 대한 100% 포인트는 첫 번째 예와 동일하다.
표 2:
Figure 112019101327525-pct00005
놀랍게도, 75% 아세틸-A-Q를 25% A-Q와 조합함으로써 제조된 보충물은 세포 특이적 생산성과 시간-특이적 생산성 뿐만 아니라 상대 역가의 최상의 조합을 초래하였다. 이는 또한, 아세틸-A-Q와 유리 글루타민의 조합보다 우월하다. 100% A-Q로 보충시킨 현재의 산업 표준은 모든 관련 범주에서 더 낮은 수준으로 수행된다.
실시예 2: 공급 배치식 배양에서 아세틸-A-Q와 상이한 글루타민 공급원의 혼합물
유리 글루타민, A-Q 또는 아세틸-A-Q를 글루타민 없는 배지 (파워CHO-2 CD, 론자 AG; 스위스 비스프)에 부가하여 최종 배지에서 8 mM의 총 글루타민 농도를 수득하였다. 또한, 이들 물질 뿐만 아니라 아세틸-A-Q와 A-Q의 75% 혼합물을 상업적 피드 보충물 (CHOMACS 피드 보충물, 밀테니 바이오텍; 독일)의 글루타민 없는 제형에 부가하여 5.5 g/L의 글루타민 농도를 산출하였다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (서브클론 DG44; 라이프 테크놀로지스 코포레이션; 미국 칼즈배드)를 사용하여 성장 및 생산성을 측정하였다. 그 결과가 표 3에 요약되어 있다. 모든 역가-관련 정보는 유리 글루타민을 기초 배지 및 피드에 부가함으로써 수득된 역가와 비교하여 제공된다. 따라서, 상대적 세포-특이적 생산성은 먼저, 상대 역가를 통합 생육성 세포 밀도 (IVCD)로 나눈 다음, 이러한 수치를 100% 유리 글루타민에 대한 역가/IVCD 비율로 나눔으로써 수득되었다. 상대적 시간-특이적 생산성은 상대 역가를 샘플링까지의 배양 지속 기간으로 나눈 다음, 이러한 수치를 유리 글루타민에 대한 역가/배양 시간 비율로 나눔으로써 수득되었다.
표 3:
Figure 112019101327525-pct00006
놀랍게도, 동일한 경향이 공급 배치식 작업에 대해서도 발견되었다. 아세틸-A-Q만으로 배양하면, 매우 높은 세포-특이적 생산성이 초래되었지만, 세포 밀도는 매우 낮았다. 이러한 특이적 실험의 세트에서는, 심지어 매우 낮은 역가 수준이 초래되었다. 이들 실험은 또한, 75%/25% 비율의 아세틸-A-Q와 A-Q의 이전에 선택된 조합이 또한, 피드 보충물을 위한 글루타민 공급원으로서 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 요약하면, 기초 배지 중의 Q 또는 A-Q와 같은 글루타민 공급원을 피드 중의 아세틸-A-Q와 조합하는 것은, 피드 중의 Q 또는 A-Q의 조합보다 항상 더 우수하게 수행되었다. 기초 배지 중의 A-Q를 피드 중의 아세틸-A-Q와 A-Q의 혼합물과 조합하면 전반적으로 최상의 성능 조합이 초래되었다.

Claims (14)

  1. N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트로부터의 L-글루타민 및 다른 글루타민-공급원 Q공급원의 세트로부터의 L-글루타민을 규정된 몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)으로 포함하는 세포 배양 배지로서;
    여기서 X는 L-아미노산으로서 규정되고;
    여기서 Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고;
    여기서 아실은 아미드 결합을 통해 L-아미노산 X의 아미노-말단에 부착된 C1-C7-아실 모이어티로서 규정되고;
    여기서 R은 0.03 내지 20의 범위 내에 있는 것으로 규정되고;
    여기서 n(아실-X-Q)는 배양 배지 중의 N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이고;
    여기서 n(Q공급원)은 배양 배지 중의 다른 글루타민 공급원 Q공급원의 세트 내에 함유된 L-글루타민의 물질의 총량이고,
    여기서 다른 L-글루타민 공급원 (Q공급원)의 세트의 구성성분은 하기: 유리 L-글루타민, 디펩티드 Y-Q, 또는 그의 혼합물로부터 선택되며, 여기서 Y는 20개의 유전적으로 코딩된 L-아미노산 중 하나로서 규정되고,
    여기서 Q는 아미드 결합을 통해 L-아미노산 Y에 부착된 L-글루타민으로서 규정되고, 여기서 디펩티드 Y-Q에서 Y와 Q를 연결하는 아미드 결합은 아미노산 Y의 카르복시 말단 및 글루타민 Q의 아미노 말단을 수반하는 규칙적인 주쇄 아미드 결합인
    세포 배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, 세포 배양 배지가 무혈청인 세포 배양 배지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 배양 배지가 화학적으로 규정된 것인 세포 배양 배지.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 유일한 구성성분이 디펩티드 Y-Q이며, 여기서 Y는 알라닌인 세포 배양 배지.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 유일한 구성성분이 유리 L-글루타민인 세포 배양 배지.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 총 농도가 1 mM 내지 8 mM의 범위인 세포 배양 배지.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)이 0.04 내지 15.67의 범위 내인 것으로 규정된 것인 세포 배양 배지.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트가 아세틸-A-Q, 아세틸-G-Q, 아세틸-N-Q 중 하나 이상으로서 규정된 것인 세포 배양 배지.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트가 아세틸-A-Q, 아세틸-G-Q 중 하나 이상으로서 규정된 것인 세포 배양 배지.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트가 아세틸-A-Q로서 규정된 것인 세포 배양 배지.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 배양 배지가 화학적으로 규정되고;
    다른 L-글루타민 공급원 Q공급원의 세트의 유일한 구성성분이 디펩티드 Y-Q이며, 여기서 Y는 알라닌이고;
    몰 비 R = n(아실-X-Q) / n(Q공급원)이 0.04 내지 15.67의 범위 내인 것으로 규정되고;
    N-아실화된 디펩티드 아실-X-Q의 세트가 아세틸-A-Q로서 규정되고;
    아세틸-A-Q의 농도가 1 mM 내지 8 mM의 범위 내인
    세포 배양 배지.
  12. 세포를 제1항 또는 제2항에 따른 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 배양 산물의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 세포 배양 배지와 접촉된 세포가 CHO 세포인 제조 방법.
  14. 삭제
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